Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm và phân lập một số thành phần từ alkaloid toàn phần của rễ cây bá bệnh (eurycoma longifolia jack )

B GIÁO D

O

B

IH

YT

C HÀ N I

LÊ THANH LIÊM

NGHIÊN C U

NG

CH NG VIÊM VÀ PHÂN L P M T S
THÀNH PH N T

ALKALOID TOÀN

PH N C A R CÂY BÁ B NH
(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK.)
LU N

CH C

HÀ N I 2018

B GIÁO D

O
IH

B YT
C HÀ N I

LÊ THANH LIÊM

NGHIÊN C U

NG

CH NG VIÊM VÀ PHÂN L P M T S
THÀNH PH N T

ALKALOID TOÀN

PH N C A R CÂY BÁ B NH
(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK.)
CH C

LU
C LI U
MÃ S : 8720206
ng d n khoa h c :

HÀ N I 2018

C H C C TRUY N


-

chân thành
-

-

-

Lê Thanh Liêm


M CL C
Trang
DANH M C CÁC KÝ HI U, CH

VI T T T

DANH M C CÁC B NG
DANH M C CÁC HÌNH
TV
NG QUAN
Eurycoma

Eurycoma
1.2. T ng quan v loài Eurycoma longifolia

1.2.2

1.2.4. Công d ng theo y h c c truy n

....

1

....

3

......

3

..

3

..

3

..

4

........

4

.....

5

......

9

........

14

1.3. T ng quan b

....... 15

1.3.1. Khái ni

......

15

1.3.2. Vai trò c

........

16

...........

17

U.....

20

1.3.3

........................................................... 20
2.2. Hóa ch t và thi t b dùng trong nghiên c u.........................................

20

..................................

20

.....................................

20

2.2.3. D ng c thi t b

nh c

........ 21
in vitro

.........

21

in vivo

..........

21


........

22

........ 22
2.3.1

..................................
nh tính m t s nhóm ch t h

22

n alkaloid

toàn ph n ....................................................................................................

22

2.3.1.2. Chi t xu t và phân l

22

.......

nh c u trúc............................................................................ 23

2.3.1
2.3.2.

in vitro và in vivo

... 23

2.3.2

t tính ch ng viêm trên in vitro

........ 23

2.3.2

t tính ch ng viêm trên in vivo

........

26

......

28

lý s li u

2.3.3

t qu

3:

.... 29
......

29

.............................

29

in vitro, in vivo

3.2.1.

các nhóm ch

n alkaloid toàn ph n

r Bá b nh

. 29
tác d ng ch ng viêm c p trên in vitro

..........

31

in vivo

........................

32

nh c
ch t phân l

t tính ch ng viêm in vitro c a các
c

33

3.3.1. Phân l p các ch

n ELA

3.3.2. Nh n d ng c u trúc các ch t phân l

33
c

36

3.3.2.1. Nh n d ng ch t EL-

.. 36

3.3.2.2. Nh n d ng ch t EL-

. 41

3.3.2.

.. 45

in vitro


48
4: BÀN LU N

....

51

4.1. V tác d ng sinh h

......

51

4.2. V thành ph n hóa h

.......

54

.....

56

K T LU

XU T

TÀI LI U THAM KH O
PH L C


DANH M C CÁC KÝ HI U, CH

VI T T T

13

C-NMR

Ph c

ng t h t nhân Carbon -13

1

H-NMR

Ph c

ng t h t nhân proton

A-549

T bào u

COX

Cyclooxygenase

D

Diclomethan

DD

Dung d ch

i

n Vi t Nam IV
DEPT

Ph DEPT

DM

Dung môi

DMEM

Dulbecco's modified Eagle's medium

DMSO

Dimethylsulfoxide

eNOS

Nitric oxide synthase n i bào

FBS

Fetal bovine serum

Gr

Gram

H2SO4

Acid sulfuric

HCl

Acid clohydric

HepG2

T bào u

HL-60

Human leukemia 60

HMBC

Ph

HO

Heme oxygenase

HSQC

Ph

h t nhân qua nhi u liên k t

h t nhân tr c ti p


IC50

N

c ch 50%

IL

Interleukin

iNOS

Nitric oxide synthase c m ng

Jurkat

T bào B ch c u T

KHCNVN

Khoa h c Công ngh Vi t Nam

LPS

Lipopolysaccharide

M

Methanol

MCF-7

T bào u

MS

Ph kh

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

NaCl

Natri clorua

NaOH

Natri hydroxit

NF-

Y u t nhân kappa B

nNOS

Nitric oxide synthase th n kinh

NO

Nitric oxide

NOS

Nitric oxide synthases

PG

Prostaglandin

TLTK

Tài li u tham kh o

TT

Thu c th

THP-1

T bào monocyte

YHCT

Y h c c truy n

ng


DANH M C CÁC B NG
B ng

Tên b ng

3.1 K t qu

Trang

các nhóm ch

n ELA b ng

ph n ng hóa h

30

3.2 K t qu ho t tính ch ng viêm c a cao

n ELA t

r cây

Bá b nh
3.3

. 31
ng c

n ELA t r cây Bá b

phù

chân chu t
3.4 B ng s li u ph

32
1

H-NMR và 13C-NMR c a h p ch t EL1 có so

sánh v i TLTK [24], [27]................................................................. 40
3.5 B ng s li u ph

1

H-NMR và 13C-NMR c a h p ch t EL2 có so

sánh v i TLTK [29] ........................................................................
3.6 B ng s li u ph

1

44

H-NMR và 13C-NMR c a h p ch t EL3 có so

sánh v i TLTK [27] .......................................................................
3.7 K t qu ho t tính ch ng viêm c a các h p ch

48

c phân l p t

r cây Bá b nh .................................................................................

49


DANH M C CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Hình thái th c v t cây Bá b nh (Eurycoma longifolia

1.2

C u trúc c a m t s quassinoid phân l p t cây Bá b

1.3

C u trúc c a m t s alkaloid phân l p t cây Bá b

1.4

C u trúc c a m t s triterpen phân l p t cây Bá b

1.5

C u trúc c a m t s d n xu t skylene phân l p t cây Bá b nh.

14

2.1

Quy trình thí nghi m th tác d ng ch

27

3.1

chi

3.2

phân l p các h p ch t EL-1, EL-2, EL-

3.3

n alkaloid toàn ph

ng h p ch t EL-1, EL-2, EL-3 v

.

11
.

...

12

.... 13

.

.. 30
..

35

n

ELA, h dung môi D:M (20:1)
1

5

36

3.4

Ph

H-NMR c a h p ch t EL-

.

36

3.5

Ph giãn 1H-NMR c a h p ch t EL-

.

37

3.6

Ph

....

38

3.7

Ph DEPT c a h p ch t EL-

....

39

3.8

C u trúc c a h p ch t EL-

3.9

Ph kh

13

C-NMR c a h p ch t EL-

.. 39
n t c a h p ch t EL-1.......................

40

H-NMR c a h p ch t EL-2.....................................................

41

3.10 Ph

1

3.11 Ph

13

C-NMR c a h p ch t EL-2 ...................................................

42

3.12 Ph HSQC c a h p ch t EL-2.........................................................

42

3.13 Ph HMBC c a h p ch t EL-2........................................................

43

3.14 C u trúc h p ch t EL-2....................................................................

43

3.15 Ph kh

44

3.16 Ph

1

3.17 Ph

13

ng p

n t c a h p ch t EL-2.......................

H-NMR c a h p ch t EL-

.

45

.

46

3.18 Ph DEPT c a h p ch t EL-

..

46

3.19 Ph MS c a h p ch t EL-

.

47

3.20 C u trúc c a h p ch t EL-

. 47

C-NMR c a h p ch t EL-



TV
Vi t Nam là qu c gia n m trong vùng khí h u nhi

th c v

i gió mùa, có h

ng v i ngu n tài nguyên cây thu c d i dào v

ch ng lo i l n công d ng làm thu c

c bi t n n y h c c truy

cho nên vi c s d ng cây c ch a b nh

i,

c ta là hoàn toàn phù h p và có

u ki n phát tri n.
(Eurycoma longifolia

[4], [5], [7], [13]. Các

alkaloid
[31]
cao c

lipopolyssccharide (LPS) [15]

tài
và phân

alkaloid
u:

1.

2.

alkaloid

p

2-3

1

alkaloid


c2m

tài s

c ti n hành v i các n i dung

sau:
N i dung 1: Nghiên c u v tác d ng sinh h c:
-

ng ch ng viêm in vitro c a

ph n c a r cây Bá b nh và m t s ch t phân l
-

n alkaloid toàn
c.

tác d ng ch ng viêm in vivo c a

n alkaloid toàn

ph n c a r cây Bá b nh.
N i dung 2: Nghiên c u v thành ph n hóa h c:
- Chi t xu t và phân l p 2-3 ch t t alkaloid toàn ph n c a r cây Bá
b nh.
-

nh c u trúc hóa h c các ch t phân l

2

c.


chi Eurycoma

Theo các nghiên c u v phân lo i th c v t, chi Eurycoma có v trí phân
lo

[3]:
Ngành Ng c lan (Magnoliophyta)

L p Ng c lan (Magnoliopsida)
Phân l p Hoa h ng (Rosidae)
B Cam (Rutales)
H Thanh th t (Simaroubaceae)
Chi Eurycoma
Loài E. longifolia
Eurycoma
Eurycoma Jack là nh ng cây g hay cây b i có v

ng, nhánh ph lông

tuy n sít nhau. Lá m c so le, lá kép lông chim nh , có nhi
nguyên, thuôn. C m hoa là chùy r ng, g n
ho c dính

g

ng

i

ng ph lông tuy

g p trong. Nh 5, xen k

v i cánh hoa, nh

có 2 v y có lông nhung
ngã xu ng, l

u,

g c, r i ho c dính t

ngang ho

cánh hoa, r i; r

n ng n, có khi

ng trong. Lá noãn 5, x p ch ng trên
y dính thành c

không có các lá noãn ho c ch có r

u nh y r i;

c

h ch 3-5, có chân hay

không, m m t trong; h
Phân b ch y u

nh r i,

l m ch m lông ng n [4].
vùng nhi

Nam Á có 3 loài và m

t là loài Bá

b nh phân b r ng rãi t
M

o Borneo (Indonesia) và Philippin. Loài này còn xu t hi n

Trung Qu c,

và m t s vùng khác n a [12].
3

Nam


Theo tác gi Ph m Hoàng H , h Thanh th t (g i là h Kh m c)

Vi t

Nam có 8 chi:
Samadera

Quassiflavonoid, saponin, tanin, acid h
các nhóm ch
B ng 3.1. K t qu

ng kh
o

k t qu phân

c trình bày

b ng 3.1.

các nhóm ch

n ELA

b ng ph n ng hóa h c

STT

1

2

Nhóm ch t

Alkaloid

Glycosid tim

K t

Ph n ng

qu

Ph n ng v i TT. Mayer

++

Ph n ng v i TT. Bouchardat

++

Ph n ng v i TT. Dragendorff

++

Ph n ng Liebermann-burchardt

-

Ph n ng Keller-Kiliani

-

30

k t
lu n

Có

Không

3

Flavonoid

Ph n ng Baljet

+

Ph n ng Legal

+

Ph n ng Cyanidin

-

Ph n ng v i ki m

-

Ph n ng v i S t (III) clorid 5%

+

Ph n ng v i TT.diazo

-

Không
Không

4

Saponin

Hi

5

Anthranoid

Ph n ng Borntrager

-

Ph n ng v i dd s t (III) clorid 5%

+

Ph n ng v i dd chì acetat 10%

-

Ph n ng v i dd gelatin 1%

-

Ph n ng v i TT Felling

-

6

Tanin

7

ng kh

ng t o b t

Ghi chú: (-): Ph n ng âm tính

Không

Không

Không

(+) Ph n

(++) Ph n
Nh n xét

n ELA cao chi t r Bá b nh có nhóm ch t: alkaloid
tác d ng ch ng viêm c p trên in vitro

K t qu th tác d ng ch ng viêm c a cao
Cao

n EL

c th

n ELA r Bá b nh

ho t tính ch ng viêm trên t bào

RAW264.7 và th c nghi m t i Trung tâm tiên ti n v Hóa sinh h

, Vi n

Hóa sinh bi n, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam. K t qu
c th hi n

b ng 3.2.

B ng 3.2. K t qu ho t tính ch ng viêm c a cao

n ELA t r

cây Bá b nh
% c

Tên m u

Sai s

ch

% t bào

Sai s

IC50

s ng

Cao phân

1 µg/ml

21,91

1,74

129,72

2,23

44,67 ± 1,80

n ELA

3 µg/ml

22,19

1,66

10444

1,31

µg/ml

31


10 µg/ml

25,56

1,00

101,13

2,36

30 µg/ml

31,74

0,38

96,94

1,49

50 µg/ml

57,30

1,74

94,50

1,75

100 µg/ml

90,73

1,37

76,71

1,97

0.3 (µM)

13,49

0,88

98,90

1,03

1 (µM)

25,78

0,58

96,54

0,67

3 (µM)

74,70

1,20

93,27

1,12

Cardamonin*

*

2,59 ± 0,18
(µM)

c s d ng làm ch ng

Nh n xét
T k t qu

kh

b ng 3.2 cho th y, cao

n ELA r cây Bá b nh có

c ch s s n sinh NO m nh nh t (90,73%

n

100 µg/ml).

n ELA r cây Bá b nh không có kh
các n

t t bào

th nghi m.

Giá tr IC50 c a cao

n r cây Bá b nh có ho t tính c ch s n

sinh NO t t (IC50= 44,67 µg/ml.)
ng ch ng viêm c p trên in vivo

3.2.3

c th c hi n t

c lý sinh hóa-Vi

c li

trên mô hình gây phù chân chu t b ng carrageenan.
K t qu m

tích chân chu t c a các lô và % c ch phù

c a lô th so v i lô ch
B ng 3.3.

c th hi n

ng c a cao

b ng 3.3.
n ELA t r cây Bá b nh

phù chân chu t
Sau 3 gi gây phù

Lô thí nghi m
phù
(%)
Ch ng b nh lý

Sau 5 gi gây phù

Sau 7 gi gây phù

%

%

%

gi m

gi m

gi m

so v i
ch ng

46,0±4,8

phù
(%)
42,0±2,8

32

so v i
ch ng

phù
(%)
29,0±2,5

so v i
ch ng


ELA 50 mg/kg

49,1±4,8

-6,9

46,2±3,4

-10,1

32,7±2,2

-12,9

ELA 250 mg/kg

34,3±5,0

25,4

35,9±4,0

14,4

28,5±4,2

1,8

23,9±3,0**

48,1

21,8±3,3**

48,1

19,8±2,2

31,7*

Diclofenac

10

mg/kg

Chú thích: *; **: P so v i lô ch ng b nh lý t i cùng th

m < 0,05; 0,01

Nh n xét:
K t qu

b ng 3.3 cho th y, sau 3 gi và 5 gi , % phù bàn chân chu t lô

ch ng b

t m c phù l n nh t, t i 7 gi thì m c phù chân chu

gi
Lô u ng ELA li

ng 50 mg/kg th tr ng chu t có th tích bàn

chân phù còn l

ng b nh lý t i c 3 th

m 3 gi , 5 gi và 7

gi .
Lô u ng ELA li
phù bàn chân t i th

ng 250 mg/kg th tr ng chu t có % th tích
m 3 gi nh

ng b

ng kê (P > 0,05). Sau 5 gi và 7 gi thì m
chân phù c a lô u ng m u th gi

c ch bàn
i lô ch ng

b nh lý.
M

i ch

ng c ch

phù gây b i carrageenan so v i lô ch ng b

ng kê (P <

0,05 và 0,01) t i c 3 th
nh c
ch t phân l

t tính ch ng viêm in vitro c a các
c

3.3.1. Phân l p các ch t
Cao

n ELA

mv

n ELA
c hòa tan vào m

ng t i thi u methanol, sau

ng t l 1:1. Kh i silicagel

thu h

n, b

c c t quay
chi t pha r n

c ti p theo.
33


Chu n b c t: c t s

c r a s ch, tráng b

nhiên. Lót bông

t và c

ng lên c

nh ch c ch n trên giá. Cho silicagel pha

ng ch

b t phân b

khô t

m silicagel nói trên lên c t, gõ nh

u.

Tri n khai c t v i h dung môi Diclomethan/Methanol (D/M), t l D/M
là 10:1. Ki m tra b ng s c ký l p m

n (kí hi u l n

t là ELA-I, ELA-II, ELA-III).
Ti p t c kh

n ELA-I trên s c ký c

ki m tra b ng s c ký l p m

ng,

n nh (ELA-I.1, ELA-I.2,

ELA-I.3, ELA-I.4, ELA-I.5).
n ELA-I.2 b ng s c ký l p m ng và thu c th

Ki

Dragendoff th y xu t hi n v t màu cam trên b n m ng tuy nhiên v n còn t p
ch t, cho nên ti p t

n này trên s c ký c

v ih

n nh là ELA-I.2.1 và

ELA-I.2.2. Ch t c n tách n m
v

ng

n ELA-

ch và khó tách, ti p t

n này
n này trên s c ký c t

Sephadex v i h dung môi ly gi

c (M/W) t l 1:1, thu

c 1 ch t s ch ký hi u EL-1 (9,5 mg).
Trên phâ

n ELA-I.4 s c ký c t silicagel và r a gi i v i h dung môi

D/M (20:1 v/v), s
Trên phân

c 1 ch t s ch ký hi u EL-2 (6,5 mg).

n ELA-I.3 xu t hi n k t tinh, r a k t tinh b ng
c 1 ch t s ch ký hi u EL-3 (15 mg).

Quy trình phân l p các ch
c trình bày

n alkaloid toàn ph n ELA

hình 3.2.

34


ELA (5g)
ng D/M (10:1)

ELA-I (0,94g)

ELA-III (1,47g)

ELA-II (0,3g)
ng H/A (20:1)

ELA-I .1
(0,12g)

ELA-I.2
(0,19g)

ELA-I.3

(0,09g)

R ak t
tinh b ng
CH2Cl2

Silicagel pha
ng

D/M(30:1)
EL-3
(15mg)
ELA-I.2.1
0,15g

ELA-I.4
(0,09g)

D/M (20:1)

EL-2
(6,5mg)

ELA-I.2.2

Sephadex M/W (1:1)
EL-1 (9,5mg)

phân l p các ch t EL-1, EL-2, EL-3

35

ELA-I .5
(0,49g)


A

B
ng h p ch t EL-1, EL-2, EL-3 v

n

ELA, h dung môi D:M (20:1)
Chú thích:
A: S

quan sát

ng, hi n màu b ng TT H2SO4 10%
n.

B: S

quan sát

c sóng

3.3.2. Nh n d ng c u trúc các ch t phân l

c

3.3.2.1. Nh n d ng ch t EL-1

Hình 3.4. Ph

1

H-NMR c a h p ch t EL-1
36


Hình 3.5. Ph giãn 1H-NMR c a h p ch t EL-1
H p ch t EL-

i d ng b t màu vàng. Trên ph

ng cao xu t hi n tín hi u c
nhóm O-CH3.

ng d ng singlet t

ng h n proton H-2 xu t hi n
a vòng pyridin, có tín hi u c

a

ng th p nh t do

ng d

-2=8,74 ppm (1H, d, J = 5 Hz). Proton H-5 m
c bi t c a vòng canthin, m

c a Oxi l

ng kéo c p e v

c p e không chia s c a nguyên t
H-5 không b ch u
ph
d

H-NMR, t i

ng th p xu t hi

proton c

tác v i H-

1

n
pb i

chuy n d ch hóa h c c a

ng nhi

xu t hi n tín hi u c

ng c nh

-5=6,93 ppm (1H, d, J = 10 Hz). Trên
ng t i 7,95 ppm (1H, d, J

nh là H-

u này kh

l ch gi a H-8 và H khác, c th là có s

37

i

nh có s
i H-

m khác


nh n d ng vòng canthin chính là h ng s J gi a H-10 v i H-11 là 10,0 Hz và
H-10 v i H-8 là (2-2,5 Hz). Các proton còn l
8,12 ppm (1H, d, J
6,93 ppm (1H, d, J

c th hi

-1=

-4= 8,18 ppm (1H, d, J

-5=

-10= 7,13 ppm (1H, dd, 2,5 Hz/10,0 Hz),

-11= 8,08 ppm (1H, d, J = 10,0 Hz). K t qu

i phù h p v i

h p ch t 9-methoxycanthin-6-on [24], [27].

Hình 3.6. Ph
kh
thêm ph

13

13

C-NMR c a h p ch t EL-1

nh thêm v c u trúc c a h p ch t EL-1, tôi ti
C-NMR. Trên ph

xu t hi n

k t h p v i ph

tín hi u c a 15 carbon, và
c m t nhóm methoxy OCH3 có

55,72 ppm. Trên ph

xu t hi n tín hi u c a 7 carbon b c 4 t

(C-6); 161,60 (C-9); 116,81 (C-12); 140,15 (C-13); 129,32 (C-14); 131,56 (C15); 135,05 (C-16),

i v i C-

ng h

c bi t xu t hi n t

ng

ng so v
nh n d ng vòng canthin. Ngoài ra trên ph

38

còn xu t hi n b y carbon


chuy n d ch hóa h

methin

116,17 (C-

1); 145,82 (C-2); 139,85 (C-4); 128,04 (C-5); 100,66 (C-8); 113,03 (C-10);
124,18 (C-11).

Hình 3.7. Ph DEPT c a h p ch t EL-1
n t xu t hi n tín hi u m/z: 251 [M+H]+ cho

Ph kh
c kh

ng phân t M = 250.

y b ng vi c phân tích ph 1 chi u, 2 chi u k t h p so sánh v i tài
li u tham kh o [27] có th k t lu n h p ch t EL-1 là 9-methoxycanthin-6-on. Có
c
10

11
12

9
H3C

O

8

14

13 15
7 N
6
O

1
2
N 3
16
4

5

Hình 3.8. C u trúc c a h p ch t EL-1
39