Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm của cắn dịch chiết ethylacetat nho rừng (vitis heyneana roem schult , họ nho vitaceae) thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU,
CHỐNG VIÊM CỦA CẮN DỊCH CHIẾT
ETHYL ACETAT NHO RỪNG
(VITIS HEYNEANA ROEM. & SCHULT.,
HỌ NHO VITACEAE) THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU,
CHỐNG VIÊM CỦA CẮN DỊCH CHIẾT
ETHYL ACETAT NHO RỪNG
(VITIS HEYNEANA ROEM. & SCHULT.,

HỌ NHO VITACEAE) THỰC NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LÝ – DƢỢC LÂM SÀNG
MÃ SỐ: 8720205
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Đỗ Thị Nguyệt Quế
PGS.TS. Đỗ Thị Hà

HÀ NỘI 2018


LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và yêu mến tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
TS. Đỗ Thị Nguyệt Quế, bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội, là
người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, khích lệ tôi trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thiện luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Đỗ Thị Hà và NCS. Phùng
Thanh Long, khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu, đã chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất
nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật
viên, các em sinh viên, các bạn học viên đang nghiên cứu khoa học tại bộ môn
Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn bên tôi, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình tôi thực hiện và hoàn thiện luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè đã
đồng hành, chia sẻ với tôi trong gần hai năm học tập và nghiên cứu dưới mái
trường Dược thân yêu!
Hà Nội, ngày 31 tháng 3 năm 2018

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .............................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU.....................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ...........................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 3
1. Tổng quan về đau ........................................................................................................3
1.1. Vài nét về sinh lý đau ............................................................................................... 3
1.2. Thuốc giảm đau ........................................................................................................4
2. Tổng quan về viêm ......................................................................................................5
2.1. Khái niệm và nguyên nhân gây viêm .......................................................................5
2.2. Vai trò của cyclooxygenase (COX), lypooxygenase (LOX) và các chất trung gian
hóa học trong đáp ứng viêm ............................................................................................ 6
2.3. Thuốc chống viêm ..................................................................................................11
3. Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu về tác dụng giảm đau, chống viêm..........13
3.1. Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau ................................ 13
3.2. Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng chống viêm ............................ 14
4. Tổng quan về dƣợc liệu nghiên cứu ..........................................................................16
4.1. Đặc điểm thực vật của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.) ..............16
4.2. Thành phần hóa học chính của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.) 17
4.3. Tác dụng sinh học của một số loài chi Vitis và cây Nho rừng (Vitis heyneana
Roem. & Schult.) ...........................................................................................................19
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................25
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................................. 25
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................27
2.2.1. Đánh giá tác dụng giảm đau của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho rừng ..............27
2.2.2. Đánh giá tác dụng chống viêm cấp của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho rừng ....28
2.2.3. Đánh giá tác dụng chống viêm mạn của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho rừng ..30
2.2.4. Đánh giá tác dụng ức chế cyclooxygenase 2 (COX - 2) trên tế bào cơ trơn động
mạch............................................................................................................................... 31

2.2.5. Xử lý số liệu ........................................................................................................33
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .........................................................................34
3.1. Tác dụng giảm đau ngoại vi của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho rừng trên mô hình
gây đau quặn bằng acid acetic .......................................................................................34
3.2. Tác dụng chống viêm của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho rừng ............................ 35
3.3. Tác dụng ức chế cyclooxygenase 2 (COX-2) trên tế bào SMC của cắn dịch chiết
ethyl acetat Nho rừng ....................................................................................................41
Chƣơng 4. BÀN LUẬN.................................................................................................43
4.1. Về tác dụng giảm đau của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho rừng ........................... 43
4.2. Về tác dụng chống viêm của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho rừng .......................44
4.3. Về khả năng ức chế enzym Cyclooxygenase (COX) trên tế bào SMC của cắn dịch
chiết ethylacetat Nho rừng............................................................................................. 49
KẾT LUẬN ...................................................................................................................51
1. Về tác dụng giảm đau, chống viêm ...........................................................................51
2. Về tác dụng ức chế COX-2 trên tế bào SMC ............................................................ 51
KIẾN NGHỊ ...................................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
COX (1,2) :

Enzym cyclooxygenase (1, 2)

DPPH :

1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl

GC :

Glucocorticoid

HeLa :

Tế bào ung thƣ cổ tử cung

HepG2 :

Tế bào ung thƣ gan ngƣời

IASP :

Hiệp hội quốc tế nghiên cứu về đau

IL :

Interleukin

iNOS :

Nitric oxyd synthase

INF :

Interferon

LCT :

Leucotrien

LPS :

Lipopolysaccharid

NO• :

Gốc nitric oxyd tự do

NSAIDs :

Thuốc chống viêm không steroid

PG :

Prostaglandin

PGI :

Protacyclin

SMC:

Tế bào cơ trơn động mạch

TNF :

Yếu tố hoại tử u

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
STT
1

Tên bảng
Sơ đồ quy trình thí nghiệm nghiên cứu tác dụng
giảm đau của cắn dịch chiết ethyl acetat nho rừng
Sơ đồ 2.1
trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic

Trang
28

2

Sơ đồ quy trình nghiên cứu tác dụng chống viêm
Sơ đồ 2.2 cấp của cắn dịch chiết ethyl acetat nho rừng trên
mô hình gây viêm bằng carrageenin

29

3

Sơ đồ quy trình nghiên cứu tác dụng chống viêm
Sơ đồ 2.3 cấp của cắn dịch chiết ethyl acetat nho rừng trên
mô hình gây viêm màng bụng

30

4

Bảng 3.1

Số cơ đau quặn của các lô chuột trong các giai đoạn
sau khi gây đau bằng acid acetic

34

5

Bảng 3.2

Tỉ lệ phù chân chuột của cắn dịch chiết ethyl acetat
Nho rừng

36

6

Bảng 3.3

Tỉ lệ ức chế phù chân chuột của cắn dịch chiết ethyl
acetat Nho rừng

37

7

Bảng 3.4

Ảnh hƣởng của cắn dịch chiết ethylacetat Nho rừng
lên thể tích dịch rỉ viêm

38

8

Bảng 3.5

Ảnh hƣởng của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho
rừng đến số lƣợng bạch cầu trong dịch rỉ viêm

38

9

Bảng 3.6

Ảnh hƣởng của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho
rừng đến hàm lƣợng protein trong dịch rỉ viêm

39

10

Bảng 3.7

Khối lƣợng u hạt sau khi cân ƣớt

40

11

Bảng 3.8

Khối lƣợng u hạt sau khi cân khô

41

Bảng 3.9

Kết quả thử tác dụng ức chế COX-2 in vitro
trên tế bào SMC của cắn dịch chiết ethyl acetat và 3
phân đoạn khác của Nho rừng (Vitis heyneana
Roem. & Schult.)

42

12


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT

Tên

1

Sơ đồ đƣờng dẫn truyền cảm giác đau và vị trí tác
Hình 1.1 dụng chính của thuốc giảm đau

2

Hình 1.2

3

Hình 1.3

4

Hình 1.4

5

Hình 1.5 CTCT một số hợp chất stilbenoid thuộc V. heyneana

6

Hình 1.6

Phản ứng chuyển hóa của acid arachidonic dƣới sự
xúc tác của enzym COX
Phản ứng chuyển hóa của acid arachidonic dƣới sự
xúc tác của enzym LOX
Đặc điểm hình thái của cây Nho rừng (Vitis heyneana
Roem.& Schult.)

Công thức cấu tạo một số hợp chất khác thuộc V.
heyneana

Trang

4

8
9
17
18
19


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, có nguồn tài
nguyên thực vật phong phú và đa dạng, trong đó có rất nhiều loài đƣợc sử dụng
làm thuốc. Việc sử dụng thuốc và các thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc
từ thực vật chủ yếu vẫn còn dựa trên kinh nghiệm dân gian, chƣa có đầy đủ bằng
chứng khoa học để chứng minh tác dụng, cơ chế tác dụng, tác dụng không mong
muốn...của những cây cỏ làm thuốc này. Trong đó, cây Nho rừng cũng là một
đối tƣợng gần đây đƣợc quan tâm rất nhiều.
Từ lâu, chi Nho Vitis đƣợc sử dụng làm thuốc với rất nhiều công dụng nhƣ:
lá cây nho leo có đặc tính làm se, mát, dịu da và chống viêm sƣng đƣợc sử dụng
làm trà chữa bệnh tiêu chảy, kinh nguyệt nhiều và xuất huyết tử cung, làm thuốc
chữa loét miệng và thuốc thụt rửa âm đạo nhiều mủ. Lá và quả nho leo chữa
bệnh giãn tĩnh mạch, bệnh trĩ và mao mạch yếu. Nhựa của cành cây đƣợc dùng
làm thuốc rửa mắt. Quả nho khô có tác dụng long đờm, làm dịu cơn ho [5]. Hiện
đã có một số nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về thành phần hóa
học, tác dụng sinh học... của chi Nho, nhƣng chủ yếu trên V. vinifera, một số ít

nghiên cứu tiến hành trên các loài V. amurensis, V. thunbergii.
Cây Nho rừng (hay còn gọi là nho lông, nho năm góc, nho ngũ giác, nho
tía), tên khoa học là Vitis heyneana Roem. & Schult., họ Nho Vitaceae [5], [7].
Trong dân gian, rễ Nho rừng đƣợc dùng để ăn với trầu và dùng trị viêm phế
quản; làm thuốc lợi tiểu và phối hợp với rễ dứa hãm hoặc sắc uống trị bệnh lậu.
Vỏ rễ đƣợc dùng trị kinh nguyệt không đều và bạch đới, dùng ngoài điều trị
chứng viêm đau nhƣ đòn ngã tổn thƣơng, gân cốt tê đau; toàn cây thì dùng trị
bệnh sởi; lá dùng trị bệnh lỵ, mụn nhọt sƣng lở; và một số tác dụng khác [7].
Trên thế giới nghiên cứu về tác dụng của Nho rừng rất ít, và ở Việt Nam hiện
chƣa có nghiên cứu nào về tác dụng của loài này.
Vì vậy, để góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về cây Nho rừng, sử dụng cây
này làm thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng giảm đau,

1


chống viêm của cắn dịch chiết ethyl acetat Nho rừng (Vitis heyneana Roem.
& Schult., họ Nho Vitaceae) thực nghiệm”. Với hai mục tiêu nhƣ sau:
1. Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm của cắn dịch chiết ethyl acetat
Nho rừng trên thực nghiệm.
2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym cyclooxygenase in vitro của cắn dịch
chiết ethyl acetat Nho rừng.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1. Tổng quan về đau
Theo Hiệp Hội Quốc Tế Nghiên Cứu Về Đau (International Association for
the Study of pain – IASP), đau là một trải nghiệm khó chịu về cảm giác và cảm

xúc đi kèm với tổn thƣơng mô thực sự hoặc tiềm tàng, hoặc đƣợc mô tả trong
thuật ngữ của những tổn thƣơng đó [58].
1.1. Vài nét về sinh lý đau
Tất cả các kích thích đều có thể gây đau (cơ học, hóa học, điện học, nóng,
lạnh,...) nếu cƣờng độ kích thích lên quá một ngƣỡng nhất định. Cảm giác đau từ
ngoại biên (da, cơ, mô, tạng phủ,...) sẽ đƣợc truyền lên não. Hiện nay, ngƣời ta
cho rằng có 3 nơi phối hợp để tiếp nhận cảm giác đau là tủy sống, đồi thị và vỏ
não. Đƣờng dẫn truyền cảm giác đau đƣợc mô tả nhƣ sau:
- Dẫn truyền cảm giác đau từ ngoại vi vào tủy sống
Xung động đau từ ngoại biên đƣợc đƣa đến rễ sau rồi vào sừng sau của tủy
sống do thân tế bào neuron thứ nhất (neuron hình T) nằm ở hạch gai rễ sau đảm
nhiệm. Các sợi thần kinh đảm nhận dẫn truyền cảm giác đau là sợi Aδ (có
myelin) và sợi C (không myelin), với tốc độ dẫn truyền khác nhau [3], [4].
- Dẫn truyền cảm giác đau từ tủy sống lên não
Từ tủy sống phát xuất một neuron thứ hai bắt chéo sang cột trắng trƣớc –
bên đối diện và lên não theo nhiều đƣờng: bó tủy sống - đồi thị, bó tủy sống –
cấu tạo lƣới tận cùng, ở hành não, cầu não, não giữa ở cả hai bên. Từ đồi thị,
một neuron thứ ba dẫn truyền luồng thần kinh lên vùng đỉnh của vỏ não tại trung
khu cảm giác đau [3], [4].
- Trung tâm nhận thức cảm giác đau
Đƣờng dẫn truyền cảm giác đau tận cùng ở cấu trúc lƣới của thân não,
trung tâm dƣới vỏ nhƣ nhân lá trong của đồi thị và vùng S-I, S-II, vùng đỉnh,
vùng trán của vỏ não. Cấu trúc lƣới và trung tâm dƣới vỏ vừa có chức năng nhận
thức đau vừa tạo ra các đáp ứng về tâm lý khi đau. Vỏ não có cấu trúc phân tích
cảm giác đau tinh vi, phân biệt vị trí, đánh giá mức độ đau [3], [4].
3


1.2. Thuốc giảm đau
Thuốc giảm đau có tác dụng làm giảm hoặc mất cảm giác đau mà không

tác dụng lên nguyên nhân gây đau, không làm mất cảm giác khác và không làm
mất ý thức [1].
Thuốc giảm đau có thể đƣợc chia làm 3 loại: thuốc giảm đau trung ƣơng,
thuốc giảm đau ngoại vi, và thuốc giảm đau hỗ trợ [8].
Căn cứ vào con đƣờng dẫn truyền cảm giác đau từ receptor ngoại biên đến
vỏ não, các thuốc giảm đau hiện nay có thể tác động vào các khâu khác nhau để
cắt đứt dẫn truyền làm mất đau nhƣ hình 1.1:
Thuốc
giảm đau
trung ƣơng
Vỏ não

Thuốc mê

Chất xám
quanh não thất.
Hệ thống lƣới

Đồi thị
Thuốc giảm đau
trung ƣơng

Hành tủy

Sừng sau tủy sống

Sợi cảm giác

Thuốc tê

Receptor nhận cảm giác đau

NSAIDs

đau

Hình 1.1. Sơ đồ đường dẫn truyền cảm giác đau và vị trí tác dụng chính của
thuốc giảm đau.
 Thuốc giảm đau trung ương
* Cơ chế:

4


Các opioid gắn vào các receptor opioid (µ, k, ) làm kích thích các receptor
này. Tất cả các receptor của opioid đều cặp đôi với protein G i. Khi kích thích
các receptor của opioid, gây ức chế adenylcyclase, ức chế mở kênh Ca2+ và hoạt
hóa kênh K+ (tăng ƣu cực). Vì vậy, ức chế giải phóng các chất dẫn truyền thần
kinh (chất P, acid glutamic) và ngăn cản dẫn truyền xung động thần kinh.
* Nhóm thuốc này gồm:
- Thuốc chủ vận trên receptor opioid:
+ Các opioid tự nhiên: morphin, codein…
+ Các opioid tổng hợp: pethidin, methadon…
- Thuốc chủ vận – đối kháng hỗn hợp và chủ vận từng phần trên receptor
opioid: pentazocin, nalorphin, nalbuphil, butorphanol,….
- Thuốc đối kháng đơn thuần trên receptor opioid: naloxon, naltrexon [1].
 Thuốc giảm đau ngoại vi
Các thuốc nhóm này chỉ có tác dụng với các chứng đau nhẹ, đau khu trú,
tác dụng tốt với các chứng đau do viêm (đau khớp, viêm cơ, viêm dây thần kinh,
đau răng…)

* Cơ chế
Thuốc làm giảm tổng hợp prostaglandin F2, làm giảm tính cảm thụ của
ngọn dây thần kinh cảm thụ với các chất gây đau của phản ứng viêm nhƣ
bradykinin, serotonin….[2].
*Các

thuốc

nhóm

này:

paracetamol,

ibuprofen,

indomethacin,

diclofenac,…[2], [8], [20].
2. Tổng quan về viêm
2.1. Khái niệm và nguyên nhân gây viêm
Viêm là phản ứng tại chỗ của cơ thể do .các mô bị kích thích hoặc tổn
thƣơng. Đó là một phản ứng phức tạp của các mô liên kết và của tuần hoàn mao
mạch ở nơi bị tác động, đƣợc thể hiện bằng các triệu chứng sƣng, nóng, đỏ, đau
và rối loạn chức phận [11].
5


Viêm là một phản ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch trƣớc sự tấn công
của tác nhân bên ngoài: vi khuẩn, yếu tố cơ học, vật lý, hóa học, sinh học; hoặc

của tác nhân bên trong: hoại tử do thiếu máu cục bộ, viêm tắc động mạch, bệnh
tự miễn, hay do sản phẩm chuyển hóa nhƣ acid uric tăng, lắng đọng gây viêm
khớp trong bệnh gout, ure huyết tăng gây viêm màng phổi, màng tim…[10].
Phản ứng viêm là điều cần thiết cho sự sống còn khi đối mặt với các tác nhân
gây bệnh; trong một số tình huống và bệnh tật, phản ứng viêm có thể không có
lợi ích rõ ràng mà thậm chí còn gây hậu quả nghiêm trọng đối với cơ thể.
Quá trình viêm thƣờng đƣợc chia làm ba giai đoạn chính: giai đoạn rối loạn
tuần hoàn gồm rối loạn vận mạch, tạo dịch rỉ viêm, bạch cầu xuyên mạch và
hiện tƣợng thực bào; giai đoạn rối loạn chuyển hóa (glucid, protid, lipid) và tổn
thƣơng tổ chức; giai đoạn tăng sinh tế bào để hàn gắn, sửa chữa tổ chức viêm
[10].
Ngay ở giai đoạn đầu sau khi yếu tố gây viêm tác động, nhiều loại tế bào
đƣợc hoạt hóa, tập trung đến ổ viêm nhƣ đại thực bào, bạch cầu đa nhân, bạch
cầu đơn nhân, tế bào lympho, dƣỡng bào, tiểu cầu tế bào nội mạc... giải phóng ra
nhiều chất hóa học có hoạt tính sinh học cao, gọi là các chất trung gian hóa học
của viêm nhƣ prostaglandin, leucotrien, histamin, serotonin... Các chất trung
gian hóa học này lại hoạt hóa các tế bào khác làm giải phóng các enzym tiêu
protein (các proteinase), các interleukin 1, 2, 3, TNF, các superoxyd, các ion
hydroxyl, hydroperoxyd... Những chất này lại tiếp tục gây tổn thƣơng mô, khép
kín “vòng luẩn quẩn” của viêm mạn tính [8].
2.2. Vai trò của cyclooxygenase (COX), lypooxygenase (LOX) và các chất
trung gian hóa học trong đáp ứng viêm
 Enzym cyclooxygenase (COX) còn đƣợc gọi là prostaglandin H/G
synthase có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp các prostanoid. Các
phospholipid ở màng tế bào bị thủy phân bởi phospholipase A2 tạo ra acid
arachidonic. Enzym COX sẽ xúc tác cho quá trình tạo ra các prostanoid từ acid
arachidonic. Prostanoid là thuật ngữ chung dùng để chỉ các phân tử bao gồm:
prostaglandin (PG), các prostacyclin (PGI) và thromboxan (Tx) [32].
6

Hai đồng phân của COX đã đƣợc xác định là COX-1 và COX-2 [8], [30],
[32].
- COX-1 hay PGG/H synthetase-1 có tác dụng duy trì các hoạt động sinh lý
bình thƣờng của tế bào, là một "enzym cấu tạo". Enzym có mặt ở hầu hết các
mô: thận, dạ dày, nội mạc mạch, tiểu cầu, tử cung, tinh hoàn ... Tham gia trong
quá trình sản xuất các PG có tác dụng điều hoà các chức phận sinh lý, ổn định
nội môi, bảo vệ tế bào, do đó còn gọi là "enzym giữ nhà'' ("house keeping
enzyme"): Thromboxan A2 của tiểu cầu, Prostacyclin (PGI2) trong nội mạc
mạch, niêm mạc dạ dày, Prostaglandin E2 tại dạ dày bảo vệ niêm mạc,
Prostaglandin E2 tại thận đảm bảo chức năng sinh lý.
- COX-2 hay PGG/H synthetase-2 có chức phận thúc đẩy quá trình viêm.
COX-2 có ở các tế bào tham gia vào phản ứng viêm nhƣ bạch cầu đơn nhân, đại
thực bào, bao hoạt dịch khớp, tế bào sụn, và ở hầu hết các mô với nồng độ rất
thấp trong trạng thái bình thƣờng. Trong các mô viêm, nồng độ COX-2 có thể
tăng cao tới 80 lần so với nồng độ COX-2 ở trạng thái không viêm. Các kích
thích viêm gây cảm ứng và hoạt hóa mạnh COX-2, vì vậy COX-2 còn đƣợc gọi
là "enzym cảm ứng”.
Các prostanoid có dạng “số 2” (ví dụ PGE2) đƣợc hình thành từ acid
arachidonic (hình 1.2), “số 2” này chỉ số liên kết đôi trong cấu trúc phân tử.
Enzym cyclooxygenase (COX) xúc tác cho phản ứng bis-oxy hóa, trong đó hai
phân tử O2 đƣợc đƣa vào khung carbon của acid arachidonic để tạo thành PGG2.
Peroxidase (POX) xúc tác cho phản ứng khử nhóm 15- hydroperoxyl của PGG2
để cho sản phẩm là PGH2 và nƣớc. PGH2 không đƣợc tích tụ trong tế bào mà
đƣợc biến đổi nhanh chóng thành những chất khác gây đáp ứng sinh học nhƣ:
PGD2, PGE2, PGF2α, PGI2 và TxA2. Ngoại trừ PGF2α đƣợc tạo ra sau phản ứng
khử hai electron của PGH2, còn các chất khác đƣợc tạo ra dƣới xúc tác của các
enzym không oxy hóa để sắp xếp lại cấu trúc phân tử.
Các prostanoid cuối cùng gắn đặc hiệu với một hoặc một số receptor liên
kết với protein G, một số prostanoid khác lại thể hiện tác dụng qua receptor ở

nhân. Thông thƣờng mỗi loại tế bào thƣờng có một hoặc hai sản phẩm
prostanoid chủ yếu. Ví dụ, ở tiểu cầu chủ yếu có thromboxan. Một số PG có tác
7


dụng gây viêm và gây đau, đặc biệt là PGE2 đƣợc giải phóng do kích thích cơ
học, hóa học, nhiệt, vi khuẩn có tác dụng làm giãn mạch, tăng tính thấm thành
mạch gây viêm và đau. PGF1 gây đau xuất hiện chậm nhƣng kéo dài. PGI1 gây
đau xuất hiện nhanh nhƣng nhanh hết. PG còn làm tăng tính nhạy cảm của các
receptor với các chất gây đau nhƣ bradykinin [32].

Hình 1.2. Phản ứng chuyển hóa của acid arachidonic dưới sự xúc tác của
enzym COX
 Enzym lypoxygenase (LOX) có vai trò xúc tác cho phản ứng tạo thành
leucotrien từ acid arachidonic (hình 1.3). Leucotrien hoạt động nhƣ một chất hóa
ứng động tế bào, lôi kéo các tế bào của hệ thống miễn dịch đến ổ viêm. Các
enzym LOX phổ biến nhất là 5, 12 và 15-LOX. Khi acid arachidonic đƣợc
chuyển hóa bởi 12-LOX và 15-LOX cho các lipoxin là những chất có tác dụng
chống viêm bằng cách: tổng hợp các chalon (là phân tử tín hiệu dừng quá trình
viêm), ức chế các receptor của leucotrien, giảm hoạt hóa tế bào bạch cầu đơn
nhân. Ở ngƣời, 5-LOX có mặt trong các tế bào có nguồn gốc dòng tủy đặc biệt
là bạch cầu. 5-LOX xúc tác cho phản ứng chuyển đổi acid arachidonic thành
acid 5S-hydroperoxyeicosatetraenoic (5-HpETE), sau đó 5- HpETE đƣợc
8


chuyển hóa thành LTA4. LTA4 đƣợc chuyển hóa thành LTB4 và LTC4 dƣới xúc
tác của LTA4 hydrolase và LTC4 synthase tƣơng ứng, sau đó thành các cysteinyl
leucotrien. Các sản phẩm đƣợc chuyển hóa bởi 5-LOX gây hóa ứng động bạch
cầu, kích hoạt bạch cầu hạt, tế bào T, tăng tổng hợp IgG, gây co thắt phế quản,

co thắt tế bào cơ trơn và có liên quan đến quá trình viêm nhiều bệnh lý nhƣ ung
thƣ, đái tháo đƣờng, béo phì [32].

Hình 1.3. Phản ứng chuyển hóa của acid arachidonic dưới sự xúc tác của
enzym LOX
 Các chất trung gian hóa học trong viêm
* Prostaglandin (PG)
Trong viêm cấp, các mô và mạch máu sản xuất ra PGE2 và PGI2, tế bào
mast giải phóng ra PGD2. Trong viêm mạn các bạch cầu đơn nhân và đại thực
bào giải phóng ra PGE2 và thromboxan A2. Các chất PGE2, PGI2, PGD2 làm
tăng tính thấm thành mạch gián tiếp thông qua histamin và bradykinin. Tuy
nhiên, bên cạnh chức năng trung gian hóa học trong viêm, một số PG còn đóng
vai trò chống viêm đáng kể do làm giảm hoạt tính của các tế bào viêm, ví dụ
PGE2 làm giảm giải phóng các enzym của lysosom và các chất chuyển hóa gây
độc từ bạch cầu trung tính, làm giảm giải phóng histamin từ tế bào mast [32].
9


* Leucotrien
Leucotrien B4 lôi kéo bạch cầu tới lớp nội mạc của các mạch máu bị tổn
thƣơng, nó cũng hoạt động nhƣ một chất hóa ứng động thực bào. LTC4 và LTD4
gây co thắt phế quản mạnh và đã đƣợc tìm thấy trong các trƣờng hợp dị ứng.
LTC4, LTD4 và LTE4 là những chất gây phản ứng chậm của phản ứng sốc phản
vệ đƣợc tiết ra trong trƣờng hợp dị ứng (hen suyễn, sốc phản vệ) [6].
* Histamin
Histamin đƣợc hình thành và dự trữ sẵn trong các hạt và đƣợc giải phóng
do sự vỡ hạt của các dƣỡng bào khi đáp ứng với các kích thích nhƣ: tổn thƣơng
vật lý, phản ứng miễn dịch làm gắn các kháng thể với dƣỡng bào. Histamin gây
giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch với các tiểu tĩnh mạch
[6], [32].

* Serotonin
Serotonin có tác dụng tƣơng tự nhƣ histamin. Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu
(PAF) PAF hoạt động trên các receptor đặc hiệu của nó và có khả năng gây ra
nhiều hiện tƣợng trong viêm. PAF hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính, kích
thích sự xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng các men của tiêu thể, gây hoạt
hóa và kết dính tiểu cầu [6], [33].
* Các cytokin
Cytokin là những chất do các tế bào sau khi hoạt hóa tiết ra, có nhiều hoạt
tính sinh học khác nhau. Đối với viêm các cytokine có tác dụng: thu hút bạch
cầu đến ổ viêm, tăng sinh và hoạt hóa một số loại tế bào, gây sốt, giúp bạch cầu
bám dính và thực bào, tăng tính thấm thành mạch. TNF (yếu tố gây hoại tử u),
IL-1, IL-6 tham gia phát triển phản ứng viêm tại chỗ hoặc hệ thống. Tại chỗ,
chúng gây hoạt hóa nội mô, gây sốt, làm tăng lƣợng bạch cầu đa nhân trung tính,
tăng nguyên bào sợi và kích thích tổng hợp collagen. IL-8 là một tác nhân gây
hóa ứng động và hoạt hóa mạnh đối với bạch cầu đa nhân trung tính, đồng thời
IL-8 còn là chất cảm ứng mạnh đối với các cytokin khác, chủ yếu là TNF và IL1 [6], [30].
* Hệ thống bổ thể
10


Hệ thống bổ thể có các thành phần C3a và C5a làm tăng tính thấm thành
mạch, tăng tiết dịch, thu hút bạch cầu. C5a hoạt hóa con đƣờng chuyển hóa
LOX của acid arachidonic ở các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đơn
nhân, gây giải phóng các chất trung gian hóa học của quá trình viêm, C5a còn là
tác nhân gây hóa ứng động mạnh bạch cầu [6].
* Bradykinin: Bradikinin gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch. Hệ
thống đông máu và tiểu tơ huyết. Hệ thống đông máu là một loạt những protein
huyết tƣơng có thể bị hoạt hóa bởi yếu tố Hageman. Bƣớc cuối cùng là sự
chuyển fibrinogen thành fibrin. Trong quá trình biến đổi này, các fibrinopeptid
đƣợc hình thành, nó gây tăng tính thấm mao mạch và nó có hoạt tính hóa ứng

động đối với bạch cầu [6], [32].
* Oxyd nitơ: NO do đại thực bào sản xuất, có tác dụng làm giãn mạch, tăng
tính thấm thành mạch, tăng sản xuất các PG gây viêm. Tuy nhiên nếu đại thực
bào bị hoạt hóa sản xuất quá nhiều NO sẽ gây giãn mạch quá mức, gây sốc
nhiễm khuẩn [6].
2.3. Thuốc chống viêm
 Thuốc chống viêm steroid (Glucocorticoid)
Gồm các thuốc nhƣ hydrocortisone, prednisolon, methylprednisolon,
dexamethasone, bethamethasone...
Các thuốc này ức chế phospholipase A2, do kích thích sự tổng hợp
lipocortin, làm giảm tổng hợp và giải phóng leucotrien và prostaglandin (là
những chất trung gian hóa học tham gia vào phản ứng viêm), nên có tác dụng
chống viêm [8].
Ở giai đoạn sớm của viêm, GC ức chế các yếu tố hóa ứng động và các
cytokin thúc đẩy viêm nhƣ IL-1, IL-6, IL-8, TNF α (yếu tố hoại tử u α), do đó
làm giảm luồng đại thực bào và bạch cầu hạt kéo đến ổ viêm. Hơn nữa, GC còn
làm giảm tiết các chất vận mạch nhƣ serotonin, histamin và do đó đối kháng với
sự tăng tính thấm thành mạch [8], [32].

11


GC tác dụng ngay cả ở giai đoạn đang viêm: ức chế mạnh nitric oxyd
synthetase, làm giảm sản xuất gốc tự do NO • trong đại thực bào. Thuốc còn ức
chế sản xuất các protease trung tính nhƣ collagenase, elastase [8], [32].
 Thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs)
Gồm các thuốc: aspirin, indomethacin, ibuprofen, diclofenac, piroxicam,
meloxicam, celecoxib...[8], [20], [30], [35].
Cơ chế tác dụng chính của các thuốc NSAIDs là ức chế enzym
cyclooxygenase (COX), làm giảm tổng hợp các prostaglandin là các chất trung

gian hóa học có vai trò quan trọng trong việc làm tăng và kéo dài đáp ứng viêm
ở mô sau tổn thƣơng.
Khi tổn thƣơng, màng tế bào giải phóng phososospholipid màng. Dƣới tác
dụng của phospholipase A2 (là enzym bị corticoid ức chế), chất này chuyển
thành acid arachidonic. Sau đó, một mặt, dƣới tác dụng của lipooxygenase
(LOX), acid arachidonic tạo thành các leucotrien có tác dụng co khí quản; mặt
khác, dƣới tác dụng của cyclooxygenase, acid arachidonic tạo ra PGE 2 (gây
viêm, đau), prostacyclin (PGI2) và thromboxan A2 (TXA2) tác động đến sự lắng
đọng tiểu cầu. Các NSAIDs ức chế COX nên ức chế đƣợc các phản ứng viêm
[8]
Các nghiên cứu cho thấy có hai loại COX-1 và COX-2 có chức phận khác
nhau [8], [30], [32].
- COX-1 có mặt ở hầu hết các mô, thận, dạ dày, nội mạc mạch máu, tiểu
cầu, tử cung, tinh hoàn... có tác dụng duy trì các hoạt động sinh lý bình thƣờng
của tế bào. COX-1 tham gia quá trình sản xuất các PG có tác dụng điều hòa các
chức phận sinh lý, ổn định nội mô, bảo vệ tế bào nhƣ: Thromboxan A2 của tiểu
cầu; Prostacyclin trong nội mạc mạch, niêm mạc dạ dày; Prostaglandin E 2 tại dạ
dày bảo vệ niêm mạc; Prostaglandin E2 tại thận.
- COX-2 có mặt ở hầu hết các mô trong cơ thể, đảm nhận chức phận thúc
đẩy quá trình viêm. COX-2 tham gia quá trình sản xuất các PG gây viêm đau
nhƣ PGE2, PGF1α

12


Nhƣ vậy, thuốc ức chế COX-1 sẽ gây nhiều tác dụng không mong muốn,
thuốc ức chế chọn lọc COX-2 sẽ có tác dụng chống viêm mạnh mà ít gây tác
dụng không mong muốn hơn.
Các NSAIDs còn có tác dụng đối kháng hệ enzym phân hủy protein, ngăn
cản sự biến đổi protein, làm vững bền màng lyposom và đối kháng tác dụng của

các chất trung gian hóa học nhƣ: bradykinin, histamin, serotonin, ức chế hóa ứng
động bạch cầu, ức chế sự di chuyển của bạch cầu tới ổ viêm [2], [8].
3. Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu về tác dụng giảm đau, chống
viêm
3.1. Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau
Hiện nay, một số mô hình đƣợc dùng để nghiên cứu tác dụng giảm đau trên
thực nghiệm nhƣ:
 Thí nghiệm nhúng đuôi chuột trong nước nóng (Tail immersion test)
Đuôi chuột nhạy cảm với bất kỳ kích thích nào, nhúng đuôi chuột vào trong
cốc nƣớc nóng sẽ khiến cho chuột phản ứng bằng việc kéo đuôi lại.
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên chuột cống. Trƣớc khi làm thí nghiệm nhốt
chuột vào lồng 30 phút, nhúng phần đuôi dài 5cm vào cốc nƣớc sạch đƣợc duy
trì ở nhiệt độ 55ºC. Dùng đồng hồ để đo thời gian phản xạ giật mạnh đuôi của
chuột trƣớc và sau khi cho chuột dùng thuốc.
Thí nghiệm này hữu ích cho việc đánh giá tác dụng giảm đau trung ƣơng
của mẫu thử [56].
 Mô hình gây đau quặn trên chuột của Koster (Writhing test)
Đau gây ra do tiêm chất kích thích vào khoang phúc mạc của chuột. Động
vật phản ứng với một hành vi kéo dài đặc trƣng đƣợc gọi là quằn quại.
Thí nghiệm gây đau quặn là thí nghiệm thƣờng đƣợc dùng nhiều nhất để
khảo sát tác dụng của các thuốc giảm đau ngoại vi. Trong thí nghiệm gây đau
quặn của Koster và cộng sự (1959), chuột nhắt đƣợc tiêm màng bụng 0,1 ml
dung dịch acid acetic 1% trong nƣớc. Đặt chuột trong hộp thí nghiệm và quan

13


sát số cơn đau quặn trong vòng 35 phút. Biểu hiện cơn đau quặn là bụng kéo
căng và ít nhất một chân duỗi ra [12].
3.2. Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng chống viêm

3.2.1. Mô hình đánh giá tác dụng chống viêm cấp
 Thử nghiệm trên phù chân chuột gây bằng carrageenin
Tác nhân gây viêm carrageenin là một polysaccharid gần giống với cấu
trúc của vỏ vi khuẩn sẽ khởi động các quá trình viêm cấp, kích thích giải phóng
histamin, serotonin, prostaglandin … biểu hiện quan sát thấy chủ yếu là triệu
chứng phù.
Trong thử nghiệm này, gây phù bàn chân sau của chuột bằng cách tiêm
dƣới da ở bề mặt gan bàn chân sau của chuột 0,05 ml dung dịch carrageenin 1%.
Trong quá trình viêm gây bởi carrageenin, mức độ viêm tối đa ở trong khoảng
thời gian 3 – 4 giờ. Nên để đánh giá mức độ viêm, đo thể tích bàn chân tới khớp
cổ chân, trƣớc và 3 giờ sau khi tiêm carrageenin giữa các lô.
So sánh mức độ phù ở các lô để đánh giá tác dụng ức chế viêm của thuốc
[12].
 Thử nghiệm gây viêm màng bụng trên chuột cống trắng
Áp dụng phƣơng pháp của A.R.Weidbase & Rhirf Chelmann [26]. Tác
nhân carrageenin và formaldehyd gây viêm tạo ra dịch rỉ viêm bao gồm PG,
protease, lysosom … để đánh giá sự thoát dịch, sự di chuyển bạch cầu và các chỉ
số sinh hóa khác trong phản ứng viêm.
Chuột đƣợc uống thuốc hoặc dung môi trong 5 ngày liên tục trƣớc khi gây
viêm. Ngày thứ 5, sau khi uống thuốc 1 giờ, gây viêm màng bụng bằng dung
dịch carrageenin 0,05g pha với formaldehyd 1,4 ml, pha trong nƣớc muối sinh lý
0,9% vừa đủ 100ml. Tiêm vào khoang màng bụng với thể tích 2ml/chuột.
Sau 24 giờ gây viêm, mổ ổ bụng chuột hút dịch rỉ viêm. Đo thể tích và đếm
số lƣợng bạch cầu/ml dịch rỉ viêm, định lƣợng protein trong dịch rỉ viêm và so
sánh giữa các lô để đánh giá tác dụng ức chế viêm của thuốc.
 Thử nghiệm gây ban đỏ bởi tia tử ngoại ở chuột lang

14

Tác nhân gây viêm (tia tử ngoại) kích thích giải phóng prostaglandin,
leucotrien gây giãn mạch.
Dùng chuột lang trắng, cân nặng tối thiểu 300g. Cạo lông thật kỹ ở một bên
cột sống (xén lông rồi bôi nƣớc làm rụng lông), và 4 giờ sau chuột đã sẵn sàng
để thử nghiệm. Mỗi lô gồm 8 chuột lang đƣợc chiếu tia tử ngoại làm đối chứng,
chuột đƣợc giữ ở tƣ thế nằm sấp ở khoảng cách 30cm với một đèn tử ngoại công
suất 400W. Sự chiếu tia kéo dài 30 phút, 2 giờ sau ban đỏ ở mức tối đa và trông
rõ. Ngày hôm sau, những chuột lang đó đƣợc chiếu tia tử ngoại lần thứ hai ở bên
kia của cột sống, cho chuột uống thuốc. Mọi chế phẩm có hoạt tính phải ức chế
ít nhất 50% ban đỏ so với mức ban đỏ đối chứng, mỗi chuột lang là đối chứng
của bản thân nó, vì đã đƣợc làm thử nghiệm trắng ngày hôm trƣớc thử nghiệm
với thuốc (Levy và cộng sự, 1968).
Thử nghiệm bằng phƣơng pháp chiếu tia tử ngoại nghiêm ngặt hơn thử
nghiệm phù chân chuột, và không do kích thích tuyến thƣợng thận nên
corticosteroid thể hiện rõ tác dụng trên mô hình này.
Trong thử nghiệm gây ban đỏ, đánh giá mức độ viêm bằng cách đo diện
tích ban đỏ [12],[56].
3.2.2. Mô hình đánh giá tác dụng chống viêm mạn
 Thử nghiệm trên u hạt thực nghiệm gây bằng bông ( Meier và cộng sự
(1950)) [56]
Cấy vật lạ (bông cotton) không hấp thu vào cơ thể, cơ thể sẽ phản ứng bằng
cách tập trung nhiều loại tế bào tạo mô bào lƣới và nguyên bào sợi bao quanh
vật lạ, tạo thành một khối u hạt thực nghiệm tƣơng tự với tiến triển của viêm
mạn tính.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên chuột cống trắng. Bông cotton đƣợc vê
tròn, cân và sấy tiệt khuẩn. Cấy miếng bông đó vào dƣới da lƣng của chuột theo
chiều hƣớng lên đầu. Cho chuột dùng thuốc liên tục trong một thời gian từ 5 – 7
ngày. Mổ chuột bóc tách u hạt đem cân tƣơi ngay từng u hạt, sau đó sấy khô tới
khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng khô.

15


Đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc bằng cách so sánh mức độ giảm
khối lƣợng u hạt giữa lô chuột dùng mẫu thử và lô chuột chứng [56].
4. Tổng quan về dƣợc liệu nghiên cứu
4.1. Đặc điểm thực vật của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.)
Cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. & Schult.) còn có tên đồng nghĩa: V.
ficifolia var. pentagona PAMP; V. heyneana subsp. heyneana; V. kelungensis
Momiy; V. lanata Roxb; V. pentagona Diel & Gilg; V. pentagona var.
honanensis Rehder; V. quinquangularis Rehder; V. thunbergii var. yunnanensis
Planch. ex Franch [59].
Tên địa phƣơng: nho lông, nho năm góc, nho ngũ giác, nho tía [5].
Cây nhỡ leo; cành cây màu đỏ, phủ lông nhện tựa bông, lông màu xám
hoặc nâu, tua chia làm đôi đối diện với lá [5],[51]. Cành cây hình trụ với đƣờng
cong chạy dọc, có lông màu xám hoặc nâu, tua chia làm đôi [51]. Lá đơn; lá
kèm màu nâu hình trứng hay hình mác dài 3-5mm, rộng 2-3mm, đỉnh nhọn hiếm
khi tù; cuống lá dài 2,5-6 cm với lớp lông tơ dày đặc; phiến lá thỉnh thoảng chia
3 thùy dài 4-12 cm, rộng 3-8 cm, lớp lông tơ xám hoặc nâu thƣa dần, lông gân lá
xa trục đôi khi có lông, gần trục với lớp lông tơ thƣa thớt khi còn non sau đó thì
không có lông, gân xa trục thì nhẵn đôi khi có vài lông tơ, gân chính có từ 3-5,
gân bên có 4-6 cặp, hình tim đến gần hình tim, khe tù hiếm khi sắc nhọn, mép từ
9-19 răng cƣa mỗi bên, sắc nhọn. Cụm lá đối dài 4-14 cm, phân nhánh phát
triển; cuống dài 1-2 cm với lông màu xám hoặc nâu. Cuống nhỏ 1-3 mm, nhẵn.
Nụ hình trứng hoặc elip, 1,5-2 cm, đỉnh tròn [51]. Đài hoa 0,1mm. Chỉ nhị hình
sợi, 1-1,2 mm, bao phấn màu vàng hình elip; nhụy hoa bầu dục, ngắn. Quả
mọng, màu tím đen khi chín, hình cầu đƣờng kính 1-1,3 cm [51]. Hạt 2-4 [5],
hình trứng, đỉnh tròn, rốn ở giữa có lỗ hƣớng lên [51].
Sinh thái: trong rừng, cây bụi, sƣờn đồi, thung lũng [51], ra hoa tháng 5-6,
có quả tháng 10-11 [5].

16


Phân bố: Lạng Sơn, Ninh Bình vào Bình Thuận; còn có ở Trung Quốc,
Lào, Campuchia [5].

Hình 1.4. Đặc điểm hình thái của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem.&
Schult.) [9].
Chú thích: a. Cành mang lá, cụm quả; b. Thân già; c. Thân non; d. Tua
cuốn; e. Lá; f. Gốc lá; g. Ngọn lá; h. Cụm quả; i. Quả; j. Quả cắt ngang; k. Hạt
(mặt bụng); l. Hạt (mặt lƣng); m. Hạt cắt ngang; n. Hạt cắt dọc
4.2. Thành phần hóa học chính của cây Nho rừng (Vitis heyneana Roem. &
Schult.)
Hiện nay có rất ít nghiên cứu về cây nho rừng (Vitis heyneana), một số hợp
chất đã đƣợc phân lập từ cây này thuộc nhóm stilbenoid, acid phenolic, terpen
[25], [35], [36].
 Nhóm stilbenoid
Cho đến nay, ngƣời ta đã phân lập đƣợc 7 stilbenoid trong đó có 3
monostilben (Vitisinols A; Piceid; Hopeaphenol) [36] và 4 oligostilben gồm một
tetrastilben (heneanol A), một tristilben (ampelopsin C) và hai distilben
(amelopsin A; (+)-ε-viniferin) [35].
17