Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano dihydroartemisinin PLGA bao acid folic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM HỮU PHONG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN
NANO DIHYDROARTEMISININ-PLGA
BAO ACID FOLIC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM HỮU PHONG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN
NANO DIHYDROARTEMISININ-PLGA
BAO ACID FOLIC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 8720202

Người hướng dẫn khoa học : TS. Nguyễn Thị Hường
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến

HÀ NỘI 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đối với:
Cô TS. Nguyễn Thị Hường
Và thầy: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
Những thầy cô giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết đã định hướng, giúp đỡ tôi thực
hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS.Trần Ngọc Bảo và các thầy cô, các anh chị kỹ
thuật viên thuộc viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, Bộ môn Công nghiệp Dược,
Bộ môn Bào chế đã tạo điều kiện về thiết bị, máy móc, hóa chất, giúp đỡ tôi hoàn
thành luận văn.
Tôi xin phép cảm ơn Ban giám Hiệu nhà trường, phòng Đào tạo và các Phòng ban
khác, các thầy cô và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo, tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học tại trường.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình tôi, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua
Hà nội, ngày 30 tháng 3 năm 2018

Phạm Hữu Phong


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về dihydroartemisinin ......................................................................... 2
1.1.1. Tính chất lý, hóa ............................................................................................ 2
1.1.2. Tác dụng dược lý ........................................................................................... 2
1.1.3. Dược động học .............................................................................................. 3
1.1.4. Độc tính của DHA ......................................................................................... 3
1.1.5. Định lượng DHA ............................................................................................ 4
1.2. Tổng quan về nano polyme................................................................................... 6
1.2.1. Đặc điểm......................................................................................................... 6
1.2.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme .................................... 6
1.2.3. Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch ................................ 9
1.2.4. Một số phương pháp để thu được tiểu phân nano polyme ........................... 10
1.2.5. Một số chế phẩm chứa tiểu phân nano trên thị trường ................................. 11
1.2.6. Vài nét về chất mang PLGA ........................................................................ 12
1.2.7. Vài nét về FA, thụ thể của FA ...................................................................... 14
1.2.8. Vài nét về Chitosan ...................................................................................... 15
1.3. Các phương pháp xác định độc tính tế bào và một số các dòng tế bào ung thư
hay được sử dụng để thử in vitro của DHA ............................................................... 16
1.3.1. Các phương pháp xác định độc tính tế bào .................................................. 16
1.3.2. Một số các dòng tế bào ung thư hay được sử dụng để thử in vitro của DHA ..
..................................................................................................................... 17
1.4. Một số nghiên cứu liên quan ............................................................................. 18
1.4.1. Một số nghiên cứu về nano DHA ................................................................. 18
1.4.2. Một số nghiên cứu về nano bao acid folic hướng đích ............................... 19
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 22


2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị...................................................................................... 22

2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................ 22
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu....................................................................................... 22
2.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................... 23
2.2.1. Xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA ..................... 23
2.2.2. Xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA-CS-FA ........ 23
2.2.3. Thử tác dụng ức chế ung thư in vitro của hệ tiểu phân nano bào chế được
trên 2 dòng tế bào ung thư KB, HL-60................................................................... 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 24
2.3.1. Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA ................................ 24
2.3.2. Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA ............. 24
2.3.3. Đánh giá một số đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân nano DHA ..................... 25
2.3.4. Thử tác dụng ức chế ung thư in vitro của hệ tiểu phân nano DHA trên 2
dòng tế bào ung thư ................................................................................................ 27
2.4. Phương pháp thiết kế thí nghiệm và xử lý số liệu .............................................. 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 30
3.1. Khảo sát phương pháp định lượng DHA ............................................................ 30
3.1.1. Độ tuyến tính ................................................................................................ 30
3.1.2. Độ ổn định hệ thống ..................................................................................... 30
3.2. Kết quả xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA ............... 31
3.2.1. Ảnh hưởng của các yếu tố công thức ........................................................... 32
3.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố quy trình ............................................................ 35
3.3. Kết quả xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA38
3.3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ CS-FA/ PLGA tới đặc tính của hệ tiểu phân nano ..... 38
3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ FA/CS tới đặc tính của hệ tiểu phân nano .................. 39
3.3.3. Xác định sự có mặt của FA trong hệ tiểu phân nano DHA bao CS-FA ...... 40
3.4. Kết quả đánh giá hình thái, cấu trúc của tiểu phân nano .................................... 45
3.5. Kết quả sơ bộ thử tác dụng ức chế ung thư in vitro của hệ tiểu phân nano DHA
bào chế được trên 2 dòng tế bào ung thư KB, HL-60 ............................................... 47
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................................ 49

4.1. Về phương pháp định lượng ............................................................................... 49
4.2. Về phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi có đồng nhất bằng máy siêu âm đầu
dò
......................................................................................................................... 49
4.3. Về các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 50
4.3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố công thức ........................................................... 50
4.3.2. Ảnh hưởng thông số trong quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ................. 51
4.4. Các phương pháp gắn FA lên tiểu phân nano và kết quả bào chế hệ tiểu phân
nano DHA-PLGA bao FA ......................................................................................... 53
4.4.1. Các phương pháp gắn FA lên tiểu phân nano .................................................. 53
4.4.2. Kết quả bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA ......................... 54
4.5. Về kết quả xác định sự có mặt của FA trên tiểu phân nano DHA-PLGA bao CSFA. ......................................................................................................................... 55
4.6. Về kết quả sơ bộ thử tác dụng ức chế ung thư in vitro của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA bao CS- FA trên 2 dòng tế bào ung thư KB, HL-60 ............................ 57
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN:

Acetonitril

CS:

Chitosan

DCC:

Dicyclohexyl carbodimid

DCM:

Dicloromethan

DHA:

Dihydroartemisinin

DL:

Tỷ lệ nạp thuốc (Drug loading)

DMSO:

Dimethyl sulfoxid

EE:

Hiệu suất mang thuốc (Encapsulation efficiency)

FA:

Acid folic

FDA:

Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm (Food and Drug Administration)

FR:

Thụ thể folat (folat receptor)

HL-60:

Ung thư tế bào bạch cầu cấp ở người (human acute leukemia)

KB:

Ung thư biểu mô miệng ở người (human carcinoma in the mouth)

KTTP:

Kích thước tiểu phân

NHS:

N-hydroxysuccinimid

PDI:

Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

PEG:

Poly ethylen glycol

PLGA:

Poly (acid lactic-co-glycolic)

RSD:

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

SRB:

Sulforhodamin B

TBUT:

Tế bào ung thư

TCA:

Acid tricloracetic

TEM:

Kính hiển vi điện tử truyền qua ( Transmission electron microscopy)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số các nghiên cứu định lượng DHA

5

Bảng 1.2. Một số chế phẩm chứa tiểu phân nano lưu hành trên thị trường

12

Bảng 1.3. Một số dòng tế bào ung thư hay được sử dụng để thử in vitro của DHA

17

Bảng 2.1. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng để bào chế hệ tiểu phân nano DHA

22

Bảng 3.1. Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA

30

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống

31

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thể tích pha ngoại tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA

32

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA/dược chất tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA

33

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA

34

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của năng lượng siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA

36

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA

37

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ CS-FA so với PLGA tới đặc tính của hệ nano
DHA-PLGA bao CS-FA

38

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ FA/CS tới đặc tính của hệ nano DHA-PLGA bao
CS-FA

39

Bảng 3.10. EE, LC của một số công thức tốt nhất

47

Bảng 3.11. Kết quả sơ bộ thử tác dụng dược lý

47


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Dihydroartemisinin

2

Hình 1.2. Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang

6

Hình 1.3. Kỹ thuật nhũ hóa và bốc hơi dung môi

7

Hình 1.4. Kỹ thuật nhũ hóa và khuếch tán dung môi

8

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA

13

Hình 1.6. Công thức cấu tạo của Acid folic

14

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của Chitin và Chitosan

15

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ DHA

30

Hình 3.2. Đồ thị ảnh hưởng của thể tích pha ngoại tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA

32

Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA/Dược chất tới đặc tính của hệ nano
DHA-PLGA

33

Hình 3.4. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt tới đặc tính của hệ tiểu phân
nano DHA-PLGA

35

Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của năng lượng siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA

36

Hình 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân nano
DHA-PLGA

37

Hình 3.7. Đồ thị ảnh hưởng của tỷ lệ CS-FA so với PLGA tới đặc tính của hệ nano
DHA-PLGA bao CS-FA

38

Hình 3.8. Đồ thị ảnh hưởng của tỷ lệ FA/CS tới đặc tính của hệ tiểu phân nano DHA
bao CS-FA

40

Hình 3.9. Phổ hấp thụ UV của nano DHA-PLGA bao CS-FA

41

Hình 3.10. Phổ FT-IR của nano DHA-PLGA bao CS-FA, DHA, PLGA, CS, FA

42

Hình 3.11. Phổ XRD của nano DHA-PLGA bao CS-FA, nano DHA-PLGA bao CS,
DHA nguyên liệu, CS nguyên liệu, FA nguyên liệu, PLGA nguyên liệu

44

Hình 3.12. Hình ảnh chụp TEM của nano DHA-PLGA ở tỷ lệ 100 nm

45

Hình 3.13. Hình ảnh chụp TEM của nano DHA-PLGA bao CS-FA ở tỷ lệ 200 nm 46

Hình 3.14. Hình ảnh chụp TEM của nano DHA bao CS-FA ở tỷ lệ 500 nm

46


Hình 4.1.Hình ảnh mô tả mức tăng năng lượng/cm2 khi tăng năng lượng siêu âm khi
để ở một khoảng cách xác định

52

Hình 4.2. Năng lượng nhận được trên một đơn vị cm2 khi tác động với cường độ
500W với tần số siêu âm 23 kHz

52


ĐẶT VẤN ĐỀ
Dihydroartemisinin (DHA) là dẫn chất của Artemisinin đã được sử dụng
rộng rãi từ rất lâu trong điều trị sốt rét do có hiệu lực điều trị cao. Trong những năm
gần đây, có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng DHA còn có khả năng tiêu diệt
và ức chế hiệu quả sự phát triển của tế bào ung thư.
Nano polyme là dạng bào chế lý tưởng do có nhiều ưu điểm như tăng thời
gian lưu thuốc trong hệ tuần hoàn, cải thiện sinh khả dụng của dược chất. Các
polyme hay được sử dụng để bào chế nano như poly (acid lactic-co-glycolic), poly
acid lactic, poly acid glycolic …nhờ tính tương thích sinh học cao, khả năng phân
hủy sinh học và tính an toàn đã được FDA chấp thuận.
Nano DHA đã được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu
trong những năm gần đây, tuy nhiên nano DHA bao FA thì cho đến hiện nay chưa
có công trình nghiên cứu nào công bố.
Nhằm bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao FA với mục đích tăng

cường tính hướng đích và sơ bộ thử tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro của hệ
tiểu phân nano bào chế được.
Đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano dihydroartemisininPLGA bao Acid folic” đã được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng được công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CSFA.
2. Sơ bộ đánh giá được tác dụng ức chế ung thư in vitro trên 2 dòng tế bào ung
thư KB, HL-60 của hệ tiểu phân nano bào chế được.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về dihydroartemisinin
1.1.1. Tính chất lý, hóa

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của dihydroartemisinin
Công thức phân tử của DHA: C15H24O5
Tên khoa học (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-Decahydro-3,6,9-trimetyl3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3,-j]-1,2-benzodioxepin-10-ol
Khối lượng phân tử của DHA: 284,35 g/mol
DHA là chất chuyển hóa chính có hoạt tính của các dẫn xuất artemisinin,
DHA là những tinh thể hình kim màu trắng, vị đắng, không mùi, rất ít tan trong
nước và trong dầu. DHA tan tốt trong ethanol 96%, tan được trong các dung môi
ether, cloroform.
Trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh, DHA bị thủy phân mạnh
nhưng bền vững trong môi trường trung tính, ngoài ra DHA cũng không bền với
nhiệt.
Năng suất quay cực [α] = 140-146 (C =1,0026 trong cloroform). C12 là một
cacbon bất đối tạo ra 2 đồng phân quang học α và β. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia
X, người ta chứng minh được DHA tồn tại chủ yếu dạng α, nhưng trong dạng dung
dịch thì tồn tại cả 2 dạng.
Nhiệt độ nóng chảy : 145 – 150C [5].

1.1.2. Tác dụng dược lý
2


DHA được biết đến là chất có tác dụng diệt kí sinh trùng sốt rét rất hiệu quả
đặc biệt đối với ký sinh trùng P. falciparum. DHA ít tan trong nước và sinh khả
dụng thấp khi dùng đường uống vì thuốc tan chậm và có thể bị phân hủy bởi dịch dạ
dày ruột. Thời gian bán thải của DHA rất ngắn (34-90 phút) [42], [43].
Ngoài ra, DHA là chất bán tổng hợp và chuyển hóa từ Artemisinin đã được
nghiên cứu với hai cơ chế tiêu diệt tế bào ung thư. Cơ chế thứ nhất nhờ việc tạo ra
các gốc tự do thông qua sự phân cắt đồng nhất của cầu endoperoxid yếu (R-O-O-R),
cơ chế thứ hai thông qua sự phân chia dị hợp của cầu nối endoperoxid và nước, dẫn
đến sự hình thành hydroperoxid hoặc gốc hydroxyl dựa trên phản ứng Fenton. Hai
cơ chế chống ung thư đều cho thấy tác dụng dược lý của DHA có liên quan và phụ
thuộc vào nồng độ sắt trong cơ thể. Các gốc tự do có thể oxy hóa lipid, gây tổn
thương màng tế bào, protein và ADN, gây ra sự tự chết của tế bào ung thư [37].
1.1.3. Dược động học
Nghiên cứu trên động vật thực nghiệm: DHA hấp thu qua đường uống, tỷ lệ
liên kết với protein huyết tương là 50%. Với liều uống là 20 mg/kg kết quả cho thấy
thời gian bán thải là 2,1 giờ và thải trừ hoàn toàn sau 3,04 giờ. DHA phân bố đến
khắp các cơ quan, đặc biệt phân bố nhanh đến gan và tim. DHA phân bố đến hồng
cầu bị nhiễm P.falciparum cao hơn so với hồng cầu bình thường. DHA thải trừ
nguyên dạng qua nước tiểu (82,7%) và 1 phần qua phân. Khi dùng DHA đồng thời
với các thuốc khác có tỷ lệ liên kết với protein huyết tương cao nhận thấy độc tính
không tăng lên.
Nghiên cứu trên cơ thể người: DHA hấp thu qua đường uống với liều 1,1mg
và 2,2 mg/kg, nồng độ trong huyết tương cao nhất đạt được sau 1,33 giờ và t1/2 là
1,63-1,57h.
1.1.4. Độc tính của DHA
-

Độc tính : LD50 của DHA dùng đường uống là 834,5 mg/kg đối với chuột thí
nghiệm.

- Độc tính trường diễn: cho chuột uống liên tục với liều 20 mg/kg và 60mg/kg
hàng ngày thấy chuột vẫn bình thường. Khi tăng liều đến 180 mg/kg (gấp 100 lần

3


liều điều trị ở người) mới thấy trọng lượng ruột giảm sút, kém ăn. Các thử nghiệm
về bệnh lý, huyết học, máu ngoại vi đều bình thường.
- Độc tính với bào thai: DHA có độc tính với bào thai chuột ở giai đoạn nhạy
cảm của chuột mang thai. Kết quả nghiên cứu trên không thể suy ra giống như vậy
đối với người. Tuy nhiên cũng nên thận trọng khi dùng DHA đối với phụ nữ có thai.
1.1.5. Định lượng DHA
Theo Dược điển Trung Quốc 2010, DHA nguyên liệu được định lượng bằng
phương pháp HPLC, sử dụng cột C18, pha động ACN: nước= 60:40, bước sóng
phát hiện 210 nm. Hòa tan 1 lượng DHA và Artemisinin chuẩn vào pha động sao
cho thu được 1 dung dịch có nồng độ 1mg/ml. Tiêm 20 µl vào cột sắc ký C18. DHA
thể hiện 2 pic, độ phân giải giữa pic Artemisinin và pic DHA không thấp hơn 2,0,
số đĩa lý thuyết không thấp hơn 6000 được tính với pic tham khảo của DHA. Sau đó
cân chính xác 25mg mẫu thử, hòa tan vào pha động trong bình định mức 25ml và
pha loãng tới vạch. Tiêm 20 µl vào cột sắc ký trong 8 giờ và ghi sắc ký đồ. Lặp lại
thao tác với DHA chuẩn. Tính toán hàm lượng DHA dựa vào diện tích pic trên sắc
ký đồ của mẫu thử, mẫu chuẩn.
Trong khi đó viên nén chứa DHA, Dược điển Trung Quốc 2010 định lượng
theo phương pháp đo UV, đo độ hấp thụ tại bước sóng 238 nm, với mẫu trắng là
dung dịch hỗn hợp natri hydroxid 2%: ethanol=4:1. Tính toán hàm lượng DHA
bằng cách so sánh với dung dịch chuẩn cùng nồng độ.

Ngoài Dược điển Trung Quốc 2010 hướng dẫn định lượng DHA còn rất
nhiều các nghiên cứu của các tác giả định lượng DHA, có thể kể ra một số nghiên
cứu sau:

4


Bảng 1.1. Một số các nghiên cứu định lượng DHA
Tên các
nghiên cứu

Đối tượng
định lượng

Phương
pháp định
lượng

Điều kiện định lượng

Nghiên cứu
của Zhang và
cộng sự [42]

Nano DHA
sử dụng chất
mang thân
lipid

HPLC

- Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao LC-20A của Shimadzu
- Detector SPD-20MA
Thiết bị loại khí DGU-20A3
- Sử dụng cột C18 (4,6mm x 150mm
x 5µm)
- Pha động bao gồm ACN: 0,02
mol/l amoni sulfat:12% triethylamin
= 100:100:0,15(v/v/v).
- Tốc độ dòng 1ml/phút
- Bước sóng phát hiện 213 nm
- Nhiệt độ chạy sắc ký 30C
- Thể tích tiêm mẫu là 50µl.

Nghiên cứu
của Attih EE
và cộng sự [7]

DHA trong
viên nén
hoặc trong
thuốc bột

Chuẩn độ
iod

Nghiên cứu
của Babalola
và cộng sự [8]

Viên nén
DHA

Zhu Kai và
cộng sự [44]

DHA và
piperaquin
phosphat
trong viên
nén

- Dựa trên phản ứng của DHA với
kali iod (1:1), iod giải phóng được
chuẩn độ bằng dung dịch natri
thiosulfat với chỉ thị hồ tinh bột
- Phạm vi định lượng 5-70mg DHA
Quang phổ
- Tạo phản ứng giữa dung dịch
UV sử dụng methanol của DHA và p-nitroanilin
p-nitroanilin trong môi trường acid HCl 1M ở
làm tác nhân nhiệt độ cao và thời gian phản ứng
tạo dẫn xuất ngắn, tỷ lệ giữa DHA: p-nitroanilin
là 2:1.
- Đo độ hấp thụ của sản phẩm tại
bước sóng 290 nm.
HPLC

5

- Cột C18 (250 mm x 4,6mm x
5µm)
- Pha động gồm: ACN: methanol:
0,02 mol/lít amoni sulfat = 50:10:40
(v/v/v)
- Tốc độ dòng 1 ml/phút
- Bước sóng phát hiện 210nm
- Nhiệt độ chạy sắc ký 30C.


1.2. Tổng quan về nano polyme
1.2.1. Đặc điểm
Các tiểu phân nano polyme (PNPs) được bào chế từ các polyme tương thích
hoặc phân hủy sinh học có kích thước từ 1-1000 nm tại đó thuốc được hòa tan, bẫy,
bao gói hoặc phân tán trong cốt của chất mang. Tùy theo phương pháp bào chế mà
thu được siêu vi cầu (nanospheres) hoặc siêu vi nang (nanocapsules). Siêu vi nang
có cấu trúc nhân vỏ như vi nang, còn siêu vi cầu có cấu trúc cốt (matrix) đồng nhất
như vi cầu [2], [3], [4].

Hình 1.2. Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang
Tiểu phân polyme mang thuốc có đặc điểm chung là dùng polyme làm giá
mang dược chất với mục đích che chở, bảo vệ dược chất, kéo dài tác dụng của dược
chất và hướng dược chất tới đích tác dụng.
Theo cơ chế mang dược chất có thể chia làm 3 nhóm [2], [3], [4]:
-

Hệ cốt: Tiểu phân nano được phân tán trong giá mang polyme: siêu vi cầu,

tiểu phân lipid rắn.

-

Hệ màng bao: Polyme bao ngoài tiểu phân nano dược chất: siêu vi nang,

liposome, micell, dendrime, ống carbon,…
-

Hệ liên kết: Polyme gắn trực tiếp với phân tử dược chất qua các cầu liên kết

hóa học
1.2.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme
Các phương pháp bào chế PNPs hay được sử dụng có thể chia ra 3 nhóm [2],
[3], [4]:
6


-

Phương pháp phân tán trong polyme được hình thành từ trước: Là một kỹ

thuật phổ biến được sử dụng để bào chế các hệ nano sử dụng polyme phân hủy sinh
học như poly (acid lactic) (PLA), poly (D, L-acid glycolic) (PLG), poly (D, L-acid
lactic-co-glycolic) (PLGA) và poly (cyanoacrylat) (PCA). Nhóm này bao gồm các
phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi, nhũ hóa và khuếch tán dung môi, hóa
muối, thẩm tách, sử dụng dung môi siêu tới hạn.
-

Phương pháp polyme hóa từ monome: Nhũ tương, vi nhũ tương, polyme hóa

bề mặt.

-

Phương pháp gel ion hóa hay keo tụ.

-

Sau đây là một số phương pháp thường được sử dụng:
1.2.2.1 . Nhũ hóa và bốc hơi dung môi
Nguyên tắc: Tạo ra vi nhũ tương (thường là dầu/nước), sau đó bốc hơi dung

môi hữu cơ tạo vi tiểu phân. Polyme hay dùng loại tan trong dung môi hữu cơ như
PLA, PLGA, Eudragit,…Hòa tan chất mang và dược chất vào dung môi hữu cơ
(hay dùng methylen clorid, cyclohexan…) rồi nhũ hóa vào pha nước đã có chất nhũ
hóa (PVA (polyvinyl alcol), Tween, Poloxamer…). Tiến hành đồng nhất hóa rồi
bốc hơi dung môi hữu cơ, lọc và rửa vi tiểu phân. Một số yếu tố ảnh hưởng tới đặc
tính tiểu phân nano tạo thành là cường độ và thời gian đồng nhất hóa, loại và lượng
chất nhũ hóa, tỷ lệ polyme, dược chất và cách bốc hơi dung môi.

Hình 1.3. Kỹ thuật nhũ hóa và bốc hơi dung môi

7


1.2.2.2. Nhũ hóa và khuếch tán dung môi
Nguyên tắc: Nhũ hóa pha hữu cơ (gồm polyme, dược chất, dung môi hữu cơ)
vào một dung dịch chất ổn định (pha nước). Dung môi sẽ khuếch tán từ pha dầu vào
pha nước hình thành các tiểu phân nano polyme. Để kết tụ polyme và tạo thành các
tiểu phân nano cần thiết phải sử dụng pha pha loãng để thúc đẩy sự khuyếch tán của
dung môi pha phân tán. Các dung môi được bốc hơi hoặc lọc.
Kỹ thuật này có ưu điểm như hiệu suất bao gói cao (thường lớn hơn 70%),

không cần phải đồng nhất, độ tái lặp giữa các lô cao, dễ mở rộng quy mô, đơn giản,
phân bố kích thước tiểu phân hẹp. Nhược điểm là thể tích lớn nước được loại bỏ
khỏi hỗn dịch và sự thẩm thấu nước hòa tan dược chất vào pha ngoại bão hòa nước
trong suốt quá trình nhũ tương hóa làm giảm hiệu suất bao gói dược chất .

Hình 1.4. Kỹ thuật nhũ hóa và khuếch tán dung môi
1.2.2.3. Sử dụng dung môi siêu tới hạn
Nguyên tắc: Hòa tan dược chất trong dung môi siêu tới hạn (hay dùng CO2)
ở điều kiện tới hạn, sau đó xả CO2 để giảm áp suất đột ngột, dược chất sẽ bị kết tủa
lại dưới dạng siêu mịn hoặc hòa tan dược chất vào dung môi rồi bơm vào thùng
chứa cùng với CO2 siêu tới hạn, dung môi chuyển sang CO2 làm kết tủa dược chất,
sau đó giảm áp suất để thu sản phẩm.
Phương pháp này có nhiều ưu điểm như không độc, giá thành rẻ, các thông
số tới hạn của CO2 không quá cao (nhiệt độ tới hạn là 31,3°C, áp suất tới hạn là
73,7 bar).

8


1.2.2.4. Phương pháp gel ion hóa hay keo tụ
Các tiểu phân nano polyme được bào chế bằng cách sử dụng các polyme
phân hủy sinh học ưa nước như là chitosan, gelatin, natri alginat. Phương pháp này
liên quan đến một hỗn hợp của hai pha nước, trong đó có một pha là polyme
chitosan, một đồng polyme di-block của polyethylen oxid hoặc polypropylen oxid
(PEO-PPO). Pha còn lại là một poly anion natri tripolyphosphat. Nhóm amin của
chitosan tích điện dương tương tác với tripolyphosphat tích điện âm để tạo thành
keo tụ với kích thước nano. Keo tụ được hình thành do kết quả tương tác tĩnh điện
giữa 2 pha nước, ở đó nguyên liệu chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái gel.
1.2.3. Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch
Sau khi tiêm tĩnh mạch, sự phân bố của tiểu phân nano có thể xảy ra theo 2

hướng [2], [3], [4]:
1.2.3.1. Thanh thải bằng thực bào
Hệ thống thực bào trong cơ thể coi tiểu phân như một vật thể lạ và tiến hành
thanh thải theo cơ chế bảo vệ của cơ thể. Các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 500
nm dễ bị thanh thải hơn cả. Sau khi thực bào, tiểu phân được đưa về gan, lách…
Như vậy có thể lợi dụng cơ chế thực bào để chủ động đưa thuốc tới gan, lách,
phổi…và tăng cường ái lực với thụ thể trên thực bào đơn nhân. Mặt khác, tổ chức u,
viêm là những nơi có quá trình thực bào xảy ra mạnh nhất, trở thành cơ quan đích
của tiểu phân.
Để tránh thực bào, tăng cường phân bố đến các tổ chức cần phải:
-

Ngụy trang tiểu phân nhằm tránh sự nhận diện của tế bào lympho: bao tiểu

phân với các polyme thân nước như PEG, khi đó PEG liên kết đồng hóa trị với các
tiểu phân thân nước như nano albumin, nano PLGA… kéo dài thời gian bán thải
-

Biến tính bề mặt tiểu phân để ngăn cản quá trình thực bào: tạo ra cấu trúc

cồng kềnh hoặc bao chất diện hoạt
-

Bao tiểu phân bằng các tác nhân phân giải màng lysosome
1.2.3.2. Phân bố đến cơ quan, tổ chức
Các tiểu phân không bị thực bào dễ dàng đi qua thành mạch mao quản để

phân bố tiếp đến các cơ quan, tổ chức trong cơ thể đặc biệt là các tổ chức u, viêm do
9

tính thấm tăng lên. Các tiểu phân nhỏ hơn 250 nm (một số nghiên cứu cho là 200
nm) dễ qua thành mạch, tránh được thực bào [2], [3].
Sau khi qua thành mạch, tùy theo cấu trúc và kích thước, hệ nano được phân
bố ở 3 mức độ khác nhau:
-

Tới cơ quan đích: Gan, lách, phổi…

-

Tới nhóm tế bào đặc biệt (viêm, ung thư, đại thực bào…)

-

Tới nội bào: Do có kích thước ở mức độ phân tử, nhỏ hơn khe hở liên bào và

nhiều liên kết lỏng lẻo trên màng tế bào nên hệ nano có khả năng xuyên qua màng
tế bào vào nội bào. Nếu kích thước lớn hơn, hệ được vận chuyển bằng cơ chế thực
bào hoặc tương hợp với màng tế bào (liposome).
1.2.4. Một số phương pháp để thu được tiểu phân nano polyme
Việc bảo quản tiểu phân nano dưới dạng hỗn dịch gặp nhiều khó khăn như:
-

Thể tích nước lớn, hàm lượng dược chất trong một đơn vị thể tích thấp

-

Polyme có thể bị phân hủy trong quá trình bảo quản

-

Các tiểu phân nano có thể bị kết tụ, sa lắng

-

Dược chất bị mất dần hoạt tính

-

Dễ nhiễm vi sinh vật
Để thu được tiểu phân nano polyme có 2 phương pháp được sử dụng là

phương pháp đông khô và phun sấy.
1.2.4.1. Đông khô
Đông khô là một quá trình làm khô dung dịch nước đã được đông lạnh ở
nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutectic của dung dịch, dung môi được loại trực tiếp từ
pha rắn, không qua pha lỏng dưới áp suất giảm (thường dưới 100 μm Hg), cho ra
sản phẩm khô [2], [3].
Kỹ thuật đông khô có nhiều ưu điểm:
-

Hạn chế tốc độ phản ứng hóa học phân hủy dược chất vì quá trình đông khô

được tiến hành ở nhiệt độ thấp
-

Sản phẩm khô thu được có diện tích bề mặt riêng lớn nên sẽ hòa tan rất

nhanh khi cần hòa tan trở lại

-

Dễ đạt yêu cầu đồng nhất về hàm lượng, giảm thiểu sự nhiễm chéo
10


-

Giảm thiểu sự oxy hóa dược chất
Tuy vậy, kỹ thuật đông khô cũng có những hạn chế như có thể gây ra mất ổn

định và thay đổi các đặc tính hệ nano.
Nguyên tắc chung của quá trình đông khô được thực hiện qua các bước:
-

Chế phẩm được đông lạnh

-

Khi sản phẩm đã đông rắn hoàn toàn, tiến hành hút chân không để giảm áp

suất hơi ở buồng đông khô xuống dưới áp suất hơi của nước đá và cung cấp nhiệt
cho giá để tạo năng lượng cần thiết cho quá trình thăng hoa (giai đoạn làm khô sơ
cấp). Dưới những điều kiện đó nước sẽ bay hơi trực tiếp từ trạng thái rắn tạo ra
bánh thuốc khô, xốp. Khi đó phần lớn dung môi được loại đi
-

Tiếp tục cung cấp nhiệt để làm khô bánh thuốc đến độ ẩm xác định (giai

đoạn làm khô thứ cấp).

1.2.4.2. Phun sấy
Nguyên tắc chung là dưới áp lực cao của vòi phun sẽ chuyển dung dịch thành
dạng khí dung, dòng khí dung này được tiếp xúc trực tiếp với luồng không khí nóng
thổi cùng chiều, dung môi từ các giọt khí dung sẽ bay hơi rất nhanh do có diện tích
tiếp xúc lớn và để lại bột thuốc khô.
So với đông khô, phun sấy có ưu điểm như thao tác nhanh, chi phí thấp hơn,
phù hợp với quy mô công nghiệp, bột phun sấy có thể dùng dưới dạng hỗn dịch
hoặc đưa vào viên nén, viên nang.
Nhược điểm của phun sấy là cần gia nhiệt, có thể tác động lên tính toàn vẹn
của tiểu phân nano polyme và dược chất, hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp. Ngoài ra,
để đảm bảo vô khuẩn cho bột đông khô sau phun sấy là khó khăn vì cần lọc loại
khuẩn một lượng không khí lớn và đảm bảo yêu cầu vô khuẩn cho toàn bộ thiết bị
phun sấy cũng như khối bột sau phun là không hề đơn giản [2], [3].
1.2.5. Một số chế phẩm chứa tiểu phân nano trên thị trường

11


Bảng 1.2: Một số chế phẩm chứa tiểu phân nano lưu hành trên thị trường [12]
Biệt dược
Doxil Caelyx

Hoạt chất
Doxorubicin

Chỉ định phê duyệt
Ung thư buồng trứng, kaposi’s sarcoma
kết hợp AIDs, tái phát ung thư vú, kết
hợp điều trị cùng với bortezomib trong
ung thư đa tủy

Myocet

Doxorubicin

DaunoXome

Daunorubicin

Kết hợp với cyclophosphamid trong
điều trị ung thư vú tái phát, ung thư
buồng trứng và Kaposi’s sarcoma kết
hợp AIDs
Kaposi’s sarcoma

Onco TCS

Vincristine

Tái phát mạnh Lymphotma không
Hodgkin’s

Abraxane

Paclitaxel

Ung thư vú di căn

Abelcet Amphotec

Amphotericin B

Điều trị nhiễm nấm xâm lấn ở những
bệnh nhân bị dai dẳng hoặc không dung
nạp amphotericin B

AmBisome

Amphotericin B

Điều trị theo kinh nghiệm cho các bệnh
nhiễm nấm ở bệnh nhân giảm bạch cầu
có sốt. Điều trị leishmaniasis nội tạng.
Điều trị nhiễm nấm xâm lấn ở những
bệnh nhân bị dai dẳng hoặc không dung
nạp amphotericin B

1.2.6. Vài nét về chất mang PLGA
1.2.6.1. Cấu trúc
Poly (acid lactic-co-glycolic) (PLGA) là một copolyme được tổng hợp bằng
phương pháp đồng polyme hóa mở vòng ngẫu nhiên của 2 monome khác nhau,
dime vòng (1,4-dioxan-2,5-dion) của acid glycolic và acid lactic. Các PLGA khác
nhau bởi tỷ lệ các monome sử dụng và khối lượng phân tử (KLPT), ví dụ PLGA
75:25 chứa 75% acid lactic và 25% acid glycolic [2], [3], [4], [39].

12


Hình 1.5. Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA
1.2.6.2. Tính chất, ứng dụng

PLGA là một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất do có
khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh
học với nhiều mô và tế bào, ngoài ra nano PLGA đang được nghiên cứu ứng dụng
trong liệu pháp chẩn đoán hình ảnh và trong điều trị ung thư. PLGA phân hủy sinh
học bằng thủy phân liên kết ester tạo thành acid lactic và acid glycolic. Cả hai được
chuyển hóa qua chu trình Krebs thành CO2 và nước rồi đào thải ra ngoài nên độc
tính thấp.
Trong PLGA thì phần PLA (poly acid lactic) có cấu trúc kỵ nước hơn PGA
(poly acid glycolic). Do đó, nếu PLGA có tỷ lệ PLA cao hơn thì ít thân nước hơn và
thủy phân chậm hơn. Điều này ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất. Ngoài ra, sự
phân hủy sinh học của PLGA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như trạng thái kết
tinh, hình dạng bề mặt và kích thước, pH, khối lượng phân tử trung bình, hàm lượng
dược chất, loại dược chất [2], [3], [4], [39] .
1.2.6.3. Một số hạn chế khi sử dụng PLGA
Khi sử dụng PLGA làm chất mang sự giải phóng dược chất trải qua hai giai
đoạn, trong đó giai đoạn đầu có sự giải phóng “bùng nổ, ồ ạt” do xảy ra quá trình
hòa tan và ăn mòn ở bề mặt. Mặt khác các tiểu phân nano PLGA dễ bị bắt giữ bởi
hệ thống thực bào và tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào làm giảm hiệu
quả điều trị và tăng tác dụng phụ. Do đó, nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi các đặc
tính lý hóa bề mặt của tiểu phân nano PLGA đã được thực hiện như bao tiểu phân
với polyme thân nước (PEG, chitosan) để kéo dài thời gian tuần hoàn do tiểu phân
thân nước có khả năng tuần hoàn trong máu lâu hơn và bị tích lũy ở gan ở mức độ
tối thiểu [2], [3], [4], [39].

13


1.2.7. Vài nét về FA, thụ thể của FA
1.2.7.1. Acid folic

Hình 1.6. Công thức cấu tạo của acid folic
Tính chất: Bột kết tinh màu hơi vàng, không mùi, không tan trong nước lạnh,
tan tốt trong kiềm, acid, nhiệt độ nóng chảy 250C. Acid folic dễ bị phân hủy mất
hoạt tính dưới tác dụng của ánh sáng, chất oxy hóa, chất khử, acid, kiềm hoặc khi
đun nóng.
Acid folic (FA) là một trong những phối tử (ligand) được sử dụng phổ biến
với mục đích hướng đích nhờ gắn với các thụ thể folat trên tế bào ung thư [11],[30],
[36], [38], [40].
1.2.7.2. Thụ thể của FA
Các thụ thể folat (FR) thuộc về một họ protein liên kết acid folic có ái lực
cao, được mã hóa bởi ba gen khác nhau ,, và nằm trên nhiễm sắc thể 11. Các thụ
thể folat hoàn chỉnh tương tự những protein mà chứa 229-236 amino acid với trọng
lượng phân tử 38-40 kDa [15]. FR và FR được gắn trên màng tế bào bằng
glycosylphosphatidylinositol (GPI). Trong khi đó FR là một protein liên kết gắn
với folat hòa tan được tiết ra khi glycosylphosphatidylinositol có sự biến đổi [24],
[28].
Thông thường thụ thể folat ở người xuất hiện ở một số mô bình thường trong
ngưỡng cho phép. Trong đó thụ thể folat FR xuất hiện nhiều nhất ở tế bào biểu mô
thận, phổi, ruột, tuyến giáp. Trong tất cả các mô này các thụ thể được biểu hiện trên
bề mặt màng đỉnh. Ngoài ra cũng còn thấy sự hiện diện cao của FR ở phần ống

14


lượn gần của thận có khả năng gắn kết acid folic trước khi được bài tiết qua nước
tiểu và đưa trở lại lưu thông thông qua quá trình tái hấp thu [15],[17],[18],[27], [32].
Thụ thể folat FR phần lớn được biểu hiện qua các khối u không có biểu mô
như bệnh bạch cầu tủy cấp tính.
Sự hiện diện quá mức của các thụ thể folat FR thường xuất hiện ở những vị
trí có khối u ác tính, có nguồn gốc biểu mô như u buồng trứng, nội mạc tử cung, đại

trực tràng, vú, phổi, thận, di căn não, ung thư biểu mô thần kinh [27] dựa vào đây
chúng ta có thể chẩn đoán chính xác bệnh ung thư thông qua xét nghiệm tìm FR.
Bình thường các thụ thể folat không thể tiếp cận được với dòng máu nên
không có khả năng gắn acid folic tuy nhiên khi tế bào chuyển thành ác tính thụ thể
folat có thể tiếp cận được với dòng máu đây là điều kiện lý tưởng để đưa thuốc
hướng đích thụ thể folat qua trung gian acid folic [15].
1.2.8. Vài nét về Chitosan
Chitosan (CS) (poly 1,4-β-D-glucosamin) là một polysaccarid tự nhiên, gồm
nhiều polyme khác nhau về khối lượng phân tử (50-2000 kDa) và mức độ acetyl
hóa (40-98%). CS được sản xuất bằng cách N-deacetyl hóa chitin lấy từ vỏ của
động vật giáp xác như tôm, cua…

Chitin

Chitosan

Hình 1.7 . Cấu trúc hóa học của Chitin và chitosan
CS có pKa khoảng 6,2-7, không tan trong các dung dịch pH trung tính và
kiềm. Trong môi trường acid, nhóm amin của CS nhận proton, làm cho phân tử tích

15