báo cáo thí nghiệm vi sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CN HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM


BÁO CÁO
THÍ NGHIỆM VI SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

MÃ HP: 162ENMI327010
NHÓM THỰC HIỆN: Nhóm 4
HỌC KỲ: II NĂM HỌC: 2016-2017
GVHD: TS. Nguyễn Mỹ Linh

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 05 năm 2017
1


ĐIỂM:

HỌ TÊN SINH VIÊN THỰC HIỆN

NHẬN XÉT CỦA GV
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………….......
……………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
GV kí tên

Thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường
2


MỤC LỤC

Mục lục….
Bài 3: Chuẩn bị Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật…………………….4
Bài 4: Các phương pháp phân lập vi sinh vật……………………………….……..8
Bài 5: Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật………………………………………………11
Bài 6: Các phương pháp nhuộm màu và quan sát hình thái vi sinh vật………..14
Bài 7: Tổng số vi sinh vật hiếu khí…………………………………………….…20
Bài 8: Phương pháp kiểm tra tổng coliformtrong nước thải……………………..24
Bài 9: Kiểm tra E. coli trong nước thải…………………………………………...28

Bài 3:
CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NÔI CẤY VI SINH VẬT

3


1. Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG
Các chất dinh dưỡng là những chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.
Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm
vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi
trường.

Người ta dựa vào các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường:
- Theo thành phần và nguồn gốc: môi trường tự nhiên, môi trường tổng hợp và môi
trường bán tổng hợp;
- Theo tính chất lý học: môi trường lỏng, môi trường đặc và môi trường và môi
trường bán lỏng;
- Theo công dụng: môi trường cơ bản và môi trường chọn lọc.
2. NGUYÊN TẮC
Thao tác phải hết sức cẩn thận, thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn.
Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác.
Agar trong môi trường nuôi cấy vi sinh đóng một vai trò là "giá đở". Nếu nhiều quá
hoặc ít quá thì cũng có ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy.
Khử trùng môi trường dinh dưỡng nhằm mục đích:
- Tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường.
- Tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, nuôi cấy chính xác.
Sau khi khử trùng môi trường phải đảm bảo một số điều kiện sau:

Không làm biến tính môi trường, không làm biến tính một số chất trong
môi trường.

Sau khi khử trùng , trong môi trường không sản sinh ra chất độc gây chết vi
sinh vật nuôi cấy.

Phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khi khử trùng.

Bảo đảm an toàn đối với người sử dụng.
Nơi cất giữ môi trường phải thuận tiện cho việc theo dõi, sử dụng và bảo quản.

3. PHƯƠNG PHÁP
- Phương pháp thực hiện: Làm thạch nghiêng; Đổ đĩa petri.
- Phương pháp khử trùng: autoclave (121oC)

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
a. Chuẩn bị môi trường
Cân chính xác các thành phần của môi trường:
4


- Saccharose or Maltore: 10gr
- KH2PO4:
0.6gr
- Agar:
4gr

- Pepton:
- MgSO4:
- Nước cất:

2gr
1gr
200ml

Cho hỗn hợp trên vào bình tam giác có chứa 200 mL nước cất, khuấy tan hỗn hợp.
Sau đó đậy kín miệng lại bằng nút bông và bọc giấy bạc. Hấp tiệt trùng ở 121 oC trong 2
giờ.

b. Chuẩn bị dụng cụ:
Làm nút bông cho ống nghiệm, gói giấy báo đĩa petri và ống nghiệm. Sau đó cho
vào tủ sấy.

c. Phân phối môi trường vào dụng cụ vào dụng cụ:
Thao tác dưới ngọn lửa đèn cồn, quá trình làm cẩn thận tránh để môi trường rơi ra

ngoài.
- Môi trường cần được đun cho hóa chất lỏng rồi cho vào các dụng cụ
- Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường.
- Tay phải kẹp nút bông và kéo ra.
- Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại.
5


Ống nghiệm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường kết
thúc và môi trường chưa đông đặc.

Đổ thạch vào đĩa petri: Toàn bộ qui trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện dưới
ngọn lửa đèn cồn.

Chú ý: Thao tác hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế nhiễm khuẩn. Mặt
thạch phải phẵn, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm. Thông thường ¼ lít môi trường có thể
phân phối 22 25 đĩa petri.
Sau khi đã phân phối môi trường vào dụng cụ, chờ thạch đông lại, rồi đem ủ trong tủ
ủ ở 35oC từ 1 - 2 ngày.

5. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Môi trường sau khi đã được phân phối vào dụng cụ:

6


Môi trường sau khi ủ trong 2 ngày:

6. NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Sau khi đã ủ trong tủ ủ 2 ngày, lấy ra quan sát kết quả ta thấy: Trong số 8 nghiệm

chứa môi trường thì có 5 ống nghiệm vô khuẩn ( môi trường không thay đổi so với trước
khi ủ) đạt chuẩn và có 3 ống nghiệm có vi sinh phát triển.
Nguyên nhân nhiểm khuẩn: có thể trong quá trình thao tác cách xa ngọn lửa đèn
cồn, tay chưa được vệ sinh cồn đúng cách.

Bài 4:
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH
1. Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG:
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách rời các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và
đưa về dạng thuần khiết.
7


Trong thiên nhiên hay trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh thường tồn tại ở dạng
hỗn hợp nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hóa hoặc úng
dụng vào đời sống thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa về dạng thuần khiết.
2.
NGUYÊN TẮC:
Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật; nuôi cấy các tế bào trên trong môi
trường dinh dưỡng đặc trưng cho các loại khuẩn lạc riêng rẻ, cách biệt nhau.
3.
PHƯƠNG PHÁP
- Phương pháp cấy ria.
- Phương pháp đổ đĩa
-`
4.
CÁCH TIẾN HÀNH:
Gồm ba bước sau:
Bước 1: Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẻ từ quần thể vi sinh vật ban đầu.
Bước 2: Phân lập vi sinh vật thuần khiết.

Bước 3: Kiểm tra độ tinh khiết cảu những khuẩn lạc
Chú ý: Nếu mẫu ban đầu ở dạng rắn cần đưa về dạng lỏng để phân lập bằng cách
tiến hành các bước sau
- Nghiền mẫu.
- Hòa tan mẫu trong nước cất vô trùng.
- Pha loãng mẫu ỏ nồng độ thích hợp.
- Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó.
Để có được chủng thuần chủng cần tiến hành lập lại nhiều lần các kĩ thuật tiến hành
pha loãng như trên cho đến khi đồng nhất các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường.
a. Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn: (Phương pháp cấy ria)
- Hơ đỏ que cấy, làm nguội rồi lấy đầy que cấy 1 vòng vi sinh vật cần phân lập.
- Nghiên hở Petri. Dùng que cấy gạch những đường song song ở phần a của hộp
Petri.
- Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch những đường song song ở phần b của đĩa Petri.
- Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch những đường song song ở phần b của đĩa Petri.
- Lật ngược hộp Petri có chứa vi sinh vật và cho vào tủ ấm ở 35 độ C trong 24 đến
48h.

Phương pháp cấy ria

8


b. Phương pháp trải đĩa:
- Dùng Pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0.1 ml dịch chứa vi
sinh lên bề mặt môi trường trong đĩa Petri.
- Nhúng que trang vào cồn rồi hơ trên ngọn lữa đèn cồn để khử trùng, để nguội dưới
ngọn lữa đèn cồn.
- Mở nhẹ nắp Petri, dùng que trang nhẹ nhàng trãi đều mẫu khắp mặt thạch.
- Rút nhanh que trang khỏi đĩa, đậy đĩa và gói đãi đem ủ ở nhiệt độ và thời gian

thích hợp.
c. Phương pháp đỗ đĩa
- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng đưa 1 ml dung dịch mẫu đã được pha loãng lên
trên bề mặt đĩa petri
- Đỗ khoảng 10 -15ml môi trường vào đĩa (chú ý để nguội môi trường đến nhiệt độ
thích hợp để tránh gây sốc nhiệt cho vi sinh vật)
- Xoay nhẹ đĩa Petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để được trộn
đều trong môi trường cấy.
- Đậy nắp đĩa Petri và để đông tự nhiên rồi đem ủ ở nhiệt độ thích hợp.
5. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM:
Sau khi ủ trong 24h, kết quả được thể hiện qua hình ảnh như sau:
- Phương pháp cấy ria
9


- Phương pháp trãi đĩa , đổ đĩa:

6. NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
a. Nhận xét: Trong phương páp cấy ria có hiện tượng nhiễm khuẩn. Qua hình ảnh
cho thấy số lượng VSV có trong mẫu là khá nhiều, chúng thể hiện qua việc mọc với mật
độ nhiều trong môi trường ở cả hai phương pháp.
b. Bàn luận: Trong quá trình khử trùng, môi trường khử trùng không đạt được yêu
cầu. Trong thao tác thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn không cẩn thận gây nhiễm.

BÀI 5:
KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT
1. Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG
10

Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi
trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác thậm chí
là bình serum đối với vi sinh vật kị khí. Để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát
triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích
hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật
luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết.
2. NGUYÊN TẮC
Thao tác cấy chuyền phải hết sức cẩn thận, tránh làm hỏng bề mặt môi trường có
trong ống nghiệm.
Thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn.
Mỗi lần cấy chuyền chỉ nên dùng với một loại vi sinh vật để tránh lây nhiễm chéo
các loại VSV với nhau.
Vi sinh vật thường được cấy chuyền bằng que cấy vòng hay que cấy nhọn. Trong
những trường hợp đặc biệt có thể dùng pipet, que đầu có quấn bông hay que trang.
3. PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp cấy truyền
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Ghi nhãn từng ống nghiệm với đầy đủ thông tin: tên vi sinh vật, ngày cấy chuyền,
môi trường cấy chuyền.
Cầm que cấy trong tay phải ( tay thuận ), ống nghiệm gốc và ống nghiệm sẽ cấy
chuyền trong tay trái.
Tiệt trùng que cấy bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn tới khi que cấy nóng đỏ.
Mở nắp ống nghiệm gốc trước bằng cách dùng ngón tay út kẹp chặt nút bông trong
lòng bàn tay và kéo nút bông ra khỏi ống nghiệm, hơ nút bông và miệng ống nghiệm gốc
trên ngọn lửa đèn cồn.

11


Mở nắp ông nghiệm cấy chuyền bằng cách kẹp chặt nút ống nghiệm giữa ngón út và

ngón áp út ( làm tương tự như ống nghiệm gốc ).
Cho que cấy đã vô khuẩn và làm nguội vào ông nghiệm gốc, lấy một vòng que cấy
môi trường có chứa VSV và chuyển nó sang môi trường ống nghiệm thứ 2.
Lướt que cấy trên mặt thạch nghiêng theo hình chữ chi, hình xoắn, hình vạch song
song

Rút que cấy ra, hơ đỏ trên ngọn lửa đèn cồn vô khuẩn sau đó đặt que cấy lên giá đỡ
ống nghiệm.
Hơ lần lượt miệng ống nghiệm và nút bông qua ngọn lử đèn cồn sau đó đậy nắp ống
nghiệm lại.
Mang ống nghiệm đi ủ nhiệt độ 35ºC trong 24 – 48 giờ.

12


5. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Ống nghiệm sau khi được cấy chuyền và ủ ở nhiệt độ 35ºC trong khoảng 36 giờ.

6. NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Sau khi đã ủ khoảng 36h, lấy ra quan sát kết quả ta thấy: tất cả 8 ống nghiệm chứa
môi trường đều có VSV phát triển nhưng chỉ có 2 ống nghiệm có vi sinh phát triển và
mọc tương đối đều.
Nguyên nhân: Khi phân phối môi trường thạch nghiêng thì môi trường đông đặc
không giữ được mặt thạch nghiêng, nên khi cấy vi sinh vật và bỏ vào tủ sấy thạch chảy
đẫn đến kết quả không được như mong muốn.
Có thể trong quá trình thao tác cách xa ngọn lửa đèn cồn nên bị nhiễm khuẩn. Các
thao tác cấy không đúng (cấy không đều tay, quá mạnh tay làm hỏng bề mặt môi trường).

13

Bài 6:
CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI
SINH VẬT
1. Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG
Xác định hình thái tế bào VSV, xác định kích thước và sự sắp xếp của chúng.
Quan sát tế bào sống VSV. Tế bào đã cố định và nhuộm màu, đặc điểm hình thái.
2. NGUYÊN TẮC
Loại tiêu bản giọt treo theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động
và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích.
Phương pháp nhuộm màu sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc đối với vi sinh
vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động
sau khi nhuộm màu.
Phương pháp nhuộm Gram: Tất cả các vi khuẩn chia làm 2 nhóm lớn:
- Nhóm 1: Giữ được phức chất tạo thành giữa tím tinh khiết và iod, khi sử lý bằng
cồn, vi khuẩn nhuộm Gram +.
- Nhóm 2: Vi khuẩn không có khả năng giữ được phức chất và bị mất màu khi xử
lí bằng cồn, vi khuẩn nhuộm Gram -.
3. PHƯƠNG PHÁP
Có 2 phương pháp chính để nhuộm màu và quan sát hình thái vi sinh vật là: Phương
pháp làm tiêu bản cố định và phương pháp làm tiêu bản tạm thời .Phương pháp thường
được sử dụng là một phương pháp làm tiêu bản cố định và nhuộm Gram: Là phương
pháp nhuộm để phân loại vi khuẩn theo khả năng bắt màu với các thuốc nhuộm tím kết
tinh và iod.
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
a. Tiêu bản tạm thời
Tiêu bản giọt ép
- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi. Giống vi sinh
được sử dụng là nấm men; bùn hoạt tính; nước dưa chua.
- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo bọt khí. Muốn

vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ là kính xuống.
- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.
Tiêu bản giọt treo
14


- Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa
- Bôi vazolin quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính.
- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên
phần lõm của phiến kính.
b. Tiêu bản tạm thời có nhuộm màu
- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính.
- Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm. Vi sinh vật được sử dụng để
quan sát là nấm men bia.
- Đậy lá kính lên giọt dịch.
- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40).

c. Tiêu bản cố định
Bước 1: Làm vết bôi ( trải trùng)
- Vi khuẩn trong môi trường lỏng: dùng que cấy đầu tròn lấy 1 giọt vi khuẩn đặt lên
lamelle sạch.
- Vi khuẩn trong môi trường đặc: lấy 1 giọt nước vô trùng đặt lên lamelle.
- Lấy vi khuẩn trộn đều trong 1 giọt nước ( trải mỏng lên lamelle)
- Cố định vết bôi: Để khô tự nhiên hoặc cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn.
- Mục đích cố định: Gắn tế bào VSV lên phiến kính, tránh bị rửa trôi về sau.  Vết
bôi dễ bắt màu thuốc nhuộm.

15

Bước 2: Nhuộm tiêu bản bằng Crytasl Violet ( Getian violet) trong 1 phút.
Bước 3: Nhuộm lugol trong 1 phút ( rửa nước hoặc không).
Bước 4: Rửa nước, tẩy cồn 1 phút, rửa nước.
Bước 5: Nhuộm Fuschin (Safanin) 1 phút, rửa nước, để khô.
Bước 6: Nhỏ dầu, quan sát ở vật kính (x 100).
- Tiêu bản đem quan sát

16


5. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
a. Tiêu bản tạm thời nhuộm màu
Nấm men ( vật kính x10)

Nấm men ( vật kính x40)

17


Dưa chua( vật kính X10)

Dưa chua (vật kính x40)

18


b. Tiêu bản cố định: Nấm men ( vật kính x100)

6. NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ

Nhận xét:
- Ở tiêu bản tạm thời nhuộm màu nấm men quan sát hình thái VSV rất rõ nét.
- Ở tiêu bản tạm thời nhuộm dưa chua hình thái VSV quan sát không rõ.
- Ở tiêu bản cố định ta chỉ quan sát được đối với Nấm men còn Dưa chua thì không
thấy kết quả.
Bàn luận kết quả:
- Số lượng nấm men cao, các bước thực hiện làm tiêu bản chính xác và sử dụng
kính hiển vi thành thạo nên cho kết quả rõ nét.
- ở dưa chua do số lượng VSV trong dưa chua thấp, trong quá trình thực hiện còn
nhiều sai sót nên không đạt được kết quả mong muốn.

Bài 7:
19


TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
1. Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG
Việc đếm tổng số vi sinh vật cung cấp một phương tiện tiêu chuẩn để xác định mật
độ vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí và kị khí, tùy tiện trong nước. Có 3 phương pháp và 3 loại
môi trường để xác định chỉ tiêu này.
Kỹ thuật đếm trên đĩa các tế bào dị dưỡng là phương pháp tốt nhất xác định thành
phần vi khuẩn tổng quát có trong mẫu nước, để có thể đánh giá hiệu quả nhà máy xử lí
nước, sự tăng trưởng sau đó của vi khuẩn trong các đường ống, trong các nguồn
nước..v..v..
2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Phương pháp đổ đĩa: Đầu tiên được xem là phương pháp đếm tiêu chuẩn.
Nhược điểm: hạn chế số lượng tối đa của vi khuẩn trên môi trường do nhiệt độ ủ và thời
gian xét nghiệm ( nhiệt độ môi trường 44-46 0C có thể gây sốc nhiệt cho vi khuẩn ) Môi
trường giàu dinh dưỡng có thể làm giảm sự phát triển của những vi khuẩn thiếu dinh
dưỡng. Kỹ thuật cãi tiến có thể khắc phục những hạn chế trên.

Phương pháp trải đĩa: Không bị sốc nhiệt do nhiệt độ của thạch. Thêm vào đó, tất cả
khuẩn lạc mọc trên mặt thạch có thể nhìn thấy và đếm dễ dàng và cũng dễ phân biệt
những khuẩn lạc riêng biệt hoặc những bong bóng khí. Kỹ thuật này có hạn chế sử dụng
mẫu thể tích nhỏ: 0.1 – 0.5 ml và phụ thuộc vào khả năng hấp phụ của thạch.
3. MÔI TRƯỜNG
Trytone glucose extract agar: dùng cho phương pháp đỗ đĩa và trãi đĩa. pH được
chỉnh ở 6.8-7.0. Sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
Place count agar: dùng cho phương pháp đổ đĩa và trãi đĩa. pH được chỉnh ở 7.07.2. Sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
R2A: dùng cho phương pháp đỗ đĩa, trải đĩa và màng lọc. Môi trường này không ở
dạng dehydrate mà phải chuẩn bị theo những thành phần cơ bản theo công thức môi
trường. Điều chỉnh pH đến 7.2 bằng K2HPO4 hoặc KH2PO4 dạng rắn trước khi thêm agar
và khử trùng ở 1210C, 15 phút.

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

20


Chuẩn bị môi trường plate count agar: khử trùng hoặc đun cho đến khi nóng chảy
agar nếu là môi trường đã khử trùng và trữ lạnh( pha 3.6g môi trường và 150ml nước cất)

Chuẩn bị nước cất khử trùng

Khử trùng dụng cụ: pipette, petri

Pha loãng mẫu nước thải
21


Hút vào petri đã khử trùng 1ml mẫu đã pha loãng, mỗi độ pha loãng chuẩn bị 2

petri (thao tác vô trùng dưới đèn cồn)
Ghi kí hiệu độ pha loãng lên từng petri
Thực hiện 4 độ pha loãng cho mỗi mẫu ( 10-4;10-5;10-6;10-7)
Sau khi để nguội môi trường khoảng 35-40 0C, rót vào các petri đã chứa mẫu mỗi
petri khoảng 10ml môi trường
Xoay nhè nhẹ petri, tránh không để môi trường tràn ra ngoài và phân bố đều vi
sinh vật có trong mẫu.
Chờ thạch đóng cứng lại, lật ngược các petri và ủ ở 300C-350C

Sau 24-72h đếm các khuẩn lạc riêng lẽ quan sát được.
5. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Mẫu sau khi được ủ ở 300C-350C trong khoảng 24-72h

Trải đĩa: độ pha loãng 10-7: 31
22


Đổ đĩa: độ pha loãng 10-6: 468

A
Trãi đĩa:

A
Đổ đĩa:

31
 3,1.108  CFU / g 
7
1.1.10

468
8

4,68.10
 CFU / g 
1.1.106

6. NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Tiêu chuẩn cho phép của tổng số VHKH trong nước sinh hoạt là 100(CFU/g).
Cho thấy mẫu nước cần được xử lý nếu muốn đưa vào sử dụng trong sinh hoạt.
Trong 3 nồng độ pha loãng gồm 6 đĩa petri mang đi ủ thì chỉ có 2 đĩa đạt yêu cầu. Tỉ
lệ này vẫn còn thấp so với yêu cầu.
Nguyên nhân có thể do các đĩa bị nhiễm khuẩn trong quá trình đổ môi trường và lấy
mẫu nước thải pha loãng vào đĩa.

BÀI 8:
23


PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA TỔNG COIFORM TRONG NƯỚC THẢI
1. Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị
khí tùy ý, có khả năng lên men Lactose sinh acid và sinh hơi ở 37 oC trong 24-48
giờ. Nhóm Coliforms còn được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện
của chúng trong thực phẩm, nước hay mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả
năng hiện diện của các loài vi sinh vật gây bệnh khác. Khi số Coliforms của thực
phẩm cao thì khả năng hiện diện của vi sinh vật gây bệnh cũng cao.
Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với 1 loài duy nhất là E. coli,
Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter.
Coliforms gồm 2 nhóm: Coliform chịu nhiệt và Coliforms phân.

2. NGUYÊN TẮC
Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, 2 nồng độ kế tiếp nhau khác
nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng độ
pha loãng được lặp lại 3 – 5 ống. Theo dõi sự sinh hơi trong từng ống nghiệm. Xác
định các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra
số lượng nhóm VSV tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) ban đầu.
3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Phương pháp MPN (Most Pobable Number – Phương pháp có xác suất cao
nhất, phương pháp pha loãng tới hạn).
4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
a. Chuẩn bị môi trường:
Môi trường Lauryl Tryptose: Cân 3,56 gr cho vào 100ml nước cất (môi trường
có màu vàng).
Môi trường Briilian Green Bile Lactose Broth: Cân 4,00 gr cho vào 100ml
nước cất (môi trường có màu xanh lục)

b. Pha loãng mẫu:
24


Chuẩn bị 5 ống nghiệm có đánh số, mỗi ống chứa 9ml nước cất khử trùng.
Cho 1ml mẫu nước vào ống đầu tiên 10-1, sau đó pha loãng đến 10-5

c. Nuôi cấy
Nuôi cấy mẫu trong môi trường Laury Trytose (LT) ở 3 nồng độ: 10 -3, 10-4, 105
, 3 ống nghiệm /nồng độ; 1ml dịch pha loãng /ống LT. Ủ ở 37oC trong 24h.

Sau 24h, lấy những ống nghiệm chứa môi trường LT ra quan sát kết quả, xem
những ống nào dương tính ( môi trường đục và ống chuông nổi hoặc có bọt khí
trong ống chuông) rồi cấy chuyển sang các ống BGBL, ủ ở 37 oC trong 24h.

25