KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT
GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT
Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)

SVTH : VÕ THỊ THU TRANG
Bộ môn : CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
Niên khóa: 2004-2008

Tháng 10/2008


KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES
TỪ CÂY CỎ NGỌT
Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)

Tác giả

VÕ THỊ THU TRANG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
Cấp bằng Kỹ sư ngành
Công nghệ hóa học

Giáo viên hướng dẫn
Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN

Tháng 10/2008
i


LỜI CÁM ƠN
Con thành kính ghi ơn công lao sinh thành và dưỡng dục của cha mẹ, cùng toàn
thể gia đình đã luôn bên con trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Hữu Anh Tuấn đã tận tình hướng dẫn và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin cám ơn T.S Võ Duy Huấn đã góp ý giúp tôi giải đáp những khúc mắc trong
quá trình thực hiện đề tài.
Xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố
Hồ Chí Minh và thầy cô Bộ môn Công Nghệ Hóa Học đã truyền đạt những kiến thức
quý báu cho tôi trong suốt thời gian học đại học.
Cuối cùng xin cám ơn toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên, chia sẻ những khó
khăn với tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Thành phố Hồ Chí Minh
Võ Thị Thu Trang

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Khảo sát quá trình tách chiết hoạt chất glycosides từ cây cỏ ngọt Stevia
Rebaudiana Bertoni (Bert.)”
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách các hoạt chất gây ngọt (hệ
dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết và tỉ lệ DM/NL) lên lượng cao tổng và
cao BuOH.
Mục đích: tối ưu các thông số ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách các hoạt chất cho

nguồn nguyên liệu cỏ ngọt Hải Hưng. Đây là qui hoạch thực nghiệm bốn yếu tố được
bố trí theo phương pháp bề mặt đáp ứng kiểu phương án quay bậc hai có tâm. Bốn yếu
tố khảo sát là hệ dung môi chiết (cồn 15, cồn 10, cồn 5), nhiệt độ chiết (65 oC, 70oC,
75oC), thời gian chiết (20 phút, 30 phút, 40 phút) và tỉ lệ DM/NL (65, 75, 85)
Kết quả: Từ phân tích ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên các đáp ứng, các
thông số tối ưu đã được thiết lập dựa trên giản đồ tối ưu với cơ sở là làm cực đại các
đáp ứng. Điều kiện chiết tách kiến nghị cho nguồn nguyên liệu Hải Hưng là hệ dung
môi (cồn, nước) 6,51%, nhiệt độ chiết 64,03oC, thời gian chiết 44,45 phút với tỉ lệ
DM/NL là 55; khi đó lượng cao tổng thu được là 1,84g và lượng cao BuOH là 0,22g.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa ..................................................................................................................... i
Lời cám ơn ................................................................................................................. ii
Tóm tắt ..................................................................................................................... iii
Mục lục ..................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt.......................................................................................... vi
Danh sách các bảng .................................................................................................. vii
Danh sách các hình ảnh – sơ đồ ............................................................................... viii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU........................................................................................ 1
1.1.

Đặt vấn đề .....................................................................................................1

1.2.

Mục đích đề tài..............................................................................................2

1.3.

Nội dung đề tài..............................................................................................2

1.4.

Yêu cầu .........................................................................................................2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3
2.1.

Tổng quan cây cỏ ngọt...................................................................................3

2.1.1.

Giới thiệu cây cỏ ngọt ............................................................................3

2.1.2.

Các hợp chất có trong cây cỏ ngọt ..........................................................5

2.1.3.

Tình hình sử dụng cỏ ngọt trong nước ..................................................12

2.1.4.

Tình hình sử dụng cỏ ngọt trên thế giới ................................................13

2.2.

Các công trình nghiên cứu về cây cỏ ngọt....................................................14

2.2.1.

Các nghiên cứu về các thành phần các chất có trong cây cỏ ngọt..........14

2.2.2.

Các nghiên cứu về chiết tách các hợp chất trong cây cỏ ngọt................15

2.2.3.

Các nghiên cứu về độc tố trong cỏ ngọt................................................21

2.2.4.

Các hướng nghiên cứu mới về cây cỏ ngọt ...........................................22

2.3.

Định tính và định lượng các thành phần có trong cỏ ngọt ............................23

2.3.1.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .........................................................23

2.3.2.

Sắc ký lớp mỏng TLC ..........................................................................24

2.4.

Ứng dụng của cỏ ngọt..................................................................................24

2.4.1.

Ứng dụng trong đời sống......................................................................25

2.4.2.

Các sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ cỏ ngọt ..............................25
iv


CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM ........................................................................ 27
3.1.

Thiết bị và hóa chất .....................................................................................27

3.1.1.

Thiết bị.................................................................................................27

3.1.2.

Hóa chất...............................................................................................27

3.2.

Nguyên liệu .................................................................................................27

3.2.1.

Khảo sát độ tro .....................................................................................28

3.2.2.

Khảo sát độ ẩm.....................................................................................29

3.3.

Qui trình công nghệ thực hiện .....................................................................30

3.4.

Phương pháp thí nghiệm..............................................................................35

3.4.1.

Cơ sở khảo sát......................................................................................35

3.4.2.

Bố trí thí nghiệm ..................................................................................35

3.5.

Phương pháp đo đạc ....................................................................................37

3.6.

Xử lý số liệu................................................................................................37

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 38
4.1.

Kết quả khảo sát nguyên liệu .......................................................................38

4.1.1.

Độ tro...................................................................................................38

4.1.2.

Độ ẩm ..................................................................................................38

4.2.

Kết quả khảo sát điều kiện chiết ..................................................................38

4.2.1.

Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến lượng cao tổng
.............................................................................................................41

4.2.2.

Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến lượng cao
BuOH...................................................................................................45

4.2.3.

Nhận xét chung ....................................................................................48

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 50
5.1.

Kết luận.......................................................................................................50

5.2.

Đề nghị........................................................................................................50

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................51
PHỤ LỤC........................................................................................................55
Phụ lục 1................................................................................................................... 55
Phụ lục 2................................................................................................................... 59
Phụ lục 3 ...................................................................................................................62
v


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ADI

Acceptable Daily Intake

ns

not stated in original publication

CC

Column Chromatography

HPLC

High Pressure Liquid Chromatography

TLC

Thin Layer Chromatography

TJPR

Tropical Journal of Pharmaceutical Research

EtOAc

Ethyl acetate

BuOH

Butanol

DM/NL

dung môi /nguyên liệu

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1.

Thành phần dinh dưỡng của cỏ ngọt.......................................................5

Bảng 2.2.

Tỉ lệ các hợp chất gây ngọt có trong lá khô.............................................7

Bảng 2.3.

Thành phần và cấu trúc của các hợp chất gây ngọt ................................7

Bảng 2.4.

Hàm lượng stevioside và rebaudioside A ở 1 số quốc gia .......................8

Bảng 2.5.

Cường độ gây ngọt của stevioside và rebaudioside A trong nước .........10

Bảng 2.6.

Cường độ gây ngọt của Marumilon 50 trong các loại dung dịch ...........10

Bảng 2.7.

Độ tan trong nước của các hợp chất gây ngọt .......................................11

Bảng 2.8.

Các nghiên cứu về khả năng gây độc chủ yếu của hỗn hợp chất ngọt
stevia từ Nhật Bản ................................................................................21

Bảng 2.9.

Hàm lượng tối đa các chất gây ngọt từ cỏ ngọt trong thực phẩm...........22

Bảng 3.1.

Mã hóa các yếu tố khảo sát...................................................................36

Bảng 3.2.

Bố trí thực nghiệm các điều kiện khảo sát ............................................36

Bảng 4.1.

Kết quả khảo sát độ tro của cỏ ngọt ......................................................38

Bảng 4.2.

Kết quả khảo sát độ ẩm của cỏ ngọt......................................................38

Bảng 4.3.

Kết quả khảo sát các điều kiện chiết tách (Thực nghiệm LẦN 1) ...........39

Bảng 4.4.

Kết quả khảo sát các điều kiện chiết tách (Thực nghiệm LẦN 2) ...........40

Bảng 4.5.

Tác động của các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng ........................42

Bảng 4.6.

Tác động của các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao BuOH .....................46

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH – SƠ ĐỒ
Hình 2.1.

Cây cỏ ngọt ............................................................................................3

Hình 2.2.

Hạt giống cỏ ngọt...................................................................................4

Hình 2.3.

Hoa cỏ ngọt............................................................................................4

Hình 2.4.

Cỏ ngọt khô............................................................................................5

Hình 2.5.

Công thức cấu tạo của steviol .................................................................6

Hình 2.6.

Mô hình đánh giá sự tương quan hậu vị..................................................9

Hình 2.7.

Cỏ ngọt được trồng theo mùa vụ ở Paraguay ........................................13

Hình 2.8.

Các sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ cỏ ngọt ..............................26

Hình 3.1.

Mẫu cỏ ngọt trước và sau xử lý ............................................................28

Hình 3.2.

Bảo quản cỏ ngọt..................................................................................28

Hình 3.3.

Cỏ ngọt được đun hồi lưu với dung môi chiết.......................................32

Hình 3.4.

Hỗn hợp chiết được lọc chân không loại phần bã rắn............................32

Hình 3.5.

Cô quay chân không loại dung môi ......................................................32

Hình 3.6.

Cao tổng...............................................................................................33

Hình 3.7.

Lắc với EtOAc .....................................................................................33

Hình 3.8.

Lọc và tách lấy pha lỏng.......................................................................33

Hình 3.9.

Cô quay chân không loại EtOAc ..........................................................34

Hình 3.10.

Lắc với BuOH bão hòa nước ................................................................34

Hình 3.11.

Cô quay chân không loại BuOH ...........................................................34

Hình 4.1.

Mô hình thể hiện tính tương thích của các yếu tố lên cao tổng..............41

Hình 4.2.

Mô hình bề mặt đáp ứng của cao tổng được biểu diễn theo thời gian
chiết, nhiệt độ chiết và hệ dung môi .....................................................42

Hình 4.3.

Tương tác giữa các yếu tố lên lượng cao tổng.......................................43

Hình 4.4.

Mô hình thể hiện tính tương thích của các yếu tố lên cao BuOH ..........45

Hình 4.5.

Mô hình bề mặt đáp ứng của cao BuOH được biểu diễn theo các thông
số khảo sát điều kiện chiết....................................................................46

Hình 4.6.

Tương tác giữa các yếu tố lên lượng cao BuOH ...................................47

viii


Hình 4.7.

Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng và cao BuOH ...
.............................................................................................................49

Hình 4.8.

Tối ưu hóa các yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng và cao BuOH ......49

Sơ đồ 2.1.

Qui trình tách chiết chất ngọt từ cỏ ngọt ở Nhật Bản ............................17

Sơ đồ 2.2.

Qui trình tách chiết hỗn hợp chất ngọt từ cỏ ngọt ở Paraguay ...............18

Sơ đồ 2.3.

Qui trình tách chiết stevioside từ cỏ ngọt ở Việt Nam...........................19

Sơ đồ 2.4.

Qui trình tách chiết stevioside từ cỏ ngọt làm chất chuẩn ở Việt Nam ..20

Sơ đồ 3.1.

Qui trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết.................31

ix


CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Chất ngọt từ xưa đã là một trong những loại gia vị không thể thiếu được của loài
người. Đường (sucrose) hay còn gọi là đường mía là loại chất ngọt đã được biết đến
và sử dụng rộng rãi hơn 4000 năm nay. Tuy nhiên, việc sử dụng một lượng đường lớn
hằng ngày có thể là nguyên nhân dẫn đến những vấn đề dinh dưỡng và bệnh lý như
béo phì, tiểu đường, cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, các bệnh về răng miệng…. Hàng
loạt những hợp chất gây ngọt tổng hợp đã xuất hiện và được sử dụng trên nhiều quốc
gia như saccharin, cyclamate, aspartame, acesulfame-K, alimate và sucralose[20].
Nhưng việc sử dụng chúng cũng đã bị hạn chế và ngăn cấm ở nhiều quốc gia cũng như
chống chỉ định đối với một số loại bệnh.
Do đó, xu hướng tìm kiếm những hợp chất gây ngọt không chứa năng lượng (no
calori) có nguồn gốc từ thiên nhiên là một trong những hướng nghiên cứu mới hiện
nay. Hơn 75 chất ngọt trên 20 họ thực vật đã được tìm thấy và sử dụng ở nhiều nước
trên thế giới như: glycyrrhizin (Nhật Bản), mogroside V (Nhật Bản), phyllodulcin
(Nhật Bản), thaumatine (Nhật Bản, Anh), và đặc biệt là stevioside từ cây cỏ ngọt
Stevia rebaudiana Bertoni (Nhật Bản, Brazil, Hàn Quốc….) [11].
Cỏ ngọt có chứa hàm lượng lớn các chất có vị ngọt thuộc họ diterpen glycoside,
ngọt khoảng 300 lần so với đường sucrose và đặc biệt là tạo ra vị ngọt nhưng không
tạo ra hoặc tạo ra rất ít năng lượng[35]. Đặc tính quan trọng của các glucosides này là
có thể làm ngọt cho các loại thức ăn và đồ uống mà không gây độc hại cho người,
không đòi hỏi kỹ thuật sản xuất phức tạp, công nghệ thu hái chế biến đơn giản nhưng

vẫn đạt năng suất cao[34][35]. Ở Việt Nam, khả năng phát triển loại cây này là khá tốt
ở nhiều vùng sinh thái khác nhau trên đất nước ta mà không đòi hỏi khắt khe lắm về
điều kiện thổ nhưỡng như Đà Lạt, Hải Hưng, Cao Bằng….. Tuy nhiên, hiện nay ở
nước ta việc nghiên cứu về loại cây này vẫn còn khá hạn chế dù những tiềm năng thiết
thực mà cây cỏ ngọt mang lại là vô cùng to lớn .Do đó, đề tài này nhằm mục đích khảo
sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tách chiết hoạt chất gây ngọt từ cây cỏ ngọt để
có thể áp dụng trên qui mô công nghiệp.

1


Với những nhận định như trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT QUÁ
TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT Stevia
Rebaudiana Bertoni (Bert.)” dưới sự hướng dẫn của Th.s Nguyễn Hữu Anh Tuấn.
1.2.

Mục đích đề tài
(i).

Lựa chọn qui trình chiết tách hoạt chất gây ngọt từ cây cỏ ngọt

(ii). Khảo sát các điều kiện chiết tách các hoạt chất glycosides từ cây cỏ ngọt
1.3.

Nội dung đề tài

Tổng quan về các quá trình nghiên cứu và sử dụng cỏ ngọt trên thế giới và Việt
Nam hiện nay.
Sử dụng nguồn nguyên liệu cỏ ngọt từ Hải Hưng (Việt Nam), chúng tôi tiến hành
khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách các hoạt chất gây ngọt như sau:

(i).

Hệ dung môi chiết

(ii).

Nhiệt độ chiết

(iii).

Thời gian chiết

(iv).

Tỉ lệ giữa dung môi chiết và nguyên liệu chiết

Ảnh hưởng của các yếu tố trên được đánh giá theo hiệu suất chiết trên hai thông số:

1.4.

(i).

Khối lượng cao tổng

(ii).

Khối lượng cao BuOH

Yêu cầu

Từ kết quả khảo sát, kiến nghị qui trình và điều kiện chiết tách thích hợp cho nguồn
cỏ ngọt Hải Hưng, Việt Nam.

2


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Tổng quan cây cỏ ngọt

2.1.1. Giới thiệu cây cỏ ngọt
Cỏ ngọt còn có tên khoa học là Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.), thuộc giới
Plantae, lớp Magnoliopsida, loài Asterales và chi Stevia. Chi Stevia có hơn 150 loài;
nhưng chỉ tìm thấy chất ngọt trong 18 loài. Và Stevia rebaudiana Bertoni (Bert.) là
loài chứa hàm lượng chất gây ngọt cao nhất[38].

Hình 2.1. Cây cỏ ngọt ()
Cỏ ngọt hay còn gọi là cỏ mật, cỏ đường, trạch lan hay cúc ngọt. Cỏ ngọt còn có các
tên gọi khác như: candy leaf, sugar leaf (Anh), sweet honey leaf (Úc), sweet herb, ka´a
he´ê (Paraguay), estevia (Tây Ban Nha)….Những tên này đều có nghĩa là cỏ ngọt
(sweet herb) hay còn gọi là cây thay thế đường (Sweetener Sugar Substitute).
a). Nguồn gốc của cây:
Cỏ ngọt có nguồn gốc tự nhiên ở vùng Đông Bắc Paraguay, được biết đến như một
loại gia vị ngọt đa năng từ thế kỷ thứ XVII[11]. Cỏ ngọt được sử dụng trong trà để
tăng vị, thay đường, bổ sung vào các loại thuốc dược thảo. Năm 1988, cỏ ngọt được
biết đến như 1 cây trồng mùa vụ ở Nam Mỹ.
b). Đặc điểm thực vật học của cây: [34], [1], [36]
Cỏ ngọt sinh sản hữu tính (gieo hạt) và vô tính (giâm cành).
Tuy nhiên hiệu suất của quá trình gieo hạt không cao, khoảng 25%.

3


Hình 2.2. Hạt giống cỏ ngọt
Cỏ ngọt có thân rễ khỏe, mọc cạn đến 30cm (tùy vào độ phì nhiêu, tơi xốp, và mực
nước ngầm của đất), ít phân nhánh; sống từ 3 đến 5 năm, là 1 loại cây ưa ẩm, ưa sáng
nhưng sợ úng và chết khi ngập nước.
Toàn thân cây có vị ngọt, nhiều nhất là ở lá, lá già ở dưới thấp chứa nhiều chất ngọt
hơn lá non ở trên cao. Hàm lượng chất ngọt trong cỏ ngọt đạt cao nhất ở thời kỳ trước
khi nở hoa, tức là nên thu hoạch ở giai đoạn hình thành nụ, không nên để cây ra hoa
mới thu hái. Hàm lượng chất ngọt có thể thay đổi từ 4 đến 20% trọng lượng lá khô, tùy
điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu cũng như điều kiện chăm sóc nhưng cũng chỉ dao động
trên dưới 10%. Stevioside và rebaudioside A là hai chất có hàm lượng nhiều nhất trong
cây, kế đó là rebaudioside B, dulcoside A và rebaudioside C[35]
Hoa cỏ ngọt màu trắng ngà, thuộc loại hoa có đầu phức hợp, nhỏ, mọc ở đầu cành
hay kẽ lá. Phấn hoa có nhiều gai lông nên dễ gây dị ứng.

Hình 2.3. Hoa cỏ ngọt
Trong quá trình phơi sấy bảo quản, tuyệt đối không để bị ướt vì thành phần ngọt
trong lá sẽ bị tan chảy ra ngoài, giảm chất lượng sản phẩm. Lá khô sau khi thu hái và
sấy khô (hàm lượng nước phải dưới 10%) phải được bảo quản trong túi ni lông, tránh
hút ẩm….[36] thì các thành phần dinh dưỡng của cỏ ngọt mới được đảm bảo.
4


Hình 2.4. Cỏ ngọt khô
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của cỏ ngọt (tính trên 100mg khối lượng khô) [13]
Thành phần dinh dưỡng

Trên 100mg

Hàm lượng xấp xỉ

Hàm lượng ẩm (g)

7,0

Năng lượng (kcal)

270,0

Chất đạm (g)

10,0

Chất béo (g)
Chất bột đường (g)
Chất tro (g)

3,0
52,0
11,0

Chất xơ thô (g)

18,0

Khoáng chất

Canxi (mg)

464,4

Photpho (mg)

11,4

Sắt (mg)
Natri (mg)
Kali (mg)

55,3
190,0
1800,0

Anti-Nutritional Factors

Acid Oxalic (mg)

2295,0

Tannins (mg)

0,0

2.1.2. Các hợp chất có trong cây cỏ ngọt
Từ thập niên 1970, việc nghiên cứu các thành phần gây ngọt trong cỏ ngọt mới
được chú ý và phát triển mạnh với sự đóng góp quan trọng của ông Tanaka và các
cộng sự ở trường đại học Hiroshima. Cỏ ngọt chứa hỗn hợp các thành phần: labdane
diterpenes, triterpenes, stigmasterol, tannins, tinh dầu, và các hợp chất gây ngọt

diterpenes glycosides… đã có hơn 100 hợp chất được tìm thấy trong cây cỏ ngọt[11].

5


2.1.2.1.

Các hợp chất gây ngọt

Bao gồm 8 loại hợp chất: stevioside, steviobioside, dulcoside, và rebaudioside
A,B,C,D,E. Theo đó, 8 loại hợp chất gây ngọt glycosides từ cỏ ngọt đều chứa chung 1
aglycon là steviol (13- hydroxyl- ent kaur -16- en-19-oic acid) và chỉ khác nhau về
thành phần glycosid ở C13 và C19 [11]. Trong đó hợp chất chứa hàm lượng nhiều nhất
là stevioside và rebaudioside A.

Hình 2.5. Công thức cấu tạo của steviol
a). Tỉ lệ các hợp chất gây ngọt trong cây cỏ ngọt
Theo Tanaka (1977), từ dịch chiết methanolic của lá cây cỏ ngọt; thu được
rebaudioside A là 1,4% khối lượng so với lá cỏ khô (w/w) chiếm khoảng 25-51% khối
lượng stevioside ; rebaudioside C là 0,4%; rebaudioside D là 0,03%; rebaudioside E là
0,03% …còn rebaudioside B có được do sự thủy phân 1 phần rebaudioside A trong
quá trình chiết. Rebaudioside A cũng được tìm thấy trong hoa cỏ ngọt với hàm lượng
thấp, khoảng 0,15% khối lượng[11]. Thông thường trong cao chiết BuOH, stevioside
chiếm hàm lượng lớn nhất trong tổng chất ngọt khoảng 60-70%; rebaudioside A chiếm
khoảng 30-40% tổng chất ngọt[35]
Lượng stevioside từ lá cỏ ngọt khô có thể biến đổi rất lớn, vào khoảng 5-22% khối
lượng của lá khô tùy vào điều kiện thổ nhưỡng và chăm bón. Stevioside cũng được tìm
thấy trong hoa của cỏ ngọt với hàm lượng thấp, khoảng 0,9% khối lượng của lá khô
(w/w) [11]

6


Bảng 2.2. Tỉ lệ các hợp chất gây ngọt có trong lá khô (w/w)[11]
Thành phần
Dulcoside A
Rebaudioside A
Rebaudioside B
Rebaudioside C
Rebaudioside D
Rebaudioside E
Steviolbioside
Stevioside

Bộ phận của cây

Tỉ lệ % theo khối lượnglá khô (w/w)

Lá
Thân
Lá
Hoa
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Lá
Thân

0,03
ns
1,43
0,15
0,44
0,4
0,03
0,03
0,04
2,18
0,92

b). Cấu trúc của các hợp chất diterpenes glycosides

Bảng 2.3. Thành phần và cấu trúc của các hợp chất gây ngọt[8]



glc, β-D-glucopyranosyl; rhm, α-L-rhamnopyranosyl



Sweening potency: độ ngọt so với đường sucrose

7


c). Hậu vị của các hợp chất gây ngọt
Trong các hợp chất gây ngọt thì stevioside và rebaudioside A là hai hợp chất quan
trọng và được chú ý nhất bởi độ gây ngọt và hàm lượng của chúng trong cây.

Tỉ lệ rebaudiosideA/stevioside được xem như là 1 tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng
của cỏ ngọt. Tỉ lệ rebaudioside A/stevioside lớn hay nhỏ tùy thuộc vào điều kiện khí
hậu, đất đai và phân bón. Nếu hỗn hợp có lượng rebaudioside A/stevioside lớn hơn
hoặc bằng 1 thì hỗn hợp gần như không có vị hậu. Hiện đã có nhiều nghiên cứu
phương pháp gieo trồng và bón phân nhằm làm tăng tỉ lệ này[35]
Bảng 2.4. Hàm lượng stevioside và rebaudioside A ở 1 số quốc gia :[18]
Quốc gia

Tỉ lệ tính trên 100g lá khô
Stevioside/Rebaudioside A

Russia
Ukraine

5,8/1,2
4,8/1,3

South Korea

5,5/2,5

China

6,6/3,7

Paraguay

9,1/3,8

Japan

7,7/1,9

Canada

5,0/0,3

Vietnam

15,5/3,8

Rebaudioside A: là một trong số những diterpene glycoside có độ ngọt mạnh nhất
và có vị giống sucrose nhất. Do đó, việc sử dụng rebaudioside A rất phù hợp trong
thực phẩm và đồ uống…[11]
Stevioside: có lợi thế là đa tính năng như không độc, không chứa calori, ổn định bởi
tác động của nhiệt, không lên men, 100% chất tự nhiên, không có tác nhân gây ung
thư, không gây nghiện, nhất là đối với trẻ con. Stevioside không được hấp thu trong
đường ruột, vì vậy nó cũng không tham gia trao đổi chất bởi enzyme trong ống tiêu
hóa[1], chính vì lý do này mà stevioside rất phù hợp cho những bệnh nhân tiểu đường,
béo phì, tim mạch….
Stevioside ngọt hơn sucrose từ 150300 lần , có vị hậu. Rebaudioside A ngọt hơn
sucrose 250450 lần và không có hậu vị. Ta có thể đánh giá hậu vị của stevioside và
rebaudioside A theo mô hình sau:

8


Hình 2.6. Mô hình đánh giá sự tương quan hậu vị[33]

d). Đặc tính của các hợp chất gây ngọt [11]

Đặc điểm khiến cỏ ngọt trong vòng 20 năm qua (1908-1988) từ một loại cây dại du
nhập đã trở thành cây trồng mùa vụ với năng suất ngày càng tăng ở nhiều quốc gia trên
thế giới là bởi những đặc trưng riêng biệt của hỗn hợp chất ngọt trong cây so với
đường sucrose.
 Về căn bản không sinh năng lượng
 Ổn định ở nhiệt độ cao và trong khoảng pH rộng
 Độ ngọt cao hơn nhiều so với sucrose; có vị dịu ngọt và dễ chịu
 Tính ngọt được làm mạnh và cải thiện hơn nếu phối hợp với muối, đường và
các acid hữu cơ
(i).

Cường độ gây ngọt

Cường độ gây ngọt của 1 chất ngọt biến đổi theo độ tinh khiết, nhiệt độ, pH, tỷ lệ
tồn tại, sự hiện diện của các thành phần thực phẩm khác và nồng độ của dung dịch
đường có thể so sánh được. Thông thường, nhiều hợp chất gây ngọt có độ ngọt cao tồn
tại trong giới hạn khoảng 2 đến 6% sucrose trong dung dịch nước

9


Bảng 2.5. Cường độ gây ngọt của stevioside và rebaudioside A trong dung dịch nước
Độ ngọt tương đối ( sucrose =1)

Nồng độ Sucrose
so sánh (%)

Stevioside

Rebaudioside A

2

267

385

4

160

308

6

133

261

8

118

250

10

111

208

Độ ngọt tương đối so với dung dịch Sucrose 4% được đánh giá bởi hội đồng cảm
quan ở Maruzen Pharmaceuticals Co.Ltd, stevioside và rebaudioside A đã được xác
định có độ ngọt gấp 160 lần và 308 lần.
Bằng cách trộn với muối hoặc acid hữu cơ như acid lactic, acid citric, acid acetic,
acid malic và acid tartaric; độ ngọt của các hợp chất gây ngọt Stevia được làm mạnh
thêm trong khi hậu vị của chúng giảm đi. Ví dụ: chất ngọt có tên thương mại
Marumilon 50 (Maruzen Pharmaceuticals.Co.Ltd) gồm có 60% cao chiết “Stevia
extract”và 40% dextrin – khi so sánh với nồng độ sucrose 4%, độ ngọt của chúng gấp
308 lần trong dung dịch muối 5% và ngọt gấp 111 lần trong dung dịch nước. Tác dụng
này đã tạo được một cơ sở lập luận rằng: khi trộn với muối hoặc acid hữu cơ thì cường
độ gây ngọt của hợp chất stevia tăng lên có mức độ đáng kể trong khi cường độ gây
ngọt của sucrose giảm xuống.
Bảng 2.6. Cường độ gây ngọt của Marumilon 50 trong các loại dung dịch
Nồng độ
Sucrose
so sánh (%)
2
4
6
8
10

(ii).

Độ ngọt tương đối ( sucrose =1) của Marumilon 50
Stevioside
143
111
90

60
50

Rebaudioside A
333
308
273
200
125

Tính chất gây ngọt

Khi đưa vào miệng, stevioside gây một cảm giác ngọt dịu nhẹ có dư vị; và
stevioside có vị gần giống sucrose hơn so với các chất gây ngọt triterpen glycoside,

10


glycyrhizin cũng như tính gây ngọt của stevioside cao hơn sucrose về độ dịu nhẹ và độ
sảng khoái.
Khi chất ngọt stevia được sử dụng trong thực phẩm, đặc biệt là những thực phẩm
không chứa muối như mứt kẹo, đồ uống…. thì chúng phần lớn đều được phối hợp với
các loại hợp chất gây ngọt khác như sucrose, glucose, fructose…..khi đó quan sát ta
thấy đặc tính gây ngọt của stevioside được cải thiện, có vị gần giống sucrose hơn đồng
thời hậu vị của nó cũng giảm đi. Nhưng có vẻ như không có 1 tỉ lệ nào tối ưu nhất cho
việc phối chế stevia với các loại đường trên; đặc biệt nếu phối chế với “sugar alcohol”
thì những tác động trên hầu như không có ý nghĩa.
(iii).

Tính hòa tan

Độ hoà tan không ảnh hưởng nhiều đến việc sử dụng các hợp chất gây ngọt này vì
độ ngọt cao của nó. Ở điều kiện nhiệt độ bình thường (khoảng 30oC) thì 2g hợp chất có
thể hoà tan trong 100ml nước
Bảng 2.7. Độ tan trong nước của các hợp chất gây ngọt
Diterpen Glycosides

Độ tan trong nước (%)

Stevioside
Rebaudioside A
Rebaudioside B
Rebaudioside C
Rebaudioside D
Rebaudioside E
Steviol bioside
Dulcoside A

(iv).

0,13
0,8
0,1
0,21
1
1,7
0,03
0,58

Tính ổn định

 Ổn định với nhiệt
Đây là một nhân tố quan trọng vì phần lớn việc sử dụng các chất ngọt stevia đều ở
trong điều kiện xử lý nhiệt như nấu nướng.
Đặc tính gây ngọt trong dung dịch nước của stevioside không thay đổi khi gia nhiệt
đến 95oC trong 2 giờ. Khi giữ nhiệt ở 95oC trong 8 giờ thì vị ngọt giảm nhẹ. Điều này
đã giúp chất ngọt stevia không bị phân hủy khi được ứng dụng trong thực tiễn.[11]
 Ổn định trong dung dịch có tính acid và tính kiềm
Một dung dịch acid có chứa 0,02% stevioside ở pH ≥ 3 giữ ở 95oC trong 1giờ thì
đặc tính của stevioside không thay đổi; nhưng với dung dịch chứa 12% stevioside ở
11


pH = 2 dưới những điều kiện trên thì bị phân huỷ. Theo Fujita và Edahiro (1979),
stevioside ổn định ở khoảng pH từ 3 ÷ 9 ở 100oC trong 1 giờ.
Ta có thể thấy rằng các chất gây ngọt chính stevioside và rebaudioside A của
“Stevia extracts” phân hủy tương ứng thành steviol bioside và rebaudioside B trong
dung dịch kiềm mạnh; làm cường độ gây ngọt giảm đi. Tuy nhiên, việc sử dụng các
chất ngọt stevia thường không được dùng dưới những điều kiện như trên.
2.1.2.2.

Các hợp chất không gây ngọt

Ngoài các hợp chất gây ngọt diterpen glycosides, cỏ ngọt còn chứa các thành phần
khác như sterol, labdane diterpenes, triterpenes, stigmasterol, tannins, tinh dầu…..và
một số thành phần vi lượng như phosphorus, sắt, canxi, kali, magie, kẽm, vitamin A,
protein, xơ.....cũng được tìm thấy trong cỏ ngọt với hàm lượng thấp.
Thành phần và cấu trúc của các hợp chất không gây ngọt: xem Phụ lục 1:
2.1.3. Tình hình sử dụng cỏ ngọt trong nước
Cây cỏ ngọt được nhập vào Việt Nam từ tháng 8/1988 từ Achentina[36][35]. Năm

1990, Công ty Dược Liệu Trung Ương 2 nhập cây cỏ ngọt từ Viện nghiên cứu củ cải
đường của Liên xô…Sau đó, Việt Nam nhận được hạt giống từ Viện nghiên cứu cây
trồng toàn liên bang Nga (VIR) cung cấp[36][35]. Cây cỏ ngọt khá thích nghi với điều
kiện thổ nhưỡng ở nước ta và có thể đạt năng suất từ 2 đến 3 tấn lá khô/ha/năm. Dù
vậy nhưng ở nước ta phần lớn mới chỉ trồng cỏ ngọt trên quy mô nhỏ ở các vùng núi
cao [35]…như ở Cao Bằng, Hà Giang, Hòa Bình, Vĩnh Phú, Hải Hưng, Hà Nội, Hà
Tây, Lâm Đồng, Đaklak…
Tuy nhiên, việc thu hái và chế biến ở nước ta chủ yếu chỉ ở dạng thô; chưa khai thác
hết tiềm năng của nguồn dược liệu này. Lá sau khi thu hái, phơi, sấy làm trà đơn hoặc
phối hợp với các dược liệu khác như artiso, sâm, quy, nhân trần hoặc chiết xuất ở dạng
cao thô còn lẫn nhiều tạp chất, mùi và vị chưa được đặc trưng. Năm 1997, Viện Dược
liệu đã thành công trong việc phân lập stevioside tinh khiết trên quy mô phòng thí
nghiệm, nhưng chủ yếu để làm chất chuẩn phục vụ công việc định lượng hàm lượng
stevioside trong các mẫu cỏ ngọt trồng ở Văn Điển (Hà Nội), Lâm Đồng, Thái
Nguyên….

12


2.1.4. Tình hình sử dụng cỏ ngọt trên thế giới
Việc sử dụng cỏ ngọt ở các quốc gia tùy thuộc vào luật lệ và truyền thống của mỗi
nước. Đối với hầu hết các quốc gia ở Châu Á và Nam Mỹ thì chất ngọt của cỏ ngọt đã
được công nhận và được sử dụng như là 1 chất ngọt phổ biến từ nhiều năm nay bởi ít
tạo năng lượng và không gây ảnh hưởng phụ[5]. Ngược lại ở các quốc gia phương Tây
vẫn chỉ xem cỏ ngọt như là một loại thực phẩm bổ sung.
Ngay từ những năm đầu của thế kỷ 20, người dân Paraguay đã biết sử dụng cỏ ngọt
như một loại nước giải khát; đến những năm 1970 cỏ ngọt đã bắt đầu được sử dụng
rộng rãi ở Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, và nhiều nước ở Đông Nam
Á.

Hình 2.7. Cỏ ngọt được trồng theo mùa vụ ở Paraguay
Ở Paraguay, cỏ ngọt được ghi vào danh sách những chất được sử dụng cho đồ uống
ngọt. Dịch chiết nước của lá cỏ ngọt được sử dụng như là một tác nhân ngừa thai và
cho việc điều trị bệnh tăng glucose huyết; nó còn được dùng làm thuốc bổ, trị đau bao
tử , giảm huyết áp và điều trị bệnh béo phì.[2]
Ở Brazil, cỏ ngọt được sử dụng làm chất ngọt. Hai chế phẩm, trà cỏ ngọt và viên
nang cỏ ngọt đã được cho phép bán chính thức kể từ năm 1980.
Ở Mỹ nó đã bị cấm vào năm 1990, nhưng sau đó được phép sử dụng trở lại vào năm
1995. Nguyên nhân chính chủ yếu là do quá trình tinh sạch sản phẩm khi sử dụng hóa
chất để chiết tách chất ngọt này.
13


Ở Châu Âu, cỏ ngọt bắt đầu được sử dụng từ năm 1986. Nhưng từ năm 1997 có sự
cân nhắc đối với những loại sản phẩm mới nên đã cấm sử dụng trong năm 2001 để chờ
những kết quả kiểm tra và ý kiến của Hội đồng khoa học Châu Âu về loại chất ngọt
này. Lý do mà EU chưa cho phép sử dụng stevioside là steviol, 1 loại aglycone của
stevioside có thể gây độc[16]..
Nhật là quốc gia tiêu thụ cỏ ngọt nhiều nhất trên thế giới. Theo ước tính thì có
khoảng 200 tấn chất ngọt stevia đã được sử dụng mỗi năm tại Nhật (1996). Con số này
tương đương với khoảng 2000 tấn lá khô được sử dụng cho việc chiết tách sản phẩm
chất ngọt stevia. Giá trị thương mại của các sản phẩm chất ngọt stevia ở Nhật Bản
được ước tính khoảng 2  3 triệu yên/năm.[11]
Từ năm 1991, các nước phát triển dự kiến giảm 30% đường có năng lượng cao bằng
các loại chất ngọt thay thế đường (sweetener-sugar substitute) có năng lượng thấp và
đáp ứng nhu cầu phòng ngừa và điều trị bệnh đái tháo đường, cao huyết áp, béo
phì….[36][35]. Và chất ngọt trong cỏ ngọt vẫn được cân nhắc ít nhiều, dù các quốc gia
vẫn chưa thống nhất được quan điểm với nhau. Chính điều này làm cho các nghiên
cứu về cây cỏ ngọt được quan tâm và phát triển.
2.2.

Các công trình nghiên cứu về cây cỏ ngọt

2.2.1. Các nghiên cứu về các thành phần các chất có trong cây cỏ ngọt
Đã có hơn 100 hợp chất được nhận diện trong cây cỏ ngọt[11] .
Năm 1900, Ovidio Rebaudi đã thành công trong việc cô lập 2 loại hợp chất từ cỏ
ngọt: chất có vị ngọt và chất có vị đắng (hậu vị)[7].
Tiếp đó, hai nhà khoa học Reseback (1908) và Dieterich(1909) đã chiết xuất được
glucoside từ lá cỏ ngọt.[11]
Đến năm 1931, Bridel và Lavieille mới xác định và tinh chế được tinh thể
stevioside.
Pasquel et al. (1999) đã khảo sát bằng phương pháp trích ly siêu tới hạn (SCFE) các
hợp chất không chứa gốc đường (non-glycoside) trong lá cỏ ngọt. Các chất được nhận
danh lần lượt qua phương pháp này trong dịch chiết là: spathulenol; decanoic acid;
8,11,14-ecosatrienoic

acid;

2-methyl

octadecane;

pentacosane;

octacosane;

stigmasterol; β- sitosterol; α- and β-amyrine; lupeol; β-amyrin acetate; and pentacyclic
triterpene [7].
14

Các nghiên cứu sâu hơn về các thành phần trong cỏ ngọt phần lớn là ở Nhật Bản (ví
dụ như Abe và Sonobe (1977), Morita (1977), Tanaka (1987), Yoshihira et al.
(1987)[11]. Soejarto (1983) tin rằng sesquiterpene lactones có liên quan mật thiết đến
hậu vị đắng trong cỏ ngọt (aftertaste).Tsanava et al. (1991) đề nghị thừa nhận là
caryophyllene và spathulenol góp phần quyết định hậu vị. Tuy nhiên, Phillips (1987)
đã chỉ ra rằng stevioside và rebaudioside A quyết định đến hậu vị trong cỏ ngọt[1]
2.2.2. Các nghiên cứu về chiết tách các hợp chất trong cây cỏ ngọt
Hiện đã có rất nhiều các qui trình chiết tách các hợp chất từ cây cỏ ngọt, chủ yếu là
tách hỗn hợp chất ngọt, stevioside, rebaudioside A. Mỗi qui trình đều có những điều
kiện và những yêu cầu đặc trưng riêng. Các quốc gia cũng có những qui trình tách
chiết khác nhau như: Nhật Bản, Paraguay, Hàn Quốc……Ở Việt Nam mới chỉ đưa ra
qui trình chiết và cô lập stevioside trong phòng thí nghiệm, chưa ứng dụng được vào
sản xuất.
a). Phương pháp chiết tách cổ điển
Theo Alvarez và Couto(1984) và Goto(1997) [7]
Cho 50g lá cỏ ngọt vào vừa đủ một lít nước; đun sôi ở nhiệt độ phòng (25÷30 oC)
trong vòng 1 giờ dung dịch chiết được lọc chân không, trong phễu phân tách dịch
chiết hòa thêm isobutyl alcohol giữ ở tỉ lệ thể tích 40:60 Để yên đến khi các pha
được phân ly hoàn toàn  dịch chiết butanolic được đem ly tâm với tốc độ 3500
vòng/phút trong thời gian 15 phút  sau đó gia nhiệt dịch chiết đến 80oC và lọc qua
than hoạt tính (1g than hoạt tính cho mỗi 100ml dịch chiết)  dịch chiết tiếp tục được
cô đặc l bằng máy cô quay và để trong 24 giờ để các tinh thể glycoside kết tinh hoàn
toàn  tinh thể được hòa tan lại với methanol và sấy trong lò tuần hoàn không khí.
Nước cái của sự kết tinh được cô đặc và trích ly bằng acetone. Tinh thể được rửa bằng
acetone khan và sấy trong lò tuần hoàn không khí.
b). Phương pháp trích ly mới :
Phương pháp trích ly sử dụng dung môi CO2 siêu tới hạn SFE (Supercritical Fluid
Extraction) [7][15]
 Nguyên tắc: lợi dụng tính chất khí CO2 có thể hóa lỏng, dùng CO2 lỏng để chiết

tách chất ra khỏi nguyên liệu.
15