Cải biến di truyền chủng xạ khuẩn streptomyces natalensis VTCC a 3245 nhằm tăng khả năng sinh chất kháng sinh natamycin để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ó C G IA H À N Ộ I

ùHOanH

BÁO CÁO TỎNG KẾT
K É T Q U Ả T H Ụ C H IỆ N Đ Ề T À I K H & C N
CÁP ĐẬI h ọ c QUÓC g i a

T ên đê tài: C ả i b iê n di tru y ề n c h ủ n g x ạ k h u ấ n S tr e p to m y c e s n a ta le n sis
V T C C -A -3 2 4 5 n h ăm tă n g k h ả n ă n g sin h c h ấ t k h á n g sin h n a ta m y c in để ứ n g
d ụ n g tro n g b ả o q u ả n th ự c p h ẩm

Mă số đề tài: QG. 14.62
C h ủ nhiệm đề tài: T S . N g u y ễ n K im N ữ T h ả o

ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
ĨRUNG TẦM THÔNG TIN THƯ VIỄN
.. ũ ũ ũ á ũ n a u M


PHẢN I. THÔiNG TIN CHUNG
1.1. lên đê tài: Cải biến di truyền chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensỉs VTCC-A-3245 nhằm
tăng khả năng sinh chất kháng sinh natamycin để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm
1.2. Mã số: QG. 14.62
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT

Chức danh, học vị, họ và tên

Đon vị công tác

Vai trò thực hiện đề tài

1

TS. Nguyễn Kim Nữ Thảo

Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học

Chủ nhiệm đề tài

2

TS. Nguyễn Quỳnh Uyển

Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học

Thành viên

3

ThS. Nguyễn Thị Vân

Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học

Thành viên

4

ThS. Phạm Thị Thu Hướng

Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học

Thành viên

1.4. Đo'n vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nehệ Sinh học
1.5. Thòi gian thực hiện:

1.5.1. Theo hợp đồng:
1.5.2. Gia hạn (nếu có):

từ tháng 04 năm 2014 đến tháng 03 năm 2016
đến tháng......năm

1.5.3. Thực hiện thực tế:

từ tháng 04 năm 2014 đến tháng 03 năm 2016

1.6. N h ữ n g th a y đ ổ i so v ó i th u y ế t m inh ban đ ầu (nếu có):

(Vệ mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ỷ
kiên của Cơ quan quản lý)
1.7. Tông kinh phí đưọc phê duyệt của đề tài: 150 triệu đồng.

PHÀN II. TỎNG QUAN KỂT QUẢ NGHIÊN c ử u
1. Đặi vấn đề
Striptomyces, chi lớn nhất của nhóm xạ khuẩn được biết đến với khả năng tổng họp một lượng

lớn cá; chât trao đôi thứ câp bao gôm các chât kháng vi sinh vật. Trong số đó, natamycin, một họp
chât thuộc nhóm polyene đã và đang thu hút được nhiều sự quan tâm. Natamycin được sản xuất từ
quá tình lên men một sô chủng xạ khuân như Streptomyces nơtalensis, Streptomyces
chattcnoogensịs và Strepiomyces gilvosporeus [8 ]. Đặc điểm nồi bật của natamycin là chúng có khả
năng tháng nâm mạnh, ức chê sinh trưởng của nâm men, nấm mốc và ngăn ngừa sự hình thành
aílatoiin từ nâm sợi. So với các chât kháng nấm khác thì natamycin có độc tính rất thấp với tế bào
động /ật có vú nên chúng được ứng dụng nhiêu trong y học để điều trị hiệu quả các bệnh nhiễm
trùng ịiảc mạc do Aspergillus và Fusarỉum gây ra [6 ]. Thêm vào đó, natamycin còn được sử dụns
rộng ríi trong công nghiệp thực phâm đê kéo dài thòi gian bảo quản của nhiều loại thực phẩm khác
nhau ihư pho mát, xúc xích, hoa quả và đô uống. Natamycin là một trong số rất ít các chất kháng
nâm clrợc khuyên cáo sử dụng trong thực phâm bởi cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ
(FDA . ơ Việt Nam, natamycin năm trong danh mục phụ gia thực phâm được phép sử dụng trong
sản Xiất, chế biến và kinh doanh thực phẩm theo thông tư số 27/2012/TT-BYT của Bộ Y Tế.
IV natamycin có vai trò phổ biến như vậy nhưng hiện nay ờ Việt Nam. toàn bộ lưọng
natanvcin được sử dụng đêu phải nhập khẩu. Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và
Công nghệ sinh học hiện đang bảo quản chủng Streptomyces natalensis VTCC- A-3245 có khả
năng ánh nataniycin. Chủng Streptomyces natalensis VTCC- A-3245 chính là chùng chuẩn được
1


Struyk và cộng sự phân lập từ mẫu đất ở Nam Phi [11] và đang được lưu giữ ở bảo tàng giống Nhật
Bản với ký hiệu JCM 4693. Tuy nhiên để tạo được chủng sản xuất, các nghiên cứu cải biến di
truyén cần được thực hiện để tăng khả năng sinh natamycin. Đối với chủng s. natalensis, chưa có
một nghiên cứu nào ở Việt Nam thực hiện cải biến di truyền bằng cách tác động trực tiếp vào cụm
gen sinh tông hợp natamycin. Trong khi đó, trên thế giới, trình tự cụm gen mã hóa cho quá trình
sinh tông họp natamycin đã được công bô; cụm gen này có kích thước khoảng 85 kb bao gôm 13
gen mã hóa cho polyketide synthase, 12 gen mã hóa cho protein biến đổi sau dịch mã, protein vận
chuyến và protein điều hòa, trong đó có pim M [1,2]. Gen pim M có kích thước 579 bp, được tìm
thây như một gen mã hóa cho protein điêu hòa dương của quá trình sinh tổng hợp natamycin [ 1].
Khi xóa bỏ pimM, khả năng sinh natamycin biến mất. Vì vậy, tác động vào gen pim M chính là một

chìa khóa quan trọng có khả năng cho phép tạo ra chủng sản xuất sinh natamycin với hiệu suất cao
hơn.
Trong nghiên cứu này, gen điều hòa dương p im M được tách dòng và chèn thêm một phiên bản
vào hệ gen của chủng xạ khuẩn s. natalensis, tạo nên chủng cải biến với hai phiên bản của gen điều
hòa dương pim M và hiệu suất sinh tổng họp natamycin cao hơn chủng tự nhiên. Đồng thời, điều
kiện nuôi cấy và tách chiết, tinh sạch natamycin cũng được nghiên cứu. Ngoài ra, chủng s.
natalensis cải biến cũng được sàng lọc trên môi trường chứa kháng sinh rifamycin và streptomycin,
hai loại kháng sinh được biết đến có khá năng gây đột biến ở các gen liên quan đến quá trình phiên
mã và dịch mã ở vi khuẩn nhằm mục đích chọn lọc được các chủng đột biến với hiệu suất sinh
natamycin cao hơn chủng ban đầu [ 1 0 ].
2 . Mục tiêu
Mục tiêu của đề tài là cải biến dược chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis có khả năng sinh
chât kháng nấm natamycin cao hơn chủng tự nhiên 2-4 lần, xây dụng được quy trình nuôi cấy tối ưu
cho chủng Streptomyces natalensis đã được cải biến và quy trình tách chiết, tinh sạch và phân tích
chât kháng nấm natamycin.
Ngoài mục tiêu đã được đặt ra trong thuyết minh, chúng tôi còn thử nghiệm nâng cao khả năng
sinh natamycin của chủng xạ khuẩn s. natalensis cải biến bàng cách chọn lọc các chủng đột biến
kháng rifamycin và streptomycin.
3. Phưong pháp nghiên cứu
Chủng giong
Chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis JCM 4693 = VTCC-A-3245, chủng vi sinh vật kiểm
định Saccharomyces cerevisiae V TCC-Y -62 được bảo quản tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật
VTCC - Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Chùng E. coli DH5a và
E. coli E T 12567 [pUZ8002] là quà tặng của giáo sư Takuya Nihira (Đại học Osaka, Nhật Bản)
Tách chiết DNA tong so từ chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensỉs
Chúng xạ khuân Streptomyces natalensis được nuôi trên môi trường “seed medium” (g/1:
glucose- 20; malt extract- 6 ; peptone - 6 ; NaCl-0,2 g/L và pH 7.0-7.2), lắc trong 3 ngày ở 30°c. Ly
tâm thu tế bào từ 3 mỉ dịch nuôi cấy. Tế bào được nghiền nát bằng que nghiền tế bào và rửa lại với
1 ml nước khử trùng. Thêm 0,2 ml đệm ly giải (100 mM Tris HC1, 100 mM Na 2EDTA, 1,5 M
NaCl, 1% cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), pH 8,0), 50 Ịil lysozyme (30 mg/ml) và 50

jil SDS 20%. Vortex trộn đều mẫu rồi ủ ở 65°c trong 2 giờ, sau 25 phút lắc mẫu một lần. Ly tâm
mâu à 8000 g trong 10 phút, thu dịch trong sang ông eppendorí' mới.Thêm một thê tích C:I
(Chloroíorm: Isoamylalcohol 24:1) bằng thể tích mẫu trong ống. Ly tâm 16000 g trong 5 phút. Thu
dịch nôi, thêm một lưọnơ isopropanol bằng thể tích dịch trong ổng. ủ tại nhiệt độ - 2 0 ° c trong 1
giờ, 1} tâm 16000 g trong 5 phút. Bỏ dịch nổi, rửa cặn bằng 70% ethanol lạnh. Ly tâm 16000 g
trong 5 phút. Bỏ dịch nổi, cô chân không cặn ở nhiệt độ phòng tới khô. Thêm 50 |il nước để hòa
DNA, giữ DNA ở -20°c.
Phản ừng PCR khuếch đại gen điều hòa dương pim M
Gen điều hòa dương pim M được khuếch đại từ mẫu DNA tổng số bằng phản ứng PCR sử dụng
cặp mồi PMD (5'-TCCTGGATCCGCCCTGTGCCCGCTCACTTCACGAAG-TCG-3’ì. PMR (5 GGTTGGATCCTTGCGGTCGGTGGTGC-GGGCATTACGG- ỹ ) , trong đó vị trí được gạch chân
là vị trí căt của enzyme giới hạn Bamtìỉ. Thành phần cho 10 Ị-il hỗn họp phản ứng 2 ồm: 5 jL.ll Go


Taq Colorless Master (Promega, Madision, WI USA), 0,5 |iỉ mồi xuôi PMD; 0,5 (.li mồi ngược
PMR; 3,5 Ịil H 20 ; 0,5 Ịil DNA. Phản ứng khuếch đại gồm 30 chu kì, với 5 phút biến tính ở 95°c,
15 giây bắt cặp mồi ở 62°c, 1 phút 30 giây ở 72°c để kéo dài mạch, bước cuối cùng là 72°c trong
7 phút và giữ lạnh ở 4°c. Sản phẩm PCR được điện di và kiểm tra trên gel agarose 1%.
Tạo vector tái to hợp pSE T pim M
Gen pim M và plasmid pSET152 được căt bàng enzvme giới hạn BamHl. Sau đó sản phâm căt
được nổi lại bằng ligation mix để tạo vector tái tổ họp pSETpimM. Vector pSETpimM được khuếch
đại bằng cách biến nạp vào chủng E. coli DH5a và chọn lọc bằng kháng sinh apramycin và sàng lọc
khuẩn lạc xanh/trắng sử dụng IPTG và X-gal. Khuẩn lạc trắng lựa chọn để nuôi, tách và kiểm tra
plasmid pSETpimM bằne điện di với plasmid pSET152, giải trình tự gen pim M được chèn trong
plasmid pSET152.
Biến nạp vector tái tồ hợp pSE T pim M vào chủng E. coli ET12567 và tiếp hợp với chủng s.
natalensis
Vector pSETpimM được biến nạp vào chủng E. coli ET12567 [pUZ8002] bằng phương pháp sốc
nhiệt ớ 42°c trong 1 phút. Bằng chọn lọc kháng sinh: apramycin, kanamycin và chloramphenicol;
và chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng, các khuẩn lạc trắng được lựa chọn và kiểm tra sự có mặt của
vector tái tổ hợp bàng cách PCR nhân gen pimM . Chủng E. coli E T 12567 chứa vector tái tổ họp

được sử dụng để tiếp hợp với chùng s. natalensis theo phương pháp của Enríquez và cs. [5].
Lựa chọn điều kiện nuôi cấy và môi trường thích hợp
Để xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh natamycin, chủng xạ khuẩn Streptomyces
natalensis VTCC-A-3245 (M2) được nuôi cấy trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường
lỏng, tốc độ lắc 160 v/p, nhiệt độ 30°c trong 5 ngày với các điều kiện được khảo sát bao gồm:
- Môi trường nuôi cấy: thí nghiệm được tiến hành với 6 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau
gồm MT1 (glucose - 20, cao bò- 8 , cao nấm men- 2, asparagin - 0,5, KH 2PO 4- 0,05 g/L); MT2 (tinh
bột- 10. glucose - 10, bột đậu tương- 10, pepton - 5, CaCƠ 3~ 3 g/1); MT3 (tinh bột - 50, bột đậu
tương - 30, cao nấm men - 8 , KH 2PO 4- 0,05, CaCC>3- 2 g/1); MT4 (glucose - 10, peptone- 5, malt
extraci - 3, cao nấm men - 3 g/1, 2 ml/1 MgCl2.6H20 2.5M); MT5 (glucose - 10, cao nấm men - 10
g/1); MT6 (glucose - 50, asparagines - 10, ZnS 0 4 .7 H 20 - 0,02; MgSƠ 4.7 H 2 0 - 0,2; FeS 0 4 .71rỈ2 0 0,02; CuSỏ 4.7 H 20 - 0,02 g/1); MT7 (cao nấm men - 20, tinh bột - 10 g/1).
- pH của môi trường MT3: được điều chỉnh về các giá trị 5; 6 ; 6,5; 7; 7,5; 8 ; 9 bằng NaOH và
HC1.
- Thê tích môi trường trong bình nuôi 250 ml: được thay đôi từ 25 ml đên 100 ml MT3.
- Các nguồn cacbon khảo sát gồm: tinh bột, glucose, glycerol, malt extract, galactose, dextrin với
nồng cộ 5% được thử nghiệm thông qua việc thay thế tinh bột trong môi trường MT3.
- N ing độ tinh bột trons MT3: được thay đổi từ 10 đến 70 g/1.
- N3ng độ K 2HPO 4 trong MT3 được thay đổi từ 0 đến 1 g/1.
- Các nguồn nitơ: được khảo sát gồm NaNC>3 , N H 4 C I, (N H 4 ) 2 SƠ 4 , urea, cao nâm men, cao bò với
n ồ n g CỘ 8 g/1 đ ư ợ c th ử n g h iệm th ô n g q u a v iệc th ay th ế cao n ấm m e n tro n g m ô i trư ờ n g M T 3.

- N ìng độ cao nấm men trong MT3 được thay đổi từ 2 đến 12 g/1.
Lụa ctọn điều kiện tách chiết thích hợp
Để xác định được điều kiện tách chiết natamycin tối ưu, dịch nuôi cấy chủng xạ khuân
Síreptomyces nataìensis VTCC-A-3245 (M2) đã loại bỏ tế bào được trộn với dung môi. Sau đó hỗn
hợp tách chiết được khuấy trộn liên tục bằns máy khuấy từ. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
tách chiết được khảo sát bao gồm:
- Ảnh hưởng của loại dung môi: các dung môi tách chiết được khảo sát bao gồm butanol, hexan
và eth /1 acetate, tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy là 1:1 (v/v), hỗn hợp tách chiết được đảo trộn liên
tục v ố tốc độ 500 v/p trong 1 giờ ở 30°c.

- Ả ih hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấv : dung môi (v/v): tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi được thay
đổi từ 1:0,5; 1:1; 1:2 và 1:3 (v/v). Hỗn họp tách chiết được khuấy trộn liên tục với tốc độ 500 v/p
trong giờ ở 30°c.
- Ả ih hưởng của thời gian tách chiết: thời gian tách chiết tăng dần từ 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ và 2
Ó


giờ với tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy là 1:1 (v/v), tốc độ khuấy trộn là 500 v/p ỡ 30°c.
- Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn: tốc độ khuấy trộn được khảo sát bao gồm 300, 500, 600 và
800 v/p. Hỗn hợp tách chiết có tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy là 1:1 (v/v) và được đảo trộn liên tục
băng máy khuấy từ trong 1 giờ ở 30°c.
Gây đột biến bằng kháng sinh
Các đột biến kháng rifamycin được thu nhận từ các khuẩn lạc sống sót trong 7 ngày sau khi trải
giông cấp 1 trên đĩa thạch GYM chứa riíamycin với các nồng độ khác nhau. Sau đó chủng đột biến
kháng rifamycin tiềm năng nhất tiếp tục được gây đột biến theo quy trình tương tự với
streptomycin.
Xác định hoạt tính của natamycin
Hoạt tính của natamycin được xác định định tính theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch [4]
với chủng kiểm định Saccharomyces cerevisiae V TCC-Y -62. Ket quả vòng hoạt tính được xác
địah sau 24 giờ ủ đĩa thạch ở 30 c .
Tinh sạch natamycin bằng sắc kỷ lỏng cao áp (HPLC)
Natamvcin được tinh sạch bằng cột sắc ký Eclipse Plus (5 um, 4,6 x 250 mm) (Agilent, Mỹ).
Phương pháp HPLC được cài đặt như sau: nồng độ acetonitrile 15% trong 7 phút, tăng đến 50%
trong 8 phút, tăng tiếp đến 85% trong 5 phút, giữ ở 85% trong 5 phút và cuối cùng cân bằng lại cột
băng 1 5% acetonitrile trong 3 phút; tốc độ dòng 0,5 ml/phút; thu tín hiệu trong dải bước song từ
190 - 600 nm. Đỉnh natamycin được so sánh với phổ hấp thụ của chất chuẩn natamycin trong thư
viện HPLC tại Đại học Osaka, Nhật Bản. Natamycin tinh sạch được gửi đi phân tích khối phố LCMS tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. ’
4. Tông kết kết quả nghiên cứu
4.1. Cải biến di truyền, tạo chủng xạ khuẩn s. natalensis có khả năng sinh chất kháng nam

natamycin cao hơn chủng tự nhiên
Khuếch dại gen điểu hòa dương pim M từ DNA tong so chủng s. natalensis
Trong cụm gen sinh tống hợp natamycin, gen pim M được chứng minh là gen điều hòa dương
trong con đường tổng hợp natamycin. pim M và promoter (~ lkb) được khuếch đại từ DNA tống số
c ủ a c h u n g x ạ k h uan s. natalensis b an g P C R sứ d ụ n g cặp m ồ i P M D v à P M R . S an p h â m P C R d ư ợ c
điện di kiêm tra trên gel agarose 1% với một băng duy nhất xuất hiện có kích thước gần 1 kb đúng
như mong đợi (hình 1).
M

1

2

Hình 1: Gel điện di sản phẩm pim M PCR từ
DNA tổng số (M: l Marker; 1 : pimM; 2: Đối
chứnơ âm)

1

2

Hình 2: Gel điện di vector tái tổ hợp
pSETpimM được tách từ khuân lạc trăng E.
c°li DH5ct (1: Đối chứng - pSET152; 2:
pSETpimM)

Tạo vector tái tổ hợp pSETpimM
Plasmid pSET152 và pim M được cắt bằng Bam ỉỉl và được nối lại bằng ligation mix đế tạo
vector tái tô họrp pSETpimM. Vector pSETpimM được bi ến nạp thành cône vào chủne; E. coli
4

DH5a nhàm khuếch đại vector pSETpimM. Chủng E. coli DH5a đã biến nạp được nuôi và tách
plasmi d pSETpimM để kiểm tra sự có mặt của vector tái tồ họp pSETpimM. Bằng phương pháp
điện di, vector pSETpimM có kích thước lớn hơn kích thước của vector pSET152 đúng như mong
đợi (hình 2). Thêm vào đó, vector tái tổ họp pSETpimM được gửi đi giải trình tự để kiêm tra đoạn
chèn pim M . Kết quả giái trình tự cho thấy đoạn gen pim M chèn trong vector có trình tự tương đồng
100% với gen pim M AM49372.1 trên ngân hàng gen sử dụng công cụ tìm kiếm blast. Vì vậy, kết
quả gi ải trình tự chỉ ra rằng không có đột biến nào xuất hiện trong đoạn gen pim M được chèn ở
vector tái tổ hợp.
Biến nạp vector tái tổ hợp pSE T pim M vào chủng E. coli ET12567 [pUZ8002] và tiếp hợp với
ch ủ ng s. natalensis
Bằng phương pháp sốc nhiệt, vector pSETpimM được biến nạp vào chủng E. coli ET12567
[pUZ8002]. Hai khuẩn lạc trắng được lựa chọn cho thí nghiệm PCR nhân gen pỉm M để kiểm tra sự
có mặt của vector pSETpimM. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và kết quả cho thấy
hai khuẩn lạc trắng đều có một băng duy nhất gần 1 kb xuất hiện trùng với đối chúng dương (hình
3). Như vậy, pSETpimM được biến nạp thành công vào chủng E. coli ET12567 [pUZ8002].

925 bp

Hình 3: Gel điện di sản phẩm pim M PCR từ
khuẩn lạc E. coli ET12567 được biến nạp
M: XMarker
1: Đối chứng dương (khuôn pSETpimM)
2: p im M PCR từ khuẩn lạc trắng 1
3: pim M PCR từ khuẩn lạc trắng 2
4: Đối chứng âm (khuôn pSET152)

Hình 4: Các thể tiếp họp xuất hiện trên đĩa
thạch YS

Đe chuyển một bản copy của gen pim M vào bộ gen của chủng s. natalensis, chúng E. coli
E T 12567 [pUZ8002] chứa vector pSETpimM được tiếp họp với các bào từ của s. natalensỉs. Bằng
cách sử dụng 107 bào tử s. natalensis cho mỗi thí nghiệm tiếp họp sẽ có khoảng 80 khuẩn lạc mọc
trên đĩa thạch MS sau 5 ngày ủ ở 30°c (hình 4).
S àng lọc các chủng s. natalensis có chứa gen p im M đã được tích hợp thêm vào hệ gen
60 khuẩn lạc trên dĩa MS agar được cấy vạch lại trên môi trường YS bổ sung thêm kháng sinh
apramycin và nalidixic acid. Một khuẩn lạc mọc trên đĩa YS có bổ sung kháng sinh được lựa chọn
đê nuôi cấy và tách DNA tổng số đề làm khuôn cho phản ứnơ PCR nhân gen apramycin. Chủng này
được đánh số là VTCC-A-3245 (M2). Trên gel agaroase 1%, chỉ có duy nhất một băng 1 kb từ
giếng mẫu sử d ụ n ơ khuôn DNA tổng số của chủng cải biến trùng với đối chứng dương sử dụng
khuôn pSET152, không có băng nào từ mẫu đối chứng âm sử dụng DNA tổng số của chủng hoang
dại xuất hiện (hình 5). Vì vậy, chùng cải biến đã được tiếp họp thành công vector tái tổ hợp và hệ

5


1

2

3

M

9 2 5 bp

Hình 5: Gel điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen Apramycin từ chủng cải biến
1: Đối chứng âm (khuôn DNA tổng số của chủng s. natalensis)
2: Chủng cải biến (khuôn DNA tổng số của chủng S.nataỉensis cải biến)

3: Đối chứng dương (khuôn vector pSET152)
M: X Marker.
Đảnh giá lượng natamycìn của chủng xạ khuẩn cải biến
Để kiểm tra khả năng sinh natamycin của chủng s. natalensis đột biến so với chủng dại, dịch
nuôi cấy của hai chủng này được tách chiết với n-butanol và phân tích bằng HPLC. Ket quả phân
tích diện tích dưới đường cong của peak natamycin của hai mẫu dịch tách từ hai chủng cho thây
chủng cải biến có lượng natamycin cao hơn gấp gần 3 lần so với chủng hoang dại (hình 6 ). Kêt quả
cân lượng sinh khối khô của hai chủng cho thấy tốc độ sinh trường của hai chủng là như nhau.

Hình 6 : Kết quả HPLC của mẫu tách chiết natamycin từ chủng
s. natalensis cải biến (B)

s. natalensis hoang dại (A) và chủng

4.2. Xây dựng qui trình nuôi cấy tối ưu cho chủng s. nataỉensis đã được cải biến
A n h hưởng của loại m ôi trường dinh dưỡng
Khả năng sinh natamycin của chủng cải biến Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được
khảo sát trên 7 loại môi trường khác nhau (kí hiệu MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT 6 , MT7). Kết
quả ở hình 7 cho thấy, môi trường tốt nhất cho khả năng sinh natamycin của chủng nghiên cứu là
môi trường MT3, tiếp theo là MT2, MT5, MT4, MT1, MT7. Trong môi trường MT 6 , chủng này
sinh trưởng kém và khône; sinh natamycin. Như vậy môi trường MT3 (tinh bột - 50. bột đậu tương 30, cao nấm men - 8 , KH 2PO 4- 0,05 CaCOi- 2 g/1) được lựa chọn là môi trưÒTig phù họp nhât cho
khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2).

6


\ V V - *A ."0

n \T>'5

v A t^

Hình 7: Ảnh hường của loại môi trường dinh dưỡng lên khả năng sinh natamycin của chủng
Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2). Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán
bàng T test Ợ p < 0,05).
A n h h ư ở n g của thê tích môi trường trong bình nuôi v à p H m ôi trường
Với mục đích xác định ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan trong môi trường nuôi cây đến khả
năng sinh natamycin của chủng nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành thay đổi thể tích môi trường
trong bình nuôi từ 25, 50, 75, 100 ml/bình 250 ml. Kết quả chỉ ra trên hình 8 cho thấy, chủng
VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin cao nhât khi thê tích môi trường là 50 mỉ. Tăng hoặc giảm thê
tích môi trườnơ đều làm giảm sự tổng hợp natamycin của chủng này.
30 Ị
") ■%-ị
20 H

- -

Ẽ = 15

í

= 5 10

'2

15

* 10

r ỉ

ỉ 00
Tké tich môi trường (mL)

pH

Hình 9: Ảnh hưởng của pH lên khả năng
Hình 8 : Ảnh hưởng của thể tích môi trường
sinh natamycin của chủng s. natalensis
lên khả năng sinh natamycin của chủng s.
cải biến
natalensỉs cải biên
Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05)
Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) nghiên cứu
được xác định trong dải pH từ 5 đến 9 (hình 9). Kết quả chỉ ra trên hình 2 cho thấy, chúng VTCCA-3245 (M2) có khả năng sinh trường và sinh natamycin tốt trong dải pH rộng (từ pH 5 đến 9),
trons đó khoảng tối ưu là từ pH 6 đến 8 . Tại khoáng pH tối ưu này, kích thước vòng hoạt tính đạt
23 - 24 mm sau 5 ngày nuôi cấy.
A nh hưởng của nguồn cacboiĩ và nồng độ tinh bột
Anh hưởng của nguôn cacbon lên khả năng sinh natamycin của chủng s. natalensis cải biên
dược chỉ ra trên hình 10. Chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tôt trên tât cả các nguôn
cacbon được khảo sát. trong đó galactose là nguồn cacbon tốt nhất với đường kính vòng hoạt tính
đạt 26.5 ram sau 5 ngày nuôi cấy. Tiếp theo là nguồn tinh bột, malt extract và dextrin có đường kính
vòng hoạt tính đạt 23.5-24 ram sau 5 ngày nuôi cấy. Mặc dù, galactose là nguồn cacbon tôi ưu cho
khả năng sinh natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) nhưng khi xem xét thêm các khía cạnh vê
7


mặt giá thành và mức độ phong phú của nguồn nguyên liệu thi tinh bột được lựa chọn là nguồn
cacbon phù họp nhất cho chủng này.
30

10

ỉ/.

10
GV)'"

t i » v'

20 30 40 50 60
Nong độ tinh bộr (g L)

(yữ

V ‘ -"

Hình 10: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả
năng sinh natamycin của chủng Streptomyces
natalensis VTCC-A-3245 (M2)

70

Hình 11: Anh hưởng của nồng độ tinh bột lên
khả năng sinh natamycin của chủng
Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2)

Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05)
Kết quả ảnh hường của nồng độ tinh bột khác nhau lên khả năng sinh natamycin của chủng
VTCC-A-3245 (M2) cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt nhất ờ nồng độ tinh

bột 20 g/1 (hình 11). Ở nồng độ tinh bột 20 g/1, đường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất là 29,5 mm
sau 5 ngày nuôi cấy.
A n h hưởng của nông độ phosphate
Ảnh hưởng của nồng độ phosphate lên khả năng sinh naíamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2)
được xác định bàng cách thay đổi nồng độ KH2PO4 trong môi trường nuôi cấy từ 0 đến 1,0 g/1. Kêt
quả thu được chỉ ra trên hình 12 cho thấy chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt ở tất cả
các nồng độ KH 2PO 4 khảo sát, trong đó đường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất là 23 mm sau 5
ngày nuôi cấy ở nồng độ KH2PO4 0,05 g/1.

2

lỡ

zl

0

0,05 cụ

ũ=_

0.3
v,_,

vt.

> ổ nơ độ K ọ H P 0 4 (g L)

Hình 12: Ảnh hường của phosphate lên khả năng sinh natamycin của chủng s. natalensis VTCC-A3245 (M2). Sai khác thống kê giữa các sổ liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05).
A n h hưởng của nguồn nitơ và nong độ cao nấm men

Sự tống hợp natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) được khảo sát trên 7 nguồn nitơ hữu cơ
và vô cơ khác nhau như NaNƠ 3- NH4CI, (NH^)2S0 4 , urea, cao nấm men, cao bò. Chủng VTCC-A3245 (M2) sinh natamycin cao nhất trong môi trường chứa nguồn nitơ là cao nấm men với đường
kính vòng hoạt tính đạt 24,5 mm sau 5 ngày nuôi cấy. Tiếp theo là (NH 4 )2SC>4 với đường kính vòng
8


hoạt tính đạt 21mm, NH4CI - 17 mm và NaNƠ 3 - 16 mm sau 5 ngày nuôi cấy. Trong môi trường
chửa nguồn nitơ là cao bò và urea, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh trường tốt nhưng không sinh
natamycin (hình 13).
*

N ỏ n g đ ộ c a o n â m m e n ( g /L )

Hình 13: Ánh hưởng của nguồn nitơ lên khả
năng sinh natamycin của chủng Streptomyces
natalensis VTCC-A-3245 (M2)

Hình 14: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men
lên khả năng sinh natamycin của chủng
Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2)

Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05)
Khả năng sinh natamycin của chủns VTCC-A-3245 (M2) được khảo sát ở các nồng độ cao nấm
men thay đổi từ 2 đén 12 g/1. Kết quả trên hình 14 cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh
natamycin tốt ở tất cả các nồng độ cao nấm men thí nghiệm, trong đó dường kính vòng hoạt tính đạt
cao nhất là 26 mm sau 5 ngày nuôi cấy khi môi trường có nồng độ cao nấm men 6 g/1. Tuy nhiên,
khi so sánh giữa nồng độ cao nấm men 2 g/1 và 6 g/1 thì kích thước vòng hoạt tính đo được khác
nhau không nhiều (24 mm và 26 mm, tương ứng) nên khi nuôi cấy ờ quy mô lớn thì có thê xem xét
sử dụng nồng độ cao nấm men 2 g/1 để giảm chi phí.
Để thấy rõ hơn ảnh hưởng của thành phần môi trường lên khả năng sinh natamycin của chủng

Sừeptomycẻs nulalensis VTCC-A-3245 (M2), chúng tôi đã tiên hành so sánh sự tông hựp
natamycin của chủng này trong môi trường tối UXI và môi trường không tối ưu. Ket quả trên hình 15
cho thây, đường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất trong môi trưòng tối ưu và không tối ưu lần lượt
là 26 mm và 18 ram, tương ứng, sau 5 ngày nuôi cấy. Như vậy có thể thấy rằng sau quá trình lựa
chọn môi trường nuôi cấy thích họp thì đường kính vòng hoạt tính đã tăng lên khoảng 44% so với
môi trường ban đầu.
30 1

=

s
ec*

25 1

0

DD 2 0 i
•p s
- £
1
‘I
10]
-

1

<5

-

5

j

0

'—
1

2

3

4

5

6

7

T h òi gian (n gày)
~ M ô i trư ờ n e tố i ưu

—®— M ôi trư ờ n g ban đâu

Hình 15: Khả năng sinh natamycin của chủng Strepíomyces natalemis VTCC-A-3245 (M2) trong
môi trường tối ưu và môi trưÒTìg ban đâu
4.3. Xây dựng quy trình tách chiết, tinh sạch natamycin sinh ra từ chủng s. natalensis đã được

cái biên
9


A n h hưởng của loại dung m ôi và tỷ lệ dịcli nuôi cấy : dưng môi
Đe xác định loại dung môi tối un cho quá trình tách chiết natamycin sinh ra từ chủng s.
naíalensis cải biến, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 3 loại dung môi khác nhau bao gồm: hexan,
ethyl acetate và hutanol. Ket quả cho thấy, butanol là dung môi tốt nhất để tách chiết natamycin từ
chủng này (hình 16).
25 o
£2
20
Ồ
sD'p 15 o
i
10 c
3 c
5 bD
•S
V T ' ■ ■-r........... 1..
=
5
Ethyl Hexan Butanol
acetate

20

15 1

Ì

>

10

ị
zl
£

-|

ĩ J
■
0 4
1:0,5

1:1

1:2

1:3

Tỷ lệ dịch nuôi cây/dung môi
(V A ) '

Hình 16: Ảnh hưởng của loại dung môi lên
quá trình tách chiết natamycin sinh ra từ
chủng s. natalensis cải biến

Hình 17: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy :
dung môi lên quá trình tách chiết natamycin

sinh ra từ chủng s. natalensis cải biến

Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05)
Ảnh hường của tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi butanol (1:0,5; 1:1; 1:2 và 1:3 (v/v)) lên quá trình
tách chiết natamycin sinh ra từ chùng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được chỉ ra trên
hình 17. Kết quà cho thấy, tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi = 1 :1 (v/v) là tỷ lệ tối ưu nhất để tách
chiết r.atamycin. Tăng hoặc giảm thể tích butanol đều làm giảm hiệu quả tách chiết natamycin.
Anh hưởng của thời gian tách chiết và tốc độ khuấy trộn
Chung tôi tiến hànhkhảo sát hiệu suấtthu nhận natamycin từ dịch nuôi cấy chủng Streptomyces
natalensis VTCC-A-3245 (M2) ở các thờigian tách chiết thay đổi từ 0,5 đến 2 giờ. Kết quả chỉ ra
trên h nh 18 cho thấy, thời gian tách chiết natamycin tối ưu là 1 giờ. Giảm thời gian tách chiêt
xuông 0,5 giờ hoặc tăng lên 1,5 hoặc 2 giờ đều làm giảm khoảng 10 - 12% hiệu suất tách chiết
natam/cin.
20
•s

—

-4

;C
__—

zt -

Thời gian rách chiẻt (giờ)
H hh 18: Anh hưởng của thời gian tách
chiết lên hiệu suất thu nhận natamycin sinh
ra từ chủng s. natalensis cải biến

300
500 ố 00
800
Tôc độ khuây trộn (v/p)

Hình 19: Ảnh hường của tốc độ khuấy trộn
lên quá trình tách chiết natamycin sinh ra
từ chủng s. nataỉensis cải biên

Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0.05)
Am hưởng của tốc độ khuấv trộrt lên quá trình tách chiết natamvcin sinh ra từ chủng
StrepDmyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được chỉ ra trên hình 19. Kết quả cho thấy, tốc độ
10


khuấy trộn tối ưu nhất là 600 v/p. ở các tốc độ khuấy trộn khác (300, 500 và 800 v/p), hiệu suất
tách chiết natamycin giảm đi không đáng kê.
Tinh sạch natamycin sinh ra từ chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2)
Natamycin trong dịch chiết butanol được tinh sạch bằng phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký
Eclipse Plus C18, tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết butanol trước và

[-lình 20: Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết natamycin trước (A) và sau tinh sạch (B)
Kết quả phân tích HPLC cho thấy, natamycin sinh ra từ chủng Streptomyces natalensis VTCCA-3245 (M2) có phổ hấp thụ trùng với natamycin chuẩn với 4 đình hấp thụ cực đại ở các bước sóng
279, 290, 304 và 318 nm (hình 21). Tiến hành chạy HPLC nhiều lần và thu lại phân đoạn chứa duy
nhất natamycin. Phân đoạn natamycin thu nhận dược được làm khô bằng máy cô quay chân không
và bảo quản ở -2 0 °c.
Phô hấp thụ của natamycìn chuàn

Norm

1200

£3- 1000
a
«ữ

Phô hâp thụ của natamycin sinh ra
tử chủng s, natalensis cải biên

lí


I

/

V
200

250

300

350

400

450

500

550

Bước sóng (nm)

Hình 21: Phổ hấp thụ của natamycin chuẩn và natamycin sinh ra từ chủng

s. nataỉensis cải biến

Bằng phương pháp phân tích khối phổ, trọng l ư ợ n g phân tử của chất kháng nấm sinh ra từ chủng
VTCC-A-3245 (M2) được xác định là 666,3 (hình 22). Kết quả này là tương tự với sô liệu thu được
của L i và cs, 2008 và Atta và cs, 2012 [9, 3].


Hình 22: Kết quả phân tích khối phổ của chất kháng nấm sinh ra từ chủng Streptomyces
natalensis VTCC-A-3245 (M2)
4.4. N âng cao khả năng sinh natamycin của chủng xạ khuẩn Streptomyces naíalensis VTCC-A3245 (M2) bằng cách chọn lọc các chủng đột biến kháng rifamycin và strepíomycin
Gây đột biến bằng kháng sinh ri/amycin
Bằng cách cấy trải chùng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) trên đĩa thạch GYM
chứa kháng sinh riíầmycin ở nông độ 1 và 2 |ug/ml, chúng tôi đã thu nhận được 35 chủng đột biên
(ký hiệu lân lượt từ Rfl đên Rf35) là các khuân lạc sông sót trên đĩa thạch sau 7 ngày. Kêt quả thử
hoạt tính kháng Saccharomyces cerevisiae của các chủng đột biến so với chủng ban đầu (ký hiệu DC) được trình bày trên hỉnh 23.

(a)
(b)
Hình 23: Khả năng kháng Saccharomyces cerevisiae của chủng ban đầu và các chủng đột
biên kháng riíầmycin. (a) các chủng đột biến từ Rfl đến R fl7 so với đối chứng, (b) các chủng đột
biến từ Rfl 8 đến RÍ35 so với đối chứng
Có thể thấy rằng, trong số các chủng đột biến thu nhận được thì Rf6 , R fl2, Rf20, Rf27, Rf32 và

Rf35 là các chủng có kích thước vòng hoạt tính lớn nhất, dao động từ 13-14 mm, cao hơn khoảng
1,7 lần so với chủng ban đầu. Một số chùng đột biến khác như RO, RÍÌ3, R f l 8 , RD4 có khả năng
sinh natamycin ở mức trung bình với đường kính vòng hoạt tính tăng từ 1,2 đến 1,5 lân so với
chủng ban đầu. Đặc biệt, khả năng sinh natamycin bị biến mất ở hai chủng RfìO và RÍ24. Như vậy
việc sư dụng riíamycin để gây đột biến đã làm phát sinh các chủng có khả năng tổng hợp natamycin
12


với các mức độ khác nhau. Trong đó, chủng không tổng họp natamycin chiếm 6 %, chủng làm tăng
cường sản sinh natamycin chiêm 60% và còn lại 34% là các chủng không có thay đôi vê khả năng
sinh natamycin so với chủng ban đầu (hình 24).

101-130 131-160 161-190

100

0

Khả năng sinh natamycin của chủng đột biến
kháng rifamycin so với chủng ban đầu í0/
Hình 24: Tần suất của các chủng đột biến kháng rifamycin có khả năng sinh natamycin với
các mức độ khác nhau
Gày đột biến bằng kháng sinh streptomycin
Rf35, chủng đột biên kháng ritầmycin tăng cường tông hợp natamycin tôt nhât được sử dụng làm
chủng ban đầu để tiếp tục gây đột biến ngẫu nhiên bằng streptomycin. Từ các đĩa thạch GYM chứa
streplomyein ở các nông độ 1, 5 và 10 ng/mỉ, chúng tỏi đã thu nhận được 32 chủng đột biên, kí hiệu
từ Srl đến Sr32. Trong đó, 3 chủng Sr2, Sr30 và Sr31 là các chủng có khả năng sinh natamycin tôt
nhất với đường kính vòng hoạt tính đạt 21 mm, cao hơn 1,3 lân so với chủng Rf35 ban đâu (hình
25). Tần suất của các chủng đột biến làm tăng cường tổng hợp natamycin được xác định là 34%
(hình 26).

*
o

c<ỳ

C '} C 'j ứ j
'V

C'J

r>

Ờ}

>

\


K

r

rỹ

L1

f


í

Oy

ỹ

Òỹ


_

1-

VJ *o 'o N <9

ỉy Cọ
í ' Òứỹ Õ£ỹ
ừ ĩĩ ữ
j ÍT) Cọ C 'j

0}

cộ

Ị

1

Ọ >


V o iỹ ' Cọí? oV
ỹ

ùỹ

(b)
Hình 25: Khả năng kháne; Saccharomyces cerevisiae của chủng ban đâu và các chủng đột biên
kháng streptomycin. (a) các chủng đột biến từ Srl đến Srló, (b) các chủng đột biên từ Srl7 đên
Sr32


80
60

-

ữ íì

c

1

40-

ầ?
20

0

-

<100

115-130

K hà năn g sinh nalamy cin củ a chùng đột biến
kháng streptom ycin so với chủng ban đầu (% )

Hình 26: Tần suất của các chủng đột biến kháng streptomycin có khả năng sinh natamycin
với các mức độ khác nhau
Việc sử dụng các kháng sinh có đích là các gen mã hoá cho các ribosome protein hoặc các
protein tham gia vào quá trình phiên mã ở vi khuân như streptomycin, gentamycin, rifampin... đê
gây đột biên là một phương pháp hiệu quả đê thu được các chủng có khả năng tăng cường tông họp
chất trao đổi thứ cấp [10]. Nghiên cứu của Hư và Ochi [7, 10] cho thấy, sự tổng hợp actinorhodin
tăng 1,6 đến 3 lần ở các chủng Streptomyces coelicolor đột hiến kháng một trong ba loại kháng sinh
streptomycin, riíampin hoặc gentamycin. Sự tổ hợp của hai kháng sinh làm phát sinh các đột biên
có khả năng tông họp actinorhodin tăng thêm 1,7 đên 2,5 lân. Tương tự. khả năng tông hợp
actinorhodin tiếp tục tăng lên 3.5 lần ở các chủng đột biến kháng đồns thời 3 loại kháng sinh. Tác
giả Wang và cs [13] cũng đã sàng lọc thành công các chủng đột biến có khả năng tăng cường tông
hợp actinorhodin. Chủng đột biến C7 kháng liên tiếp 7 kháng sinh có khả năng sinh actinorhodin
cao hơn 180 lần so với chủng dại Streptomyces coelicolor 1147. Phương pháp gây đột biến liên tiếp
bằng nhiều kháng sinh cũng được tác giả Tamehiro và cs [12] áp dụng đối với chủng sản xuât công

nghiệp Streptomyces albus SAM-X để tạo ra chủng đột biến có khả năng sinh salinomycin cao hơn
2.3 lần. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự tổng hợp natamycin của chủng Streptomyces natalensis
VTCC-A-3245 (M2) tảng lên cao nhất là 1,7 lần sau khi gây dột biến bằng rifamycin và tăng thêm
1.3 lần khi tiếp tục đột biến bàng streptomycin. Như vậy chủng đột biến kháng 2 loại kháng sinh có
khả năng sinh natamycin cao hơn 2,2 lần so với chủng ban đầu VTCC-A-3245 (M2). Khi so sánh
với chủng dại Síreptomyces natalensis VTCC-A-3245, chủng đột biến cuối cùng có thế tổng hợp
natamycin cao hơn khoảng 6 lần (hình 27 và 28). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi là một minh
chứng cho tính khả thi của phương pháp gây đột biến liên tiếp bằng nhiều kháng sinh đối với chủng
Slreptomyces natalensis và việc kết họp giữa cải biến chùng bằng kỹ thuật di truyền hiện đại và đột
biến bằng hoá chất làm phát sinh các đột biến có khả năng tổng hợp natamycin lớn hơn.

14


m
AL)]

9nmJ
1750-

/
1500-

12501000750
5CO
lỊỘ

co

ỌÈS ?

250

in
rr

0

ir*.


-V—ỹr-

A

Ĩ3£
B

Hình 27: Kết quả HPLC của mẫu tách chiết natamycin từ chủng
s. natalensis hoang dại (A) và chủng s. natalensis cải biến (B )

Hình 28: Kết quả thử hoạt tính của chủng dại (1) và chủng Sr30 (2)
5. Đárh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận

Trong nghiên cứu này, gen điều hòa dương p im M trong cụm Ren sinh tống hợp natamycin được
khuếch đại từ DNA tổng số chủng xạ khuẩn s. natalemis. Vector tái tổ hợp pSETpimM được xây
dựng và biến nạp thành công vào chủng E. coli ET12567. Bằng cách tiếp họp chủng E. coli
E T 12567 chứa vector tái tổ hợp pSETpimM với bào tử chủng xạ khuẩn s. natalensis, một chủng s.
natalensỉs cải biến VTCC-A-3245 (M2) có chứa thêm một bản copy gen pim M vào hệ gen được

chọn lọc. So sánh khả năng sinh natamycin giữa chủng tự nhiên và chủng cải biến để chọn lọc được
chùng s. natalensis có khả năng sinh chất kháng nấm natamycin cao hơn chủng tự nhiên bằng
phưong pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phân tích bằng HPLC. Qua tính toán diện tích dưới
đường cong của đỉnh chất natamycin cho thay chủng cải biến có lượng natamycin cao hơn chủng
hoang dại 3 lần.
Thảnh phần môi trường nuôi cấy tối ưu cho khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces
natalensis VTCC-A-3245 (M2) được xác định là tinh bột - 20. bột đậu tương - 30, cao nấm men - 6 ,
K H 2 PO4 - 0,05, CaCƠ 3 - 2 g /Ị pH môi trường là 6 - 8 . Khi nuôi cấy chủng này trong môi trường tối
ưu ở rhiệt độ 30 c , tốc độ lắc 160 rpm, thể tích môi trường trong bình nuôi là 50 ml/bình tam giác
250 rrl thì kích thước vòng hoạt tính đạt 26 mm sau 5 ngày nuôi cấy. cao hơn 44% so với môi
trường ban đầu.
Ngoài ra, sử dụng phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên liên tiếp bàng hai kháng sinh giúp chọn
lọc đu 7 c các chủng có khả năng tống họp natamycin cao hơn 2 ,2 lẩn so với chủng cải biến di truyền
Streptomyces natalensis VTCC.-A-3245 (M2) và cao hon khoảng 6 lần so với chủng dại. Chủng xạ
khuân này hứa hẹn nhiều tiềm năng ÚT12 dụng n h ư phát triển các chế phấm sinh học kháng nấm gây

bệnh cho cây trồng.

15


6.

Tóm tắ t kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
Natamvcin, a polyene compound with broad-spectrum activity against yeasts and fungi, was íĩrstly
found in Streptomyces natalensis. Because o f its low toxicity to mammalian cells, natamycin is
wiđely used in food industry and medicine to prevent fungal growth. Although natamycin has been
used worldwide, this antiíungal compound has not been produced in Vietnam. One o f the reason is we
do not process any industrial-scale production strain. In order to develop such production strain, strain
improvement must be involved. Thereíore, we carried out the study "Genetic engineering of

Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 to improve its production of natamycin”. In this study, we
introduced a copy of the gene pim M , a positive regulator gene in the natamycin biosynthetic pathway,
into s. natalensis chromosome, hence boosting the expression o f the structural genes, resulting in the
increase o f natamycin production. The result showed that the level of natamycin produced by the s.
natalensis mutant strain increased 3 fold compared to the s. natalensis wild type strain. Genetically
engineered Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) showed the highest level o f natamycin in
250 ml shake ílask containing 50 ml of medium composed o f 20 g/1 o f starch, 0.05 g/1 o f potassium
dihydrogen phosphate, 2 g/1 of yeast extract, 2 g/1 CaCƠ 3 and 30 g/1 soybean meal. Natamycin
produced by s. natalensis VTCC-A-3245 (M2) was best extracted by butanol and puriíied by
Cadenza C18 column chromatography. In addition to the genetically engineered strain, we also
obtained rifamycin and streptomycin resistant mutants which can produce 2 .2 times more
natamycin than the genetically engineered Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2).
Natamycin, một hợp chất dạng polyene có khả năng kháng nấm sợi và nấm men, được tìm thấy
lần đầu tiên từ loài Streptomyces natalensỉs. Bời vì natamycin ít gây hại cho tế bào động vật nên
natamycin được sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm và y học. Mặc dù natamycin đang được
sử dụng phổ biến trên thế giới, hợp chất này chưa được sản xuất ở Việt Nam. Một trong các lý do là
bời vì Việt Nam chưa sở hữu chủng sản xuất ở quy mô công nghiệp. Đe tạo được một chủng sản xuât
như vậy, các bước cải biến di truyền cần được thực hiện. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Cải
biên di truyền chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 nhăm tăng khả năng sinh hoạt chât
natamycin”. Trong nghiên cứu này, một bản của gen điêu hòa dương pim M của con đường sinh tông
hợp natamycin được chèn thêm vào hệ gen của chủng s. natalensis nhằm tăng quá trình phiên mã của
các gen cấu trúc, dẫn đến tăng lượng hoạt chất natamycin sản sinh. Ket quả cho thấy chủng xạ khuấn
cải biến thu được có lượng natamycin cao hơn 3 lần so với chủng dại. Chủng cải biên di truyên s.
natalensis VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin cao nhất khi nuôi cấy trong bình 250 ml chứa 50 ml
môi trường gồm (g/l): tinh bột - 20, KH 2PO 4 - 0,05, cao nấm men - 2, CaCƠ 3 - 2 và bột đậu tương 30. Natamycin sinh ra từ chủng cải biến được tách chiết tốt nhất bàng dung môi butanol và được
tinh sạch bằng cột sắc ký Cadenza C18. Ngoài chủng xạ khuấn cải biến di truyền Streptomyces
natalensis VTCC-A-3245 (M2), chúng tôi còn thu nhận được các chủng đột biến kháng rifamycin và
streptomycin có thể sinh natamycin cao hơn 2 ,2 lần so vói chúng cải biến di truyên.
Tài liệu tham khảo
]. Antón TSỊ Santos-Aberturas J, Mendes M, Guerra s, Martin J, Aparicio J (2007) PimM, a PAS

domain positive regulator of pimaricin biosynthesis in Streptomyces natalensis, Microbiology 153,
3174-3183.
2. Aparicio JF, Fouces R. Mendes MV, Olivera N, M arti'n JF (2000) A complex multienzyme
system encoded by fíve polyketide synthase genes is involved in the biosynthesis of the 26membered polyene macrolide pimaricin in Streptomyces natalensis. Chem. Biol. 7. 895-905.
3. Atta HM, Selim ShM, Zayed MS (2012) Natamycin antibiotic produced by Streptomyces sp.:
Fermentation, puriĩication and hiological activities. J Am Sci 8(2): 469-475.
4. Egorov NS (1985) In: Antibiotic, a Scientiiìc Approach (N. s. EGOROV. Editor), English
Edition. MIR Publisher, Moscow.
5. Enriquez LL, Mendes MV, Anton N, Tunca s , Guerra SM, Martin JF, Aparicio JF (2006) An
efíicient gene transíer system íor the pimaricin producer Streptomyces natalensis. FEMS Microbiol
Lett 257: 312-318.
6 . Farid MA. El-Enshasv HA, El-Diwany Al, El-Sayed ESA (2000) Optimization o f the cultivation
for nalamycin prcduction by Streptomyces natalensis. I Basic Microbiol 40(3): 157-166.
16


7. Hu H, Ochi K (2001) Novel approach for improving the pro-ductivity of antibioticproducingstrains by inducing combinedresistant mutations. Appl Environ Microbiol 67: 1885-1892.
8 Li M, Chen s, Li J, Ji z (2014) Propanol ađdition improves natamycin biosynthesis of
Streptomyces natalensis. Appl Biochem Biotechnol 172(7): 3424-3432.
9. Lu CG, Liu c w , Qiu JY, Wang HM, Liu T and Liu DW (2008) Identiíìcation of an antifungal
metabolite produced by a potential biocontrol Actinomyces strain A01. Braz J Microbiol 39(4):
701-707.
10. Ochi K (2007) From microbial diíĩerentiation to ribosome engineering. Biosci Biotechnol
Biochem 71(6): 1373-1386.
11. Struyk AP, Hoette I, Drost G, Waisvisz JM, Van Eek T, Hoogerheide JC (1958) Pimaricin, a
new antifungal antibiotic. Antibiot. Annu. 5, 878-885.
12. Tamehiro N, Hosaka T, Xu J, Hu H, Otake N and Ochi K (2003) Imiovation approach for
improvement of an antibiotic overproducing industrial strain o f Streptomyces albus. Appl Emviron
Microbiol 69(11): 6421-6417.
13. Wang G, Hosaka T, Ochi K (2008) Dramatic activation oíantibiotic production 'mStreptomyces

coelicoỉorby cumulativedrua resistance mutations. Appl Environ Microbiol 74: 2834-2840.
PHẦN III. SẢN PHẨM , CÔNG BỐ VÀ KÉT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI
3.1. Kết quả nghiên cứu

Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu kinh tế - kỹ th u ật
TT

Tên sản phâin
Đăng ký

Đạt được

1

Chùng Streptomyces
m talensis cải biến

Có khả nàng sinh chất kháng
nấm natamycin cao hom
chủng tự nhiên 2-4 lần.

Có khả năng sinh chất kháns
nấm natamycin cao hơn
chúng tự nhiên 3 lẩn.

2

Chủng Streptomyces
natalensis cải biến chứa đột
biến kháng rifamycin và

streptomycin

Không đãne ký

Có khả năng sinh chất kháng
nấm natamycin cao hơn
chủng tự nhiên 6 lần.

3

Qui trình nuôi cấy tối ưu cho
khả năng sinh natamycin của
chảng Streptomyces
natalensis cải biến.

Xác định được các điều kiện
nuôi cấy tối ưu như thành
phần môi trường, thể tích,
thời gian, nhiệt độ để hàm

Qui trình nuôi cấy tối ưu cho
khả năng sinh natamycin của
chủng Streptomyces
natalensis cải biến.

lượng natam ycin là cao nhất.

4

Qui trình tách chiết, tinh sạch

và phân tích chất kháng nấm
natamycin.

Xác định được phưoTig pháp
tách chiết, tinh sạch
natamycin từ chủng s.
nataỉensis cải biên.

Qui trình tách chiết, tinh sạch
và phân tích chất kháng nấm
natamycin.

3.2. Hình thức, cấp độ công bố kết quả
Ghi địa chỉ
và cảm 0'n
sự tài trọ'
Sản phâm
của
TT
ĐHQGHN
đúng quv
định
i
Công trình công bô trên tạp chí khoa học quôc tê theo hệ thông ISI/Scopus
Tình trạng
(Đã in/ chấp nhận in/ đã nộp
đơn/ đã được chấp nhận đơn
hợp lệ/ đã được cấp giây xác
nhận SHTT/ xác nhận sử
dụng sản phâm)

Đánh giá
chung
(Đạt.
không
đạt)

1

ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI_
i TRUNG TAM ĨHÔNG TIN THƯ VIỆN

ũonf,noooJ:£L

17


1.1
1.2
2

Sách chuyên khảo đươc xuất bản hoặc ký hợp đồng xuất bản

2.1
2 .2

3
Đãng ký sờ hũii trí tuệ
3.1
3.1

4
Bài báo quôc tê không thuộc hệ thông ISI/Scopus
4.1
4.2
Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành
5
quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế
Đạt
Có
Châp nhận in
5.1 Genetic engineering of
Streplomyces natalensis VTCC-A3245 to improve its natamycin
production
Đạt
Có
5.2 Anh hưởng của điêu kiện nuôi cây Châp nhận in
và thành phần môi trường lên khả
năng sinh natamycin của chủng xạ
khuẩn cải biến di truyền
Streptomyces natalensis VTCC-A3245 (M2)
Có
5.3 Nâng cao khả năng sinh natamycin Châp nhận in
của chủng xạ khuẩn Streptomyces
natalensis VTCC-A-3245 (M2)
bằng cách chọn lọc các chủng đột
biết kháng riíầmycin và
streptomycin
6
Báo cáo khoa học kiên nghị, tư vân chính sách theo đặt hàna của đơn vị sử dụng

Đạt

6.1
6 .2

Kêt quả dự kiến được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc cơ sờ
ứng dung KH&CN

7
7.1
7.2

3.3. Kết quả đào tạo
TT

Họ và tên

Nghièn cứu sinh
1
Hoc viên cao hoc
1 Phạm Thị
Thu Hướng

Thòi gian và kinh phí
tham gia đề tài
(số tháng/sổ tiên)

Công trình công bô liên quan
(Sản phẩm KHCN, luận ủn, luận
văn)

Luận văn thạc sĩ

Đã bảo vệ

Đã bảo vệ

18


PHẦN IV. TỎ N G HỢP KÉT QUẢ CÁC SẢN PHẨM K tì& C N VÀ ĐÀO TẠO CỦA ĐÊ TÀI

TT

Sản phâm

1

Bài báo công bố trên tạp chí khoa học quốc tê theo hệ thông
iSI/Scopus
Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký họp đông xuât
bản
Đăng ký sở hữu trí tuệ
Bài báo quôc tê không thuộc hệ thông ISI/Scopus
Sô lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN,
tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa
học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế
Báo cáo khoa học kiên nghị, tư vân chính sách theo đặt
hàng của đơn vị sử dụng
Kêt quả dự kiên được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định

chính sách hoặc cơ sở úng dụng KH&CN
Đào tao/hô trơ đào tao NCS
Đào tao thac sĩ

2

3
4
5

6

7
8

9

Số luọng
đăng ký

Sô lượng đã
hoàn thành

2

3

1

1

PHẦN V. TÌNH HÌNH s ứ DỤNG KINH PHÍ
TT
A
1
2
Ổ
4
5
6

7
8
B
1
2

Nội dung chi

Chi p h í trực tiêp
Thuê khoán chuyên môn
Nguyên, nhiên vật liệu, cây con..
Thiêt bị, dụng cụ
Công tác phí
Dịch vụ thuê ngoài
Hội nghị, Hội thảo, kiêm tra tiên độ, nghiệm
thu
In ân, Văn phòng phâm
Chi phí khác
Chi p h í gián tiếp

Quản lý phí
Chi phí điện, nước
Tông sô

Kinh phí
được duyệt
(triệu đồng)

Kinh phí
thực hiện
(triệu đông)

35
40

40
17

Ghi chú

13,5
1,5

3
75

75

PHẢN V. KIÉN NGHỊ (về phát triển các kết qua nghiên cứu của đề tài; về quàn lý, tố chức thực
hiện ở các cấp)

19


PHẨN V. KIÉN N G H Ị (về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài; về quàn lý, tô chức thực
hiện ở các cấp)
PHẦN VI. PHỤ LỤ C (minh chímg các sản phẩm nêu ở Phần III)

/<0

H à Nội, n g à y . .

t h á n g . n ă m 21'ỈS

C hủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)
/ ĩv J ỈÌ\jlì
ì 'W j . ^

ỉếưn

(Vơ

Dương Vãn HỢp

20


X Á C N H Ậ N Q U Y É T T O Á N K IN H PHÍ Đ Ẻ T À I 2014-2016
(T4/2014 đến T3/2016)

Kinh phí

Nội dung

STT

Năm 1
1

Xây dựng đề cưong chi tiểt

2.000.000

2

Thu thập và viết tổng quan tài liệu

3.000.000

Năm 2

Thu thập tư liệu (m ua, thuê)
Dịch tài liệu tham khảo (số trang X đơn giá)
3.000.000

V iết tổng quan tư liệu

Điều tra, khảo sát, thí nghiệm, thu thập sô

3

30.000.000

40.000.000

30.000.000

40.000.000

40.000.000

17.000.000

liệu, nghiên cứu...
Chi phí tàu xe, công tác phí
Chi phí thuê m ướn
Chi phí hoạt động chuyên môn

4

Chi phí cho đào tạo: Chi phí thuê m ướn NCS,
học viên cao học

5

Thuê, mua sắm trang thiết bị, nguyên vật liệu
Thuê trang thiêt bị
M ua trang thiêt bị
M ua nguyên vật liệu, cây, con

6

Viết báo cáo khoa học, nghiệm thu

13.500.000

V iết báo cáo tổng kết

12.000.000

Hội thảo

7

8

N ghiệm thu, thâm định

1.500.000

C hi k h á c

4.500.000

In ân, photocopy

1.500.000

Q uản lý phí

3.000.000
75 .000.000

T ông k in h p h í

75.000.000
...

trư ở ng

Ke toán trưởng

í ÍUI
y
Đươr.g Vần HỢp

ỈẠQ.)} i VJllw' Ịíduí,

H à Nội, ngàyi'Z tháng í năm 20 ịio
Chủ trì đê tài

knn Wứ' 'êáLv


" ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
VIỆN VI SINH VẬT VÀ CỒNG NGHỆ SINH HỌC

THUYẾT MINH ĐỀ CƯƠNG ĐÈ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Cải hiến di truyền chủng xạ khuẩn Strepíomyces
naialensỉs VTCC-A3245 nhằm tăng khả năng sinh chât
khảng sinh naiamycin để ứng dụng trong
bảo quản thực phẩm

Chủ trì đề tài: TS. Nguyễn Kim Nữ Thảo

Hà Nội, 2014


TH U Y ẾT MINH ĐÈ CƯƠNG ĐÊ TÀI NGHIÊN c ứ u
K HOA HỌC VÀ CÔNG N G H Ệ CẤP Đ H Q G H N
(Đề tài nhóm A/ B)
(Yêu cầu không thay đổi trình tự các mục, không xóa những gợi ý ghi trong ngoặc)
I. THÔNG TIN CHUNG VẺ Đ Ê T À I
1 - Tên đề tài
Tiếng Việt
Cải biến di truyền chùng xạ khuẩn Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 nhầm tăng khả năng
sinh chất kháng sinh natamycin để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.
Tiếng Anh
Genetically engineering Streptomyces natalensỉs VTCC-A-3245 to improve natamycin production
for applications in food preservation.
2 - M ã số (được cấp khi Hỗ sơ irúng tuyển)

3 - M ục tiêu và sản phẩm d ự kiến của đề tài
3.1. M ục tiêu ( Bám sát và cụ thể hóa định hướng mục tiêu theo đặt hàng - nếu có )
- Tạo được chửng xạ khuẩn Streptomyces natalensis cải biến di truyền có khà năng sinh chất kháng
nâm natamycin cao hơn chủng tự nhiên VTCC-A-3245.
- Xây dựng được qui trình nuôi cấy, tách chiết và tinh sạch natamycin từ chửng

được cải biến.

s. natalensis đã

3.2. S ản phẩm (Ghi tóm_íất±ên các sản phẩm nêu ở mục 12 và III - 21,22,23,24,25,26)
- Chủng
lần.

s. nataỉensis

cải biến di truyền có khả năng sinh natamycin cao hon chủng tự nhiên 2-4

- Qui trình nuôi cấy tối ưu, qui trình tách chiết, tinh sạch và phân tích chất kháng nấm natamycin từ
chủng s. nataỉensis đã được cải biến.
- Sản phẩm khoa học: 02 bài báo trên tạp chí chuyên ngành trong nước.
- Sản phẩm đào tạo: 01 thạc sỹ, 01 cử nhân.

4 - T h ò i gian th ự c hiện: 24 tháng
(Từ tháng 4 /2014 đến tháng 3 /2016)
5 - T hông tin về tác giả thuyết m inh đề cưoug
H ọ và tên: N guyễn Kim N ữ Thảo
Ngày, tháng, năm sinh: 24/12/1983

Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sỹ

1

Chức danh khoa học: Không
Điện thoại: 04-7547407

Chức vụ: Trưởng phòng

Tổ chức : Viện Vi sinh vật và Cồng nghệ Sinh học
Nhà riêng: số 9/ngõ 162 Chùa Láng, Hà Nội

Mobile: 0948806096

Fax: 04-7547407 E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học
Địa chi tổ chức: E2; 144 Xuân Thủy- c ầ u Giấy- Hà Nội
Tóm tắ t h o ạt động nghiên cửu của tác giả thuyết m inh đề cương
(Các chưomg trình, đề tài nghiên cứu khoa học đã tham gia, các công trình đã công bổ Hên
quan tới phương hướng của đề tài)
T hòi gian

T ên đề tài/công trìn h

Câp quản lý / noi công tác

T ư cách tham gia

Tinh sạch và phân tích các
Quỹ khoa học quốc tế IFS
Chủ nhiệm
chât có hoạt tính kháng
Xanothomonas oryzae pv.
oryzae từ xạ khuẩn để sử

dụng trong phòng trừ sinh
học bệnh bạc lá lúa ở Việt
Nam.
Tóm tă t hoạt động đào tạo sau đại học của tác giả thuyết m inh đề cương tro n g 5 năm trở lai
'
đây
T h ờ i gian
H ọ, tên NCS/học viên
T ư cách tham gia
G hi chú
CH
(HD chính/phụ)
(đã bảo vệ/đang thực hiện)
2013-2014

2013-2015

Phạm Thị Thu Hướng

H D phụ

Đang thực hiện

2013-2015

Trần Thị Hằng

HD chính

Đang thực hiện

6 - T h ư k ý đề tài (nếu có)
Họ và tên:.................................................................................
Ngày, tháng, năm sin h :..................................................Nam/ N ữ :.........
Học hàm, học v ị : ............................................................
Chức danh khoa h ọ c :.............................................
Đ iện th o ạ i:......................................

Chức v ụ :...........

Tổ chức : .................................Nhà riên g :..................................Mobile:
F a x :..................................................... E -m ail:...........................................
Tên tổ chức đang công tá c :.....................................................................
Đ ịa chi tổ chức : ..........................................................................................

7 - Tổ chứ c chủ trì đề tài
Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học
Đ iện thoại: 04-37547407 Fax: 04-37547407

2