Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano dihydroartemisinin bao phức hợp chitosan và acid folic

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  ------

NGUYỄN THỊ HÒA

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN
NANO DIHYDROARTEMISININ
BAO PHỨC HỢP
CHITOSAN VÀ ACID FOLIC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

-----  ------

NGUYỄN THỊ HÒA
MÃ SINH VIÊN: 1301159

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN
NANO DIHYDROARTEMISININ

BAO PHỨC HỢP
CHITOSAN VÀ ACID FOLIC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến
2. DS. Phạm Hữu Phong
Nơi thực hiện:
1. Viện Công nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia
2. Bộ môn Bào chế

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành nhất và sâu sắc đối với:
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
DS. Phạm Hữu Phong
Những người thầy giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết, đã hướng dẫn, định
hướng và t o m i đi u kiện thu n l i gi p đỡ tôi thực hiện kh

lu n này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Trần Ngọc Bảo cùng các thầy cô, các nh
chị kỹ thu t viên thuộc Viện Công nghệ Dư c phẩm Quốc gia, Bộ môn Công nghiệp
Dư c, Bộ môn Bào chế đã t o đi u kiện v thiết bị, máy m c, h

chất, gi p đỡ tôi

trong quá tr nh làm thực nghiệm.
Tôi xin phép cảm ơn B n giám hiệu nhà trường, Phòng Đào t o và các Phòng
b n khác, các thầy cô và cán bộ nhân viên trường Đ i h c Dư c Hà Nội đã đào t o và
gi p đỡ tôi hoàn thành kh

h c t i trường.

Cuối cùng, tôi xin đư c cảm ơn đ c biệt đến gi đ nh và b n b tôi, những
người luôn ng hộ, động viên, gi p đỡ tôi trong suốt quãng thời gi n h c t p và nghiên
c uv

qu .

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Th H a


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................. 2
1.1. Tổng quan v dihydroartemisinin ................................................................. 2
1.1.1. Công thức cấu tạo.................................................................................... 2
1.1.2. Tính chất lý hóa ....................................................................................... 2
1.1.3. Định lượng ............................................................................................... 2
1.1.4. Dược động học......................................................................................... 3
1.1.5. Tác dụng dược lý ..................................................................................... 3
1.2. Vài nét v PLGA ........................................................................................... 4
1.1.2. Cấu trúc, tính chất, ứng dụng .................................................................. 4
1.2.2. hược đi

c a

G

hi sử dụng là chất mang thuốc ..................... 5

1.3. Vài nét v chitosan ......................................................................................... 5
1.3.1. Nguồn gốc và cấu trúc ............................................................................ 5
1.3.2. Tính chất c a chitosan ............................................................................. 5
1.4. Vài nét v

cid folic và thụ thể folat .............................................................. 6

1.4.1. Cấu tạo, tính chất và ứng dụng ............................................................... 6
1.4.2. Thụ th folat ............................................................................................. 7
1.5. Vài nét v tổng h p ph c h p CS-FA............................................................ 7
1.6. Một số nghiên c u bào chế hệ tiểu phân n no liên quan .............................. 9
1.6.1. ghiên cứu về nano DHA ........................................................................ 9
1.6.2. ghiên cứu về nano sử dụng phức hợp chitosan-acid folic .................. 10
1.7. Tổng quan v tiểu phân n no polyme ......................................................... 11
1.7.1. Đặc đi m ................................................................................................ 11
1.7.2. hương pháp bào chế ti u phân nano poly e ...................................... 11
1.7.3. Cải biến bề

ặt ti u phân nano poly e hi sử dụng đư ng tiê

t nh

ạch ................................................................................................................. 12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 14
2.1. Nguyên v t liệu, thiết bị ............................................................................... 14

2.1.1. guyên liệu ............................................................................................ 14
2.1.2. Thiết bị ................................................................................................... 15
2.2. Nội dung nghiên c u .................................................................................... 15
2.3. Phương pháp nghiên c u.............................................................................. 16
2.3.1. hương pháp bào chế ............................................................................ 16
2.3.2. Các phương pháp đánh giá ................................................................... 18
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………...…20
3.1. Kết quả khảo sát phương pháp định lư ng .................................................. 22
3.2. Kết quả nghiên c u xây dựng công th c bào chế hệ tiểu phân n no DHAPLGA/CS-FA. ..................................................................................................... 22
3.2.1. Ảnh hưởng c a một số yếu tố quy trình đến đặc tính c a hệ ti u phân
nano DHA-PLGA. ............................................................................................ 22
3.2.2. Ảnh hưởng c a tỷ lệ phức CS-FA so với PLGA tới đặc tính c a hệ ti u
phân nano DH -PLGA/CS-FA. ....................................................................... 24
3.2.3. Ảnh hư ng c a tỉ lệ th tích pha dung dịch CS-FA/ pha hỗn dịch nano
đến đặc tính c a hệ ti u phân nano DHA-PLGA/CS-FA. ............................... 26
3.2.4. Ảnh hưởng c a nhiệt độ trong giai đoạn hấp phụ phức hóa học CS-FA
lên bề mặt ti u phân nano DH -PLGA/CS-FA. .............................................. 27
3.3. Đánh giá một số đ c tính c a hệ tiểu phân n no .......................................... 29
3.3.1. Đánh giá hiệu suất mang thuốc (EE) và hả năng nạp thuốc (LC) ...... 29
3.3.2. Đánh giá hả năng giải phóng dược chất c a ti u phân nano ............. 29
3.3.3. Đánh giá tương tác giữa CS-F và xác định sự có ặt c a F , CS trên
bề ặt ti u phân nano ..................................................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitril

CS

Chitosan

CS-FA

Ph c h p chitos n và cid folic

CP2010

Dư c điển Trung Quốc 2010

Da

Dalton

DA

De cetyl h

DC

Dư c chất

DCM

Dicloromethan

DCC

Dicyclohexyl carbodiimid

DHA

Dihydroartemisinin

DMSO

Dimethyl sulfoxid

D/N

Dầu Nước

EDAC

1-ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimid

EE

Hiệu suất m ng thuốc Enc psul tion efficiency)

EMA

Cơ qu n quản lý thuốc châu Âu Europe n Medicines Agency)

EPR

Tăng tính thấm và thời gi n lưu Enh nced Permeability and Retention)

FA

Acid folic

FR

Thụ thể fol t

FT-IR

Phổ h ng ngo i chuyển d ng Fourier
(Fourier transform infrared spectroscopy)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng c o High-performance liquid chromatography)

kl/kl

Khối lư ng khối lư ng

KLPT

Khối lư ng phân tử

KT

Kích thước

KTTP

Kích thước tiểu phân

KTTPTB

Kích thước tiểu phân trung b nh

kl/tt

Khối lư ng thể tích

LC

Khả năng n p thuốc c

MPS

Hệ thống thực bào đơn nhân

NC

Nghiên c u

NHS

N- hydroxysuccinimid

hệ Lo ding capacity)


NHS-FA

Este c

N-hydroxysuccinimid và cid folic

NPs

Nanoparticles

PACA

Poly (alkylcyanoacrylat)

PCL

Polycaprolacton

PDI

Chỉ số đ phân tán Polydiversity index)

PEG

Poly (ethylen glycol)

PGA

Poly (acid glycolic)

PLA

Poly (acid lactic)

PLGA

Poly (acid lactic-co-glycolic)

PNPs

Tiểu phân n no polyme Polymeric n nop rticles)

PVA

Polyvinyl alcol

TB

Trung b nh

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

tt/tt

Thể tích thể tích

US-FDA

Cục Quản lý Thực phẩm và Dư c phẩm Ho Kỳ United St tes- Food and
Drug Administration)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Nguyên liệu sử dụng trong quá tr nh thực nghiệm ................................ 14
Bảng 3.1. Mối tương qu n giữa diện tích pic và n ng độ DHA ............................ 22
Bảng 3.2. Ảnh hưởng c a thời gi n siêu âm tới đ c tính c a hệ tiểu phân n no
DHA-PLGA ............................................................................................................ 23
Bảng 3.3. Ảnh hưởng c

công suất siêu âm tới đ c tính c a hệ tiểu phân n no

DHA-PLGA .......................................................................................................... 233
Bảng 3.4. Ảnh hưởng c a tỉ lệ CS-FA/PLGA đến đ c tính hệ tiểu phân n no DHAPLGA/CS-FA ....................................................................................................... 244
Bảng 3.5. Ảnh hưởng c a tỉ lệ thể tích ph dung dịch CS-FA/pha hỗn dịch nano
đến đ c tính c a hệ tiểu phân n no DHA-PLGA/CS-FA ..................................... 266
Bảng 3.6. Ảnh hưởng c a nhiệt độ trong gi i đo n hấp phụ CS-FA đến đ c tính hệ
tiểu phân n no DHA-PLGA/CS-FA ....................................................................... 28
Bảng 3.7. Kết quả hiệu suất mang thuốc EE) và khả năng n p thuốc (LC) ......... 29
Bảng 3.8. Kết quả phần trăm giải ph ng c

DHA theo thời gi n t hệ n no DHA-

PLGA, DHA-PLGA/CS-FA. .................................................................................. 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
H nh 1.1. Công th c cấu t o c a dihydroartemisinin ............................................... 2
H nh 1.2. Cấu tr c h

h c và sự th y phân c a PLGA .......................................... 4

H nh 1.3. Cấu tr c h

h cc

chitin và chitos n ................................................... 5

H nh 1.4. Công th c cấu t o c a acid folic .............................................................. 6
H nh 1.5. Quy tr nh tổng h p ph c h p CS-FA theo cách trực tiếp ........................ 8
H nh 1.6. Quy tr nh tổng h p CS với FA thông qu chất trung gian PEG............... 9
H nh 1.7. H nh ảnh siêu vi n ng và siêu vi cầu ...................................................... 11
H nh 2.1. Sơ đ mô tả quy tr nh bào chế tiểu phân n no DHA-PLGA/CS-FA…...17
H nh 3.1. Đ thị biểu diễn mối tương qu n giữa diện tích pic và n ng độ DHA .. 22
H nh 3.2. Đ thị ảnh hưởng tỉ lệ CS-FA PLGA đến đ c tính hệ tiểu phân n no
DHA-PLGA/CS-FA ............................................................................................... 25
H nh 3.3. Đ thị ảnh hưởng c a tỉ lệ thể tích ph dung dịch CS-FA/pha hỗn dịch
nano đến đ c tính c a hệ tiểu phân n no DHA-PLGA/CS-FA .............................. 27
H nh 3.4. Đ thị ảnh hưởng c a nhiệt độ gi i đo n hấp phụ CS-FA đến đ c tính c a
hệ tiểu phân n no DHA-PLGA/CS-FA .................................................................. 28
H nh 3.5. Đ thị thể hiện phần trăm giải ph ng c

DHA theo thời gi n t hệ tiểu

phân nano .............................................................................................................. 300

H nh 3.6. Phổ hấp thụ UV-VIS c a CS, FA, ph c h p h

h c CS-FA, nano DHA-

PLGA/CS, DHA-PLGA/CS-FA ........................................................................... 311
H nh 3.7. Phổ IR c a nano DHA-PLGA/CS-FA, ph c h p CS-FA, hỗn h p v t lý
và các nguyên liệu ................................................................................................ 333


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là căn bệnh đe d a m ng sống, là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong.
Các phác đ đi u trị ung thư hiện t i thường biết đến với m c độ độc tính c o. Do đ
để tăng hiệu quả đi u trị, cần phải phát triển các thuốc ung thư hướng đích c tác dụng
hiệu quả c o trên tế bào ung thư và ít ho c không c phản ng phụ đối với tế bào b nh
thường.
Dihydroartemisinin (DHA) là một trong những dẫn xuất chính c a artemisinin.
DHA đã đư c chấp thu n và sử dụng trên lâm sàng như là một thuốc đi u trị sốt rét và
c tác dụng phụ không đáng kể [22], [34], [35]. Theo những báo cáo gần đây, DHA
đư c bào chế ở kích thước nano cho thấy ho t tính kháng ung thư m nh trên nhi u
dòng tế bào [10].
Hệ tiểu phân n no ngày càng đư c sử dụng rộng rãi như một hệ v n chuyển
thuốc hướng đích. Trong đ tiểu phân n no polyme đư c bào chế bằng cách sử dụng
poly (acid lactic-co-glycolic) PLGA) c nhi u ưu điểm như phân h y sinh h c, gi p
bảo vệ dư c chất khỏi tác động c a enzym, kiểm soát giải ph ng dư c chất [23], [27],
[38]. Để tăng tác dụng v n chuyển thuốc hướng đích, chitos n CS) đư c sử dụng rộng
rãi để cải tiến b m t c a nano PLGA, tăng khả năng bám dính tế bào, tăng tính hướng
đích, kéo dài thời gi n bán thải [18].
Theo nghiên c u, các thụ thể folat đã đư c t m thấy ở hầu hết các tế bào ung
thư nên các chất phối tử folat đư c sử dụng phổ biến với mục đích v n chuyển thuốc
hướng đích. Acid folic FA) là một trong những phối tử folat điển h nh đư c sử dụng

để tăng tác dụng hướng đích cho hệ tiểu phân n no v ái lực cao với các thụ thể folat
trên tế bào ung thư, không gây độc, ổn định khi bảo quản và lưu thông [25], [29].
Chính v v y, ch ng tôi tiến hành thực hiện đ tài “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu
phân nano dihydroartemisinin bao phức hợp chitosan và acid folic” với mục tiêu
sau:
1. Xây dựng công th c bào chế hệ tiểu phân n no DHA-PLGA/CS-FA.
2. Đánh giá một số đ c tính c a hệ tiểu phân n no bào chế đư c.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 . Tổng quan về dihydroartemisinin
1.1.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.1. Công thức cấu tạo c a dihydroartemisinin
- Tên kho

h c: (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-Decahydro-3,6,9-trimetyl-3,12-

epoxy-12H-pyrano[33]-1,2-benzodioxepin-10-ol.
- Công th c phân tử c a DHA: C15H24O5.
- Khối lư ng phân tử c a DHA: 284,35 g/mol.
1.1.2. Tính chất lý hóa
- H nh th c: DHA là những tinh thể h nh kim màu trắng, vị đắng, không mùi.
- Độ tan: rất ít t n trong nước, ít t n trong dầu, tan tốt trong eth nol 95°, t n đư c
trong các dung môi như ete, cloroform.
- Nhiệt độ n ng chảy: 145 - 150°C.
- Năng suất quay cực [α] 20 = 140 - 146 (C = 1,0026 trong cloroform).
- DHA là dẫn xuất c

rtemisinin đã đư c thay thế nh m l cton ở vị trí C12 bằng

nh m bán cet l. Chính hệ thống 3 vòng cùng nh m bán cet l ở C12 đã làm cho
DHA t n t i ở 2 d ng α và β và ch ng c thể chuyển h

lẫn nhau [19], [35].

1.1.3. Định lượng
DHA đư c định lư ng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng c o. Một số
nghiên c u đã định lư ng DHA như s u:
Shabana Ali và cộng sự tiến hành định lư ng đ ng thời DHA và artemethe bằng
HPLC-UV sử dụng C18 (Zorbax SB-Ciano, 150 × 4,6 mm, 5 µm), pha động
ACN:0,05% strifluoroacetic acid (60:40), thể tích tiêm là 20 µl, bước s ng 210 nm
[36].
DHA đư c Wang Lu và cộng sự tiến hành định lư ng theo hệ thống HPLC
Agilent 1200 với detector DAD sử dụng cột C18 (Agilent XDB, 4,6×150 mm, 5 µm),
2


ph động ACN:đệm phosphat (NaH2PO4) pH 3 (50:50), thể tích tiêm là 20 µl, bước
s ng 210 nm, tốc độ dòng 1 ml ph t [32].
1.1.4. Dược động học
Nghiên c u trên động v t thực nghiệm: DHA hấp thu tốt qu đường uống, tỷ lệ
liên kết với protein huyết tương là 50%. Với li u uống là 20 mg kg kết quả cho thấy
thời gi n bán thải là 2,1 giờ. DHA phân bố đến khắp các cơ qu n, đ c biệt phân bố
nh nh đến g n và tim. DHA c ái lực với h ng cầu bị nhiễm P.falciparum c o hơn so
với h ng cầu b nh thường. DHA thải tr nguyên d ng qu nước tiểu (82,7%) và một
phần qu phân. Khi dùng DHA đ ng thời với các thuốc khác c tỷ lệ liên kết với
protein huyết tương c o nh n thấy độc tính không tăng lên.

Nghiên c u trên cơ thể người: DHA hấp thu tốt qu đường uống với li u 1,1 mg
và 2,2 mg kg, n ng độ trong huyết tương c o nhất đ t đư c sau 1,33 giờ và t1/2 là 1,631,57 giờ. Sinh khả dụng c a ART chỉ bằng 1,62 - 10,08% sinh khả dụng c a DHA.
1.1.5. Tác dụng dược lý
DHA là chất c tác dụng diệt kí sinh trùng sốt rét rất hiệu quả đ c biệt đối với ký
sinh trùng P. falciparum [35]. Các h p chất rtemisinin trong đ c DHA tiêu diệt kí
sinh trùng một cách nh nh ch ng gần như ng y l p t c nhờ cơ chế liên kết với hem t o
r các gốc tự do trung tâm c rbon, các gốc tự do này sẽ lkyl h
sự phát triển c

protein cần thiết cho

kí sinh trùng [7].

Gần đây, DHA đư c nghiên c u với tác dụng diệt tế bào ung thư thông qu h i
cơ chế. Cơ chế th nhất, nhờ việc t o r các gốc tự do thông qu sự phân cắt đ ng nhất
c a cầu endoperoxid yếu (R-O-O-R'). Cơ chế th hai, thông qu sự phân chi dị h p
c a cầu nối endoperoxid và nước, dẫn đến sự h nh thành hydroperoxid ho c gốc
hydroxyl dự trên phản ng Fenton. Các gốc tự do c thể oxy h

lipid, gây tổn

thương màng, protein và DNA, gây r sự tự chết c a tế bào ung thư [31].
Ngoài r , DHA đã đư c ch ng minh c tác dụng kháng l i các tế bào ung thư u
thần kinh đệm, tế bào ung thư v , ruột kết, phổi, bu ng tr ng và tuyến tụy, đ i trực
tràng [10].

3


1.2 . Vài nét về PLGA

1.1.2. Cấu trúc, tính chất, ứng dụng

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học và sự th y phân c a PLGA
Poly (acid lactic-co-glycolic) PLGA) là một copolyme đư c tổng h p bằng
phương pháp đ ng polyme h
vòng 1,4-dioxan-2,5-dion) c

mở vòng ngẫu nhiên c

2 monome khác nh u, dime

cid glycolic và cid l ctic. Các PLGA khác nh u bởi

tỷ lệ các monome sử dụng và khối lư ng phân tử KLPT), ví dụ PLGA 75:25 ch a
75% cid l ctic và 25% cid glycolic [37].
PLGA là một trong những polyme phân h y sinh h c hiệu quả nhất trong phát
triển các d ng thuốc nano do n c khả năng kiểm soát và duy tr giải ph ng dư c
chất, độc tính thấp, tương thích sinh h c với nhi u mô và tế bào. Ngoài r n no PLGA
đ ng đư c nghiên c u ng dụng trong liệu pháp chẩn đoán h nh ảnh và trong đi u trị
ung thư. Trong nước, PLGA th y phân liên kết este giải ph ng cid l ctic và cid
glycolic. Cả h i monome này đư c chuyển h

thông qu chu tr nh Krebs, r i đào thải

dễ dàng s u khi chuyển đổi thành CO2 và nước do đ các hệ đư thuốc sử dụng PLGA
thường c m c độc tính thấp [37]. US-FDA và EMA cho phép sử dụng PLGA trong
nhi u d ng bào chế dư c phẩm. Trên thương m i, PLGA c nhi u lo i khác nh u v
tr ng lư ng phân tử và tỷ lệ thành phần các monome [23].
Aicd l ctic thân dầu hơn cid glycolic, do đ các PLGA giàu thành phần cid
l ctic kém thân nước hơn và phân h y ch m hơn. Quá tr nh phân h y polyme in vitro

và in vivo bị ảnh hưởng bởi nhi u yếu tố như phương pháp tổng h p, sự c m t c a
các thành phần phân tử lư ng thấp (monome, oligome, chất x c tác), KT, h nh d ng và
h nh thái b m t, các đ c tính vốn c c a polyme (KLPT, cấu tr c h
nước, tr ng thái kết tinh, nhiệt độ chuyển h
độ, lực ion c

th y tinh, các thông số lý h

môi trường), đích sử dụng và cơ chế th y phân) [23].

4

h c, tính sơ
pH, nhiệt


1.2.2. Nhược đi

c a

G

hi sử dụng là

chất mang thuốc

Một trong những kh khăn chính c a hệ nano sử dụng chất m ng là PLGA liên
qu n đến khả năng n p thuốc (LC) thấp m c dù hiệu suất mang thuốc (EE) thân dầu
cao [16].
Khi sử dụng PLGA làm chất mang c sự giải ph ng dư c chất trải qua hai giai

đo n, trong đ gi i đo n đầu c sự giải ph ng “bùng nổ,

t” do xảy r quá tr nh hò

t n và ăn mòn ở b m t. Đi u này làm cho phân tử thuốc c thể không đến đư c đích
tác dụng là các tế bào, mô bệnh lý do đ làm mất hiệu quả đi u trị [16], [23].
M t khác các tiểu phân n no PLGA dễ bị bắt giữ bởi hệ thống thực bào và tương
tác không đ c hiệu với protein và tế bào làm giảm hiệu quả đi u trị và tăng tác dụng
phụ. Do đ , nhi u nghiên c u nhằm th y đổi các đ c tính lý h

b m t c a tiểu phân

nano PLGA đã đư c thực hiện như b o tiểu phân với polyme thân nước (PEG,
chitos n) để kéo dài thời gian tuần hoàn do tiểu phân thân nước c khả năng tuần hoàn
trong máu lâu hơn và bị tích lũy ở gan ở m c độ tối thiểu [23].
1.3. Vài nét về chitosan
1.3.1. Nguồn gốc và cấu trúc
Chitosan (CS) (poly 1,4-β-D-glucosamin) là một polysaccarid tự nhiên, g m
nhi u polyme khác nh u v khối lư ng phân tử (50 - 2000 kD ) và m c độ cetyl h
(40 - 98%). CS đư c sản xuất bằng cách N-de cetyl h

chitin lấy t vỏ c

động v t

giáp xác như tôm, cu …

Chitosan

Chitin

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học c a chitin và chitosan
1.3.2. Tính chất c a chitosan
Tính chất vật lý: CS c tính b se yếu, pK khoảng 6,3 - 7,0. Không t n trong các
dung dịch pH trung tính và ki m, t n trong hầu hết các dung dịch acid hữu cơ ở pH <
6,5 như cid formic, cid cetic, cid t rtric và cid citric, nhưng không t n trong cid
sulfuric và cid phosphoric…Các muối c

CS đ u t n trong nước, độ t n phụ thuộc
5


vào m c độ DA và pH dung dịch. Sự c m t c

các muối trong dung dịch cũng ảnh

hưởng đến độ t n c

CS. Lực ion càng lớn, độ t n càng giảm do các ion c nh tr nh độ

t n dẫn đến sự kết t

CS trong dung dịch [18], [26].

Tính chất hóa học: Trong phân tử CS c các nh m ch c: -OH, -NH2, -NHCOCH3
nên c thể coi CS v

là lcol, v

là min, v

là mid. Phản ng h

h c c thể xảy

ra ở các vị trí nh m ch c t o ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-… Do các monome
c

CS đư c nối với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycosid nên dễ bị cắt m ch bởi các

chất h

h c như: cid, b se, tác nhân oxy h

và các enzym th y phân [18].

Tính chất sinh học: CS là một polyme phân h y sinh h c gi p tăng v n chuyển
các thuốc phân cực qua b m t biểu mô, c tương thích sinh h c và khả năng phân h y
sinh h c. Nhờ vào tính chất tích điện dương gi p cho CS ho t động như một chất bám
dính sinh h c, c khả năng bám vào các b m t tích điện âm như màng nhầy. Ngoài r ,
CS còn c nhi u tác dụng sinh h c như c chế vi khuẩn và vi nấm, giảm lipid máu,
kháng ung thư và kích thích miễn dịch [18], [26].
1.4. Vài nét về acid folic và thụ thể folat
1.4.1. Cấu tạo, tính chất và ứng dụng

Hình 1.4. Công thức cấu tạo c a acid folic
Tính chất: Là bột kết tinh màu hơi vàng, không mùi, không t n trong nước l nh,
tan tốt trong ki m, acid loãng, nhiệt độ n ng chảy 250ºC. Acid folic dễ bị phân h y
mất ho t tính dưới tác dụng c

ánh sáng, chất oxy h , chất khử, acid, ki m ho c khi

đun n ng.
Ứng dụng: Ngoài việc liên kết ch t chẽ với các thụ thể folat, FA đư c sử dụng
với mục tiêu hướng đích không chỉ trong đi u trị các bệnh ung thư mà còn là một lo t
các bệnh viêm nhiễm khác. FA c thể hò t n trong nước, c tr ng lư ng phân tử
tương đối thấp, c thể dễ dàng sử dụng và c khả năng lưu giữ tốt, ngoài r n c các
6


tính chất liên h p đơn giản. Nhi u nghiên c u cho thấy rằng sự liên kết c

các đ i

phân tử khác nh u đã đư c cải thiện b m t bởi FA với thụ thể folat tương đương với
sự liên kết c a FA tự do với thụ thể folat. Ngoài r , trong nh m các phối tử fol t th
FA c l i thế hơn so với các phối tử khác ví dụ IgG monoclonal, peptid, hormon…).
Chính v v y việc sử dụng FA làm mục tiêu v n chuyển thuốc hướng đích tới các tế
bào bị bệnh trở nên phổ biến hơn so với các nh m phối khác [12], [21], [25], [29].
1.4.2. Thụ th folat
Thông thường, thụ thể folat ở người xuất hiện ở một số mô b nh thường trong
ngưỡng cho phép. Tuy nhiên các thụ thể folat thường xuất hiện ở n ng độ cao t i
những tế bào ác tính. Trong đ , thụ thể FRβ phần lớn đư c biểu hiện các khối u không
c biểu mô như b ch cầu. Thụ thể FRα ở các tế bào ác tính như bu ng tr ng, nội m c
tử cung, đ i trực tràng, v , phổi, th n, di căn não, ung thư biểu mô thần kinh. Dự vào
đây, c thể chẩn đoán chính xác bệnh ung thư thông qu xét nghiệm t m FR [25].
B nh thường, các thụ thể fol t không thể tiếp c n đư c với máu nên không c khả
năng gắn acid folic. Tuy nhiên khi tế bào chuyển thành ác tính thụ thể fol t c thể tiếp
c n đư c với máu, đây là đi u kiện lý tưởng để đư thuốc hướng đích thụ thể folat qua
trung gian acid folic [15].

1.5. Vài nét về tổng hợp phức hợp CS-FA
 Phƣơng pháp vật lý:
Trong môi trường c pH thích h p, nh m NH2 c a CS và COOH c

FA điện ly

t o thành các ion trái dấu tương ng -NH3+ và -COO-. Khi đ CS liên kết với FA ch
yếu theo tương tác tĩnh điện. Tỉ lệ FA/CS, pH c a dung dich CS, pH c a dung dịch FA
là các yếu tố quyết định đến độ liên kết c a ph c h p CS-FA [33].
Ưu điểm c a phương pháp là cách tiến hành đơn giản, thời gian hấp phụ nhanh
do đ giảm nguy cơ th y phân, cắt m ch polyme làm phá vỡ cấu tr c tiểu phân n no
polyme phân h y sinh h c. Tuy nhiên bản chất liên kết giữa CS và FA là liên kết tĩnh
điện nên c thể liên kết không ch t chẽ, lỏng lẻo.
 Phƣơng pháp hóa học:
Ph c h p CS-FA đư c tổng h p bằng phản ng h

h c giữ các nh m -NH2 c a

CS và nh m -COOH c a FA để t o thành liên kết đ ng h

trị.

Dimethylsulfoxid (DMSO) là một dung môi lý tưởng để hò t n FA và là một
môi trường thích h p để thực hiện các phản ng h
7

h c. Trong khi đ , CS là một


glucosamin tan trong dung dịch acid và không t n trong dung môi hữu cơ. Do đ , việc

t o ph c h p CS-FA bằng phương pháp h

h c thường đư c thực hiện trong các

dung môi đ ng tan với nước ví dụ: 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid ho c đệm
phosphat) ho c trong hỗn h p dung môi hữu cơ và nước [28], [30].
Ph c h p CS-FA c thể đư c tổng h p bằng 2 cách:
Cách 1: Cho FA phản ng trực tiếp với CS bằng cách ho t h
c a FA với các tác nhân h

nh m -COOH

h c như: N, N'-dicyclohexylcarbodiimid (DCC) ho c 1-

ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimid với N-hydroxysuccinimid (NHS). Este
NHS-FA thu đư c cho phản ng với các nh m min tự do c a CS trong dung dịch
nước ở pH thấp hơn 6 ho c trong DMSO để t o thành một liên kết amid ổn định giữa
FA và CS [30]. Quá tr nh tổng h p ph c h p CS-FA bằng cách trực tiếp đư c thể
hiện trên h nh vẽ:

Hình 1.5. Quy trình tổng hợp phức hợp CS-FA theo cách trực tiếp
Cách 2: FA đư c liên kết với CS thông qu chất trung gi n như PEG, Ocarboxymethylat chitosan, trimethylat chitosan, N-succynyl chitosan, deoxycholic
acid-O-carboxymethylat chitosan,… [9], [28] với các tác nhân h

h c như là 2,2’-(

ethylenedioxy)-bis-(ethyamin), 1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimid, 4dimethylamino-pyridin…Ví dụ quy tr nh tổng h p CS với FA thông qu chất trung
gian là PEG với tác nhân h

h c là 1-ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimid

(EDAC) và N-hydroxysuccinimid (NHS) đư c thể hiện qu h nh 1.6 dưới [30]:
8


Hình 1.6. Quy trình tổng hợp CS với F thông qua chất trung gian PEG
Ưu điểm c

phương pháp h

h c là t o liên kết b n vững giữ CS và FA.

Như c điểm là quy tr nh ph c t p và thời gian phản ng kéo dài tăng nguy cơ phá vỡ
cấu tr c các polyme phân h y sinh h c.
1.6. Một số nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano liên quan
1.6.1. Nghiên cứu về nano DHA
Năm 2010, DHA đư c Zh ng X. và cộng sự tiến hành tối ưu h

và bào chế dưới

d ng tiểu phân n no sử dụng chất m ng thân lipid. Hệ n no đư c bào chế bằng cách
hò t n dư c chất, glycerol monoster t và Myglyol trong hỗn h p dung môi hữu cơ
g m ethanol-aceton (1:1). S u đ phân tán ph dầu vào trong 20 ml dung dịch ch a
Tween 80 và Poloxamer 188 trong 30 ph t dưới tác động c

máy khuấy cơ h c ở tốc

độ 3000 vòng ph t. Thêm HCl 0,1 N vào hỗn dịch t o thành để đi u chỉnh pH v 1,2,
s u đ ly tâm trong 50 ph t. Thu lấy phần rắn và phân tán trở l i vào 10 ml dung dịch
natri dodecyl sulfat 0,3% để lo i bỏ phần dư c chất tự do nằm ngoài tiểu phân n no.

Các tiểu phân n no s u khi lo i phần dư c chất tự do đư c thêm l ctose và glucose và
tiến hành đông khô thu sản phẩm. Kết quả nghiên c u chỉ ra tỉ lệ và hàm lư ng các
thành phần trong công th c tối ưu c a tiểu phân n no DHA như s u: DHA 1 g/l, n ng
độ lipid 1% và tỷ lệ lipid lỏng so với tổng lipid là 0,1:1. Hiệu suất mang thuốc (EE),
khả năng n p thuốc (LC), kích thước trung b nh MPS), chỉ số đ phân tán PDI) và
giá trị thế zet cho công th c tối ưu lần lư t là: 98,97 ± 2,3%, 15,61 ± 1,9%, 198 ± 4,7

9


nm, 0,146 và -21,6 ± 1,3 mV. Kết quả giải ph ng dư c chất trong nghiên c u cho thấy
hệ tiểu phân n no giải ph ng t t trong 48 giờ [35].
Năm 2015, hệ nano DHA-PLC-NPs đã đư c Lu Wang và công sự nghiên c u với
mục đích tăng hiệu suất mang thuốc c

DHA. Trong nghiên c u DHA đư c t o ph c

với phospholipid bằng cách hò t n DHA và phospholipid vào trong cloroform trong
đi u kiện nhiệt độ và thời gi n thích h p, s u đ tiến hành tinh chế và đông khô thu
đư c ph c h p DHA-PLC. Hệ nano DHA-PLC-NPs bào chế theo phương pháp nhũ
h

dung môi khi g m pha dầu (ph c h p DHA-PLC, PLGA, diclometh n) đư c nhỏ

t t vào ph nước (dung dịch PVA) trong đi u kiện nhiệt độ l nh s u đ bốc hơi dung
môi trong đi u kiện chân không với nhiệt độ 30°C, thời gi n 20 ph t. Kết quả hệ tiểu
phân n no thu đư c c kích thước tiểu phân, thế zeta, hiệu suất mang thuốc và khả
năng n p thuốc lần lư t là 265,3 ± 7,9 nm, 21,4 ± 6,3 mV, 74,2 ± 6,5% và 2,80 ±
0,35%. Kết quả đánh giá khả năng giải ph ng c a DHA t hệ nano sau 1 giờ, 4 giờ và
7 ngày lần lư t là 24,47 ± 1,90%, 46,38 ± 1,79%, và 93,54 ± 0,23%. Đi u này cho

thấy hệ nano DHA-PLC-NPs c khả năng kiểm soát giải ph ng [32].
1.6.2. Nghiên cứu về nano sử dụng phức hợp chitosan-acid folic
Nghiên c u v nano bao ph c h p chitosan- cid folic hướng đích c thể kể đến
một số nghiên c u sau:
Năm 2011, Jingou và cộng sự đã đư c tiến hành bào chế tiểu phân n no
methotrexat (MTX) bởi phương pháp gel h

giữa ph c h p CS-FA với tác nhân liên

kết chéo tripolyphosph t (TPP). Kết quả thu đư c hệ nano MTX-CS-FA với kích
thước tiểu phân trong khoảng t 293,9 ± 24,2 đến 401.5 ± 20,4 nm, với chỉ số phân tán
nhỏ hơn 0,25, thế zet các mẫu nano lớn hơn 20 mmV, hiệu suất mang thuốc khoảng
30%, khả năng n p thuốc lên tới 11,54%. Khả năng giải ph ng thuốc in vitro cho thấy
rằng nano MTX giải ph ng

t vào gi i đo n đầu s u đ là gi i đo n giải ph ng

ch m, và các FA trên b m t tiêu phân n no cũng đư c giải ph ng nên c thể làm
giảm tác dụng phụ c a MTX [20].
Năm 2015, Dh s N mdev L. cùng cộng sự đã tiến hành thiết kế và tối ưu công
th c hệ tiểu phân n no bicalutamid-PLGA bao ph c h p chitosan-aicd folic (BLT NPs
bao CS-FA) dùng trong đi u trị ung thư tuyến ti n liệt. Kết quả nano BLT bao CS-FA
cho kết quả như s u: Giá trị kích thước tiểu phân trung b nh, thế zeta, hiệu suất mang
thuốc, khả năng n p thuốc c a BLT NPs bao CS-FA lần lư t là 206,9 nm, +21,7 mV,
10


87,11%, và 9,37%. Khả năng giải ph ng thuốc c

công th c BLT NPs bao CS-FA tối

ưu s u 120 giờ là 101,27 ± 1,61%. Nghiên c u độc tính tế bào cho thấy giá trị IC50
c a BLT NPs bao CS-FA < 80 µg ml so với giá trị IC50 c a bicalutamid hỗn dịch là >
80 µg ml. Kết quả c

nghiên c u cũng chỉ ra rằng BLT NPs bao CS-FA ổn định trong

máu, n toàn và c thể đư c dùng trong đi u trị ung thư ti n liệt tuyến [11].
1.7. Tổng quan về tiểu phân nano polyme
1.7.1. Đặc đi m
Các tiểu phân n no polyme đư c bào chế t các polyme tương thích ho c phân
h y sinh h c c kích thước t 1 - 1000 nm t i đ thuốc đư c hò t n, bẫy, b o g i
ho c phân tán trong cốt c a tiểu phân n no. Tùy theo phương pháp bào chế mà thu
đư c siêu vi cầu (nanospheres) ho c siêu vi n ng n noc psules). Siêu vi n ng c cấu
tr c nhân vỏ như vi n ng, còn siêu vi cầu c cấu tr c cốt m trix) đ ng nhất như vi cầu
[2], [24].

Hình 1.7. Hình ảnh siêu vi nang và siêu vi c u
1.7.2.

hương pháp bào chế ti u phân nano poly e
Dựa theo quy tr nh bào chế, c thể chi các phương pháp bào chế nano polyme

làm 2 lo i: 1 gi i đo n và 2 gi i đo n.
Phương pháp 1 gi i đo n: Dự trên sự kết t a c a polyme t một dung dịch
ho c dự trên sự kết t p tự phát c
các ph c h p c

các đ i phân tử để h nh thành các n nogel ho c

các chất đ điện phân polyelectrolyte).

Phương pháp 2 gi i đo n: Bao g m gi i đo n đầu chung cho các phương pháp
là bào chế một nhũ tương và gi i đo n 2 là gi i đo n h nh thành nên tiểu phân nano.
Gi i đo n 2 c thể đư c thực hiện dựa trên phản ng polyme hoá các monome ho c
các quá tr nh kết t , gel hoá c

các polyme [39].
11


Các polyme đư c sử dụng c thể là polyme tự nhiên, các polyme tổng h p, c
sẵn ho c t o thành t các monome. Tuy nhiên, do các polyme t o thành t phản ng
polyme hoá thường ít phân h y sinh h c, các monome t n dư và chất diện ho t đư c
dùng với lư ng lớn c thể gây độc và đòi hỏi quá tr nh tinh chế ph c t p. Do v y, hiện
nay các nghiên c u sử dụng ch yếu các polyme c sẵn như các Eudr git và đ c biệt là
các polyme phân h y sinh h c như PLGA, polylactic acid (PLA), polycaprolacton
PCL),…Bên c nh đ , nhi u nghiên c u sử dụng kết h p các polyme tổng h p và
polyme thiên nhiên như lgin t, chitos n…
Các phương pháp s u thường đư c sử dụng trong đi u chế tiểu phân n no
polyme t các polyme tổng h p c sẵn [24], [39] :
-

Nhũ hoá bốc hơi dung môi.

-

Tự nhũ hoá do khuếch tán dung môi.

-

Thay thế dung môi.

-

Nhũ hoá khuếch tán dung môi.

-

Hoá muối.

-

Gel h

1.7.3. Cải biến bề

h y kết tụ.
ặt ti u phân nano poly e hi sử dụng đường tiê

t nh

ạch

Hiện n y c nhi u mối qu n tâm trong việc phát triển các hệ v n chuyển thuốc c
kích thước đ nhỏ để sử dụng theo đường tĩnh m ch và c thời gian tuần hoàn đ để
c thể giải ph ng thuốc t i đích tác dụng theo cách liên tục ho c c kiểm soát. Tiểu
phân n no polyme là những hệ đư thuốc lý tưởng cho các thuốc tác dụng t i đích theo
đường tĩnh m ch, gi p tăng hiệu quả t i mô bệnh lý và giảm độc tính chung.
S u khi tiêm tĩnh m ch, hệ thống thực bào đơn nhân MPS) trong tuần hoàn coi

tiểu phân như một v t thể l và tiến hành đào thải. Để lưu giữ tiểu phân trong tuần
hoàn lâu hơn, gi p tăng khả năng phân bố tiểu phân đến đích tác dụng, cần phải c các
giải pháp để tránh thực bào như:
- “Ngụy tr ng” tiểu phân nhằm tránh sự nh n biết c

tế bào lympho: B o bên

ngoài với các polyme thân nước và tương thích sinh h c như PEG, poloxamer và
poloxamin, chitosan... [13], [27] gi p bảo vệ tiểu phân n no khỏi sự bắt giữ c
và tăng độ ổn định.

12

MPS


- Biến tính b m t tiểu phân để ngăn cản quá tr nh thực bào: Tiểu phân n no
polyethylen oxyd t o r cấu tr c không gi n c ng k nh, làm giảm thực bào. Tiểu phân
b o chất diện ho t cũng h n chế tỷ lệ thực bào.
- B o tiểu phân bằng tác nhân phân giải màng lysosom.
Ngoài r , để tăng n ng độ dư c chất t i đích tác dụng, c thể gắn lên b m t tiểu
phân các phân tử hướng đích tuy nhiên biến đổi b m t tiểu phân cũng ảnh hưởng đến
sự giải ph ng dư c chất.

13


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết b
2.1.1. Nguyên liệu

Bảng 2.1. Nguyên liệu sử dụng trong quá tr nh thực nghiệm
Tên nguyên liệu

STT
1

Dihydroartemisin

Nguồn gốc
Dư c phẩm Tuấn T
( Việt Nam)

Tiêu chuẩn
CP2010

PLGA 50:50 DLG 2A, KLPT
2

7-17 kD , độ nhớt 0,16-0,24

Evonik Đ c)

dL g dung dịch 0,1% trong

TCCS

cloroform, 25°C)
Chitosan, KLPT 30-45 kDa,
DA=75-85%, độ nhớt 20 –
3

Sigma Aldrich

300 cP n ng độ 1% kl tt)

(Mỹ)

trong acid acetic 1% (tt/tt),

TCCS

25°C
4

Acid folic

Sigma Aldrich

5

Dicloromethan

6

Tween 80

Mỹ

7

Acid acetic

Trung Quốc

Tinh khiết h

8

Kali dihydrophosphat

Merk Đ c)

Tinh khiết phân tích

9

Acid phosphoric đ c

Merk Đ c)

Tinh khiết phân tích

10

Acetonitril

Merk Đ c)

Dùng cho HPLC

11

Natri hydroxyd

Trung Quốc

Tinh khiết h

h c

12

Aceton

Trung Quốc

Tinh khiết h

h c

13

N-hydroxysuccunimid

14

Trung Quốc

TCCS
Tinh khiết h

USP 38

Sigma Aldrich

TCCS

Dicyclohexylcarbodiimid

Merk Đ c)

TCCS

15

Dimethylsulfoxid

Merk Đ c)

TCCS

16

Diethyl ete

Trung Quốc

14

h c

Tinh khiết h

h c

h c


2.1.2. Thiết bị
- Máy đo thế Zet và xác định phân bố KTTP Zetasizer NanoZS90 (Anh).
- Máy khuấy t Ik L bortechnik Đ c).
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng c o HPLC Thermo Finnigan (Mỹ).
- Máy ly tâm l nh HERMLE Larbotechnik GmbH – Z326k Đ c).
- Máy siêu âm đầu dò Vibra Cell, Sonics & Materials, INC (Mỹ), công suất
tối đ 130 W, tần số 20 kHz.
- Máy đo phổ h ng ngo i FT/IR 6700 JASCO (Nh t Bản).
-Máy đông khô Alpha 1-2 LDplus, Martin Christ Gefriertrocknungsanlage GmbH
Đ c).
- Máy Vortex Mixer VM-300 Đ c).
- Màng thẩm tích Membr nce Cel kích thước 10000 Da (Mỹ).
- Máy sấy chân không LVO-250, D ih n L btech Co.Ltd Hàn Quốc).
- Máy qu ng phổ UV-VIS U-1900, HITACHI (Nh t Bản).
- Máy l c nước PURELAB classic UV, ELGA (Anh).
- Máy đo pH Eutech instrument pH 510.
- Cân kỹ thu t, cân phân tích, các dụng cụ th y tinh khác.
- Ống ly tâm ch

màng siêu l c 10000Da, Millipore, Billerica, MA (USA).

- T l nh sâu Unicryo Mỹ).
- Bể siêu âm WUC- A06H, D ih n Hàn Quốc).

- Các thiết bị khác cốc c mỏ, pipet, b nh định m c…).
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng công th c bào chế hệ tiểu phân n no DHA-PLGA/CS-FA: Khảo sát ảnh
hưởng c a một số yếu tố ảnh hưởng đ c tính tiểu phân n no DHA-PLGA/CS-FA như
thời gi n siêu âm, công suất siêu âm, tỉ lệ CS-FA/PLGA, nhiệt độ hấp phụ CS-FA, tỉ lệ
thể tích ph dung dịch CS-FA/pha hỗn dịch nano.
- Đánh giá một số đ c tính tiểu phân n no bào chế đư c như KTTPTB, PDI, thế zeta,
hiệu suất mang thuốc (EE), khả năng n p thuốc (LC), khả năng giải ph ng DC t hệ
tiểu phân n no, đánh giá sự tương tác giữ CS và FA, xác định sự c m t c a CS, FA
trên hệ tiểu phân n no.

15


2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. hương pháp bào chế
2.3.1.1. hương pháp bào chế hệ ti u phân nano DHA-PLGA
Qua tham khảo nghiên c u [1], [2], [3], [32] và kết h p với đi u kiện thực
nghiệm tiến hành bào chế tiểu phân n no DHA-PLGA theo phương pháp nhũ h

bốc

hơi dung môi t nhũ tương D/N.
- Pha dầu: Hò t n 10 mg DHA và 30 mg PLGA vào 5 ml DCM.
- Ph nước: Dung dic Tween 80 n ng độ 1,5% (kl/tt) trong 50 ml nước cất.
- Gi i đo n nhũ h : Nhỏ t t pha dầu vào ph nước (tốc độ khoảng 2,5 ml ph t).
Nhũ tương D N đư c đ ng nhất bằng cách sử dụng đầu siêu âm tần số 20 kHz, công
suất 100% - 130 W). Trong quá tr nh đ ng nhất, duy tr nhiệt độ 0 - 5°C bằng nước đá
và kết h p khuấy t .
- Bốc hơi dung môi: Nhũ tương thu đư c tiếp tục đư c khuấy t nhẹ nhàng trong 3 giờ

ở nhiệt độ phòng để lo i dung môi hữu cơ.
2.3.1.2. hương pháp bao phức hợp CS-F lên hệ ti u phân nano DH -PLGA.
a. Tổng hợp phức CS-FA
Qua tham khảo nghiên c u [11], [30] và kết h p với đi u kiện thực nghiệm tiến
hành tổng h p CS với FA như s u:
- FA, DCC và NHS (theo tỉ lệ mol FA:DCC:NHS = 1:1,2:1,2) đư c hò t n DMSO để
trong l tránh ánh sáng, c khuấy t qu đêm. L c bỏ t a t p lấy dịch trong. Tiến hành
thu t a este NHS-FA bằng cách nhỏ t dung dịch diethyl ete c ch

30% ceton để

l nh vào cho đến khi thấy t a. Thu t a bằng cách ly tâm ở 10000 vòng/ph t trong 5
ph t. Rửa t a nhi u lần với dung dịch diethyl ete (ch a 30% ceton) và sấy khô t a ở
nhiệt độ 35°C.
- NHS-FA đư c hò t n trong DMSO, s u đ cân một lư ng tỉ lệ CS vào dung dịch
DMSO. Duy tr nhiệt độ khoảng 35°C, để khuấy t trong vòng 12 giờ trong đi u kiện
tránh ánh sáng. Đem hỗn dịch đi ly tâm ở tốc độ 10000 vòng ph t trong thời gian 5
ph t để thu t a CS-FA. T a CS-FA đư c rửa nhi u lần với nước cất để lo i bỏ DMSO.
S uđ t

đư c sấy chân không ở nhiệt độ 35°C cho đến khi khô. Thu đư c ph c h p

CS-FA.

16