Khảo sát một số đặc tính của nấm men saccharomyces cerevisiae cố định trong hệ gel alginat bao chitosan

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

CHORK CHIMY

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH
CỦA NẤM MEN Saccharomyces
cerevisiae CỐ ĐỊNH TRONG HỆ GEL
ALGINAT BAO CHITOSAN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

CHORK CHIMY
Mã sinh viên: 1301046

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH
CỦA NẤM MEN Saccharomyces
cerevisiae CỐ ĐỊNH TRONG HỆ GEL
ALGINAT BAO CHITOSAN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. ThS. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Công nghiệp Dƣợc

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới ThS. Kiều Thị
Hồng là người thầy đã truyền cho tôi tình yêu khoa học qua những giờ giảng trên lớp,
dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa học, cũng là người hướng dẫn và
tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn người đã nhiệt tình hướng dẫn đến TS. Đàm Thanh
Xuân luôn giúp đỡ, giải đáp những thắc mắc, khó khăn mà tôi gặp phải trong suốt thời
gian thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo và các anh, chị kỹ thuật viên Bộ
môn Công nghiệp Dƣợc, đặc biệt là Tổ Công nghệ Sinh học-những người đã luôn
giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực nghiệm và nghiên cứu
để hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ
nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội- những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong
suốt 5 năm học tập tại đây.
Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn ở
bên động viên khích lệ, tạo mọi điều kiều kiện thuận lợi để tôi được học tập và luôn
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Chork Chimy


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN ..........................................................................................2
1.1 Giới thiệu chung về nấm men ...............................................................................2
1.2 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae .............................................2
1.2.1 Đặc tính nấm men Saccharomyces cerevisiae..............................................2
1.2.2 Ứng dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae trong công nghệ sinh học..3
1.3 Phương pháp cố định tế bào .................................................................................3
1.3.1 Khái niệm .....................................................................................................3
1.3.2 Phân loại phương pháp cố định tế bào..........................................................3
1.3.3 Ưu nhược điểm của cố định tế bào ...............................................................4
1.4 Tổng quan về một số chất mang sử dụng trong cố định tế bào ............................6
1.4.1 Alginat ..........................................................................................................6
1.4.2 Chitosan ......................................................................................................10
1.5 Phương pháp sản xuất ethanol ............................................................................12
1.6 Một số nghiên cứu về phương pháp cố định tế bào trên thế giới và Việt Nam..12
CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .............................................................................................................14
2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị, môi trường sử dụng ......................................14
2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất .............................................................................14
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu ................................................14
2.1.3 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ...................................................15
2.1.4 Môi trường sử dụng ....................................................................................15
2.2 Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................17
2.2.1 Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men S.cerevisiae cố định
trong hệ gel alginat-chitosan................................................................................17


2.2.2 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định trong hệ gel

alginat–chitosan ...................................................................................................17
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................17
2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ......................................................17
2.3.2 Phương pháp giữ giống...............................................................................18
2.3.3 Phương pháp nhân giống ............................................................................18
2.3.4 Phương pháp cố định tế bào nấm men S. cerevisiae trong hệ gel alginatchitosan ................................................................................................................18
2.3.5 Phương pháp lên men .................................................................................19
2.3.6 Phương pháp khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định ....20
2.3.7 Phương pháp định lượng đường .................................................................20
2.3.8 Phương pháp đông khô ...............................................................................21
2.3.9 Phương pháp chụp ảnh xác định kích thước và cấu trúc tế bào nấm men
S. cerevisiae .........................................................................................................22
CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................23
3.1 Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men S. cerevisiae cố định trong
hệ gel alginat-chitosan ..............................................................................................23
3.1.1 Tạo hạt cố định tế bào nấm men trong hệ gel alginat-chitosan ..................23
3.1.2 Khả năng lên men các tế bào cố định trong hệ gel alginat-chitosan ..........26
3.1.3 Khảo sát khả năng tiêu thụ đường ..............................................................28
3.2 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định cố định trong hệ gel
alginat-chitosan .........................................................................................................30
3.2.1 Khả năng lên men sau khi tái sử dụng các tế bào cố định trong hệ gel
alginat-chitosan .........................................................................................................30
3.2.2 Khảo sát khả năng tiêu thụ đường sau khi tái sử dụng ...............................33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .........................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

c

Nồng độ (Concentration)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performent liquid
chrogratomaphy)

h

Giờ (hour)

M

Mẫu

PL

Phụ lục

S. cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

SD

Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

TB

Tế bào

TN

Thí nghiệm

VSV

Vi sinh vật

V

Thể tích (Volume)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1

Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

14

Bảng 2.2

Thiết bị dùng trong nghiên cứu

14

Bảng 2.3

Dụng cụ dùng trong nghiên cứu

15

Bảng 2.4

Hóa chất dùng trong môi trường giữ giống

15

Bảng 2.5

Hóa chất dùng trong môi trường nhân giống

16

Bảng 2.6

Hóa chất dùng trong môi trường lên men

16

Bảng 2.7

Hóa chất dùng trong môi trường giữ hạt cố định tế bào

17

Bảng 2.8

Thiết kế công thức tạo hạt

19

Bảng 3.1

Đặc điểm hạt tế bào cố bào cố định nấm men S.cerevisaie

25

Bảng 3.2

Đặc điểm của các bình sau khi lên men 24h

26

Bảng 3.3

Nồng độ đường tiêu thụ trung bình trong 100ml(n=9)

29

Bảng 3.4

Đặc điểm của các bình sau khi lên men tái sử dụng sau 24h

31

Bảng 3.5

Nồng độ đường tiêu thụ trung bình sau khi tái sử dụng trong
100ml (n=9)

33


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình
Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5
Hình 1.6
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3
Hình 3.4
Hình 3.5
Hình 3.6
Hình 3.7

Hình 3.8

Tên hình
Tế bào nấm men S.cerevisiae
Các phương pháp cố định tế bào
Mô tả cấu trúc của alginat
Mô tả vi trứng, vị trí của ion Ca2+ trong gel và sự tạo thành
gel calci alginat
Cơ chế tạo gel của alginat theo phương pháp tạo gel từ bên
ngoài
Cấu trúc hóa học của chitosan
Hạt tế bào cố định trong hệ alginat
Hạt tế bào cố định trong hệ gel alginat-chitosan
Kích thước hạt tế bào cố định trong hẹ gel alginat
Kích thước hạt tế bào cố định trong hẹ gel alginat-chitosan
Bình lên men nấm men S.cerevisiae trên tế bào tự do
Bình lên men nấm men S. cerevisiae bằng alginat
Bình lên men nấm men S. cerevisiae bằng alginat-chitosan
Đồ thị so sánh khả năng tiêu thụ đường sau khi lên men 24h

Bình lên men nấm men S.cerevisiae bằng alginat sau khi tái
sử dụng 24h
Hình 3.10 Bình lên men nấm men S.cerevisiae bằng alginat-chitosan sau
khi tái sử dụng 24h
Hình 3.11 Đồ thị so sánh khả năng tiêu thụ đường sau khi tái sử dụng
24h
Hình 3.9

Trang
2

3
6
7
8
10
24
24
24
24
27
27
27
29
32
32
33


ĐẶT VẤN ĐỀ
Như chúng ta đã biết, nấm men là một loài vi sinh vật có nhiều ứng dụng trong công
nghệ và sản xuất. Một trong những ứng dụng phổ biến của chúng là tạo ethanol trong
ngành sản xuất rượu, một ngành sản xuất sản phẩm lên men có truyền thống lâu đời.
Loài nấm men đóng vai trò chính trong quá trình lên men tạo ethanol trong sản xuất
rượu là loài Saccharomyces cerevisiae. Tuy nhiên, việc sử dụng nấm men tự do để lên
men gặp phải một số vấn đề như thời gian lên men dài, tiêu tốn nhiều năng lượng để
tách nấm men ra khỏi rượu sau quá trình lên men... Để giải quyết các vấn đề này,
nhiều nghiên cứu về việc sử dụng nấm men cố định trong sản xuất đã được nhiều nhà
nghiên cứu thực hiện. Các nghiên cứu này đều cho thấy nấm men cố định có nhiều ưu
điểm hơn hẳn so với nấm men tự do như là tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời
gian lên men, ổn định hoạt tính của nấm men, góp phần tăng năng suất lên men... Đặc

biệt, việc sử dụng nấm men cố định ra đời nhằm mục đích mở rộng của các enzym và
thu hồi được enzym đó để sử dụng lần sau nên không lãng phí [11].
Chính vì những lợi ích về kỹ thuật và kinh tế do việc sử dụng nấm men cố định
trong sản xuất ethanol mang lại mà những nghiên cứu về chúng ngày càng được mở
rộng và thu hút sự chú ý nhiều hơn [2]. Từ các lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài
“Khảo sát một số đặc tính của nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trong
hệ gel alginat bao chitosan” với các mục tiêu sau:

1. Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men S. cerevisiae cố định trong hệ
gel alginat-chitosan.

2. Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định trong hệ gel alginatchitosan.

1


CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu chung về nấm men
Nấm men (Yeast, Levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm có vị trí phân
loại không thống nhất nhưng có những đặc điểm sau đây: tồn tại chủ yếu ở trạng thái
đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi, cũng có khi có hình thức phân cắt tế
bào, nhiều loài có khả năng lên men đường, thành tế bào có chứa mangan, thích nghi
với môi trường chứa đường cao, có tính acid cao.
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa
đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong,
trong đất ruộng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có nhiễm dầu mỏ.
Trong công nghệ sinh học, do các loài nấm men có các thuộc tính sinh lý học có lợi
của nấm men đã dẫn tới việc sử dụng trong công nghệ sinh học. Quá trình lên men các
loại đường bởi men là ứng dụng lâu đời và rộng rãi nhất của công nghệ này. Các ứng
dụng của nấm men trong công nghệ sinh học bao gồm:

 Nấm men bia được sử dụng để sản xuất bia và nấm men cũng được dùng để sản
xuất rượu vang.
 Nấm men bánh mỳ dùng để sản xuất bánh mỳ.
 Nấm men cũng là một trong số các vi sinh vật mẫu được sử dụng rộng rãi nhất
trong nghiên cứu di truyền học và tế bào sinh học [6].
1.2 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae
1.2.1 Đặc tính nấm men Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae là một loại thuộc nấm túi Ascomycetes còn gọi là men bánh mì hay
men rượu, loại nấm chủ yếu dùng trong quá trình lên men rượu. Nấm me S. cerevisiae
là Eukaryota đơn bào có kích thước 5-10 µm [6].

Hình 1.1 Tế bào nấm men S. cerevisiae
2


1.2.2 Ứng dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae trong công nghệ sinh học
Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: công nghiệp sản
xuất bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipid nấm
men. Các enzym như là Amylase invertase, lactase, uricase..., sản xuất esgosterol, acid
ribonucleic, riboflavin (Vitamin B12), và các acid amin. Phần lớn nấm men được sử
dụng trong công nghiệp thuộc giống Saccharomyces trong lớp nấm túi và vài giống
thuộc nấm bất toàn. Giống Saccharomyces quan trọng nhất là loài S. cerevisiae, được
dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Một số chủng của nấm men này làm men nở
bánh mỳ, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rượu vang, sản xuất enzym
invertase hoặc sản xuất glycerin [7], [11].
1.3 Phƣơng pháp cố định tế bào
1.3.1 Khái niệm
Phương pháp cố định tế bào là một kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là
―kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên một‖ vùng không gian
nhất định ―nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn‖ (Karel và cộng sự 1985)

[23]. Cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế
bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có trong
tự nhiên. Nhiều vi sinh vật tự nó có khả năng gắn lên trên những bề mặt khác nhau
trong tự nhiên [23].
1.3.2 Phân loại phương pháp cố định tế bào
Nhiều quá trình trong công nghệ sinh học thuận lợi hơn nhờ kỹ thuật cố định, do đó
mà nhiều kỹ thuật và chất mang được đưa ra. Những kỹ thuật này có thể chia thành 4
nhóm chính như là cố định trên bề mặt chất mang rắn, nhốt trong khung mạng xốp,
keo tụ tế bào, nhốt bằng phương pháp cố định học bên trong một màng chắn [23].

Hinh 1.2 Các phương pháp cố định tế bào
3


* Phương pháp nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel):
+ Nguyên tắc: Đưa tế bào vào bên trong một mạng chặt để ngăn cản của tế bào khuếch
tán vào môi trường xung quanh trong khi vẫn cho phép sự vận chuyển tự do của các
chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất diễn ra [19], [23].
+ Ưu điểm: Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vị tích chất mang cao hơn so
với canh trường vi sinh vật tự do [25].
+ Nhược điểm: Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel
[23]. Tế bào trên bề mặt tăng lên nhiều lần và dễ thoát ra khỏi mạng gel và phát triển
trong môi trường như là các tế bào tự do.
1.3.3 Ưu nhược điểm cố định tế bào
a. Ưu điểm của cố định tế bào

 Hoạt động kéo dài và sự ổn định của chất xúc tác sinh học, chất mang có thể
đóng vai trò như một chất bảo vệ chống lại ảnh hưởng hóa lý của nhiệt độ, pH,
dung môi hoặc thậm chí là kim loại nặng.



Mật độ tế bào trên một đơn vị thể tích của thiết bị phản ứng sinh học cao hơn,
thời gian phản ứng ngắn hơn và sự loại bỏ sự tăng trưởng của những tế bào vi
sinh vật không có lợi.

 Sự hấp thụ cơ chất tăng và năng suất được cải thiện.
 Có thể thực hiện được với quá trình liên tục.
 Khả năng chịu đựng được nồng độ cơ chất cao tăng và giảm sự ức chế của sản
phẩm cuối.

 Với quá trình lên men, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp dẫn đến cải thiện chất
lượng cho một số sản phẩm.

 Hoàn thiện sản phẩm dễ dàng hơn do giảm được thủ tục tách chiết và lọc, do đó
giảm giá thành cho thiết bị và yêu cầu về năng lượng.

 Sự tái sinh và tái sử dụng chất xúc tác sinh học cho nhiều thời của sự vận hành
gián đoạn mà không phải tháo bỏ nó ra khỏi thiết bị phản ứng sinh học.

 Giảm rủi ro nhiễm vi sinh vật có hại bởi vì mật độ tế bào cao.
 Có thể sử dụng thiết bị phản ứng sinh học nhỏ hơn, với sự thiết kế quá trình công
nghệ đơn giản hóa và do đó giảm chi phí vốn.
4


 Giảm thời gian sản xuất ra sản phẩm [23].
b. Nhược điểm của cố định tế bào
 Khi sử dụng tế bào vi sinh vật cố định, trong môi trường sản xuất, hiện tượng rò
rỉ hay rửa trôi tế bào ra khỏi chất mang ít hay nhiều là điều không thể tránh

khỏi. Do đó, việc thu nhận và tính sạch sản phẩm đôi khi cũng khá phức tạp.
 Tế bào cố định đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạng đảm
bảo khả năng phát triển và hoạt động bình thường. Khi đó, trong hệ thống sử
dụng tế bào cố định có thể xảy ra hiện tượng phân hủy sản phẩm để cung cấp
đầy đủ chất dinh dưỡng và năng lượng cần thiết cho tế bào. Vì thế mà hiệu suất
sử dụng tế bào cố định có thể thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bào tự do.
 Do được bao bọc bởi chất mang, thành tế bào, màng tế bào chất… có thể gây
cản trở việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm và các cấu tử từ môi trường ra vào tế
bào.
 Một nhược điểm thường thấy ở những tế bào vi sinh vật được ―gói‖ trong
khuôn có cấu trúc gel, nhưng cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không có
điều kiện tiếp xúc với tế bào vi sinh vật cố định. Vì thế mà hoạt lực của những
tế bào cố định có thể sẽ thấp hơn so với những tế bào tự do.
 Trong trường hợp cụ thể khi sản xuất ethanol, người ta không quan tâm đến sự
ức chế của ethanol lên hoạt động sống của nấm men khi tiến hành lên men gián
đoạn, khi đó nấm men chỉ được sử dụng một lần rồi được hoạt hóa lại cho lần
sản xuất tiếp theo. Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của ethanol đến hoạt động của
nấm men là rất lớn trong quá trình lên men liên tục. Sau khi lên men, hoạt tính
của tế bào nấm men có thể bị ức chế bởi ethanol. Tương tự như vậy, khi sử
dụng phương pháp cố định nấm men để sản xuất ethanol liên tục, hoạt tính của
nấm men cố định cần được duy trì và nồng độ ethanol phải thấp để không gây
ức chế đến tế bào nấm men. Như thế thì hiệu suất thu nhận sản phẩm không
cao. Nhiều phương pháp thảo sản phẩm liên tục khỏi thiết bị lên men được
nghiên cứu nhằm tránh những tác động không tốt của sản phẩm lên men đối với
nấm men [11].

5


1.4 Tổng quan về một số chất mang sử dụng trong cố định tế bào

1.4.1 Alginat
a. Nguồn gốc
Alginat là loại polymer sinh học biển phong phú nhất thế giới và là loại polymer
sinh học nhiều thứ hai trên thế giới sau cellulose. Alginat được phát hiện đầu tiên bởi
Stanford năm 1881, là một acid hữu cơ có trong tảo nâu, trọng lượng phân tử từ
32.000-200.000 [10].
Nguồn alginat chủ yếu được tìm thấy ở thành tế bào và ở gian bào của tảo nâu ở
biển (thuộc họ Rhaeophyceae), tảo bẹ Macrocystis pyrifera, Nodosum ascophyllum và
các loại Lamminaria nhưng nhiều nhất là ở tảo nâu, ở dưới dạng muối alginat.
Alginat tồn tại dưới 2 dạng không tan là acid alginic và calci alginat và magie (kí
hiệu: AlgCa, AlgMg) rất bền vững ở thành tế bào cây rong, tạo nên cấu trúc lưới gel
bền trên thành tế bào rong nâu [3].
a. Cấu tạo
Algiant là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid alginic là một acid
hữu cơ có trong họ tảo nâu (thuộc họ Rhaephyceae). Alginat là một polymer có các
monomer là hai acid manunuronic (viết tắt là M) và acid guluronic (viết tắt là G) gắn
với nhau bằng liên kết 1-4 glycosid [16].

Hình 1.3 Mô tả cấu trúc của alginat

6


b. Đặc điểm, tính chất liên quan đến cố định tế bào
Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực. Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và khả năng
tạo gel. Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa
trị II, III, sự tạo thành gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng. Bình thường trong
dung dịch alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc. Khi có
mặt ion kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+, Sr2+,...) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo thành

gel xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần tử gấp khúc tạo
thành khoảng không gian giống gần như chỗ đặt trứng [3]. Các ion Ca2+ khớp và các
khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian 3 chiều. Với cấu trúc gel này khi sử
dụng làm màng bao, chúng có vai trò như 1 tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi
của môi trường và cho phép giải phóng dược chất theo hướng kiểm soát được [16].

Hình 1.4 Mô tả vi trứng, vị trí của ion Ca2+ trong gel và sự tạo thành gel calci alginat
c. Cơ chế tạo gel alginat
Alginat có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao hoặc khi
phân tử alginat bị acid hóa. Tuy nhiên, phương pháp tạo gel bằng cách acid hóa phân
tử alginat ít được dùng vì quy trình thực hiện rất phức tạp.
Alginat có khả năng kết hợp nhanh với các action kim loại hóa trị cao để tạo thành
gel đồng thể. Ái lực của alginat đối với các ion hóa trị 2 khác nhau giảm theo thứ
tự.Tùy thuộc vào loại ion liên kết và loại alginat mà gel tạo thành có tính chất khác
nhau. Thông thường, người ta thường sử dụng cacium để làm ion gel.
7


Quá trình tạo gel của alginat theo phương pháp kết hợp với cation kim loại hóa trị
cao có thể tiến hành theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài và phương pháp tạo gel từ
bên trong [11]
* Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài:
Đây là phương pháp tạo gel phố biến nhất của alginat. Phương pháp này có ưu điểm
là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản. Khi nhỏ dung dịch alginat vào dung dịch có
chứa cation có khả năng tạo gel thường gặp nhất là bề mặt ngoài của hạt alginat sẽ lập
tức bị gel hóa. Tiếp theo đó, các cation tạo gel ở bên ngoài của hạt alginat tiếp túc
khuếch tán vào bên trong hạt làm cho các phân tử alginat bên trong tiếp tục gel hóa.
Quá trình này xảy ra trên bề mặt hạt và phát triển vào bên trong. Phương pháp này tạo
gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại không cao [14].

Hình 1.5 Cơ chế tạo gel của alginat theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài
d. Ứng dụng
Alginat là một trong những polymer biển có vai trò bao gồm [3], [10]:
+ Trong y học và dược học:
 Trong Y học alginat được dùng làm chất trị bệnh nhiễm phóng xạ vì
khi người bệnh ăn natri alginat hì nó kết hợp với stronti rồi thải ra
ngoài. Hiệu suất chữa bệnh khá cao.
 Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành
có độ ổn định cao. Được sử dụng trong bào chế vi nang.
 Natri alginat làm tăng hiệu quả chữa bệnh của penicillin vì khi có mặt
natri alginat sẽ làm cho penicillin tồn tại lâu hơn trong máu.
 Trong công nghệ bào chế thuốc natri alginat được sử dụng làm chất ổn
định, nhũ tương hóa hay chất tạo đặc cho dung dịch, làm vỏ bọc thuốc,
làm chất phụ gia chế các loại thức ăn kiêng.

8


 Trong nha khoa dùng acid alginic thay thạch cao để làm khuôn răng, nó
giữ được hình răng chính xác.
+ Trong công nghiệp dược phẩm:
 Alginat làm tá dược rã viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng dược
chất, dùng để đóng nang, bao phim.
 Alginat được dùng để làm trơn, ngăn trào ngược dịch dạ dày và là yếu
tố ổn định nhũ tương, huyền phù. Alginat còn được sử dụng để cố định
tế bào như một gel có nhiều ưu điểm.
+ Trong công nghiệp thực phẩm:
 Natri alginat cũng được dùng trong một số thực phẩm để hạn chế tăng
trọng. Ví dụ: 1 g alginat natri chỉ cung cấp 1,4 Kcal.
 Trong sản xuất kem, acid alginic và muối của nó có thể dùng làm chất

ổn định trong kem ly, làm cho kem mịn có mùi thơm, chịu nóng tốt,
thời gian khuấy trộn lúc sản xuất ngắn.
 Cho vào sữa bò với nồng độ keo natri alginat 0,1% (1,8% sẽ chống
được hiện tượng các chất không hòa tan kết tủa).
 Alginat còn dùng trong sản xuất bơ, bánh kẹo, fomat, nước giải khát
cũng như các mặt hàng đông lạnh.
+ Trong công nghiệp dệt:
 Alginat có độ nhớt cao, tính mao dẫn kém, khi khô trong suốt, bóng và
có tính đàn hồi tốt. Vì thế người ta dùng hồ vải cho sợi bền và chịu
được cọ sát, giảm bớt tỷ lệ sợi đứt và nâng cao hiệu suất dệt.
 Trong công nghiệp in hoa natri alginat là chất tạo cho thuốc nhuộm có
độ dính cao đáng kể, in hoa không nhòe và rõ ràng. Ngoài ra còn dùng
làm vải không thấm nước.
+ Trong công nghiệp giấy:
 Alginat hồ lên giấy làm cho giấy bóng, dai, không gẫy, mức độ khô
nhanh, viết trơn, giấy hồ natri alginat còn làm tăng tính chịu nóng, do
đó còn làm nguyên liệu để chế giấy chống cháy.
 Ngoài ra natri alginat còn làm chất kết dính trong mực in.

9


+ Trong tơ nhân tạo:
 Dung dịch natri alginat nếu phun qua những lỗ nhỏ vào muối kim loại
hóa trị II hay axit thì hình thành sợi tơ.
 Qua nghiên cứu người ta thấy rằng tơ nhân tạo alginat tương đối bền.
+ Trong công nghệ mỹ phẩm:
 Cho alginat vào hỗn hợp nước và mỡ, nó sẽ làm nước và mỡ trộn đều
một cách ổn định. Ví dụ: kem đánh răng gồm glycerin xà phòng, bột
mùi … được trộn thành dạng nhũ tương ổn định.

1.4.2 Chitosan
a. Nguồn gốc
Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng deacetyl
hóa của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của N-acetylglucosamine và dẫn xuất
đường glucose. Chitin là thành phần chính của thành tế bào nấm, xương ngoài động
vật chân đốt như tôm, cua, côn trùng [28].
b. Công thức hóa học

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của chitosan

c. Tính chất của chitosan
Phân tử lượng từ 3.800 đến 2.000.000 dalton, mức độ acetyl hóa từ 40% đến 98%.
Kích thước tiểu phân, phân tử lượng, tỷ trọng, độ nhớt, mức độ acetyl hóa là những
đặc tính quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng làm tá dược trong kỹ thuật bào
chế. Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng nồng độ chitosan, giảm nhiệt độ
và phụ thuộc mức độ deacetyl hóa của chitosan. Nhóm amino của chitosan có pKa xấp
10


xỉ 6.5. Chitosan mang điện tích dương, có tính base yếu, thấm nước, tan trong hầu hết
các dung dịch acid hữu cơ ở pH nhỏ hơn 6.5 như acid formic, acid acetic, acid tartaric
và acid citric, nhưng không tan trong acid sulfuric và acid phosphoric. Các muối
glutamat, clorid của chitosan tan trong nước. Chitosan không tan trong môi trường
kiềm, môi trường trung tính. Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang
chitosan [28].
Chitosan là một polymer tự nhiên có nhiều ưu điểm như không độc, có hiệu quả
trong việc đưa thuốc thấm vào trong niêm mạc sinh học [29]. Chitosan có tác dụng
chống acid và chống ung thư, có thể ngăn ngừa hoặc làm giảm sự kích ứng thuốc trong
dạ dày [31]. Ngoài ra, chitosan là một hydrogel nhạy với pH, ở pH thấp (như pH dạ
dày), nhóm amin bị proton hóa (- NH3+) có thể làm cho các phân tử chitosan gắn chặt

vaog bề mặt niêm mạc dạ dày làm thuốc dễ được hấp thu.
d. Ứng dụng
Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên có vai trò bao gồm [13]:
+Trong y học:
 Chỉ phẫu thuật tự hoại, chito-olygosaccarit; da nhân tạo; kem chống khô
da, kem dưỡng da ngăn chặn tia cực tím phá hoại da.
 Dùng làm thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày – tá tràng. Dùng bào chế
dược phẩm; thuốc giảm béo.
 Từ Chitosan vỏ cua, vỏ tôm có thể sản xuất Glucosamin, một dược chất
quý dùng để giảm các triệu chứng của viêm xương khớp, chống viêm,
giảm nguy cơ ung thư phổi, là chất chống oxy….
+ Trong công nghệ thực phẩm:
 Chất làm trong ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả: trong
sản xuất nước quả, việc làm trong là yêu cầu bắt buộc. Thực tế hiện nay
đang sử dụng các chất làm trong như: genatin, bentonite, kali caseinat,
tannin, polyvinyl pirovinyl. Chitosan là tác nhân tốt loại bỏ đi đục, giúp
điều chỉnh acid trong nước quả. Đối với dịch quả táo, nho, chanh, cam
không cần qua xử lý pectin, sử dụng chitosan để làm trong.
 Sử dụng trong thực phẩm chức năng: chitosan có khả năng làm giảm
hàm lượng cholesterol trong máu. Nếu sử dụng thực phẩm chức năng
11


có bổ sung 4% chitosan thì lượng cholesterol trong máu giảm đi đáng
kể chỉ sau 2 tuần. Ngoài ra chitosan còn xem là chất chống đông tụ
máu. Nguyên nhân việc giảm cholesterol trong huyết và chống đông tụ
máu được biết là không cho tạo các mixen.
 Ứng dụng làm màng bao (bảo quản hoa quả, thực phẩm).
+Trong các công nghiệp khác:
 Làm tăng độ bền của giấy, sử dụng trong sản xuất sơn chống mốc và

chống thấm, dùng làm mực in cao cấp trong công nghệ in, bảo quản
quả, hạt giống mang lại hiệu quả cao.
 Dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng cây trồng cho lúa, cây công
nghiệp, cây ăn quả, cây cảnh… Xử lý nước thải công nghiệp rất hiệu
quả.
1.5 Phƣơng pháp sản xuất ethanol
Như chúng ta đã biết, ethanol đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực như:
Tổng hợp chất hữu cơ, dược phẩm... Đặc biệt là lĩnh vực sản xuất thực phẩm. Trong
sản xuất thực phẩm, ethanol dùng làm nguyên liệu đồ uống có cồn, dung làm dung
môi... Lên men ethanol là một quy trình sản xuất đã có lịch sử lâu đời và phổ biến trên
khắp thế giới. Có nhiều phương pháp lên men và sử dụng nhiều loại VSV khác nhau.
Ứng với mỗi phương pháp, mỗi loại nấm men cho một hiệu suất và giá trị cảm quan
khác nhau. Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về dòng sản phẩm này để có được
sản phẩm ethanol tốt nhất về kinh tế, cảm quan...
Theo nghiên cứu của Phạm Thị Hồng Nga (2007): đã sử dúng nấm men S.cerevisiae
trong quá trình lên men để sản xuất ethanol bằng phương pháp cố định tế bào [11].
Theo nghien cứu của Inloes DS và cộng sự (1983): đã sản xuất ethanol bằng
phương pháp cố định tế bào và dùng nấm men S.cerevisiae [20].
1.6 Một số nghiên cứu về phƣơng pháp cố định tế bào trên thế giới và Việt Nam
Tại Việt Nam: Theo nghiên cứu ―cố định tế bào nấm men ứng dụng trong lên men
cồn rỉ đường‖ [14].
Các điều kiện cố định tế bào nấm men phù hợp cho quá trình lên men cồn từ rỉ
đường bằng phương pháp lên men liên tục đã được khảo sát, bao gồm nồng độ natri
alginat, nồng độ CaCl2 2%, tốc độ dòng chảy tạo hạt, mật độ tế bào trong dung dịch
12


gel. Ngoài ra đã đánh giá được việc tái sử dụng tế bào nấm men cố định trong lên men
cồn trên môi trường rỉ đường qua 4 lần lên men. Kết quả cho thấy điều kiện cố định tế
bào thích hợp là nồng độ chất mang natri alginat 3 %, nồng độ dung dịch tạo gel CaCl2

2%, mật độ giống thích hợp trong dịch chất mang 109 tế bào/ml gel, tốc độ dòng chảy
tạo hạt tế bào cố định cho hệ thống tạo hạt 24 kim (đường kính hạt 0,5 cm) là
200 ml/phút. Ngoài ra kết quả đánh giá lên men cho thấy sau 4 lần lên men thì hạt tế
bào cố định tái sử dụng vẫn có hoạt lực khá tốt, nồng độ cồn tạo ra chỉ giảm nhẹ (từ 11
%v /v xuống 10,5 % v/v) so với lần đầu sử dụng.
Tại nước ngoài: Nhóm tác giả Juliana C Duarte và cộng sự đã đánh giá ảnh hưởng
của hệ gel calci alginat trong cố định tế bào lên men ethanol [21].
Các tế bào S.cerevisiae được cố định trong hệ gel calci alginat và các hạt calci
alginat bao chitosan và nghiên cứu trong quá trình lên men của glucose và sucrose để
sản xuất ethanol. Việc lên men theo lô được tiến hành trong máy lắc quỹ đạo và đánh
giá bằng cách theo dõi nồng độ chất nền và sản phẩm bằng HPLC. Sự cố định của tế
bào trong hạt calci alginat và hạt calci alginat bao chitosan cho phép sử dụng lại hạt
trong tám lần lên men tuần tự 10h mỗi lần.

13


CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị, môi trƣờng sử dụng
2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất
. Chủng VSV: Nấm men Saccharomyces cerevisiae
. Bảng các hóa chất dùng trong nghiên cứu:

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

Acid clorid

Trung Quốc

Cao nấm men

Merck -Đức

Natri alginat

Ấn Độ

KH2PO4

Trung Quốc

Calci clorid

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

Acid acetic băng

Trung Quốc

(NH4)2SO4

Trung Quốc

Chitosan

Đức

Natri clorid

Trung Quốc

KI

Trung Quốc

2.1.2 hiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Cân kỹ thuật

Đức (Satorious)

Nồi hấp tiệt trùng

Nhật (ALP)

Máy khuấy từ

Hàn Quốc (Wisd)

Tủ ấm CO2

Nhật (Sanyo)

Máy lắc ổn nhiệt

Trung Quốc (KWF)

Tủ cấy vô trùng

Nhật (Sanyo)

Máy ly tâm

Đức (Satorious)

Tủ lạnh bảo quản

Hàn Quốc (LG)

Tủ lạnh

Hàn Quốc (LG)

Tủ sấy

Thiết bị đông khô

Đức (Christ Alpha)

Tủ lạnh sâu

Bảng 2.3 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu
14

Hàn Quốc
(Daihan)
Đức (HAIER
DW86W420 )


Bình nón 100, 250, 1000ml

Pipet pasteur

Cốc có mỏ

Pipet chia vạch

Ống đong

Pipet tips (Đầu côn)

Ống ly tâm

Pipet Eppendort

Ống nghiệm có nắp

Đĩa petri đường kính 9 cm

2.1.3 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
 Dung dịch Acid acetic 0.5 %
 Dung dịch Natri clorid 0.9%, pH = 3
 Dung dịch Natri Thiosunfat 0.1N
 Dung dịch Acid Sulfuric 25%
 Dung dịch thuốc thử School A và School B
 Dung dịch Calci Clorid 2%
 Dung dịch NaOH 1N
2.1.4 Môi trường sử dụng
a. Môi trường giữ giống (g/ 100ml)
Bàng 2.4 Hóa chất dùng trong môi trường giữ giống
STT

Tên hóa chất

Hàm lƣợng (g/100ml)

1

Glucose

5.0

2

Cao nấm men

0.5

3

(NH4)2SO4

0.3

4

MgSO4.7H2O

0.1

5

KH2PO4

0.2

6

Nước cất vừa đủ

100

7

pH

6.5-7

8

Thạch

2.0

b. Môi trường nhân giống (g/ 100ml)
15


Bảng 2.5 Hóa chất dùng trong môi trường nhân giống
STT

Tên hóa chất

Hàm lƣợng (g/100ml)

1

Glucose

8

2

Cao nấm men

0.5

3

(NH4)2SO4

0.3

4

MgSO4.7H2O

0.1

5

KH2PO4

0.2

6

Nước cất vừa đủ

100

7

pH

6.5-7

c. Môi trường lên men (g/ 100ml)
Bảng 2.6 Hóa chất dùng trong môi trường lên men
STT

Tên hóa chất

Hàm lƣợng (g/100ml)

1

Glucose

10.0

2

Cao nấm men

0.5

3

(NH4)2SO4

0.3

4

MgSO4.7H2O

0.1

5

KH2PO4

0.2

6

Nước cất vừa đủ

100

7

pH

6.5-7

d. Môi trường giữ hạt cố định tế bào (g/ 100ml)
16


Bảng 2.7 Hóa chất dùng trong môi trường giữ hạt cố định tế bào
STT

Tên hóa chất

Hàm lƣợng (g/ 100ml)

1

Cao nấm men

0.2

2

Nước cất vừa đủ

100

2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men S.cerevisiae cố định trong
hệ gel alginat-chitosan
 Tạo hạt cố định tế bào nấm men trong hệ gel alginat-chitosan.

 Khả năng lên men 24h các tế bào cố định trong hệ gel alginat-chitosan.
 Khảo sát khả năng tiêu thụ đường sau khi lên men 24h các tế bào cố định trong
hệ gel alginat-chitosan: so sánh khả năng tiêu thụ đường của tế bào tự do với tế
bào cố định trong hệ gel alginat và tế bào cố định torng hệ gel algintat-chitosan.
2.2.2 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định trong hệ gel alginat–
chitosan


Khả năng lên men 24h các tế bào cố định trong hệ gel alginat-chitosan sau khi
tái sử dụng.

 Khảo sát khả năng tiêu thụ đường sau khi tái sử dụng các tế bào cố định trong
hệ gel alginat-chitosan: so sánh khả năng tiêu thụ đường của tế bào cố định
trong hệ gel alginat và tế bào cố định torng hệ gel algintat-chitosan sau tái sử
dụng.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm
Chế phẩm, nguyên liệu cần tiệt khuẩn được gói kín trong giấy bạc hoặc cần tiệt
khuẩn được đựng trong bình nón và đậy kín bằng nút bông. chuyển vào nồi hấp, cài
đặt ở chế độ 115oC; 0,6 atm trong 20 phút [1].

17