Phân lập vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ HÒA TAN LÂN
TỪ ĐẤT VÙNG RỄ Ở ĐẤT NÂU ĐỎ
TỈNH BÀ RỊA VŨNG TÀU

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs.Ts. CAO NGỌC ĐIỆP

Cần Thơ, Tháng 07/2012

SINH VIÊN THỰC HIỆN
Nguyễn Thị Cẩm Tú
MSSV:3092522
LỚP:CNSH K35


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(ký tên)

PGs.Ts. CAO NGỌC ĐIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)

Nguyễn Thị Cẩm Tú

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2010
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU....................................................................................3
1.1.

Đặt vấn đề.......................................................................................................3

1.2.

Nội dung nghiên cứu......................................................................................4

1.3.

Mục tiêu đề tài................................................................................................4

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.................................................................4
2.1. Sơ lược về chu trình nitơ, cơ chế cố định đạm và vi khuẩn cố định đạm......5
2.1.1. Sơ lược về chu trình nitơ trong tự nhiên........................................................5
2.1.2. Quá trình cố định đạm...................................................................................6
2.1.3. Vi khuẩn cố định đạm....................................................................................6
2.2. Sơ lược về chu trình lân, quá trình hòa tan lân và vi khuẩn hòa tan lân.....7
2.2.1. Sơ lược về chu trình lân trong tự nhiên.........................................................7
2.2.2. Quá trình hòa tan lân của vi khuẩn................................................................8
2.2.3. Vi khuẩn hòa tan lân....................................................................................10
2.3. Sơ lược về IAA và cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn..................................10
2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong sản xuất nông nghiệp
11
2.4.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trên thế giới......................11
2.4.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong nước.......................12
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................13
3.1.

Thời gian và địa điểm...................................................................................13

3.2.

Phương tiện thí nghiệm................................................................................13

3.2.1.

Vật liệu thí nghiệm..................................................................................13

3.2.2.

Dụng cụ và trang thiết bị..........................................................................13

3.2.3.

Hóa chất...................................................................................................13

3.3.

Phương pháp nghiên cứu.............................................................................15

3.3.1.

Phân lập vi khuẩn.....................................................................................15

3.3.2.

Quan sát hình dạng và khả năng chuyểnđộng của vi khuẩn.....................16

3.3.3.

Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc............................................16

3.3.4. Xác định hàm lượng NH4+ do vi khuẩn tạo ra bằng phương pháp
Indophenol Blue....................................................................................................17
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

3.3.5.

Xác định khả năng hòa tan lân của vi khuẩn............................................18

3.3.6.

Đánh giá khả năng tổng hợp Indole-3-acid acetic của vi khuẩn,..............21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ DỰ KIẾN.....................................................................23
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................24

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1.

Đặt vấn đề
Trong hoạt động sản xuất nông nghiệp phân bón là một trong những vật tư quan

trọng và được sử dụng với một lượng khá lớn hàng năm. Phân bón đã góp phần đáng
kể làm tăng năng suất cây trồng, chất lượng nông sản, đặc biệt là đối với cây lúa ở Việt
Nam.
Thật vậy, năng suất của hầu hết cây trồng gia tăng tuyến tính với lượng phân bón
mà chúng hấp thu. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về lương thực, mức tiêu thụ
của thế giới về các nguyên tố khoáng chính như đạm, lân và kali tăng dần từ 112 triệu
tấn năm 1980 đến 143 triệu tấn 1990 (Lauriente, 1995). Tuy nhiên, cây trồng chỉ sử
dụng dưới mức phân nửa của lượng phân đã bón (Loomis và Conner, 1992). Lượng
khoáng chất còn lại có thể thấm lậu vào nước ngầm, bị cố định trong đất, hoặc góp
phần vào sự ô nhiễm không khí.
Qua những nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phân vi sinh vật để thay thế phân
hóa học là một trong những giải pháp hữu hiệu mà chúng ta có thể áp dụng. Phân vi
sinh là sản phẩm chứa nhiều vi sinh vật có ích, có khả năng cố định đạm hay chuyển
hóa các hợp chất lân khó tan thành dạng cây trồng dễ hấp thu, tham gia trực tiếp hay
gián tiếp vào quá trình dinh dưỡng của cây trồng.
Do được bổ sung vi sinh có ích nên sản phẩm an toàn, lượng nitrat trong sản
phẩm giảm đáng kể, đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả
năng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp và cây
dễ hấp thu dinh dưỡng hơn. Đặc biệt ở các chủng vi sinh vật trong đất có khả năng
tổng hợp nitơ tự do tạo nguồn đạm sinh học, hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây
trồng. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng vì ngoài việc làm giảm chi phí trồng trọt,
góp phần nâng cao lợi nhuận cho nông dân, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường và
xây dựng mô hình phát triển bền vững trong nông nghiệp.
Vì thế, việc nghiên cứu để tìm ra những dòng vi khuẩn vừa có hoạt tính cố định
đạm tốt đồng thời có khả năng hòa tan lân và kali cao để phục vụ cho nhu cầu sản xuất
phân bón vi sinh là rất cần thiết.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

Việc nghiên cứu, phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan
lân nhằm làm giảm lượng phân hóa học sử dụng trong nông nghiệp nhưng vẫn giữ
được năng suất cao, cải thiện độ phì nhiêu của đất và an toàn cho môi trường là rất cần
thiết.
Vì vậy, đề tài “Phân lập vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân từ đất vùng rễ
của cây bắp ở đất nâu đỏ Vũng Tàu” thực hiện nhằm phân lập những dòng vi khuẩn
có khả năng cố định đạm và hòa tan lân.
1.2.

Nội dung nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm, hòa tan lân từ

đất vùng rễ của cây bắp ở đất nâu đỏ Vũng Tàu.
Xác đinh hình thái của các dòng vi khuẩn tuyển chọn.
Xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, khả năng cố định đạm và
hòa tan lân của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn
1.3.

Mục tiêu đề tài
Tuyển chọn những dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân tốt.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về chu trình nitơ, quá trình cố định đạm và vi khuẩn cố định
đạm
2.1.1. Sơ lược về chu trình nitơ trong tự nhiên
Nitơ là một chất cần thiết cho sự sống, là thành phần của protein và acid nucleic
trong các tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật. Khí nitơ chiếm nhiều nhất trong
không khí (79%) và là yếu tố dinh dưỡng giới hạn trong môi trường nước và trong các
loại đất nông nghiệp. Tuy nhiên, hầu hết các sinh vật lại không sử dụng được nếu
chúng không được chuyển thành ammonia.

Hình 1. Chu trình nitơ
(Nguồn: ngày 07/07/2012)

Chu trình nitơ được tóm tắt bao gồm các quá trình cơ bản sau:
Cố định đạm
Đồng hóa đạm

Khoáng hóa đạm
Sự nitrate hóa
Sự khử nitrate

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

2.1.2. Quá trình cố định đạm
Quá trình cố định nitơ xảy ra bởi các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học.
Trong đó người ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm sinh học vì hiệu quả và
tính an toàn của nó đối với môi trường.
Quá trình cố định đạm sinh học là quá trình đồng hóa nitơ của không khí dưới tác
dụng của một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nitrogenase hay nói
cách khác quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N 2 thành NH3 dưới xúc tác
của enzyme nitrogenase khi có mặt ATP, trong đó nitrogenase được cấu tạo bởi hai
phần: Fe-protein có khối lượng khoảng 6,0x104 Dal và Mo-Fe-protein có khối lượng
phân tử khoảng 2,2x105 Dal theo sơ đồ phản ứng sau:
Nitrogenase
+

N2 + 6H + 6e

2NH3

NH3 sẽ kếp hợp với acid hữu cơ tạo thành protein.
NH3 + Acid hữu cơ

Amino acid

Protein

(Lê Văn Nhương et al., 2009)
2.1.3. Vi khuẩn cố định đạm
Trong đất vi khuẩn thường tập trung xung quanh rễ cây. Rễ cây tác động đến sự
phát triển của vi sinh vật và ngược lại thực vật bị tác động bởi hoạt động của vi sinh
vật vùng rễ. Kết quả phân tích cho thấy dịch rễ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi sinh
vật đất, kích thích sự gia tăng của một số vi sinh vật ở vùng rễ và ngăn cản sự sống của
những vi sinh vật khác. Một đặc tính quan trọng là dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, điều này
quyết định đến sự phát triển dồi dào của vi sinh vật cố định đạm ở vùng rễ, mà vi sinh
vật này liên quan đến sự tăng trưởng, ngăn chặn bệnh cây và được xem là vi khuẩn
kích thích tăng trưởng thực vật (plant growth-promoting rhizobacteria-PGPR)
(Kloepper, 1994).
Một số vi sinh vật có khả năng cố định đạm trong đất như:
Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, chuyển động và có dạng hình que ngắn, là vi
khuẩn cố định đạm thúc đẩy sự phát triển, tăng năng suất cây trồng, tổng hợp IAA,
hòa tan lân dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Bilal et al., 1990). Azospirillum

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

hiện diện ở trong rễ, vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây trồng (Glick, 1995). Chúng
cũng được phân lập từ vùng rễ của nhiều loại cỏ, mía đường và ngũ cốc trên thế giới, ở
vùng khí hậu nhiệt đới cũng như ôn đới (Reinhold-Hurek et al., 1986).
Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, dạng hình que ngắn, đường kính khoảng
1m, di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Caballero-Mellado et al., 2004). Đây là vi
khuẩn sống cộng sinh với cây trồng, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong
vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Chen et al., 2006). Chúng
sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí. Tuy nhiên chúng phát
triển tốt trong môi trường ít khí oxy.
Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao ở cực, có khả năng
di chuyển tốt trong nước, không có khả năng tạo bào tử, là vi khuẩn sống tự do (Chan,
1994).
Clostridium là vi khuẩn hình que, sinh bào tử, sống tự do trong đất và nước, có
thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện yếm khí (Lê Văn Nhương et al., 2009).
2.2. Sơ lược về chu trình lân, quá trình hòa tan lân và vi khuẩn hòa tan lân
2.2.1. Sơ lược về chu trình lân trong tự nhiên

Phosphate (Pi) được cây hấp thu từ đất, được động vật sử dụng khi chúng ăn thực
vật và được trả lại đất như một dạng cặn bã hữu cơ, sau đó sẽ được phân rã vào trong
đất. Hầu hết Pi được sử dụng bởi những sinh vật sống và chúng trở thành những liên
kết chặt chẽ trong những liên kết hữu cơ. Khi những vật liệu hữu cơ từ thực vật trả lại
đất thì những Pi hữu cơ này sẽ được phóng thích một cách chậm chạp như là Pi vô cơ
hoặc được liên kết chặt chẽ vào những vật liệu hữu cơ ổn định hơn và trở thành một
thành phần hữu cơ của đất. Sự phóng thích của những Pi vô cơ từ những Pi hữu cơ

được gọi là sự khoáng hóa (mineralization) và được vi sinh vật bẽ gãy những liên kết
hữu cơ. Hoạt động của vi sinh vật có hiệu quả cao là tùy thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm
của đất (Busman et al., 2009).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Nuôi sống
sinh vật dị
dưỡng

Trường ĐHCT

Sự hô hấp tế
bào thải ra
Phoshate (Pi)
Phân bón

Pi được hấp thu
bởi TV. Được
ổn định vào Pi
hữu cơ trong
sinh khối TV

Nông nghiệp

Tảo, TV phù du
Khai thác
mỏ đá Pi
Pi trong đất

Pi dư thừa từ
phân bón

Pi được phân
hủy vào nước

Sự hình thành
trầm tích

Một triệu năm

Hình 2. Chu trình lân trong tự nhiên
(Nguồn: ngày 20/07/2012; (TV) Thực
vật; (Pi) Phosphate)

Vi khuẩn có vai trò trung tâm trong chu trình lân diễn ra trong tự nhiên. Chu trình
oxi hóa và sự làm giảm hợp chất lân xảy ra thông qua sự dịch chuyển electron một
cách liên tục trong quá trình chuyển đổi số oxi hóa từ P(-3) sang P(+5) trong tự nhiên.
Mặc dù vi sinh vật tham gia vào quá trình oxi hóa khử (redox) của lân nhưng những cơ
chế sinh hóa và di truyền học của quá trình biến đổi đó hiện nay chưa được tìm hiểu
một cách rõ ràng (Ohtake et al., 1996).
2.2.2. Quá trình hòa tan lân của vi khuẩn
Một vài loài vi khuẩn có khả năng khoáng hóa và hòa tan lân hữu cơ và vô cơ

tương ứng (Hilda và Fraga, 2000). Cơ chế chủ yếu của sự hòa tan P vô cơ là hoạt động
tổng hợp acid hữu cơ của vi sinh vật và giảm pH đất (Kpomblekou và Tabatabai,
1994). Theo nghiên cứu của Halder et al., (1990) cho thấy những acid hữu cơ phân lập
từ Rhizobium leguminosarum hòa tan một lượng P tương đương với lượng được hòa
tan bởi chính vi khuẩn. Bên cạnh đó, việc xử lý phần nước lọc ra từ Rhizobium với
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

pepsin hoặc loại bỏ protein bởi việc tủa acetone thì không ảnh hưởng đến khả năng
giải phóng P. Tuy nhiên, trung hòa với NaOH sẽ phá hủy hoạt tính hòa tan.
Acid hữu cơ được phân lập từ Rhizobium leguminosarum cũng như Rhizobium
meliloti, Bacillus firmus, và một số loài vi khuẩn khác là acid -ketogluconic. Nhưng
với vi khuẩn Pseudomonas sp, Erwinia herbicola và Burkhoderia cepacia thì acid
gluconic là acid hữu cơ chính được tạo để hòa tan lân. Một số acid khác như acid
glycolic, oxalic, malonic và succinic cũng được nhận diện trong số vi khuẩn hòa tan
lân (Illmer và Shinner, 1992).
Chất chelate và acid vô cơ được xem như cơ chế khác trong việc hòa tan lân.
Tuy nhiên hiệu quả và sự đóng góp của chúng để giải phóng lân ít hơn acid hữu cơ.
Sự phân hủy hợp chất lân hữu cơ phụ thuộc chủ yếu vào tính chất hóa lý và hóa
sinh của những phân tử này, chẳng hạn acid nucleic, phospholipids và đường
phosphate thì dễ dàng bị cắt, nhưng acid phytic, polyphosphate và phosphonate thì
được phân hủy chậm hơn nhiều (Ohtake et al., 1996). Sự khoáng hóa của những hợp

chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là
phosphohydrolase, phosphohydrolase gồm nhóm acid hoặc kiềm.). Những phản ứng
khử phosphoryl này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoester hoặc
phosphoanhydride. Acid phosphohydrolase, không giống phosphatase kiềm, hoạt động
xúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung tính. Hơn thế nữa, chúng còn được phân
nhóm thành acid phosphatase đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, liên quan đến tính đặc
hiệu cơ chất của chúng. Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau bao
gồm 3’- nucleotidase và 5’- nucleotidase, hexose phosphatase và phytase. Một nhóm
đặt hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ
(Ohtake et al., 1996).
Một vài phosphohydrolase được tiết ra bên ngoài màng sinh chất, chúng được
giải phóng dưới dạng hòa tan hoặc được giữ lại như protein liên kết màng. Sự định vị
này cho phép chúng hoạt động như enzyme loại bỏ phosphoester hữu cơ, thành phần
của trọng lượng phân tử lớn (như RNA và DNA) và không thể xuyên qua màng tế bào
chất. vật chất này đầu tiên có thể được chuyển thành thành phần trọng lượng phân tử
thấp, và quá trình này có thể xuất hiện một cách liên tục như là sự biến đổi của RNA
và DNA thành nucleoside monophosphate thông qua Rnase và Dnase, tiếp theo là giải

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

phóng P và sản phẩm hữu cơ thông qua phosphohydrolase, cung cấp cho tế bào những

chất dinh dưỡng cần thiết (Goldstein, 1994).
2.2.3. Vi khuẩn hòa tan lân
Trong đất, vi khuẩn hòa tan lân hiện diện với số lượng khác nhau. Chúng gồm cả
dòng hiếu khí và dòng kị khí, thường thấy dòng hiếu khí nằm trong đất (Sperberg,
1958). Mật độ của vi khuẩn hòa tan lân trong vùng rễ cao hơn so với đất ngoài vùng
rễ (Katzelson et al., 1962), và hiện diện ở vùng đất mát mẻ và ẩm thấp nhiều hơn ở
vùng đất khô hạn. Một số vi khuẩn hòa tan lân được phát hiện như:
Bacillus megaterium là vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả năng hình thành
bào tử, di chuyển dễ dàng, là vi khuẩn yếm khí, và hình thành acid lactic.
Bacillus pumilus là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình que, có khả năng hình
thành bào tử do đó môi trường sống của Bacillus pumilus rất đa dạng. Tuy nhiên, trong
tự nhiên chúng phân bố chủ yếu trong đất và mô thực vật chết (Smibert và Kreig,
1994).
Paenibacillus là vi khuẩn Gram dương, yếm khí, có khả năng hình thành bào tử,
phân phối rộng rãi trong đất, nước, không khí, các vùng rễ cây… (Daane et al., 2002).
Nhiều dòng trong chi Paenibacillus có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự tăng
trưởng của thực vật. Tăng cường sự phát triển của thực vật theo hai cơ chế: cơ chế trực
tiếp bao gồm hòa tan lân, cố định đạm, phân hủy các chất gây ô nhiễm môi trường và
sản xuất các hoormone; cơ chế gián tiếp bao gồm kiểm soát phytopatogens bằng cách
cạnh tranh các nguồn tài nguyên như sắt, axit amin và đường, cũng như sản xuất thuốc
khánh sinh (Bloemberg và Lugtenberg, 2001).
Acinetobacter là vi khuẩn Gram âm, sống hoại sinh, không sản xuất sắc tố, được
tìm thấy nhiều nơi trong đất, nước, sinh vật ngay cả trên da người (Barbe et al., 2004).
Brevibacillus gồm cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, hiếu khí, chuyển động
chậm, bào tử hình elip. Brevibacillus có khả năng sản xuất acid từ glycerol, LArabinose, rhammose, ribose, và D-Fructose, chủ yếu là các acid béo (Keiichi Goto et
al., 2004).
2.3. Sơ lược về IAA và cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn
Indole-3- acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, chất điều hòa chủ yếu của sự
sinh trưởng thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa
sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng (Cao

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

Ngọc Điệp, 2011). Trong tự nhiên IAA có hai dạng: IAA liên kết (CH 2COO-R) và IAA
tự do (R-CH2COOH). Chỉ có IAA tự do điều khiển hoạt động sinh lý của thực vật, mà
đặc trưng về sự sinh trưởng của cây qua sự tăng trưởng của tế bào.
Xem xét cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn Pseudomonas cho thấy L-Tryptophan
đóng vai trò quan trọng, nó được xem như tiền chất trong lộ trình tổng hợp IAA của cả
thực vật lẫn vi sinh vật. Suzuki et al., (2003) khảo sát khả năng tổng hợp IAA của
chủng Pseudomonas fluorescens HP72 bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy
nhiều tiền chất khác nhau và đưa ra 3 lộ trình tổng hợp IAA của vi sinh vật như sau:
Lộ trình Indole-3-acetamide (A-B) với sự tham gia của enzyme Tryptophan
monooxygenase và enzyme Indole acetamide hydrolase.
Lộ trình Indole 3-pyruvid acid (E-F-D) với sự tham gia của enzyme Tryptophan
transferase, enzyme 3 pyruvate decacboxylase và Indole 3 acetaldehyde oxydase.
Lộ trình Trytophan side chain oxydase ( C-D) với sự tham gia của enzyme side
chain oxydase và enzyme Indole 3-acetaldehyde oxydase.
2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong sản xuất nông nghiệp
2.4.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trên thế giới
Thế giới đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật cố định đạm, hòa tan lân
trên cây trồng. Trong đó nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phân sinh học có
chủng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân có thể thay thế một lượng phân hóa học

đáng kể.
Sản phẩm phân bón vi sinh cố định nitrogen tự do từ vi khuẩn Azotobacter và
Clostridium đã được sản xuất tại Mỹ, Autralia và sử dụng nhiều nơi trên thế giới với
tên gọi E.2001. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm E.2001 có tác dụng tốt
trong việc nâng cao năng suất rau, trong đó mức độ tăng có thể từ 33,33% đến 56%
tùy từng loại rau. E.2001 có tác dụng làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh do nấm và vi khuẩn
gây nên như bệnh héo xanh, thối đen rễ, lở cổ rễ (Lê Văn Nhương et al., 2009).
Theo Gaur (1992) nhiều kết quả nghiên cứu khoa học đã chứng minh ở Liên Xô,
năng suất cây trồng tăng 5-10% và có trường hợp tăng 30% khi sử dụng vi sinh vật
hòa tan lân; hiệu quả này ở Ấn Độ tương ứng là 10-20% tương đương với bón P 2O5
một lượng 50 kg/ha. Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada và Ấn Độ cho thấy: vi
sinh vật phân giải lân có thể thay thế 50-75% lượng lân cần bón bằng quặng phosphate

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

có hàm lượng P2O5 tổng số tương đương mà năng suất và chất lượng nông sản không
thay đổi. Ngoài tác dụng phân giải phosphate khó tan, vi sinh vật phân giải lân còn có
khả năng sản sinh các chất kích thích sinh trưởng thực vật giúp cây trồng phát triển và
chống chịu tốt hơn đối với các điều kiện bất lợi ngoại cảnh hoặc sinh tổng hợp chất
kháng sinh góp phần kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây bệnh
vùng rễ cây trồng.

2.4.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong nước
Sản phẩm Dasvila của công ty Dasco chứa hai chủng vi khuấn Azospillium sp,
Pseudomonas sp có tác dụng cố định đạm và hòa tan lân khó tiêu cung cấp cho cây
lúa. Vi khuẩn cộng sinh với cây lúa tạo ra kích thích tố tăng trưởng IAA (Indol-3acetic acid), Cytokinins, Auxin, Gibberelin.
Theo nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp (2011), ứng dụng vi khuẩn
Gluconacetobacter diazotrophicus và Pseudomonas stutzeri với công thức bón 500kg
phân sinh học/ha – 103,5 N – 80 P2O5 kg/ha cho năng suất mía cây tương đương với
mía bón 207 N - 160 P2O5 kg/ha nhưng chữ lượng đường và tổng lượng đường/ha cao
hơn cây mía chỉ bón phân hóa học (207 N - 160 P 2O5 kg/ha) một cách rất có ý nghĩa.
Như vậy việc bón 500 kg/ha phân sinh học cho cây mía không những tiết kiệm được
103,5 N - 80 P2O5 kg/ha mà còn thu lợi cao nhất trong canh tác mía đường.

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

3.1.

Trường ĐHCT

Thời gian và địa điểm
- Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật môi trường và

phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật đất thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ
Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
- Thời gian thực hiện từ tháng 8/2012 đến tháng 11/2012.
3.2.

Phương tiện thí nghiệm

3.2.1. Vật liệu thí nghiệm
Mẫu đất vùng rễ của cây bắp ở đất nâu đỏ tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu.
3.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị
- Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, lam,
lamen…
-

Máy chụp hình, kính hiển vi.

-

Cân điện tử Sartorius (Đức).

-

pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ).

-

Tủ cấy vi sinh vật (Pháp).

-

Tủ ủ vi sinh vật (Đức).

-

Tủ lạnh giữ mẫu.

-

Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)

-

Bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức).

-

Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức).

-

Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan).

3.2.3. Hóa chất

Bảng 1: Thành phần môi trường Burk’s không đạm dùng để phân lập vi
khuẩn cố định đạm.
Hóa chất

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Khối lượng (g/l)

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

Sucrose

10

KH2PO4

0,41

K2HPO4

0,52

NaCl

0,05

CaCl2

0,2

MgSO4.7H2O

0,1

FeSO4.7 H2O

0.005

NaMoO4.2 H2O

0.0025

Agar

20

Sau đó chỉnh pH môi trường về 7,0.
Bảng 2: Thành phần môi trường NBRIP dùng để phân lập vi khuẩn hòa
tan lân
Hóa chất

Khối lượng (g/l)

D-Glucose

10

(NH4)2SO4

0,1

MgSO4.7H2O

0,25

MgCl2.6H2O

5

KCl

0,2

Ca3(PO4)2 (hoặc apatide)

5

Bromothymol blue

0,5% (w/v)

Sau đó chỉnh pH môi trường về 7,2.
Các hóa chất sử dụng để xác định hàm lượng đạm
Dung dịch Phenol (C5H5OH) – Sodium nitroprusside (Na2(Fe(CN)5NO(.2H2O)):
hòa tan 5g phenol và 0,025g sodium nitroprusside thêm nước đủ 500ml.
Dung dịch Sodium hypochloride: hòa tan 4,98g Na 2HPO4, 1,48g NaOH và
10ml NaOCl thêm nước đủ 100ml.
Dung dịch đạm chuẩn N-NH4 1 mg/l.
Các hóa chất dùng để xác định hàm lượng lân hòa tan

Dung dịch A:
+ 140 ml acid sunfuric (H2SO4) đậm đặc vào 1 lít nước cất đê nguội (1).
+ 12 g amonium molypdate (NH4)6Mo2O24.4H2O vào 250 nước cất đun nóng cho tan
(2).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

+ 0,2908 g Potasssium antymonyl tartrate (KSbC4H2O6) vào 100 ml nước cất (3).
+ Trộn (1), (2) và (3) và thêm nước cất cho đủ 2 l.
Dung dịch B: 1,05 g acid ascorbic + 200 ml dung dịch A.
Dung dịch lân chuẩn: P2O5: 10ppm (10 mg/l).
Hóa chất dùng để xác định hàm lượng IAA
Chuẩn bị thuốc thử Salkowski:
Đong 553 ml H2SO4 vào bình định chuẩn, thêm nước cất vào cho đủ 1 lít, để
nguội được dung dịch để nguội được dung dịch H 2SO4 đậm đặc 10,8 M. Lấy cốc có
dung tích 1,5 lít cho vào 4,5 gram FeCl 3, rồi từ từ cho vào hết 1 lít H 2SO4 đặc, khuấy
cho FeCl3 tan hết, để nguội, bảo quản trong chai có màu sậm và đặt trong tối.
3.3.

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phân lập vi khuẩn

Bước 1: Phân lập vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân.
-

Cân 5g mẫu đất vùng rễ cho vào bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml

nước cất vô trùng, đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu. đem các bình tam giác lên máy
lắc khoảng 2 giờ.
-

Sau khi lắc, tiến hành pha loãng mẫu 10, 100, 1000 lần, rồi nhỏ mỗi nồng

độ pha loãng lên đĩa petri có chứa môi trường phân lập.
-

Dùng que gạt phân phối dịch mẫu trãi đều khắp dịch mặt thạch.

-

Đĩa môi trường đã trải mẫu được ủ ở 30 oC trong tủ ủ vi sinh 2-3 ngày để

vi khuẩn phát triển.
Bước 2: Làm thuần
-

Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường đĩa nuôi cấy, cấy chuyển

nhiều lần sang môi trường như trên đến khi các khuẩn lạc rời và đều so với các khuẩn
lạc khác trên môi trường.
-

Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn phân lập bằng phương

pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cách chuẩn bị mẫu
vi khuẩn:
+ Từ một khuẩn lạc rời cấy vào một ống nghiệm chứa môi trương phân lập rồi
ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh cho đến khi phát triển tốt.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

+ Khử trùng lam kính và lamen bằng cồn, để khô cồn.
+ Nhỏ 30 l nước cất vô trùng lên lam kính.
+ Khủ trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
+ Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn trong ống nghiệm trải đều lên giọt nước
trên lam kính.
+ Lấy lamen đậy lên giọt nước bằng cách để lamen tiếp xúc với lam kính và
giọt nước ép một góc 45o, hạ lamen xuống nhẹ nhàng để tránh bị bọt khí.
+ Quan sát kiểm tra độ ròng của mẫu.
-

Nếu mẫu ròng thì cấy vào ống nghiệm chứa môi trường phân lập đễ trữ

mẫu ròng

3.3.2. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Hình dạng và chuyển động của vi khuẩn cũng được quan sát bằng phương
pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần
3.3.3. Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường phân lập ta đồng thời tiến hành
đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc,
hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường.
-

Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng thước centimet (cm). Tuy nhiên,

đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
3.3.4. Xác định hàm lượng NH4+ do vi khuẩn tạo ra bằng phương pháp
Indophenol Blue
Đây là phương pháp xác định hàm lượng NH 4+ bằng phương pháp so màu trên
quang phổ kế (Spectrophotometer) tại bước sóng 636 nm (phương pháp so màu
Indophenol Blue) theo nguyên tắc:
NH4+ + Phenol

Ion hypochloride

Indophenol (màu xanh lá cây)

NaOH

Chuẩn bị:
Nuôi vi khuẩn trong môi trường Burk lỏng không đạm: môi trường Burk sau khi
pha sẽ chuẩn pH = 7 bằng dung dịch NaOH chuẩn và cho vào từng ống bình tam giác

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

100 ml (khoảng 50 ml/bình) rồi đem khử trùng nhiệt ướt (121 oC, 20 phút). Các dòng vi
khuẩn được chuyển vào các bình chứa môi trường Burk bằng que cấy, ủ ở nhiệt độ
30oC và tiến hành đo khả năng cố định đạm từng dòng vi khuẩn sau 2,4,6 và 8 ngày
nuôi trên máy lắc 120 vòng/phút.
Các bước tiến hành định lượng đạm tổng hợp:
Bước 1: Xây dựng đường chuẩn NH4+
Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 0 đến 5, lần lượt thêm vào mỗi ống các
thành phần như bảng sau:
Bảng 3: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+
Ống nghiệm

0

1

2

3

4

5

2,5

2

1,5

1

0,5

0

NH4+ chuẩn (ml)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Nitroprusside (ml)

1

1

1

1

1

1

Sodium Hypochloride (ml)

2

2

2

2

2

2

Thành phần
H2o (ml)

Tiến hành vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng khoảng 15-30 phút để
phản ứng tạo màu xảy ra theo nguyên tắc nồng độ NH 4+ càng cao thì màu xanh càng
đậm dần.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu đo: H2O (2 ml) + mẫu (0,5 ml) + Nitroprusside (1 ml) +
Sodium Hypochloride (2 ml). Mỗi mẫu lặp lại 3 lần. Tiến hành vortex các ống nghiệm
và để ở nhiệt độ phòng khoảng 15-30 phút cho phản ứng màu tạo ra theo nguyên tắc
nồng độ NH4+ càng cao thì màu xanh càng đậm dần.
Chú ý:
o Để đo hàm lượng ammonium trong mẫu phải loại bỏ các tạp chất bằng
cách ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút.
o Nếu hàm lượng ammonium trong mẫu sau khi ly tâm cao hơn so với
đường đạm chuẩn sẽ tiến hành pha loãng mẫu (5, 10, 50 lần) để hàm
lượng ammonium đo được có giá trị chính xác.
Bước 3:
Bật máy quang phổ khoảng 30 phút trước khi đo, hàm lượng NH 4+ được xác định
bằng cách đo cường độ hấp thu màu (OD) ở bước sóng 636 nm.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm đã biết hàm lượng NH4+ trước, sau đó tiến hành
đo OD các mẫu chuẩn bị.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có NH 4+ , không có màu xanh) làm mẫu

blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại. Năm ống nghiệm
1, 2, 3, 4, 5 có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần.
Từ giá trị OD tương ứng với hàm lượng đạm đã biết, dùng chương trình vẽ đồ thị
trong phần mềm Excel xác định phương trình đường chuẩn NH4+ .
Bảng 4: Giá trị đường chuẩn NH4+
Hàm lượng NH4+ (x mg.l) 1

2

3

4

5

OD (y)

y2

y3

y4

y5

y1

Phương trình đường chuẩn NH4+: y = a*x + b
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD của mẫu tính hàm lượng NH 4+
các mẫu còn lại: x = (y-b)/a.

Từ kết quả trên sẽ đánh giá sơ bộ về khả năng cố định đạm của các dòng vi
khuẩn phân lập được và trên cơ sở đó chọn những dòng tạo hàm lượng NH 4+ cao.
3.3.5. Xác định khả năng hòa tan lân của vi khuẩn

Đánh giá khả năng hòa tan lân
Sau khi xác định dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân, dùng thuốc thử Acid
Ascorbic – Ammoniummolypdate – Potassium antinomol tartrate để đánh giá lượng
lân được vi khuẩn hòa tan trong dung dịch theo nguyên lý:
- Lân sau khi được hòa tan trong môi trường tác dụng với ammoniummolypdate
trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolydate màu vàng.
H2PO4- + NH4+ + MoO42+ + 2H+

(NH4)3[P(MoO10)4]

- Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo6+ bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm cho
dung dịch có màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong
dịch huyền phù vi khuẩn, pH và điều kiện khử của môi trường. Đo mẫu trên máy so
màu ở bước sóng 880nm.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

16

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

- Trong môi trường acid vừa phải, nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố
định, nồng độ P nhỏ ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỉ lệ
thuận với hàm lượng P theo đúng đinh luật Bir Lambeg.
Để đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn, tiến hành thí
nghiệm sau:
- Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa môi trường NBRIP lỏng thu sinh khối:
cấy vi khuẩn vào các bình tam giác có chứa 50 ml môi trường NBRIP lỏng, đặt lên
máy lắc với tốc độ 110 vòng /phút.
- Lấy mẫu vào thời điểm 2,4,6 và 8 ngày nuôi. Lọc lấy 2 ml phần dịch trong để
xác định hàm lượng lân hòa tan theo phương pháp Blue – molypden.
Các bước tiến hành xác định lượng lân hòa tan
Bước 1: Dựng đường chuẩn P2O5: gồm 6 ống nghiệm (loại 20 ml), đánh số thứ tự
từ 0 đến 5 tương ứng với hàm lượng P 2O5 trong ống, lần lượt thêm vào mỗi ống
nghiệm các thành phần như sau:

Bảng 5: Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5.
Ống nghiệm

0

1

2

3

4

5

Nước khử khoáng (ml)

5

5

5

5

5

5

Dung dịch lân chuẩn (ml)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Dung dịch B (ml)

4

4

4

4

4

4

3,5

3

2,5

2

1,5

1

Thành phần

Nước khử khoáng (ml)

Tiến hành trộn mẫu trên máy vortex các ống nghiệm và để ở nhiệt độ phòng
khoảng 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra theo nguyên tắc hàm lượng P 2O5 càng cao

thì màu xanh càng đậm dần.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

17

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

Bước 2: chuẩn bị mẫu: mẫu được lọc qua giấy lọc trước khi đo lân, chuẩn bị 3
ống nghiệm (loại 20 ml) cho mỗi mẫu, cho vào mỗi ống nghiệm các thành phần sau:
+ 5 ml nước khử khoáng.
+ 0,5 ml dung dịch mẫu.
+ Thêm 4 ml dung dịch B.
+ 3 ml nước khử khoáng.
Trộn đều dung dịch trong máy vortex, để ổn định 20 phút tại nhiệt độ phòng.
Bước 3:Tiến hành đo hàm lượng lân hòa tan có trong mẫu dựa trên phương pháp
so màu Oniani ở bước sóng 880 nm (OD880nm).
Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm đường chuẩn, sau đó mới tiến hành đo OD của các
mẫu thí nghiệm.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 ( không có P 2O5, không có màu xanh) làm mẫu
blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại.
Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn của P 2O5.
Phương trình đường chuẩn có dạng: y = a*x + b.
Trong đó:

x là nồng độ của mẫu (mg/l)
y là độ hấp thu quang (OD880nm).

Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng
P2o5, sau đó tính hàm lượng PO43- dựa theo công thức:
3

Hàm lượng PO4 
Trong đó:

C * M PO4
M P2O5

C là hàm lượng lân có trong mẫu tương ứng với hàm lượng P2O5
M P2O5 = 142
M PO4 = 95

3.3.6. Đánh giá khả năng tổng hợp Indole-3-acid acetic của vi khuẩn,
Các bước định lượng IAA
Bước 1:Xây dựng đường chuẩn IAA:
Bảng 6: Thành phần của dãy đường chuẩn IAA

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

18

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Thuốc thử Salkowski (ml)

1

1

1

1

1

1

Dung dịch IAA chuẩn có nồng độ 1g/ml (l)

0

1

2

3

4

5

Thành phần
Nước khử khoáng (ml)

Bước 2: Chuẩn bị mẫu:
Lấy mẫu vi khuẩn đã được nuôi trên môi trường phân lập dạng lỏng có bổ sung
100 mg/l L- Tryptophan (đối với môi trường NBRIP không cho Bromothylmol Blue) ở
các thời điểm 2,4,6 và 8 ngày, đem ly tâm 1200 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 0,5 ml
dịch cho vào ống nghiệm chứa 1 ml thuốc thử Salkowski. Lắc nhẹ khuấy đều bằng
máy vortex trong vài giây, để yên trong 15-20 phút để cho phản ứng xảy ra hoàn toàn.
IAA được tạo trong dung dịch mẫu sẽ phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch có
màu hồng nhạt hay đậm tùy vào lượng IAA do vi khuẩn tạo ra nhiều hay ít. Sau đó đo
lượng IAA tổng hợp được bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm
(OD530nm).
Bước 3: Các số liệu đo OD được xử lý bằng chương trình excel 2003 dựa vào
phương trình Y = aX + b. Trong đó, X là nồng độ của mẫu, Y là độ hấp thụ quang
(OD). Đo độ hấp thụ quang của mẫu cần phân tích để tính hàm lượng IAA có trong
mẫu theo công thức X = (Y-b)/a.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

19

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ DỰ KIẾN
-Phân lập được dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân.
-Khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

20

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35 – 2012

Trường ĐHCT

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Cao Ngọc Điệp. 2011. Sách chuyên khảo vi khuẩn nội sinh thực vật. Nxb Đại học Cần
Thơ, trang 27.
Lê Văn Nhương, Nguyễn Văn Cách, Quản Lê Hà, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng,
Hoàng Đình Hòa, Nguyễn Lan Hương, Ngô Trang Nhung, Khuất Hữu Thanh,
Nguyễn Quang Thảo, Phạm Thị Thùy, Phạm Văn Toản. 2009. Cơ sở công nghệ
sinh học - Tập 4 – Công nghệ vi sinh. Nxb Giáo dục Việt Nam, trang 411-418.
Tiếng Anh
Baker, W. W., Welch S.A., Chu S. and J.F. Banfield. 1998. Experimental obvervation
of the effects of bacteria. Mikrobiolohichnyi Zhurnal (Kiev) 29, pp.111-114.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

21

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học