XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN BƯỞI (Citrus grandis L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN BƯỞI
(Citrus grandis L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 - 2008
Sinh viên thực hiện: ĐIỀN NGỌC PHA

Tháng 10/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN BƯỞI
(Citrus grandis L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. HOÀNG XUÂN QUANG

ĐIỀN NGỌC PHA

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

Tháng 10/2008


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khoá luận này, ngoài sự nổ lực của bản thân còn có sự chỉ bảo
tận tình của thầy cô cũng như sự giúp đỡ, động viên rất nhiều từ gia đình và bạn bè;
bằng tất cả lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến
 Ba mẹ, những người đã luôn chăm sóc, dạy dỗ và là nguồn động viên, an ủi lớn
nhất cho tôi trong học tập và trong cuộc sống.
 Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm bộ
môn Công nghệ Sinh học, Ban giám đốc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi
trường cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm theo
học tại trường.
 Tiến sĩ Lê Đình Đôn, Thạc sĩ Hoàng Xuân Quang, Thạc sĩ Nguyễn Vũ Phong
đã hết lòng chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
 Ban giám đốc cùng các anh, chị tại phòng Bảo Vệ Thực Vật, phòng Công nghệ
Sinh học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài tại đây.
 Kỹ sư Nguyễn Văn Lẫm, kỹ sư Trần Văn Kỳ đã truyền đạt cho tôi nhiều kỹ
năng và kinh nghiệm quý báu. Cũng xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học K30
đã luôn bên cạnh, chia sẻ cùng tôi những vui buồn và khó khăn trong suốt 4 năm học
vừa qua.

Sinh viên thực hiện
ĐIỀN NGỌC PHA

iii


TÓM TẮT
Đề tài “XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN BƯỞI (Citrus
grandis L.) BẰNG KỸ THUẬT PCR” được tiến hành tại phòng Bảo vệ Thực vật,
phòng Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam; và
Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi Trường thuộc trường ĐH Nông Lâm
Tp. HCM trong thời gian từ tháng 03/2008 đến tháng 09/2008.
Đề tài do sinh viên Điền Ngọc Pha thực hiện dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Lê
Đình Đôn và Thạc sĩ Hoàng Xuân Quang.
Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri gây bệnh
loét trên cây có múi. Cây nhiễm bệnh xuất hiện những vết thương hoại tử, hình tròn,
nhô cao trên mặt lá, thân và quả. Bề mặt biểu bì lá đứt gãy do sự tăng sinh quá mức
của mô. Ở những cây bệnh nặng, lá và quả rụng sớm. Bệnh không ảnh hưởng nhiều
đến chất lượng thịt quả bên trong nhưng làm cho quả trở nên xấu xí. Cây yếu dần và
giống thoái hoá theo thời gian trồng. Vào mùa mưa, khí hậu thuận lợi cho vi khuẩn
phát triển và lây lan nhanh nên bệnh dễ bùng phát thành dịch và gây thiệt hại lớn.
Mục đích đề tài là xác định tác nhân gây bệnh loét trên cây bưởi bằng kỹ thuật
PCR. Thí nghiệm sử dụng cặp primer J-RXg và J-RXc2 trên cơ sở trình tự vùng ITS
rDNA được thiết kế bởi Cubero và Graham (2002) phát hiện vi khuẩn gây bệnh. Kết
quả phân lập được 18 mẫu vi khuẩn gây bệnh trên bưởi trồng ở tỉnh Đồng Nai, tất cả
đều cho phản ứng Gram âm. Thực hiện phản ứng PCR trên 8 mẫu vi khuẩn đại diện
cho 4 giống bưởi thu được sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 179 bp, kết quả
này phù hợp với nghiên cứu của Cubero và Graham (2002).
Từ những kết quả thu được, chúng tôi đề nghị hoàn thành đề tài ở mức giải
trình tự vùng 16S – 23S rDNA của vi khuẩn, đối chiếu với dữ liệu ngân hàng gen để

giúp quy trình định danh này có cơ sở. Đồng thời, tiến hành nghiên cứu vi khuẩn gây
bệnh loét trên những loại cây có múi khác và ở các vùng sinh thái khác nhau; từ đó
đánh giá tính đa dạng di truyền của quần thể vi khuẩn X. axonopodis pv. citri.

iv


SUMMARY
Title: IDENTIFICATION OF BACTERIA CAUSING CITRUS CANKER
ON PUMELO (Citrus grandis L.) BY PCR TECHNIQUE.
This study was carried out at Plant Protection Research Department,
Biotechnology Department belong to Institute Of Agricultural Science for Southern
Vietnam; and, Research Institute for Biotechnology and Environment of Nong Lam
University, Ho Chi Minh city, from March to September, 2008. The identification of
citrus canker agent including experiments of Gram stain and amplification of a DNA
fragment of 179 bp using specific primers of J-RXg and J-RXc2 based on a variable
sequence in the ITS rDNA operon (Cubero and Graham, 2002). Citrus canker
symptoms are necrosis circular lesion raised and corky. On PDA medium, bacterial
colony characteristics were convex circular yellow colonies. PCR products were
approximately 179 bp for eighteen of bacteria strains with pairs of primers of J-RXg
and J-RXc2. The citrus canker disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................iii
TÓM TẮT.......................................................................................................................iv
SUMMARY..................................................................................................................... v
MỤC LỤC ......................................................................................................................vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG ................................................................................ x
Chương 1. MỞ ĐẦU...................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục đích, yêu cầu.....................................................................................................2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu ..................................................................................................................2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về cây bưởi ..............................................................................................3
2.1.1. Tình hình trồng cây có múi ở Việt Nam và trên thế giới ......................................3
2.1.2. Nguồn gốc, phân loại cây bưởi..............................................................................4
2.1.3. Đặc điểm hình thái.................................................................................................5
2.1.4. Giá trị dinh dưỡng của bưởi ..................................................................................5
2.2. Sơ lược về bệnh lóet trên cây có múi .......................................................................5
2.2.1. Lịch sử xuất hiện và lan truyền bệnh.....................................................................5
2.2.2. Triệu chứng bệnh...................................................................................................6
2.2.3. Các biện pháp phòng trừ bệnh...............................................................................8
2.3. Giới thiệu vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri...........................................9
2.3.1. Phân lọai học vi khuẩn ..........................................................................................9
2.3.2. Phổ ký chủ .............................................................................................................9
2.3.3. Đặc điểm sinh học ...............................................................................................10
2.3.4. Tương tác giữa Xac và ký chủ.............................................................................11
2.3.5. Giới thiệu các gen gây bệnh của vi khuẩn...........................................................11
2.3.5.1. Gen pthA ........................................................................................................... 11
2.3.5.2. Các gen hrp....................................................................................................... 12
2.3.5.3. Đặc điểm xâm nhiễm và lan truyền của vi khuẩn ............................................ 13
2.4. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh thực vật ......................................14
vi

2.4.1. Phương pháp dùng cây chỉ thị .............................................................................14
2.4.2. Phương pháp huyết thanh học .............................................................................14
2.4.3. Phương pháp in dấu Phage (phage - typing) .......................................................15
2.4.4. Kỹ thuật PCR.......................................................................................................15
2.4.4.1. Nguyên tắc........................................................................................................ 15
2.4.4.2. Quy trình thực hiện........................................................................................... 16
2.4.4.3. Thành phần, vai trò các chất tham gia phản ứng PCR ..................................... 17
2.4.4.4. Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR.................................................................... 19
2.4.4.5. Ứng dụng kỹ thuật PCR ................................................................................... 19
2.4.4.6. Một số vấn đề thường gặp khi thực hiện phản ứng PCR ................................. 20
2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn gây bệnh loét cây có múi.........20
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 22
3.1. Thời gian và địa điểm.............................................................................................22
3.2. Nội dung thực hiện .................................................................................................22
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................22
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị ..................................................................................................22
3.3.2. Hóa chất thí nghiệm.............................................................................................22
3.3.3. Phương pháp tiến hành ........................................................................................23
3.3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu bệnh ...................................................................... 23
3.3.3.2. Phân lập và nuôi cấy đơn dòng vi khuẩn.......................................................... 23
3.3.3.3. Nhuộm Gram .................................................................................................... 24
3.3.3.4. Ly trích DNA vi khuẩn..................................................................................... 24
3.3.3.5. Thực hiện PCR với cặp primer J-RXc2 và J-RXg ............................................ 25
3.3.3.6. Điện di kiểm tra sản phẩm DNA ...................................................................... 27
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 28
4.1. Kết quả phân lập và nhuộm Gram vi khuẩn...........................................................28
4.2. Kết quả ly trích DNA .............................................................................................29
4.3. Kết quả PCR ...........................................................................................................31
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 34
5.1. Kết luận...................................................................................................................34

5.2. Đề nghị ...................................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 35
vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Thuật ngữ
ACIAR

:

Australian Centre for International Agricultural Research

Bộ NN và PTNT

:

Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn

DNA

:

Deoxyribonucleic acid

FAO

:

Food and Agriculture Organization

FFTC

:

Food and Fertilizer Technology Center for the Asian and
Pacific Region

G-

:

Gram âm

IAS

:

Institute Of Agricultural Science For Southern Vietnam

ICARD

:

Information Center on Agriculture and Rural Development

ITS

:

Internal transcribed spacer

NXB

:

Nhà xuất bản

pv.

:

Pathovar

PCR

:

Polymerase Chain Reaction

rDNA

:

Ribosomal DNA

STT

:

Số thứ tự

SOFRI

:

Southern Fruit Research Institute

Taq

:

Thermus aquaticus

Tp.

:

Thành phố

Xac

:

Xanthomonas axonopodis pv. citri

USDA

:

United States Department of Agriculture

UV

:

Ultra violet

CTAB

:

Cetyl Trimethylammonium Bromide

dNTPs

:

Deoxynucleotide Triphosphate

EtBr

:

Ethidium Bromide

EDTA

:

Ethylene Diamine Tetraacetate

EPS

:

Extracellular Polysaccharide

SDS

:

Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

:

Tris Acetate/ EDTA

Hoá chất

viii


TE

:

Tris - EDTA

bp

:

base pair

ha

:

hecta

kb

:

kilobase

mM

:

milimol

µl

:

microlit

µM

:

micromol

ng

:

nanogram

Đơn vị

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG
HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Quả bưởi ......................................................................................................... 4
Hình 2.2. Biểu hiện bệnh loét ở mặt trên và mặt dưới lá cây bưởi. ................................ 7
Hình 2.3. Biểu hiện bệnh loét trên thân, cành và vỏ quả bưởi. ....................................... 7
Hình 2.4. Biểu hiện bệnh loét trên những vết thương do sâu vẽ bùa .............................. 8
Hình 2.5. Tổ chức cụm gen hrp của X. axonopodis pv. citri 306 ................................. 12
Hình 2.6. Vi khuẩn xâm nhập vào lỗ khí khổng của lá bưới......................................... 13
Hình 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng PCR. ..................................................................... 16

Hình 2.8. Số lượng sản phẩm PCR tạo thành sau 35 chu kỳ......................................... 17
Hình 2.9. Trình tự vùng ITS được dùng thiết kế primer J-RXc2. ................................. 21
Hình 4.1. Màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trường PDA. ............... 29
Hình 4.2. Kết quả nhuộm Gram. ................................................................................... 29
Hình 4.3. Kết quả ly trích DNA tổng số 18 mẫu vi khuẩn............................................ 30
Hình 4.4. Kết quả ly trích 6 mẫu DNA lần 2................................................................. 30
Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trong 4 thí nghiệm PCR. ................... 31
Hình 4.6. Kết quả PCR 8 mẫu vi khuẩn đại diện. ......................................................... 33

BẢNG

TRANG

Bảng 3.1. Quy ước đặt tên mẫu vi khuẩn phân lập. ...................................................... 24
Bảng 3.2. Thành phần hoá chất và quy trình nhiệt thực hiện PCR ở thí nghiệm 1....... 25
Bảng 3.3. Thành phần hoá chất và quy trình nhiệt thực hiện PCR ở thí nghiệm 2....... 25
Bảng 3.4. Thành phần và quy trình nhiệt thực hiện PCR ở thí nghiệm 3. .................... 26
Bảng 3.5. Thành phần và quy trình nhiệt thực hiện PCR ở thí nghiệm 4. .................... 26
Bảng 4.1. Đặc điểm khuẩn lạc phân lập được trên môi trường PDA............................ 28
Bảng 4.2. Sự thay đổi các yếu tố trong quá trình thực hiện 4 thí nghiệm PCR. ........... 31

x


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây có múi bao gồm các loại như cam, chanh, quýt, bưởi… là loại cây ăn quả
cao cấp được nhiều người và nhiều nước trên thế giới ưa chuộng. Nó giữ một vị trí

quan trọng trong số các loại cây ăn quả vì có giá trị dinh dưỡng cao và hương vị thơm
ngon. Trong số các loại cây có múi, bưởi là loại mang đến nhiều lợi ích cho con người.
Tất cả các phần của quả bưởi đều có thể sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như
ăn tươi, vắt lấy nước uống, chế biến làm thức ăn hay lấy mùi vị làm hương liệu.
Cây bưởi hiện trồng ở nước ta nói chung và miền Đông Nam bộ nói riêng cho
chất lượng trái và mẫu mã không đồng đều. Cây thường mắc bệnh loét do vi khuẩn
thuộc giống Xanthomonas gây ra. Không chỉ gây bệnh trên bưởi, vi khuẩn còn gây
bệnh trên hầu hết các loại cây có múi khác. Bệnh loét là một trong những bệnh nguy
hiểm nhất trên cây có múi. Khi nhiễm bệnh, sinh trưởng và phát triển của cây giảm, lá
dễ rụng; vỏ bưởi xuất hiện những đốm bệnh sần sùi, quả biến dạng và ảnh hưởng đến
năng suất trồng. Vào mùa mưa, không khí ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh lây lan
và bộc phát thành dịch hại trên toàn bộ vùng trồng bưởi.
Hàng năm, thế giới phải chi hàng triệu dollar cho việc kiểm dịch, ngăn chặn và
dập tắt dịch bệnh. Đến nay, bệnh đã lây lan trên hơn 30 quốc gia trồng cây có múi ở
Châu Á, Thái Bình Dương, Ấn Độ Dương, Nam Mỹ và Bắc Mỹ. Ở Việt Nam, bệnh
loét cũng có tác động lớn đến nhiều loại bưởi có tiềm năng xuất khẩu cao như bưởi
Năm Roi, bưởi Da Xanh, bưởi Tân Triều. Bệnh không ảnh hưởng nhiều đến chất
lượng thịt quả bên trong nhưng làm cho quả không đạt tiêu chuẩn về mẫu mã. Vì vậy,
việc tiêu thụ trong nước cũng như xuất khẩu sang các nước gặp nhiều khó khăn.
Xuất phát từ thực tế trên, với mong muốn ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân
tử để chẩn đoán bệnh sớm, từ đó có biện pháp ngăn chặn, phòng trị bệnh kịp thời và
hiệu quả hơn, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh loét trên
bưởi (Citrus grandis L.) bằng kỹ thuật PCR”.

1


1.2. Mục đích, yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi dựa vào kỹ

thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
1.2.2. Yêu cầu
-

Thành thạo thao tác phân lập và nuôi cấy vi khuẩn trong phòng thí nghiệm.

-

Có khả năng ly trích DNA vi khuẩn.

-

Thiết lập phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS (internally transcribed spacer)

đặc trưng ở vi khuẩn gây bệnh loét với cặp primer chuyên biệt.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây bưởi
2.1.1. Tình hình trồng cây có múi ở Việt Nam và trên thế giới
Cây có múi gồm các loại như cam, quít, bưởi nằm trong nhóm cây ăn quả cho
sản lượng và giá trị kinh tế cao. Năm 2002, sản lượng cây có múi toàn thế giới đạt
khoảng 103,289,516 tấn và chiếm 20 % tổng sản lượng cây ăn quả. Hai khu vực có sản
lượng cam quít lớn là châu Mỹ đạt 50,090,030 tấn và châu Á đạt 31,304,257 tấn; còn
lại ở châu Âu, châu Phi, châu Úc và khu vực Địa Trung Hải (Bộ NN và PTNT, 2006).
Theo thống kê của USDA tháng 7 năm 2006, năm nước có nền sản xuất cây có

múi chính bao gồm Brazin, Mỹ, Trung Quốc, Mexico và Tây Ban Nha với tổng sản
lượng ước tính khoảng 74 triệu tấn; trong đó gồm 46,3 triệu tấn cam, 16,1 triệu tấn
quít, 4,5 triệu tấn chanh, 4,7 triệu tấn bưởi, còn lại là các loại cây có múi khác. Brazin
là quốc gia trồng cam quít lớn nhất thế giới (xem biểu đồ 2.1 phần phụ lục). Chanh
được trồng nhiều ở Mỹ, Ý, Mehico, Ấn Độ, Tây Ban Nha, Thổ Nhĩ Kỳ; trong khi các
nước trồng nhiều bưởi là Mỹ, Israel, Argentina và Trung Quốc. Ngoài ra, những nước
Trung Mỹ, Nam Phi và Địa Trung Hải cũng góp phần đáng kể cho nền công nghiệp
cây có múi của thế giới (Nguồn: />Mặc dù châu Á là nơi xuất phát điểm cây có múi nhưng so với các nước Tây
Âu, việc sản xuất loại cây này vẫn gặp nhiều khó khăn; năng suất trái còn thấp, giá
thành đầu tư trên đơn vị diện tích lại cao vì chịu áp lực của thời tiết, sâu bệnh, đặc biệt
là bệnh Huanglongbing (vàng lá Greening) và các bệnh virus làm cho tuổi thọ cây
giảm. Ở Việt Nam, diện tích cây có múi năm 1999 đạt 63.364 ha với sản lượng
504.066 tấn/năm. Chỉ tính riêng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, loại cây này chiếm
khoảng 53,6 % diện tích và 70,33 % sản lượng. So về diện tích thì cây có múi chiếm
khoảng 12 % diện tích cây ăn trái của cả vùng. Hàng năm diện tích vườn cây có nhiều
biến động, chủ yếu do dịch bệnh và lũ lụt, gây ảnh hưởng lớn đến tình hình phát triển
cam, quít trong nước (Bộ NN và PTNT, 2006).

3


2.1.2. Nguồn gốc, phân loại cây bưởi
Theo trung tâm Công nghệ Lương thực và Phân bón châu Á - Thái Bình Dương
(FFTC) thì cây có múi có nguồn gốc từ Đông Nam Á.
Phân loại: cây bưởi thuộc
-

Giới :

Plantae

-

Ngành :

Magnoliophyta

-

Lớp

:

Magnoliopsida

-

Bộ

:

Sapindales

-

Họ

:

Rutaceae

-

Chi

:

Citrus

-

Loài :

Citrus grandis (L.) Osk.

Hình 2.1. Quả bưởi.

(Nguồn: />Chi Citrus chia làm 2 nhóm nhỏ là Eucitrus và Papeda. Nhóm Papeda gồm 6
loài, thường được dùng làm gốc ghép hoặc lai với loài khác. Nhóm Eucitrus gồm
nhiều loài được trồng phổ biến hiện nay như:
-

Citrus sinensis (L.) Osb.: Cam ngọt

-

Citrus reticulata Blco.: Cây quýt

-

Citrus grandis (L.) Osb. [Citrus maxima Merr.]: Cây bưởi

-

Citrus limon (L.) Burm.f.: Chanh tây

-

Citrus aurantifolia (Christm. & Panz.) Sw.: Cây chanh ta

-

Citrofortunella microcarpa (Bunge): Cây tắc/ hạnh

-

Citrus aurantium L.: Cây cam đắng

-

Citrus paradisi Macf.: Cây bưởi chùm, bưởi vỏ dính

-

Citrus medica L.: Cây thanh yên (Nguồn: Tin khoa học, 2008)
Bưởi ở châu Á chủ yếu là loài Citrus grandis (L.); còn có một loài bưởi khác là

Citrus paradisi Macf. nhưng không được ưa chuộng ở Việt Nam. Citrus paradisi (còn
gọi là bưởi đắng, bưởi chùm hay bưởi vỏ dính) là giống lai giữa bưởi và cam chua
(Citrus aurantium L.). Đây là loài duy nhất không có nguồn gốc châu Á mà phát sinh

từ vùng Tây Ấn Độ (vùng Caribe).

4


2.1.3. Đặc điểm hình thái
Cây bưởi cao 1,5 - 4 m hoặc hơn, thân có gai, nhiều nhánh non, sống lâu năm.
Lá lớn, dày, phiến lá hình xoan đến bầu dục, mặt dưới gân chính thường có lông. Hoa
bưởi rất thơm, mọc đơn hay chùm từ 2 - 10 hoa. Quả có hình cầu, dạng giống quả lê,
đường kính từ 10 - 13 cm, màu xanh. Khi chín, quả bưởi hơi ngả vàng, vỏ dày 1 - 2
cm, tép bưởi bên trong màu vàng nhạt hay hồng. Trái nặng trung bình 1 - 2 kg, hột lớn.
Nhiệt độ thích hợp nhất để cây bưởi sinh trưởng và phát triển từ 23 - 29 OC, cây sẽ
ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ xuống dưới 13 OC và chết ở - 5 OC. Nhiệt độ có ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng của cây cũng như phẩm chất trái (Nguồn:
/>
2.1.4. Giá trị dinh dưỡng của bưởi
Nước ta hiện nay có nhiều giống bưởi như bưởi Đường Hồng, bưởi Đường Lá
Cam, bưởi Đường Cao Nốm, bưởi Thanh Trà, bưởi Ổi, bưởi Năm Roi, bưởi Da
Xanh... Quả bưởi gồm 3 lớp: vỏ xanh bên ngoài, đến cùi bưởi màu trắng xốp và trong
cùng là các múi bưởi với nhiều tép nhỏ. Cùi bưởi chứa pectin, tinh dầu và 2 flavonoid
chính là hesperidin và naringin. Dịch quả bưởi chứa 1 ít glucid, acid citric, vitamin C,
vitamin D, pectin esterase và peroxydase, ngoài ra còn có acid folic và kali. Thành
phần dinh dưỡng của các loại cây có múi được trình bày ở Bảng 2.1 phần phụ lục
Bưởi có vị chua nhẹ, hơi đắng giúp cho tiêu hóa và tuần hoàn máu. Lá và vỏ quả bưởi
có chứa tinh dầu thường được dùng để xông hơi giải cảm. Pectin trong cùi bưởi có khả
năng giảm hấp thu cholesterol trong thức ăn nên làm giảm cholesterol máu và giảm xơ
vữa động mạch. Hesperidin và narigin giúp bảo vệ tính đàn hồi của mạch máu, ngừa
xơ cứng động mạch, gián tiếp chống cao huyết áp và tai biến mạch máu não. Bưởi có
ruột hồng và ruột đỏ còn chứa thêm một carotenoid khác là lycopene. Lycopen có khả
năng ức chế hoạt động của các khối u, đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt (Nguồn:

/>
2.2. Sơ lược về bệnh lóet trên cây có múi
2.2.1. Lịch sử xuất hiện và lan truyền bệnh
Bệnh loét là một trong những bệnh gây hại nguy hiểm nhất trên cây có múi
(Zekri, 2005). Theo trích dẫn của Das (2003), Fawcett và Jenkins (1933) đã ghi nhận
bệnh có nguồn gốc từ Ấn Độ và Java. Họ đã tìm thấy vết bệnh loét trên mẫu cây có
5


múi xưa nhất được lưu giữ tại phòng mẫu cây ở Royal Botanic Gardens (Kew, vương
quốc Anh). Đó là mẫu Citrus medica thu thập từ Ấn Độ năm 1827 - 1831 và mẫu
Citrus aurantifolia từ Indonesia năm 1842 – 1844. Bệnh chủ yếu xảy ra ở những nước
trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tuy nhiên vẫn thấy bệnh xuất hiện ở khu vực có
khí hậu khô và ôn hòa như Tây Nam Á, các nước Trung Đông (Iran, Iraq, Ả Rập
Saudi, các tiểu vương quốc Ả Rập).
Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở Bắc Mỹ (khu vực gần bang Georgia và Florida)
vào năm 1910. Thời điểm đó, người ta vẫn chưa biết gì về tác nhân gây bệnh. Đến năm
1915, bệnh mới đựơc xác định là do vi khuẩn gây ra (Schubert và Sun, 2003; Spann và
ctv, 2007). Hàng năm, thế giới phải chi hàng triệu dollar cho việc kiểm dịch, ngăn
chặn và dập tắt dịch bệnh. Ở Florida, trong suốt những năm 1915 - 1933, gần 257000
vườn cây và hơn 3000000 vườn ươm đã bị tiêu hủy, tổng giá trị thiệt hại ước tính 6
triệu dollar. Lần thứ hai dịch bệnh xảy ra ở Florida vào những năm 1984-1986, gần 20
triệu vườn cây bị tiêu hủy, gây thất thoát khoảng 25 triệu dollar (Schoulties và ctv,
1987). Hiện nay bệnh đã lây lan trên hơn 30 quốc gia trồng cây có múi ở Châu Á, Thái
Bình Dương, Ấn Độ Dương, Nam Mỹ và Bắc Mỹ. Và nó đã trở thành đối tượng kiểm
dịch thực vật rất quan trọng của các nước trong việc nhập giống và trái cây có múi
thương phẩm (Gottwald và ctv, 2002; Polek và ctv, 2007).
2.2.2. Triệu chứng bệnh
Bệnh loét do vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri Hasse 1915 gây ra
(Gottwald và ctv, 2002). Đây là bệnh hại nguy hiểm trên cây có múi ở giai đoạn vườn

ươm và vườn trồng. Vi khuẩn gây bệnh trên các cây thuộc họ Rutaceae bao gồm giống
Citrus, Fortunella và Poncitrus (Kumar và ctv, 2004). Vi khuẩn thường tấn công trên
các bộ phận non của cây. Vào mùa mưa, thời tiết có ẩm độ cao, thích hợp cho sự phát
triển của vi khuẩn nên bệnh thường lây lan nhanh và gây thiệt hại lớn.
Mặc dù có nhiều chủng Xanthomonas gây bệnh loét trên cây có múi nhưng triệu
chứng giữ lại trên cây ký chủ thường giống nhau. Vi khuẩn gây ra vết thương hoại tử
trên lá, thân, quả. Tùy vào tuổi cây và mức độ nghiêm trọng của bệnh mà vết bệnh có
biểu hiện khác nhau. Ở mặt dưới lá non, ban đầu xuất hiện những chấm nhỏ như mụn
nước có đường kính dưới 1 mm, sau đó mở rộng dần và chuyển từ màu xám sang nâu
(Zekri, 2005). Triệu chứng rõ nhất là những vết thương hoại tử, hình tròn, xung quanh

6


có quầng tròn dạng giọt dầu, màu vàng sáng, nhô cao trên mặt lá, thân và quả
(Schubert và Sun, 2003; Das, 2003). Bề mặt biểu bì đứt gãy do sự tăng sinh quá mức
của mô (hypertrophy) khi vi khuẩn xâm nhập. Vết bệnh khi già sẽ rắn lại và nổi gờ,
mặt dưới lá sù sì, mặt trên nứt nẻ màu xám tro. Lá không biến dạng hay nhăn nheo.
Trên cành (chủ yếu là cành bánh tẻ), bệnh làm cho cành khô và chết dần. Cành
già ít nhiễm bệnh hơn. Các tế bào trên thân bị phân chia, thỉnh thoảng tạo thành các
vòng quanh thân non. Biểu hiện bệnh trên thân cho thấy cây đã mắc bệnh trong thời
gian khá dài và chính những vết thương này là nguồn ủ bệnh dai dẳng, tiềm ẩn nguy cơ
lây lan cao. Vết bệnh trên thân và cành không có quầng vàng xung quanh (Schubert và
Sun, 2003; Graham và ctv, 2004). Ở quả, bệnh cũng biểu hiện tương tự nhưng hiếm
khi lan sâu vào trong thịt quả. Khi cây bệnh nặng, quả biến dạng, chuyển từ màu nâu
sang đen sạm, ít nước, khô và rụng sớm trước khi chín (Zekri, 2005).

Hình 2.2. Biểu hiện bệnh loét ở mặt trên và mặt dưới lá cây bưởi.
(Schubert và Sun, 2003)

Hình 2.3. Biểu hiện bệnh loét trên thân, cành và vỏ quả bưởi.
(Nguồn: />
7


Theo thời gian, sản lượng trái giảm hoặc cây không ra trái nữa, giống thoái hóa
dần. Khi cây nhiễm bệnh ở giai đoạn phát triển sớm, quả có thể bị nứt hoặc trở nên xấu
xí, mức độ nhiễm bệnh trên quả luôn song song với mức độ bệnh trên lá (Das, 2003).
Nhiều vết bệnh có thể liên kết lại với
nhau thành từng mảng lớn, đặc biệt khi bệnh
nhiễm theo các vết thương do sâu vẽ bùa (Hình
2.4). Nếu cây bệnh nặng thì lá vàng, rụng sớm.
Ở 42 OC, vết bệnh không thấy xuất hiện hay
phát triển nữa (Pria và ctv, 2006). Lóet có thể
lầm với bệnh ghẻ (sẹo) vì biểu hiện bệnh tương
tự nhau. Tuy nhiên, có thể phân biệt được vì
bệnh ghẻ thường chỉ hiện diện ở mặt dưới lá,
vết bệnh nhỏ hơn và xung quanh không có
quầng vàng.

Hình 2.4. Biểu hiện bệnh loét trên
những vết thương do sâu vẽ bùa.
(Nguồn: />
2.2.3. Các biện pháp phòng trừ bệnh
Cây nhiễm bệnh rất khó chữa trị. Đôi khi phải tiêu hủy toàn bộ vườn cây và ít
nhất 2 năm mới trồng vụ mới. Vì thế, để hạn chế tác hại của bệnh cần chủ động áp
dụng các biện pháp phòng ngừa sớm cho cây:
-

Thường xuyên vệ sinh vườn bưởi bằng cách cắt bỏ và thu gom toàn bộ những

phần bị bệnh còn ở trên cây hoặc đã rụng xuống đất đem tiêu hủy. Nếu làm tốt biện
pháp này sẽ có hiệu quả phòng ngừa rất cao.
-

Không trồng cây con đã nhiễm bệnh, dùng giống có khả năng chống chịu tốt.

-

Thiết kế liếp trồng cao ráo, thóat nước tốt trong mùa mưa để giới hạn ẩm độ

trong vườn. Trồng cây chắn gió xung quanh vườn hoặc xen kẽ các hàng cây.
-

Không nên trồng bưởi quá dầy để vườn luôn được thông thoáng.

-

Áp dụng những biện pháp thích hợp phòng trị sâu vẽ bùa, nhện đỏ, nhện trắng

và các loài ruồi đục thân, đục quả, đặc biệt chú ý các đợt cây ra đọt và lá non.
-

Bón cân đối giữa phân đạm, lân và kali cho cây khỏe mạnh, nên bón thêm phân

hữu cơ đã hoai mục để tăng cường sức đề kháng cho cây.
-

Khi cây đã bệnh, tránh tưới nước theo kiểu phun mưa để hạn chế bệnh lây lan

từ tầng trên xuống tầng dưới của cây.

8


-

Phun xịt các loại thuốc gốc đồng vào lúc cây đang ra lá non như Copper-B

75WP, Copper-zinc 85WP, Tilt super 300EC, Champion 77WP, Vidoc 80BTN,
Starner 20WP, COC 85WP, Kocide 61,4DF, Kasuran 47WP...
2.3. Giới thiệu vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. citri
2.3.1. Phân lọai học vi khuẩn
-

Giới:

Bacteria

-

Ngành:

Proteobacteria

-

Lớp:

Grammaproteobacteria

-

Bộ:

Xanthomonadales

-

Họ:

Xanthomonadaceae

-

Giống:

Xanthomonas

-

Tên khoa học: Xanthomonas axonopodis Hasse, 1915 (hay Xanthomonas

campestris pv. citri Dye; Xanthomonas citri ex Hasse)
(Nguồn: />2.3.2. Phổ ký chủ
Không giống như Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Ralstonia và
Erwinia, vi khuẩn thuộc giống Xanthomonas luôn hiện diện trên thực vật dù không
phải lúc nào chúng cũng gây bệnh. Đa số chúng sống nội ký sinh thực vật. Theo trích
dẫn của Brunings và Gabriel (2003) thì Hayward (1993) đã ghi nhận giống
Xanthomonas có phổ ký chủ rất rộng, gồm ít nhất 68 họ thực vật và hơn 240 giống cây

trồng. Bất kỳ chủng vi khuẩn nào thuộc Xanthomonas spp. cũng chỉ có số cây ký chủ
giới hạn và phổ ký chủ thường được chỉ thị bởi trạng thái pathovar của vi khuẩn.
Theo đó, bệnh loét gây ra bởi hai nhóm di truyền phân biệt thuộc giống
Xanthomonas. Một nhóm bắt nguồn từ châu Á là X. axonopodis pv. citri (Xac) và một
nhóm bắt nguồn từ Nam Mỹ là X. axonopodis pv. aurantifolii. Nhóm châu Á gây ra
bệnh loét dạng A (canker A, cancrosis A, true canker) trên tất cả các cây có múi.
Nhóm này có mặt khắp nơi trên thế giới và gây thiệt hại nặng nề nhất. Ngược lại, tất cả
các chủng Nam Mỹ lại giới hạn số ký chủ, X. axonopodis pv. aurantifolii gây bệnh loét
dạng B (canker B, cancrosis B, false canker) và dạng C (canker C) trên chanh, chanh
Mexican, cam chua, bưởi chùm (Gottwald và ctv, 2002). Triệu chứng bệnh trên những
ký chủ mẫn cảm của hai nhóm là giống nhau.
9


Thêm vào đó, còn xuất hiện 2 pathovar phụ là Xac-A* và Xac-Aw. Xac A* được
phát hiện ở Oman, Ả Rập Saudi, Iran, Ấn Độ (Vernière và ctv, 1998). Xac Aw
(“Wellington” strain) được tìm thấy đầu tiên ở Florida năm 1999 (Sun và ctv, 2000;
2004). Hai pathovar này có phổ ký chủ giống với chủng aurantifolii nhưng về đặc
điểm di truyền giống với chủng citri. Vì vậy, chúng không được ưu tiên xếp vào nhóm
nào trong hai nhóm trên (Sun và ctv, 2004).
2.3.3. Đặc điểm sinh học
Vi khuẩn Xac hình que, Gram âm, hiếu khí bắt buộc, kích thước 1,5 - 2,0 x 0,5 0,75 μm, hai đầu tròn, có khả năng di động nhờ tiêm mao đơn cực. Khuẩn lạc phát
triển trên môi trường nuôi cấy có hình tròn, màu vàng do sự tạo thành sản phẩm
xanthomonadin. Xanthomonadin có tác dụng bảo vệ vi khuẩn tránh tia cực tím
(Brunings và Gabriel, 2003). Vi khuẩn phát triển mạnh ở các vùng cận nhiệt đới, nơi
có ẩm độ cao và mưa nhiều (Masterson và ctv, 2007). Khi môi trường có đường
(glucose hay một loại đường khác) khuẩn lạc sẽ trở nên nhầy vì có sự tạo các
polysaccharide ngoại bào (EPS). Các EPS bao phủ bên ngoài tế bào vi khuẩn và giúp
chúng kéo dài thời gian sống sót trong môi trường (Schubert và Sun, 2003).
Xac sống sót được trên nhiều loại vật liệu khác nhau như gỗ, vải cotton, kim

loại, nhựa, da thuộc, lông vũ hay trên mình động vật khi điều kiện ẩm. Thời gian tồn
tại có thể lên đến 48 giờ khi ánh nắng chiếu trực tiếp và 72 giờ trong bóng râm. Thời
gian này tuỳ thuộc nhiều vào nhiệt độ và ẩm độ môi trường thử nghiệm. Khi bề mặt
vật liệu khô, vi khuẩn sẽ chết. Dù vậy, trước khi vi khuẩn chết thì những vật liệu này
lại tiềm ẩn nguy cơ lây lan bệnh cao (Graham và ctv, 2000).
Về mặt sinh hóa, Xac cho phản ứng dương tính khi thủy phân tinh bột, aesculin,
casein; phản ứng hóa lỏng gelatin; tạo tyrosinase, catalase; khử cơ chất từ sucrose và
hydrogen sulfide. Ngược lại, chúng phản ứng âm tính với Methyl red, Idol và phản
ứng khử nitrate. Hệ gen của X.citri 306 không có pectin esterase nhưng chứa 3 pectate
lyases, 6 cellulase, 5 xylanases và 1 endoglucanase (Brunings và Gabriel, 2003).
Về mặt di truyền, Xac mang một nhiễm sắc thể vòng, chứa khoảng 5,1 triệu bp
và hai DNA plasmid nhỏ hơn. Trong khi đó, X. campestris pv. campestris là tác nhân
gây bệnh đốm lá (cháy lá chữ V) trên cây họ thập tự như cải bắp, bông cải… chỉ mang
1 nhiễm sắc thể khá nhỏ khoảng 5 triệu bp và không có plasmid. Theo các nhà nghiên

10


cứu Brazin, Xac và X. campestris pv. campestris có bộ gen giống nhau khoảng 80 %,
20 % gen còn lại quy định khả năng vi khuẩn tấn công vào loại thực vật nào và theo
phương thức đặc biệt nào (Edward, 2002).
2.3.4. Tương tác giữa Xac và ký chủ
Vi khuẩn có khả năng sản xuất ra một lượng lớn các polysaccharide ngoại bào
(EPS) trong môi trường nuôi cấy và trong mô cây. Tại vết thương, các tế bào vi khuẩn
bám vào chất nền dày đặc EPS; khi trời mưa chúng phát tán ra xung quanh làm tăng
khả năng lan truyền bệnh. Các phân tử EPS có vai trò bảo vệ vi khuẩn khỏi sự pha
lõang trong nước cũng như bị khô trong không khí.
Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào gian bào sẽ bám chặt lên thành tế bào cây
thông qua tương tác giữa EPS và agglutinin của cây (Takahashi và Doke, 1984).
Ngòai ra, Brunings và Gabriel (2003) còn nhận thấy vi khuẩn bám vào tế bào cây ký

chủ thông qua những protein đặc biệt (chất kết dính - adhesin) hay qua cơ quan đặc
biệt là pili. Tuy nhiên, vi khuẩn có khả năng gây ra phản ứng siêu nhạy cảm
(Hypersensitive Response) trên những cây không là ký chủ (non-host) nên sự kết bám
vào thành tế bào thực vật là không đặc hiệu cho ký chủ nào.
Sự sản xuất ethylene được ghi nhận trong những lá bị nhiễm Xac. Việc vi
khuẩn kích thích cây sản xuất etylene có thể là một kiểu phản ứng tự vệ của cây.
Etylene có khả năng gây ra rụng lá, nhờ đó ngăn chặn sự lây lan vi khuẩn vào toàn bộ
hệ thống hoạt động của cây (Dutta và Biggs, 1991).
2.3.5. Giới thiệu các gen gây bệnh của vi khuẩn
2.3.5.1. Gen pthA
pthA là thành viên của họ gen avrBs3/pthA. Đây là gen quy định tính gây độc
của Xac trên cây có múi (Brunings và Gabriel, 2003). Khi được chuyển vào các
xanthomonad khác thì nó bị mất tính độc. Gen pthA mang nhiều trình tự lặp lại giống
nhau có kích thước 102 bp ở vùng trung tâm (Yang và Gabriel, 1995). Gen pthA là
yếu tố đủ để kích hoạt triệu chứng đặc trưng của bệnh loét trên cây có múi, bao gồm
sự tăng sinh tế bào quá mức và tạo ra các vết thương hoại tử (Duan và ctv, 1999).
Trên những thực vật không phải là ký chủ như thuốc lá, cây đậu và bông vải,
gen pthA gây ra phản ứng siêu nhạy cảm với chương trình chết tế bào cây (Cell death
program) thể hiện ở sự hoại tử tế bào của các mô bị nhiễm. Vết loét trên cây có múi
11


không được tạo ra khi tiến hành những thử nghiệm ngắn kiểm tra sự biểu hiện của gen
avrb6, trong khi gen avrb6 có trình tự DNA tương đồng với gen pthA khoảng 97 %.
Gen avrb6 được tạo dòng (cloning) từ vi khuẩn X. campestris pv. malvacearum gây
bệnh giác ban (tàn lụi) trên cây bông vải (DeFeyter và ctv, 1993).
PthA, PthB, PthC và PthW là những đồng đẳng của nhau, chúng được phân lập
tương ứng từ X. axonopodis pv. citri chủng A, X. axonopodis pv. aurantifolii chủng B
và C, X. axonopodis pv. citri chủng Aw. Tất cả các gen này đều quy định tính gây
bệnh của vi khuẩn trên cây có múi. Mặc dù, pthC và pthW thu từ hai chủng chỉ có khả

năng gây bệnh giới hạn trên chanh nhưng khi chuyển chúng vào X. axonopodis pv.
citri chủng A thiếu gen pthA thì chúng vẫn biểu hiện đầy đủ khả năng gây bệnh. Do
vậy, có thể nói hai gen này không giới hạn phổ ký chủ (Brunings và Gabriel, 2003).
2.3.5.2. Các gen hrp
Cụm gen hrp (Hypersensitive Response and Pathogenicity) mã hoá cho những
protein cấu thành hệ thống tiết loại III (T3S - Type III secretion). Hệ thống tiết loại III
này có vai trò phân phối các protein effector gây độc vào bên trong tế bào ký chủ
(Leach và White, 1996; Dunger và ctv, 2005). Sau đó, nếu ký chủ mẫn cảm
(susceptible plant) sẽ xuất hiện kiểu hình bệnh; đối với cây có tính kháng (resistant
plant) thì xảy ra phản ứng siêu nhạy cảm.
Theo trích dẫn của Brunings và Gabriel (2003) thì Hacker và Kaper (2000) cho
rằng cụm gen hrp là một phần của khu vực đảo có tính gây bệnh (“pathogenic island”)
nằm trên nhiễm sắc thể chính, trải dài hơn 23 kb và chứa vùng có hàm lượng G+C
khác biệt so với những vùng còn lại trong hệ gen (genome) vi khuẩn. Cụm gen hrp
còn mang các yếu tố di truyền có tính di động (transposases). Mô hình tổ chức cụm
gen hrp dựa trên trình tự hệ gen của X. axonopodis pv. citri 306 thể hiện trên hình 2.5.

Hình 2.5. Tổ chức cụm gen hrp của X. axonopodis pv. citri 306
Ghi chú: Những khối màu xám tương ứng vùng ORFs. Mũi tên nằm trên các khối hình
định hướng những operon hrp. (Dunger và ctv, 2005)

12


2.3.5.3. Đặc điểm xâm nhiễm và lan truyền của vi khuẩn
Vi khuẩn xâm nhập vào cây thông qua lỗ khí khổng (Hình 2.6), qua những vết
thương cơ giới do cắt tỉa hay do côn trùng chích hút. Sự hiện diện của sâu vẽ bùa
(Phyllocnistis citrella Stainton) làm gia tăng sự xâm nhiễm và gây bệnh của vi khuẩn.
Ấu trùng ngay sau khi nở ra sẽ thâm nhập vào tế bào thịt lá và ăn dần các lớp biểu bì.
Mặc dù không phải là phương tiện truyền bệnh nhưng tập tính ăn của sâu vẽ

bùa lại cung cấp cửa ngõ cho vi khuẩn xâm nhập vào cây (Belasque và ctv, 2005). Vết
thương do sâu vẽ bùa gây ra lâu lành hơn so với các vết thương cơ học, thường kéo
dài 10 - 14 ngày thay vì 1 ngày. Những cây mang vết thương do sâu vẽ bùa sẽ duy trì
tính mẫn cảm đối với Xac trong 7 - 14 ngày, còn với những vết thương gây ra bởi gió
bão và do cơ học chỉ kéo dài 24 giờ. Mật số vi khuẩn đủ để gây bệnh qua vết thương
do sâu vẽ bùa ít hơn 10 lần so với qua các lỗ hở tự nhiên (Gottwald và ctv, 2002).

Hình 2.6. Vi khuẩn xâm nhập vào lỗ khí khổng của lá bưới.
(Gottwald và ctv, 2002)
Sau khi tấn công vào tổ chức mô cây, vi khuẩn sinh sản nhanh chóng ở gian
bào làm tế bào tăng kích thước, dần dần hóa gỗ và hình thành vết loét. Những lá non
mới nhú có tính mẫn cảm cao với bệnh vì khi đó chúng chưa đủ thời gian trưởng
thành để tạo ra lớp sáp bảo vệ bên ngoài. Sau giai đoạn phát triển, những cây già cũng
dễ nhiễm bệnh vì cây thường mang những lỗ hở tạo điều kiện cho vi khuẩn tấn công.
Khi vi khuẩn xâm nhập vào cây, vết thương sẽ được hình thành trong vòng 7 ngày,
mặc dù trong một số trường hợp có thể kéo dài 60 ngày.
Những lá đã mở rộng kích thước 50 % - 80 % tạo điều kiện tốt nhất cho vi
khuẩn xâm nhập qua khí khổng. Mưa kéo theo những cơn gió với tốc độ thổi vượt quá
8 m/s cũng giúp vi khuẩn tấn công vào cây dễ dàng hơn (Graham và ctv, 2004). Bệnh
phát triển khi nhiệt độ khoảng 20 - 30 OC và ẩm độ cao. Điều kiện ngoại cảnh này đặc

13


biệt ảnh hưởng đến thời gian biểu hiện và khả năng bùng phát dịch bệnh. Nhìn chung,
khả năng phát sinh và mức độ bệnh của cây tùy thuộc vào độ tuổi, độ thành thục của
các bộ phận cũng như tính nhạy cảm của cây. Bệnh có tính truyền nhiễm cao và lây
lan nhanh chóng nhưng hoàn toàn vô hại đối với con người, động vật và những thực
vật khác không thuộc nhóm cây có múi.
Vào mùa xuân, khí hậu ẩm ướt tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn từ trong

vết bệnh cũ hoạt động trở lại và lây lan từ nơi này sang nơi khác. Phương thức lan
truyền chủ yếu là nhờ hệ thống tưới tiêu, do mưa gió, bão táp hay côn trùng. Có
trường hợp vi khuẩn bám trên mình chim chóc, vật nuôi khi chúng tiếp xúc với cây
bệnh. Con người di chuyển nguồn nguyên liệu thực vật đã bị nhiễm đi nơi khác. Tay
chân, quần áo, máy xén cỏ và các dụng cụ làm vườn cũng tiềm ẩn nguy cơ lây lan cao.
2.4. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh thực vật
2.4.1. Phương pháp dùng cây chỉ thị
Cây chỉ thị (cây trồng hay cây dại) thực chất cũng là cây ký chủ nhưng khi vi
khuẩn xâm nhập và gây bệnh thì triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện nhanh
chóng. Đây là phương pháp khá chính xác trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh thực
vật. Cây chỉ thị được chia làm hai nhóm: cây nhiễm bệnh cục bộ và cây nhiễm bệnh
hệ thống. Thông thường, các cây nhiễm bệnh cục bộ tạo ra các vết bệnh trên bộ phận
như lá, thân,…còn cây nhiễm hệ thống sẽ tạo ra triệu chứng trên toàn bộ cây
Để có được cây chỉ thị để chẩn đoán bệnh thì cần thực hiện đầy đủ các yêu cầu
về điều kiện thí nghiệm (chuẩn bị đất trồng, phân bón, điều kiện hạn chế tối đa sự có
mặt của các vi sinh vật), có phương pháp trồng cây chỉ thị cũng như có phương pháp
tiến hành và theo dõi quá trình chủng bệnh nhân tạo này, từ đó mới đưa ra kết luận về
tác nhân gây bệnh.
2.4.2. Phương pháp huyết thanh học
Các phương pháp huyết thanh học như sử dụng kính hiển vi, nhuộm khuẩn lạc
kết hợp với phản ứng miễn dịch huỳnh quang, phản ứng ngưng kết (agglutination) và
kỹ thuật ELISA thường được dùng trong việc phát hiện và định danh vi sinh vật. Các
kỹ thuật này có điểm chung là đều dựa trên cơ sở sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể phát hiện. Kháng nguyên có thể là các lipopolysaccharide
epitopes hoặc flagellar epitope của vi khuẩn (Alvarez và ctv, 1991).
14


Trong phương pháp, xảy ra hai quá trình nối tiếp nhau: (1) sự kết hợp giữa
kháng nguyên cần tìm và kháng thể; (2) nhờ hoạt tính của enzyme (enzyme được gắn

với kháng thể phát hiện) giải phóng oxi nguyên tử và chính oxi nguyên tử này oxy hóa
cơ chất tạo màu. Cơ chất đổi màu chứng tỏ có sự kết hợp giữa kháng nguyên với
kháng thể; từ đó, khẳng định sự hiện diện của tác nhân cần tìm trong mẫu.
2.4.3. Phương pháp in dấu Phage (phage - typing)
Phương pháp dựa trên khả năng của một thực khuẩn thể (bacteriophage) nào đó
có khả năng gây độc và làm tan tế bào vi sinh vật mục tiêu một cách đặc hiệu. Trong
thí nghiệm, người ta tiến hành kiểm tra vi khuẩn nghi ngờ với phage chuyên biệt. Nếu
phage sinh sôi và dung giải tế bào vi khuẩn thì chứng tỏ có sự hiện diện của tác nhân
gây bệnh. Ưu điểm của kỹ thuật là chỉ yêu cầu quá trình ly tâm thông thường và cho
kết quả trong vòng 24 giờ mà không cần phân lập mẫu vi khuẩn trong môi trường
nuôi cấy thuần khiết. Mặc dù các kỹ thuật sử dụng kháng huyết thanh (antiserum) và
DNA để chẩn đoán bệnh khá phát triển, nhưng chúng lại có nhược điểm là phát hiện
cả những vi khuẩn còn sống và đã chết; trong khi với kỹ thuật phage - typing, phage
chỉ sinh sôi khi có mặt vi khuẩn còn sống trên ký chủ, nhờ vậy mà giúp ta dự đoán
được quá trình tiến triển của bệnh trên những vùng trồng cây có múi.
Sử dụng phage là một kỹ thuật nhanh, đơn giản, ít tốn kém. Không chỉ cho hiệu
quả phát hiện tương đương với kỹ thuật ELISA, mà nó còn tỏ ra ưu thế hơn khi chỉ
phát hiện những vi khuẩn còn sống (Myung và ctv, 2006). Năm 1993, Wu và ctv thực
hiện phương pháp này với phages Cp115 và Cp122 phân lập tương ứng từ vết loét
trên bưởi và cam ngọt Liucheng. Phages cho độ đặc hiệu cao khi dung giải tế bào vi
khuẩn được kiểm tra. Kết quả xác định được 135 (98 %) trong tổng số 138 mẫu X.
campestris pv. citri thu thập từ vết loét trên thân, lá, quả của những cây có múi khắp
Đài Loan. Đối với những vi khuẩn từ đất, đá, từ chất vô cơ hay vi khuẩn ký sinh trên
thực vật khác thuộc X. campestris nhưng không phải X. citri đều cho kết quả âm tính.
2.4.4. Kỹ thuật PCR
2.4.4.1. Nguyên tắc
PCR (hay phản ứng chuỗi polymerase) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát
minh ra vào năm 1985. Đây là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử, nó giúp tạo
dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Từ một hỗn hợp các phân tử gồm DNA, RNA,
15