PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TRÊN CÂY HỌ ĐẬU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ
TRÊN CÂY HỌ ĐẬU

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: LÊ DUY HOÀNG CHƯƠNG

Tháng -i9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ
TRÊN CÂY HỌ ĐẬU

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS. TS BÙI VĂN LỆ

LÊ DUY HOÀNG CHƯƠNG

Th.S KIỀU PHƯƠNG NAM

Tháng
-ii- 9/2008


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Phó giáo sư, Tiến sĩ BÙI VĂN LỆ đã tạo
điều kiện thuận lợi để tôi có một môi trường học hỏi, nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt
nghiệp thật tốt.
Tôi xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ KIỀU PHƯƠNG NAM đã tận tình hướng dẫn
và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm đề tài. Thầy như một người anh, người bạn sẵn sàng
giúp đỡ và chia sẻ với tôi những lúc khó khăn, bế tắc khi thực hiện đề tài này.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến :
Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý
thầy cô trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã chỉ dạy và truyền đạt
những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt 4 năm học tại trường.
Đặc biệt cảm ơn các bạn Minh Tuấn, Như Thùy, Ngọc Hà, Thành Trung, Minh
Thư, Thúy Loan, Phi Loan, Minh Trang, Phương Khánh, Bích Ngọc, Tuấn Cường, Hồng
Hạnh, Bích Nguyên lớp 04CS, em Hoàng Nguyên lớp 06CS trường Đại học Khoa Học
Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã thân thiện giúp đỡ và chia sẻ những buồn vui với tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Các bạn bè thân thương trong nhóm A Week Holiday và các bạn lớp CNSH
K30 đã cùng tôi san sẻ những niềm vui cũng như nỗi buồn trong những năm học đại học.
Đặc biệt con cảm ơn Bố, Mẹ đã luôn chăm lo, ủng hộ, tin tưởng và là chỗ dựa
tinh thần vững chắc cho con để con vững bước đến ngày hôm nay.

Tháng 9 năm 2008
Lê Duy Hoàng Chương

-ii-


TÓM TẮT
Đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn cố định nitơ trên cây họ Đậu” được thực hiện
tại trại Thực nghiệm sinh học, phòng Sinh học phân tử - Lab B, trường Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2008.
* Mục tiêu đề tài:
 Phân lập những chủng vi khuẩn Azospirillum sp. và vi khuẩn Bradyrhizobium sp.
trên môi trường chọn lọc NFb, CRA và YEM, YEMA.
 Tuyển chọn những chủng phân lập về khả năng cố định nitơ và kích thích thực vật
tăng trưởng.
 Định danh các chủng tuyển chọn bằng phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA
kết hợp với một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa.
* Kết quả:
 Phân lập được 25 chủng vi sinh vật có khả năng sinh trưởng được trên các môi
trường chọn lọc từ nguồn mẫu là rễ cây họ Đậu có nốt sần và đất ở vùng rễ được
lấy ở Thủ Đức và vườn Quốc gia Nam Cát Tiên.
 Chọn lọc được 8 chủng vi khuẩn vừa có khả năng cố định nitơ, vừa có khả năng
phân tiết các loại phytohormone kích thích thực vật tăng trưởng.
 Định danh được 8 chủng vi khuẩn thuộc 8 loài của 5 chi vi khuẩn cố định nitơ khác
nhau bao gồm: Bacillus megaterium, Pseudomonas plecoglossicida, Moraxella
oslensis, Bacillus acidiceler, Bacillus cereus, Burkholderia cepacia và
Klebsiella sp.
 Xác định môi trường NFb và CRA không hoàn toàn chọn lọc cho vi khuẩn
Azospirillum sp. và môi trường YEM không hoàn toàn chọn lọc cho vi khuẩn
Bradyrhizobium sp.

 Hai cặp mồi thoái hóa PolF – PolR và nifHfor – nifHrev không hoàn toàn đặc hiệu
với gene nifH của 8 chủng đã định danh.
-iii-


SUMMARY
The thesis was entitled “Isolation and identification of nitrogen – fixing
bacteria in Legumes”. This thesis was carried out at Biologically Experimental House
and Lab B, University of Science, National University, Ho Chi Minh city, Vietnam, from
March to September, 2008.
Recently, global agriculture is facing food crisis caused by bad effects of
increasing world population, natural calamity, and contaminated agricultural land or
large-scale growing GMF (genetically modified food). For this problem, many methods
were conducted in order to produce fertilizers for the aim of enhancement of botanical
nutritional level, plant growth promotion, disease suppression, and/or environmental
amicability. Microorganism fertilizer is a highlight. Azospirillum sp. and Bradyrhizobium
sp. are rhizosphere bacteria possessing a great many of those properties for plant fertilizer
applications. Thus, in this thesis, our goal is isolation of new species of the two genera.
Purpose:
 Isolation of Azospirillum sp. on calm-liquid NFb and Congo red agar (CRA)
media, and Bradyrhizobium sp. on Yeast extract mannitol (YEM) and Yeast
extract mannitol agar (YEMA) media from nodule root and root soil samples of
some Legumes.
 Selection of plant growth-promoting isolates.
 Identification of the selective isolates by analysis of 16S rDNA sequence data.
Results:
 Isolated 14 strains from NFb and CRA media, 11 strains from YEM and YEMA
ones.
 8 isolates were selected for their plant growth-promoting abilities.
 Identified 8 isolates to belong to 8 different species of 5 varied genera. They are

nitrogen-fixing bacteria or plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) such as
Bacillus megaterium, Pseudomonas plecoglossicida, Moraxella oslensis, Bacillus
acidiceler, Bacillus cereus, Burkholderia cepacia and Klebsiella sp.
 Drew the conclusion of the imperfectly selective NFb or CRA media for
Azospirillum sp. and the incompletely selective YEM and YEMA ones for
Bradyrhizobium sp.
 The degenerated PolF-PolR and nifHfor-nifHrev primers were not specific for nifH
genes of 8 defined strains.
-iv-


MỤC LỤC
Trang tựa

Trang

LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................i
TÓM TẮT ......................................................................................................................... iii
SUMMARY........................................................................................................................iv
MỤC LỤC ..........................................................................................................................iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ.............................................................................................ix
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ xii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ...................................................................................xiv
Chương 1 MỞ ĐẦU..........................................................................................................15
1.1

Đặt vấn đề .............................................................................................................15

1.2

Mục tiêu ................................................................................................................16

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................17
2.1

Vai trò của nitơ đối với thực vật...........................................................................17

2.2

Thực vật họ Đậu ...................................................................................................17

2.3

Quá trình cố định nitơ...........................................................................................18

2.3.1

Chu trình nitơ trong tự nhiên ................................................................................18

2.3.2

Quá trình cố định nitơ...........................................................................................19

2.4

Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ .....................................................................20

2.4.1

Phân loại ...............................................................................................................20

2.4.2

Đặc điểm...............................................................................................................20

2.4.3

Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên..................................................22

2.5

Vi khuẩn chi Azospirillum ....................................................................................23

2.5.1

Lịch sử phát hiện ..................................................................................................23

2.5.2

Phân loại ...............................................................................................................24

-iv-


2.5.3

Sự phân bố ............................................................................................................26

2.5.4

Cơ chế tương tác của Azospirillum với thực vật...................................................28

2.5.5

Đặc điểm...............................................................................................................30

2.5.5.1 Đặc điểm hình thái................................................................................................30
2.5.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa....................................................................................30
2.5.5.3 Khả năng cố định nitơ...........................................................................................31
2.5.5.4 Vai trò và ứng dụng ..............................................................................................32
2.6

Vi khuẩn chi Bradyrhizobium...............................................................................33

2.6.1

Lịch sử phát hiện ..................................................................................................33

2.6.2

Phân loại ...............................................................................................................34

2.6.3

Sự phân bố ............................................................................................................34

2.6.4

Đặc điểm...............................................................................................................34

2.6.4.1 Khả năng cố định nitơ...........................................................................................35
2.6.4.2 Vai trò và ứng dụng ..............................................................................................37
2.7

Gene nif.................................................................................................................37

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................38
3.1

Bố trí thí nghiệm...................................................................................................38

3.2

Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................38

3.2.1

Mẫu thí nghiệm.....................................................................................................38

3.2.2

Thiết bị và dụng cụ ...............................................................................................38

3.2.3

Hóa chất ................................................................................................................39

3.2.3.1 Các loại môi trường dùng cho thí nghiệm ............................................................39
3.2.3.2 Một số hóa chất khác ............................................................................................40

3.3

Phương pháp thí nghiệm.......................................................................................40

3.3.1

Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần ...................................................................42

3.3.1.1 Lấy mẫu và tăng sinh vi khuẩn.............................................................................42
3.3.1.2 Phân lập và làm thuần...........................................................................................42
3.3.1.3 Giữ giống ..............................................................................................................43

-v-


3.3.2

Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào và xác định Gram vi khuẩn ..................43

3.3.2.1 Quan sát hình thái và đo kích thước tế bào ..........................................................43
3.3.2.2 Xác định Gram vi khuẩn.......................................................................................43
3.3.2.3 Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn carbon......................................................45
3.3.3

Thí nghiệm 3: Định tính khả năng cố định nitơ bằng phản ứng hóa học .............46

3.3.4

Thí nghiệm 4: Định tính và định lượng các loại phytohormone thô có trong dịch
khuẩn.....................................................................................................................47

3.3.4.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Auxin...............................................................47
3.3.4.2 Xác định hoạt tính Cytokinin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên tử diệp
dưa chuột...............................................................................................................49
3.3.4.3 Xác định hoạt tính Gibberellin thô bằng phương pháp sinh trắc nghiệm trên hạt
xà lách ...................................................................................................................50
3.3.5

Thí nghiệm 5: Định danh các chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp phân
tích trình tự 16S rDNA .........................................................................................52

3.3.5.1 Ly trích DNA bộ gene vi khuẩn ...........................................................................52
3.3.5.2 Khuếch đại trình tự rDNA 16S của vi khuẩn bằng phản ứng PCR ......................54
3.3.5.3 Gửi mẫu giải trình tự và xử lý kết quả giải trình tự..............................................56
3.3.6

Thí nghiệm 6: Định tính gene nifH bằng phản ứng PCR .....................................56

3.3.7

Thí nghiệm 7: Khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa..................................58

3.3.7.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh lý .........................................................................58
3.3.7.2 Khảo sát một số đặc điểm sinh hóa ......................................................................60
3.3.7.3 Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl ..........................................63
3.3.8

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp PHB của các chủng định danh ........................65

3.3.9

So sánh độ tương đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard (Sj)..............................66

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................67
4.1

Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần ...................................................................67

4.1.1.1 Tăng sinh vi khuẩn................................................................................................67
4.1.1.2 Phân lập và làm thuần...........................................................................................68

-vi-


4.2

Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào và xác định Gram vi khuẩn ..................69

4.2.1

Quan sát hình thái tế bào ......................................................................................69

4.2.2

Xác định Gram vi khuẩn.......................................................................................71

4.2.2.1 Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn carbon......................................................72
4.3

Thí nghiệm 3: Định tính khả năng cố định nitơ bằng phản ứng hóa học .............73

4.4

Thí nghiệm 4: Định tính và định lượng các loại phytohormone thô có trong dịch
khuẩn.....................................................................................................................75

4.4.1

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Auxin...............................................................75

4.4.2

Định lượng auxin thô, cytokinin thô và gibberellin thô .......................................76

4.5

Thí nghiệm 5: Định danh các chủng vi khuẩn chọn lọc bằng phương pháp phân
tích trình tự 16S rDNA của vi khuẩn....................................................................79

4.5.1

Kết quả tách chiết DNA bộ gene vi khuẩn ...........................................................79

4.5.2

Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA của 8 chủng nghiên cứu.........................80

4.6

Thí nghiệm 6: Định tính gene nifH bằng phản ứng PCR .....................................82

4.7

Thí nghiệm 7: Khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa..................................86

4.7.1

Kết quả khảo sát một số đặc điểm sinh lý ............................................................86

4.7.2

Kết quả khảo sát một số đặc điểm sinh hóa..........................................................92

4.7.3

Kết quả định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl .............................95

4.7.4

Kết quả định tính PHB..........................................................................................96

4.8

Kết quả giải trình tự và định danh ........................................................................96

4.9

Thảo luận ............................................................................................................109

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................113

5.1

Kết luận...............................................................................................................113

5.2

Đề nghị................................................................................................................114

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................115
PHỤ LỤC

-vii-


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ACC

1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid

BA

6-Benzyladenin

bp

base pair

CTAB

Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide

DEPC

Diethylpyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA

Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid

EPS

Exopolysaccharide

EtOH

Ethanol

g

gram

GA3

Giberrellic acid

IAA

Indole-3-acetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

kg

kilogram

LB

Luria Bertani

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

PHB

Poly-β-hydroxybutyrate

PS

Polysaccharide

RNA

Ribonucleic acid

TAE

Tris-Acetic-EDTA

Taq

Thermus aquaticus

TE

Tris-EDTA

U

Unit

UV

Ultra Violet

-viii-

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ
Hình

Trang

Hình 2.1 – Hoa của một cây họ Đậu ...............................................................................18
Hình 2.2 – Chu trình nitơ trong tự nhiên..........................................................................19
Hình 2.3 – Phổ tương tác cố định nitơ trên thực vật ........................................................22
Hình 2.4 – Cây phát sinh loài (phylogenetic tree) của Azospirillum ...............................26
Hình 2.5 – Mô hình về sự tương tác giữa Azospirillum và rễ thực vật ............................29
Hình 2.6 – Cơ chế tạo nốt sần của Bradyrhizobium sp....................................................36
Hình 2.7 – Leghaemoglobin..............................................................................................36
Hình 3.1 – Các bước nhuộm Gram...................................................................................44
Hình 3.2 – Khoảng đổi màu của Bromothymol blue ........................................................45
Hình 3.3 – Vị trí bắt cặp các mồi trên trình tự 16S rDNA ...............................................54
Hình 3.4 – Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA ......................55
Hình 3.5 – Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch gene nifH ..........................................57
Hình 3.6 – Sự chuyển màu của dung dịch chuẩn độ từ tím đỏ sang vàng cam ................65
Hình 4.1 – Các ống nghiệm môi trường NFb sau 5 ngày tăng sinh.................................67
Hình 4.2 – Các ống nghiệm môi trường YEM sau 5 ngày tăng sinh ................................68
Hình 4.3 – Dịch khuẩn chủng 4415b có NH4+ làm đổi màu giấy quỳ ẩm thành xanh .....74
Hình 4.4 – Màu hồng do thuôc thử Salkowski phản ứng với auxin do chủng 4415b tiết ra
trên giấy lọc có sinh khối vi khuẩn.............................................................................75
Hình 4.5 – Sự khác biệt giữa tử diệp được xử lý với cytokinin thô và nước cất
(đối chứng – ĐC)........................................................................................................77
Hình 4.6 – Hình điện di DNA bộ gene của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu.......................79
Hình 4.7 – Kết quả điện di sản phẩm PCR DNA bộ gene 8 chủng nghiên cứu với cặp mồi
27F – 1525R ...............................................................................................................81

Hình 4.8 - Kết quả điện di sản phẩm PCR DNA bộ gene của 2 chủng 4453 và 4553 bằng
cặp mồi 20F – 1500R ................................................................................................81

-ix-


Hình 4.9 – Kết quả sản phẩm PCR với 3 cặp mồi 520F – 920R, 920F – 1525R
và 20F – 520R.............................................................................................................82
Hình 4.10 – Kết quả điện di sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi PolF – PolR ...................83
Hình 4.11 – Kết quả điện di sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi nifHfor – nifHrev ...........84
Hình 4.12 – Sự phát triển của các chủng ở nhiệt độ tối ưu..............................................91
Hình 4.13 – Kết quả định tính PHB của chủng 4415b và 4453 dưới kính hiển vi huỳnh
quang ở bước sóng 460nm .........................................................................................96
Hình 4.14 – Cây phát sinh loài tổng quát của các chủng 4415b, 4485 và 4487 với các
chủng chuẩn khác trong chi Bacillus .........................................................................99
Hình 4.15 – Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4415b với các chủng trong chi
Bacillus có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát ........100
Hình 4.16 – Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4485 với các chủng trong chi Bacillus
có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát.......................100
Hình 4.17 – Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4487 với các chủng trong chi Bacillus
có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát.......................101
Hình 4.18 - Cây phát sinh loài cho chủng 4420c và các chủng thuộc chi
Pseudomonas ............................................................................................................102
Hình 4.19 - Cây phát sinh loài chủng cho chủng 4453 và các chủng thuộc chi
Moraxella..................................................................................................................103
Hình 4.20 – Cây phát sinh loài tổng quát của chủng 4553 và 4574 với tất cả chủng
chuẩn thuộc chi Klebsiella .......................................................................................105
Hình 4.21 - Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4553 với các chủng trong chi
Klebsiella có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát .....106
Hình 4.22 – Cây phát sinh loài chi tiết của chủng 4574 với các chủng trong chi

Klebsiella có mối quan hệ họ hàng gần nhất theo cây phát sinh loài tổng quát .....106
Hình 4.23 - Cây phát sinh loài của chủng 4560 với các chủng chuẩn thuộc chi
Burkholderia.............................................................................................................108

-x-


Sơ đồ

Trang

Sơ đồ 3.1 – Quy trình thí nghiệm .......................................................................................41
Sơ đồ 3.2 – Quy trình tách chiết các phytohormone từ dịch nuôi cấy vi khuẩn theo
phương pháp ly trích các chất điều hòa sinh trưởng thực vật........................51
Sơ đồ 3.3 – Quy trình ly trích DNA bộ gene vi khuẩn theo phương pháp CTAB ..............53

-xi-


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1 – Các cơ chế kích thích thực vật sinh trưởng của vi khuẩn cố định nitơ ở
vùng rễ ........................................................................................................................23
Bảng 2.2 – Các loài Azospirillum sp. đã được định danh (nguồn từ NCBI) ....................24
Bảng 2.3 – Độ tương đồng di truyền trình tự 16S rDNA của các loài
Azospirillum sp. ..........................................................................................................25
Bảng 2.4 – Sự phân bố của Azospirillum sp. ....................................................................27

Bảng 2.5 – Những đặc điểm sinh lý và sinh hóa chính của Azospirillum sp. ...................31
Bảng 2.6 – Các loài Bradyrhizobium sp. đã được định danh (nguồn từ NCBI)..............34
Bảng 2.7 – Một số gene nif quan trọng và vai trò của nó trong sự cố định nitơ.............37
Bảng 3.1 – Các loại môi trường dùng cho thí nghiệm......................................................39
Bảng 3.2 – Khảo sát sự tương quan giữa OD530nm và nồng độ IAA (mg/l).......................48
Bảng 3.3 – Định lượng auxin thô từ dịch nuôi cấy vi khuẩn ............................................49
Bảng 3.4 – Nồng độ BA để xây dựng đường chuẩn ..........................................................50
Bảng 3.5 – Các các cặp mồi dùng để khuếch đại trình tự 16S rDNA của vi khuẩn .........54
Bảng 3.6 – Nhiệt độ bắt cặp taoC tương ứng với từng cặp mồi .......................................55
Bảng 3.7 – Các cặp mồi dùng để khuếch đại gene nifH ...................................................57
Bảng 3.8 – Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hoá IDS14 GNR .......................62
Bảng 4.1 – Danh mục các chủng vi sinh vật phân lập được trên 2 môi trường chọn lọc
CRA và YEMA ............................................................................................................69
Bảng 4.2 – Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng vi sinh vật phân lập được trên
môi trường CRA và YEMA .........................................................................................70
Bảng 4.3 – Kết quả xác định Gram của 16 chủng vi khuẩn .............................................71
Bảng 4.4 – Kết quả khảo sát khả năng biến dưỡng các nguồn carbon của các chủng vi
khuẩn phân lập trên môi trường CRA ........................................................................72
Bảng 4.5 – Kết quả khảo sát khả năng biến dưỡng các nguồn carbon của các chủng vi
khuẩn trên môi trường YEMA ....................................................................................73
-xii-


Bảng 4.6 – Kết quả định tính NH4+ trong dịch vi khuẩn ..................................................74
Bảng 4.7 – Kết quả định tính Auxin bằng thuốc thử Salkowski........................................75
Bảng 4.8 – Kết quả định lượng auxin thô, cytokinin thô và gibberellin thô trong các dịch
khuẩn của 12 chủng vi khuẩn nghiên cứu ..................................................................77
Bảng 4.9 – Nồng độ và độ tinh sạch DNA bộ gene của 8 chủng nghiên cứu ...................80
Bảng 4.10 – Chú thích hình điện di 4.10 ..........................................................................83
Bảng 4.11 – Chú thích hình điện di 4.11 ..........................................................................84

Bảng 4.12 – Kết quả khảo sát nhiệt độ của 8 chủng nghiên cứu......................................90
Bảng 4.13 – Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên kit IDS 14GNR của 8 chủng nghiên cứu92
Bảng 4.14 - Bảng tổng kết các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 5 chủng nghiên cứu phân
lập trên môi trường CRA ............................................................................................93
Bảng 4.15 - Bảng tổng kết các đặc điểm sinh lý sinh hóa của 3 chủng nghiên cứu
phân lập trên môi trường YEMA ................................................................................94
Bảng 4.16 – Kết quả định lượng nitơ tồng số của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng
phương pháp Kjeldahl ................................................................................................95
Bảng 4.17 – Độ dài trình tự 16S rDNA của 8 chủng nghiên cứu sau khi giải trình tự ....96
Bảng 4.18 - Hệ số tương đồng di truyền của 8 chủng nghiên cứu với các chủng chuẩn
đã được công bố trên NCBI........................................................................................97
Bảng 4.19 – Độ tương đồng di truyền của các chủng 4415b, 4485, 4487 với những có
mối quan hệ gần nhất ...............................................................................................101

-xiii-


DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ
Biểu đồ

Trang

Biểu đồ 4.1 - Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của 8 chủng vi khuẩn........................90
Biểu đồ 4.2 – Lượng nitơ tổng số của 8 chủng vi khuẩn nghiên cứu ...............................95
Đồ thị

Trang

Đồ thị 4.1 – Đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ IAA và OD530nm .......................76
Đồ thị 4.2 – Đường tương quan tuyến tính giữa độ sai biệt trọng lượng tử diệp dưa chuột

∆m (g) và nồng độ BA (mg/l) ..........................................................................76
Đồ thị 4.3 – Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610nm và mật độ tế bào ..........86
Đồ thị 4.4 – Đường cong tăng trưởng của chủng 4415b..................................................87
Đồ thị 4.5 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4420c...................................................87
Đồ thị 4.6 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4453.....................................................87
Đồ thị 4.7 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4485.....................................................88
Đồ thị 4.8 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4487.....................................................88
Đồ thị 4.9 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4553.....................................................88
Đồ thị 4.10 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4560 ..................................................89
Đồ thị 4.11 - Đường cong tăng trưởng của chủng 4574 ..................................................89

-xiv-


1 Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1

Đặt vấn đề
Chịu sự tác động bởi tình trạng khắc nghiệt của thời tiết cũng như là hậu quả của

sự tăng dân số trên toàn cầu, thế giới đang đứng trước cuộc khủng hoảng lương thực trầm
trọng. Giá lương thực đang tăng nhanh, một châu Á giàu có hơn đang đòi hỏi nhiều lương
thực hơn, tuy nhiên vẫn không đủ lượng lương thực để đáp ứng [75]. Do đó, nhiều biện
pháp và nghiên cứu đã được đề ra nhằm gia tăng lượng lương thực, thực phẩm một cách
đáng kể cũng như gia tăng hàm lượng chất dinh dưỡng chính yếu như nguồn đạm, nguồn
đường một cách tối đa để phần nào giúp giải quyết được vấn đề trên.
Bên cạnh đó, cùng với sự phát triển của khoa học - công nghệ, nhiều giải pháp
được sử dụng nhằm cải thiện năng suất của cây trồng như sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón
hóa học, và gần đây nhất khi đối mặt với cuộc khủng hoảng lương thực, nhiều quốc gia

trước đây đã nghiêm cấm việc trồng thực vật biến đổi gene thì giờ đây đang xem xét việc
tiến hành trồng đại trà và phổ biến những cây trồng biến đổi gene. Những giải pháp trên
tuy đem lại hiệu quả nhanh chóng trước mắt trong việc cải thiện năng suất, gia tăng phẩm
chất cây trồng; tuy nhiên các biện pháp này còn rất nhiều hạn chế như gây ô nhiễm môi
trường, thoái hóa đất nông nghiệp, ảnh hưởng xấu đến sự đa dạng sinh học và tác động
tiêu cực đến sức khỏe con người và vật nuôi. Ngoài ra, do tình trạng ô nhiễm môi trường
hiện đang là vấn đề chung cấp bách của các quốc gia trên thế giới nên việc xây dựng một
nền nông nghiệp năng suất cao nhưng bền vững và thân thiện với môi trường đã trở thành
một xu hướng mới trên toàn cầu. Và việc nghiên cứu về sự tương tác có lợi giữa vi sinh
vật với cây trồng nhằm sử dụng chúng để gia tăng phẩm chất cây lương thực hứa hẹn
nhiều tiềm năng; trong đó vi khuẩn cố định nitơ là đối tượng điển hình. Bên cạnh khả
năng cố định nitơ để thực vật hấp thu giúp tăng hàm lượng đạm cho cây, một số vi khuẩn
cố định nitơ như Azospirillum, Herbaspirillum, Bradyrhizobium, Pseudomonas,
Gluconoacetobacter,… còn có khả năng phân tiết ra các chất kích thích tố thực vật –
-15-


phytohormon, sản xuất siderophore, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế
sự phát triển của mầm bệnh; qua đó, kích thích sinh trưởng thực vật. Trong đó, các loài
Azospirillum là những vi khuẩn cố định nitơ đầu tiên được phân lập từ rễ thực vật thân
thảo và nó có các đặc tính tốt nhất của các loài vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực
vật; cũng như Bradyrhizobium sp. là những loài vi khuẩn quang dưỡng ở rễ cây họ Đậu,
mang nhiều đặc tính ưu việt của chi vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh.
Trên thế giới, vi khuẩn cố định nitơ đã được nghiên cứu vào khoảng đầu thế kỷ 19,
mặc dù vậy, tiềm năng ứng dụng của chúng vẫn chưa được khám phá hết. Ở nước ta, việc
nghiên cứu vi khuẩn cố định nitơ đã phổ biến và hiện nay trên thị trường phân bón trong
nước đã có nhiều chế phẩm phân vi sinh cố định đạm ra đời. Tuy nhiên, việc nghiên cứu
vi khuẩn cố định nitơ ở nước ta chỉ tập trung vào những giống phổ biến, có khả năng cố
định nitơ mạnh như Rhizobium, Azotobacter mà ít nghiên cứu những giống khác ngoài
khả năng cố định nitơ còn có tác dụng kích thích sinh trưởng cây trồng. Ngoài ra, nguồn

đa dạng sinh học của nước ta khá phong phú nên việc tìm kiếm, nghiên cứu và sử dụng
những loài vi khuẩn cố định nitơ mới có những tiềm năng mới là rất cần thiết.
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Phân lập và định danh vi khuẩn cố định nitơ trên cây họ Đậu”

1.2

Mục tiêu
 Phân lập và tuyển chọn những vi khuẩn có khả năng cố định nitơ và có đặc tính
kích thích sinh trưởng thực vật thuộc chi Azospirillum và Bradyrhizobium.
 Định danh tìm kiếm loài mới để ứng dụng sản xuất phân vi sinh.

-16-


2 Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Vai trò của nitơ đối với thực vật
Nitơ là thành phần cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, enzyme, acid

nucleic, diệp lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần chất khô của thực vật dao
động từ 1 – 3%. Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò quan trọng bậc nhất
đối với đời sống thực vật. Nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng trong đời sống sinh
trưởng, phát triển và hình thành năng suất của cây trồng. Thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém,
chlorophylle không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm
hoạt động quang hợp nên năng suất giảm. Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng
đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất cây trồng. Cây sinh trưởng mạnh, thân

lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ lốp đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có khi không có
thu hoạch [63], [64].
2.2

Thực vật họ Đậu
Thực vật họ ĐậU, tên khoa học Leguminosae (Fabaceae) – là họ lớn thứ 2 của thực

vật có hoa với 650 chi và 18000 loài. Nhiều cây trong họ này làm lương thực cho con
người và gia súc như cây Đậu Hà-lan, Đậu cô-ve, Đậu tương… hoặc làm phân xanh như
cỏ ba lá, muồng. Ngoài ra một số cây trong họ này được dùng trong mục đích cải tạo đất
bị thoái hóa, phục hồi, cải tạo môi trường sinh thái như keo, bồ kết ba gai. Một số chi
trong họ này như Mimosa, Delonix, Acacia… là các loại cây cảnh. Đặc biệt, một số loài
còn có tính chất dược học hoặc diệt trừ sâu bọ.
Một đặc điểm nổi bật của các loài cây thuộc họ Đậu là chúng là các loại cây ký chủ
cho nhiều loài vi khuẩn cố định nitơ ở rễ của chúng [67].

-17-


Trong giới Thực vật, vị trí phân loại của các cây
họ Đậu như sau:
 Ngành: Magnoliophyta (hạt kín)
 Lớp: Magnoliopsida (2 lá mầm)
 Bộ: Fabales
 Họ: Fabaceae
Hình 2.1 – Hoa của một cây họ Đậu [81]
2.3

Quá trình cố định nitơ

2.3.1 Chu trình nitơ trong tự nhiên
Khí nitơ chiếm khoảng 80% trong bầu khí quyển. Tuy nhiên, hầu hết các sinh vật
sống đều không thể sử dụng được dạng nitơ này. Khí nitơ này có thể được các vi sinh vật
cố định nitơ biến đổi thành dạng ammonia (NH3) – dạng nitơ mà hầu hết thực vật trong tự
nhiên sử dụng để tạo ra amino acid, protein, nucleic acid và những thành phần khác chứa
nitơ cần thiết cho sự sống. Cũng như carbon, nitơ trong tự nhiên cũng có chu trình chuyển
hóa. Giữa chu trình nitơ và không khí có sự trao đổi thường xuyên: nitơ phân tử chuyển
thành dạng nitơ kết hợp do các quá trình cố định nitơ sinh học, do tác dụng của điện và cố
định quang học [65], [79], [69].
Chu trình nitơ trong tự nhiên có 2 giai đoạn là cố định nitơ và khoáng hóa nitơ.
Giai đoạn cố định nitơ do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ
cây họ Đậu hay Azotobacter sống tự do,… sẽ biến đổi N2 trong không khí thành NH3, từ
NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và đồng thời làm
giàu thêm nitơ cho đất. Ở giai đoạn khoáng hóa nitơ có sự tham gia của các chủng vi
khuẩn nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter để chuyển NH3 thành nitrat (NO3-) –
dạng thích hợp nhất để cho cây trồng hấp thu [79].

-18-


Hình 2.2 – Chu trình nitơ trong tự nhiên [70]
2.3.2 Quá trình cố định nitơ
Sự cố định nitơ là quá trình chuyển hóa nitơ từ không khí thành những hợp chất
của nitơ như NH3. Các hợp chất của nitơ sẽ được cung cấp cho thực vật bậc cao hay một
số ít động vật. [69]
Sự cố định nitơ sinh học là một quá trình sinh học mà trong đó nitơ ở dạng trơ
trong không khí được biến đổi thành dạng hữu dụng là NH3 bởi những vi sinh vật cố định
nitơ. Phản ứng cố định nitơ được xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau:
N2 + 8H+ + 8e− + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi [54]
Nitrogenase là một phức hệ enzyme được cấu tạo bởi 2 thành phần, đó là protein

có phân tử nhỏ. Một thành phần gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử
hay thành phần II. Thành phần kia gọi là protein sắt – molybden (Mo-Fe protein) còn gọi
là thành phần I. Thành phần I và thành phần II của nitrogenase đếu rất mẫn cảm với oxy,
vì vậy nên hoạt động cố định nitơ của vi sinh vật diễn ra trong điều kiện kỵ khí [9].

-19-


Sự cố định nitơ sinh học có thể xảy ra trên nhiều đối tượng trong tự nhiên như tảo
lam, địa y và vi sinh vật sống tự do trong đất. Tuy nhiên, sự cố định nitơ ở những sinh vật
này chỉ cung cấp một lượng đáng kể NH3 cho hệ sinh thái tự nhiên mà hầu hết không có ý
nghĩa nhiều đối với ngành nông nghiệp. Chúng cung cấp khoảng dưới 5kg nitơ/hecta một
năm. Trong khi đó, sự cố định nitơ ở cây họ Đậu cung cấp khoảng từ 28kg đến 84kg nitơ/
hecta một năm ở hệ sinh thái tự nhiên, và khoảng vài trăm kg trong ngành
nông nghiệp [43].
2.4

Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ

2.4.1 Phân loại
Vi khuẩn cố định nitơ được phân thành 3 nhóm nhỏ: vi khuẩn sống cộng sinh, vi
khuẩn sống tự do và vi khuẩn tương tác với thực vật ký chủ. Tuy nhiên, sự phân biệt giữa
3 nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn sống tự do và nhóm vi khuẩn cố định nitơ
tương tác với thực vật thì vẫn chưa được được mô tả một cách rõ ràng và một số vi khuẩn
được xếp vào nhiều nhóm [54].
2.4.2 Đặc điểm
- Vi khuẩn sống cộng sinh là những vi khuẩn sống tương tác với thực vật ký chủ
theo kiểu 2 bên cùng có lợi. Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi chất dinh
dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định cư, điển hình
là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ ĐậU. Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn

và thực vật được xem như là sự tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó, vi
khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh. Hầu hết những vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn
gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu; hay là những thành viên của xạ
khuẩn chi Frankia – là những vi khuẩn gram dương có khả năng hình thành nốt sần trên
cây thân gỗ, cây 2 lá mầm và cây bụi. Ban đầu, những vi khuẩn cộng sinh ở cây họ Đậu
được phân loại thành chi Rhizobium, do đó, những vi khuẩn này thường được nói đến như
là những vi khuẩn nốt rễ (rhizobia). Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở cây họ Đậu

-20-


được phân loại thành nhiều chi, trong đó, hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium,
Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium và Bradyrhizobium [54].
- Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do (không cộng sinh) là những vi khuẩn tương
tác thực vật cố định đạm nhưng không xâm nhập vào một loại cây chủ theo hướng cộng
sinh chuyên biệt. Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azotobacter,
Pseudomonas và Clostridium [54].
- Vi khuẩn cố định nitơ tương tác là những vi khuẩn tham gia vào quá trình trao
đổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc rễ của thực vật. Để
phân biệt được vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh hay tương tác với thực vật ký chủ thì chủ
yếu dựa vào mức độ tương tác. Sự cố định nitơ tương tác được hiểu là quá trình cố định
nitơ bởi những vi khuẩn sống tự do nhưng lại chịu sự ảnh hưởng trực tiếp của cây trồng.
Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tương tác, cả cây trồng và vi khuẩn cố định nitơ
đều có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự cộng tác bắt
buộc. Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa quá trình cố
định nitơ cộng sinh và tự do. Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm những vi khuẩn
sống tự do trong vùng lân cận của rễ cây thực vật đến những vi khuẩn sống nội sinh trong
mô tế bào thực vật. Để quá trình cố định nitơ tương tác có thể diễn ra cần những yêu cầu
sau đây: 1) thực vật ký chủ; 2) vi khuẩn cố định nitơ; 3) chất nền thực vật; 4) môi trường
thích hợp để enzym nitrogenase hoạt động; và 5) quá trình chuyển nitơ được cố định từ vi

khuẩn sang cây trồng. Một số chi vi khuẩn tham gia vào quá trình cố định nitơ tương tác
điển hình như: Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter,
Herbaspirillum, và Klebsiella.

-21-


Vi khuẩn cộng sinh cư trú ở vùng gian bào
(Endosymbionts)
Sự gia tăng
độ mật
thiết các
tương tác
của vi
khuẩn cố
định nitơ
với thực vật

Ví dụ: vi khuẩn cộng sinh tạo nốt sần trên rễ cây họ Đậu.
Vi khuẩn cư trú ở vùng ngoại bào (Ectosymbionts)
Ví dụ: tương tác giữa vi khuẩn lam và một số loài thực vật bậc
thấp.
Vi khuẩn bên trong mô cây chủ (Endophytes)
Ví dụ: Herbaspirillum sp. ở cây mía.
Vi khuẩn chỉ sống trên bề mặt cây
Ví dụ: Azospirillum và Klebsiella cư trú ở vùng rễ thực vật.

Hình 2.3 – Phổ tương tác cố định nitơ trên thực vật [54]
2.4.3 Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên
Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định

nitơ cung cấp đạm cho cây trồng. Tuy nhiên, bên cạnh đó các vi khuẩn cố định nitơ còn
được biết đến với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như:
- Kích thích sinh trưởng ở thực vật bằng cách tạo ra các enzyme như ACC
deaminase, hay tạo ra các phytohormone như auxin, cytokinin và gibberellin [20], [44],
[54].
- Giảm tác động có hại của các mầm bệnh bằng cách cạnh tranh về dinh
dưỡng, cạnh tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân
chống lại bệnh sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký chủ
[44], [54].

-22-


Bảng 2.1 – Các cơ chế kích thích thực vật sinh trưởng của vi khuẩn cố định nitơ ở
vùng rễ [44]
Cố định nitơ
Hút các ion
Sắt, kẽm và các nguyên tố vi lượng khác
Phosphate
Tạo ra hormone thực vật
Auxin, cytokinin, gibberellin, ethylene
Thay đổi sự phát triển của thực vật
ACC deaminase
Elicitors
2.5

Vi khuẩn chi Azospirillum

2.5.1 Lịch sử phát hiện
Vào năm 1922, Beijerinck – nhà vi sinh vật học và thực vật học người Hà Lan đã

phát hiện một chủng vi khuẩn giống với Spirillum trong môi trường thiếu khoáng nitơ có
nguồn carbon là lactate hay malate từ đất vườn. Ông nhận thấy rằng khi dùng môi trường
trên để nuôi cấy chủng vi khuẩn mới này thì có sự gia tăng hàm lượng nitơ, trong khi đó,
trong môi trường không có chủng này thì không có biểu hiện như vậy. Do chủng vi khuẩn
này dễ nuôi cấy trên môi trường muối khoáng với acid hữu cơ, cũng như có hình dạng
giống với Spirillum trong những điều kiện nhất định, Beijerinck đã xem chủng này là một
thành viên của chi Spirillum và là vi sinh vật trung gian kết nối giữa chi Spirillum và
Azotobacter. Ban đầu, ông đặt tên chủng mới này là “Azotobacter Spirillum”, nhưng sau
đó lại đổi tên thành “Spirillum lipoferum”. Năm 1932, Schroder đã tiến hành nghiên cứu
lại về S. lipoferum nhưng hầu hết thất bại khi chứng minh sự cố định nitơ bởi những
chủng vi khuẩn thuần, và vì thế chủng này đi vào quên lãng trong nhiều năm. Vào năm
1963, Becking đã phân lập được một vi sinh vật tương tự với S. lipoferum có khả năng cố
định nitơ rõ rệt. Mười năm sau đó, Favilli đã tiến hành định danh vi khuẩn cố định nitơ

-23-