KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
MỘT SỐ CHỦNG Bacillus subtilis

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ THANH NHÀN

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA
MỘT SỐ CHỦNG Bacillus subtilis

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. Trương Phước Thiên Hoàng

Ngô Thị Thanh Nhàn

ThS. Nguyễn Như Nhứt
Tháng 9/2008


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, ngoài sự nổ lực của bản thân là sự chỉ dẫn tận tình của
thầy cô, giúp đỡ của bạn bè và sự động viên từ gia đình.
Bằng lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn đến:
 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt
kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường.
 Cô Trương Phước Thiên Hoàng và thầy Nguyễn Như Nhứt đã tận tình hướng
dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong thời gian thực
hiện khóa luận.
 Các anh chị trong Chi nhánh Công ty Gia Tường đã giúp đỡ em rất nhiều trong
công việc cũng như trong quá trình làm quen với môi trường làm việc mới.
 Các bạn lớp CNSH 30 đã bên em, động viên, chia sẻ trong thời gian thực tập
cũng như trong suốt bốn năm học vừa qua.
 Cha me, cậu và anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ em học tập và
hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Sinh viên thực hiện
Ngô Thị Thanh Nhàn

iii

TÓM TẮT
Ngô Thị Thanh Nhàn, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh (Tp. HCM).
Đề tài nghiên cứu: “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng
Bacillus subtilis”.
GVHD: ThS. Trương Phước Thiên Hoàng
ThS. Nguyễn Như Nhứt
Nơi thực hiện: Phòng thí nghiệm Chi nhánh công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình
Dương.
Thời gian: từ 1/3 đến 1/8 năm 2008.
Đối tượng nghiên cứu: Bacillus subtilis.
Bacillus subtilis là đối tượng có khả năng sản xuất protease có hoạt tính cao được
sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi và y học. Nhằm nghiên
cứu ứng dụng protease từ Bacillus subtilis vào lĩnh vực chăn nuôi, chúng tôi đã tiến
hành khảo sát ảnh hưởng của yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp
protease của chủng Bacillus subtilis ở hai điều kiện: nuôi cấy lỏng và nuôi cấy bán rắn.
Kết quả thu được như sau:
- Nuôi cấy bán rắn có hoạt tính protease cao hơn nuôi cấy lỏng.
- Thành phần môi trường bán rắn tối ưu khi nuôi cấy chủng Bacillus subtilis ở
quy mô phòng thí nghiệm bao gồm: cám bắp – bã đậu nành (tỷ lệ 8 : 2) với
thời gian nuôi cấy tối ưu là 66 giờ.
- Canh trường thu nhận được từ nuôi cấy bán rắn, sau khi sấy khô, xay nhuyễn,
được xác định sự hiện diện một số enzyme khác và hàm lượng các loại
nitrogen. Kết quả cho thấy trong canh trường có chứa α – amylase (37.472,399
UI/g), phytase (885,539 UI/g), xylanase (165,61 UI/g), nitrogen formol (0,854
%), nitrogen tổng số (3,644 %) và nitrogen NH3 (0,616 %).

iv

SUMMARY
Ngo Thi Thanh Nhan, Nong Lam University of Ho Chi Minh city.
Graduating thesis “Surveying the ability of biosynthesizing protease of some
Bacillus subtilis strains” was carried out from March to August, 2008, at the
Laboratory of the branch of limited liability Gia Tương company, Binh Dương
province.
Bacillus subtilis is able to produce high activity protease which is used widerly in
food industry, livestock and medicine. We studied on application of Bacillus subtilis in
field livestock by surveying the influences of environmental factors, cultural
conditions, the ability of producing protease of Bacillus subtilis strains in 2 culture
conditions: broth culture and semi - solid culture.
The results obtained shows that:
- Bacillus subtilis cultured in semi - solid culture produces protease which has
higher activity than in broth culture.
- Components of optimal semi - solid culture in culturing Bacillus subtilis strain
contain: bran of maize, residue of soya (rate 8:2), with the optimal culturing
time is 66 hours.
- Semi - solid culture after dried, grinded, was identified the presence of some
others enzyme, such as:  - amylase (34.472,399 UI/g); phytase (855,539
UI/g); xylanase (165,61 UI/g), and confirmed nitrogen contents, such as :
nitrogen formol (0,854 %); total number of nitrogen (3,644 %) and nitrogen
NH3 (0,616 %).

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................iii
TÓM TẮT.......................................................................................................................iv
SUMMARY..................................................................................................................... v

MỤC LỤC ......................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ x
DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG ...............................................................................xi
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ ......................................................................xii
Chương 1: MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích ................................................................................................................... 1
1.3. Yêu cầu ..................................................................................................................... 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
2.1 Sơ lược về Bacillus subtilis ....................................................................................... 3
2.1.1. Lịch sử phát triển................................................................................................... 3
2.1.2. Phân loại Bacillus subtilis ..................................................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis .............................................................................. 3
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái.............................................................................................. 3
2.1.3.2. Đặc điểm nuôi cấy .............................................................................................. 4
2.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa .............................................................................................. 5
2.1.3.4. Đặc điểm về sinh thái học tế bào và phân bố trong tự nhiên ............................. 6
2.1.4. Tác hại của Bacillus subtilis .................................................................................. 6
2.1.5. Ứng dụng của Bacillus subtilis.............................................................................. 7
2.2. Sơ lược về protease................................................................................................... 7
2.2.1. Lịch sử phát triển................................................................................................... 8
2.2.2. Nguồn thu nhận protease ....................................................................................... 9
2.2.2.1. Từ nguồn thực vật và động vật........................................................................... 9
2.2.2.2. Từ vi sinh vật...................................................................................................... 9
2.2.3. Phân loại protease.................................................................................................. 9
2.2.3.1. Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm .................................... 9

vi

2.2.3.2. Dựa vào tính đặc hiệu với sự phân cắt liên kết peptide.................................... 10
2.2.3.3. Dựa vào pH hoạt động...................................................................................... 10
2.2.3.4. Dựa vào nguồn thu nhận enzyme ..................................................................... 10
2.2.3.5. Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme .................... 10
2.2.4. Cơ chế tác dụng ................................................................................................... 10
2.2.5. Protease của vi khuẩn .......................................................................................... 11
2.2.5.1. Chức năng sinh học của protease vi khuẩn ...................................................... 11
2.2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi khuẩn ...... 12
2.2.6. Ứng dụng protease vi sinh vật ............................................................................ 14
2.2.6.1. Trong công nghiệp dệt...................................................................................... 14
2.2.6.2. Trong công nghiệp thuộc da ............................................................................. 14
2.2.6.3. Trong chế biến các loại bột giặt ....................................................................... 15
2.2.6.4. Trong kỹ nghệ phim ảnh................................................................................... 15
2.2.6.5. Trong y học....................................................................................................... 15
2.2.6.6. Ứng dụng khác.................................................................................................. 15
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................................ 16
2.3.1. Nghiên cứu trong nước........................................................................................ 16
2.3.2. Nghiên cứu ngoài nước ....................................................................................... 16
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................... 17
3.1. Vật liệu ................................................................................................................... 17
3.1.1. Giống vi sinh vật.................................................................................................. 17
3.1.2. Nguyên liệu nuôi cấy: bã đậu nành, bột cá, cám gạo, cám bắp, bột trùn quế. .... 17
3.1.3. Các loại môi trường dùng trong thực nghiệm ..................................................... 17
3.1.3.1. Môi trường cấy chuyền giữ giống Bacillus subtilis (MT1).............................. 17
3.1.3.2. Môi trường tăng sinh Bacillus subtilis (MT2).................................................. 18
3.1.3.3. Môi trường đếm khuẩn lạc cao thịt pepton (MT3)........................................... 18
3.1.3.4. Môi trường nuôi cấy bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) ........................... 18
3.1.3.5. Môi trường nuôi cấy lỏng sinh tổng hợp protease (MT5)................................ 18
3.1.4. Dụng cụ và thíết bị .............................................................................................. 19
3.1.4.1. Dụng cụ............................................................................................................. 19

3.1.4.2. Thiết bị.............................................................................................................. 19
3.2. Phương pháp thực hiện ........................................................................................... 19
3.2.1. Phương pháp Anson để xác định hoạt tính enzyme protease
vii


3.2.1.1. Nguyên tắc........................................................................................................ 19
3.2.1.2. Hóa chất............................................................................................................ 19
3.2.1.3. Cách thực hiện .................................................................................................. 20
3.2.2. Phương pháp trọng tài xác định độ ẩm................................................................ 21
3.2.3. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật ............................................................ 21
3.2.4. Phương pháp tăng sinh ........................................................................................ 21
3.2.5. Phương pháp xác định mật độ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc...................... 22
3.2.6. Phương pháp nuôi cấy lỏng sinh tổng hợp protease............................................ 22
3.2.7. Phương pháp thu nhận dịch chiết protease từ nuôi cấy lỏng............................... 22
3.2.8. Phương pháp chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao nhất
bằng nuôi cấy lỏng......................................................................................................... 22
3.2.9. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp
protease bằng phương pháp nuôi cấy lỏng ................................................................... 22
3.2.9.1. Khảo sát ảnh hưởng các nguồn carbon............................................................. 22
3.2.9.2. Khảo sát ảnh hưởng khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau ................... 22
3.2.9.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuối cấy ..................................................... 23
3.2.10. Phương pháp nuôi cấy bán rắn sinh tổng hợp protease ..................................... 23
3.2.11. Phương pháp thu nhận dịch chiết protease từ nuôi cấy bán rắn ........................ 23
3.2.12. Phương pháp chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao nhất
bằng nuôi cấy bán rắn.................................................................................................... 23
3.2.13. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp
protease bằng phương nuôi cấy bán rắn ........................................................................ 23
3.2.13.1. Khảo sát ảnh hưởng nguồn cơ chất ................................................................ 23
3.2.13.2. Khảo sát ảnh hưởng khi thay đổi tỷ lệ cơ chất ............................................... 24

3.2.13.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................................................... 24
3.2.14. Phương pháp khảo sát các enzyme khác trong chế phẩm thu được .................. 24
3.2.14.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase thông qua xác định hàm
lượng đường khử theo Miller ........................................................................................ 25
3.2.14.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme xylanase thông qua xác định hàm
lượng đường khử theo Miller ........................................................................................ 25
3.2.14.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase theo Fiske và Subbarow... 25
3.2.14.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme pectinase thông qua xác định hàm
lượng đường khử theo Miller ........................................................................................ 26
viii


3.2.15. Phương pháp xác định các loại nitrogen trong chế phẩm thu được .................. 26
3.2.15.1. Phương pháp Kjeldahl xác định nitrogen tổng số .......................................... 26
3.2.15.2. Phương pháp Sorensen xác định nitrogen formol .......................................... 26
3.2.15.3. Phương pháp xác định nitrogen NH3 .............................................................. 27
3.2.15.4. Xác định nitrogen amin .................................................................................. 27
3.2.16. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng điều kiện bảo quản chế phẩm enzyme thô thu
được ............................................................................................................................... 27
3.2.17. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................. 27
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.................................................................... 28
4.1. Khảo sát khả năng tổng hợp protease của 9 chủng Bacillus subtilis trên môi trường
nuôi cấy lỏng ................................................................................................................. 28
4.2. Khảo sát khả năng tổng hợp protease khi thay đổi các nguồn carbon ................... 29
4.3. Khảo sát khả năng tổng hợp protease của chủng Ba 61 khi phối hợp các nguồn
nitrogen khác nhau......................................................................................................... 31
4.4. Khảo sát khả năng tổng hợp protease theo thời gian nuôi cấy ............................... 32
4.5. Khảo sát khả năng tổng hợp protease của 9 chủng Bacillus subtilis trên môi trường
nuôi cấy bán rắn............................................................................................................. 34
4.6. Khảo sát và chọn thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn ................................... 36

4.7. Khảo sát và chọn tỷ lệ thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn ........................... 37
4.8. Khảo sát và chọn thời gian nuôi cấy tối ưu ............................................................ 39
4.9. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản ................................................................ 41
4.10. Khảo sát sự hiện diện các enzyme khác (ngoài protease) có trong canh trường
sau khi nuôi cấy chủng Ba 01........................................................................................ 42
4.11. Khảo sát các nguồn nitrogen có trong chế phẩm.................................................. 43
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 44
5.1. Kết luận................................................................................................................... 44
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 46
PHỤ LỤC

ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TSB

Trypticase Soy Broth

MR

Methyl Red

VP

Voges – Proskauer

DAP

Diammonium Phosphate

TCA

Trichloroacetic Acid

DNS

Dinitrosalicylic Acid

NTS

Nitrogen tổng số

NF

Nitrogen Formol

NNH3

Nitrogen NH3

NNH2

Nitrogen amin

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG

HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Hình dạng của Bacillus subtilis ...................................................................... 4
Hình 2.2. Cơ chế thủy phân của enzyme protease .......................................................... 8

BẢNG
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis.............................................. 5
Bảng 3.1. Các chủng Bacillus subtilis dùng trong nghiên cứu...................................... 17
Bảng 3.2. Các bước tiến hành dựng đường chuẩn tyrosine........................................... 20
Bảng 3.3. Các bước tiến hành xác định hoạt tính protease ........................................... 20
Bảng 3.4. Các tỷ lệ cơ chất dùng để khảo sát............................................................... 24
Bảng 4.1. Kết quả hoạt độ protease của 9 chủng Bacillus subtilis................................ 28
Bảng 4.2. Hoạt độ protease của chủng Ba 61 khi thay đổi các nguồn carbon trong môi
trường nuôi cấy lỏng...................................................................................................... 30
Bảng 4.3. Hoạt độ protease của chủng Ba 61 khi phối hợp các nguồn nitrogen khác
nhau trong môi trường nuôi cấy .................................................................................... 31
Bảng 4.4. Hoạt độ protease của chủng Ba 61 khi theo thời gian nuôi cấy.................... 32
Bảng 4.5. Hoạt độ protease của 9 chủng Bacillus subtilis trong canh trường nuôi cấy
bán rắn ........................................................................................................................... 34
Bảng 4.6. Hoạt độ enzyme protease khi nuôi cấy chủng Ba 01 trên môi trường có các
nguồn cơ chất khác nhau ............................................................................................... 36
Bảng 4.7. Hoạt độ enzyme protease khi thay đổi tỷ lệ cám bắp và bã đậu nành trong
môi trường nuôi cấy....................................................................................................... 37
Bảng 4.8. Sự biến thiên hoạt độ protease theo thời gian nuôi cấy ............................... 39
Bảng 4.9. Sự thay đổi hoạt độ protease (UI/g) theo thời gian và nhiệt độ bảo quản .... 41
Bảng 4.10. Hoạt độ của một số loại enzyme khác có trong chế phẩm.......................... 42
Bảng 4.11. Hàm lượng các loại nitrogen trong chế phẩm enzyme ............................... 43

xi


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ
BIỂU ĐỒ

TRANG

Biểu đồ 4.1. Hoạt độ protease của 9 chủng Bacillus subtilis khi nuôi cấy lỏng .......... 29
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh tổng hợp protease của
chủng Ba 61 ................................................................................................................... 30
Biểu đồ 4.3. Hoạt độ protease khi phối hợp các nguồn nitrogen khác nhau với pepton
trong môi trường nuôi cấy ............................................................................................. 32
Biểu đồ 4.4. So sánh hoạt độ protease của 9 chủng Bacillus subtilis............................ 35
Biểu đồ 4.5. Sự thay đổi hoạt độ protease khi nuôi cấy chủng Ba 01 trên môi trường có
các nguồn cơ chất khác nhau ......................................................................................... 37
ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Sự biến thiên hoạt độ protease của chủng Ba 61 theo thời gian nuôi cấy... 34
Đồ thị 4.2. Hoạt độ protease ở các tỷ lệ bã đậu nành – cám bắp khác nhau ................. 38
Đồ thị 4.3. Sự biến thiên hoạt độ protease theo thời gian nuôi cấy............................... 40
Đồ thị 4.3. Sự thay đổi hoạt độ protease (UI/g) theo thời gian và nhiệt độ bảo quản... 42

xii


1

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Từ những năm đầu của thế kỷ 19, việc thử nghiệm bổ sung những chế phẩm vi
sinh, những sản phẩm có chứa enzyme protease vào thức ăn gia súc để hỗ trợ tiêu hóa
cho vật nuôi đã mang lại kết quả rất thành công: trong phòng chống các bệnh về đường
ruột, thúc đẩy sự tăng trọng ở gia súc và giảm chi phí về thức ăn.
Ngày nay, protease đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp trên khắp thế giới và
ứng dụng ngày càng rộng rãi. Riêng ở Việt Nam với chăn nuôi là ngành nghề quan
trọng trong nền kinh tế, việc sử dụng sản phẩm chứa enzyme này góp phần mang lại
lợi nhuận kinh tế cho người chăn nuôi. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu ứng dụng
protease trong lĩnh vực này chưa đầy đủ và vẫn cần được tiếp tục nghiên cứu. Đây là
lĩnh vực mới mẻ nhưng có rất nhiều triển vọng ở nước ta.
Enzyme protease có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật,
động vật hay vi sinh vật. Vi sinh vật chính là đối tượng có thể sản xuất enzyme nói
chung và protease nói riêng với số lượng nhiều và giá thành rẻ. Những kết quả đạt
được trong lĩnh vực nghiên cứu về protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô
sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme này trong đời sống. Trong đó, nguồn protease
từ vi sinh vật nhất là từ vi khuẩn Bacillus subtilis là hướng nghiên cứu có nhiều triển
vọng vì Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease có hoạt tính cao và ưu thế hơn
hẳn.
Tuy nhiên, việc sản xuất protease từ vi sinh vật còn nhiều hạn chế do điều kiện
như: môi trường, giống, nhiệt độ, thành phần môi trường… Trên cơ sở đó, chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số
chủng Bacillus subtilis”.
1.2. Mục đích
Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp
protease của các chủng Bacillus subtilis nhằm thu được chế phẩm enzyme protease có
hoạt tính cao.


2

1.3. Yêu cầu
 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của một số chủng
Bacillus subtilis để chọn chủng có khả năng tổng hợp cao nhất ở điều
kiện nuôi cấy lỏng và nuôi cấy bán rắn.
 Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện ảnh hưởng lên sự tổng hợp
protease và thu nhận canh trường có hoạt tính cao, từ đó so sánh kết
quả để tìm ra hướng nuôi cấy cho sản phẩm protease có hoạt tính cao.
 Xác định một số chỉ tiêu và thành phần của sản phẩm thu được.


3

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về Bacillus subtilis (Âu Thị Bích Phượng, 2006; Bùi Thị Phi, 2007)
2.1.1. Lịch sử phát triển
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y
học Nazi của Đức. Lúc đầu, Bacillus subtilis chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lỵ
cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ
đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm
đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên
rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm.
2.1.2. Phân loại Bacillus subtilis
Giới:

Bacteria

Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Bacillales

Họ:

Bacillaceae

Giống:

Bacillus

Loài:

Bacillus subtilis

2.1.3. Đặc điểm của Bacillus subtilis
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, gram dương (G + ), dạng
hình que, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, vi
khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử. Bào tử Bacillus subilis có dạng elip đến hình
cầu, kích thước chiều rộng 0,6 – 0,9 μm, chiều dài 1,0 – 1,5 μm, nằm giữa hay trong
khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào, phần lớn được tạo thành ở 48 giờ. Mỗi cá thể
chỉ tạo một bào tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút

ẩm.


4

Hình 2.1. Hình dạng của Bacillus subtilis
( />Bacillus subtilis khi nhuộm sơ thấy được nguyên sinh chất của những tế bào non.
Bacillus subtilis không có không bào khi nuôi cấy trên môi trường thạch có glucose,
chúng chủ yếu gồm các loài sống hiếu khí.
2.1.3.2. Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu thường ở 37 0C.
Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển
trong môi trường thiếu oxy.
Độ pH: Bacillus subtilis được nuôi cấy thích hợp nhất ở pH = 7,0 - 7,4.
Khi cấy Bacillus subtilis sâu dưới mặt thạch gelatin thường hóa lỏng gelatin thành
dạng chén hay phân tầng.
Khi cấy ria trên môi trường mặt thạch đĩa, khuẩn lạc trên mặt thạch có dạng gồ
ghề, sần sùi, đục và trải rộng.
Khi cấy trên thạch nghiêng có glucose, khuẩn lạc mịn, phát triển đều hơn trên môi
trường thạch không có glucose, đôi khi có màu hồng nhạt hay màu nâu.
Trong môi trường thạch nghiêng có bột đậu nành, khuẩn Bacillus subtilis lạc mọc
tốt, đều, mịn và mật độ nhiều hơn trong môi trường không có bột đậu nành.
Trong môi trường lỏng có NaCl, Bacillus subtilis phát triển ở nồng độ từ 10 -12 %
NaCl , một vài trường hợp phát triển tốt ở môi trường có nồng độ 17 % NaCl.


5
Khi nuôi cấy Bacillus subtilis trong môi trường có sữa, xảy ra hiện tượng pepton
hóa một cách chậm chạp.
Trong môi trường có khoai tây, khuẩn lạc Bacillus subtilis mọc khá phong phú,

uốn nép hay gấp thô, trải rộng, màu vàng hoặc hồng nâu.
Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): Bacillus subtilis phát triển làm
đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan
đều.
Trong môi trường lỏng sinh khối của Bacillus subtilis tạo màng mỏng có lớp bao
phủ. Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhưng không tạo khí
(sử dụng nguồn nitrogen là muối ammonium).
Bacillus subtilis có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong điều
kiện kỵ khí, Bacillus subtilis không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate.
2.1.3.3. Đặc điểm sinh hóa
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis
Phản ứng sinh hóa

Kết quả

Hoạt tính catalase

+

Sinh Indol

–

MR (Methyl Red )

+

VP (Voges-Proskauer)

+

Sử dụng citrate

+

Khử nitrate

+

Tan chảy gelatin

+

Phân giải tinh bột

+

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose

+

Manitol

+

Glucose

+

Lactose

–


6
2.1.3.4. Đặc điểm về sinh thái học tế bào và phân bố trong tự nhiên
Dựa vào sự đa dạng trong trao đổi chất của loài Bacillus mà chúng có thể tạo ra
những quần thể ở nhiều sinh cảnh khác nhau, từ môi trường đất, trên côn trùng và trên
cơ thể con người, chẳng hạn như Bacillus thuringiensis. Mặc dù những loài Bacillus
được nghiên cứu nhiều nhất là những trực khuẩn gây bệnh nhưng hầu hết chúng đều là
những vi khuẩn hoại sinh. Những loài khác như Bacillus subtilis ký sinh trên rễ, nằm
giữa rễ và vùng đất xung quanh.
Người ta đã chứng minh được rằng các loài Bacillus có tập tính ăn thịt lẫn nhau,
chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp
có đời sống giới hạn. Một cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh, sinh tổng hợp kháng
sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả những vi khuẩn khác loài và cùng loài, để
thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót để chờ đến khi môi trường
thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng
thường tạo bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng.
Vi khuẩn Bacillus subtilis phân bố phổ biến trong tự nhiên, thông thường đất trồng
trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu tế bào/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng
đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở

nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis.
Chúng có nhiều trong rơm cỏ nên được gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”. Chúng còn
phân bố rộng rãi trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt
này. Trong bột mì, Bacillus subtilis chiếm khoảng 75-79 % vi khuẩn tạo bào tử.
Người ta nhận thấy rằng nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis có mặt khắp nơi trên
nguyên vật liệu dùng để sản xuất như: bột mì, bột gạo, muối bột, tới các thực phẩm
truyền thống như: mắm, tương, mẻ (cơm lên men chua), chao…
2.1.4. Tác hại của Bacillus subtilis
Do có bào tử chịu nhiệt, Bacillus subtilis có thể gây hỏng một số thực phẩm hộp,
làm đồ hộp có mùi thối chua rất khó chịu. Chúng là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm
sữa, bánh ngọt, chocolate, kẹo có nhân, nhất là các sản phẩm nói trên được bảo quản ở
nơi có khí hậu như Việt Nam. Chúng gây bệnh chảy nhớt khoai tây và “chảy nhớt bánh
mì” được Laurent phát hiện đầu tiên vào năm 1885 nên từ đó chúng có tên là trực
khuẩn khoai tây.
Bacillus subtilis không sinh khí hoặc có thể sinh khí trong môi trường có đường.


7
2.1.5. Ứng dụng của Bacillus subtilis
Nhiều loài vi khuẩn Bacillus subtilis đã được xác định là có khả năng chế ngự
mầm bào tử của nấm bệnh. Hiện nay các nhà nghiên cứu đang tiến hành các thí
nghiệm để nâng cao hiệu quả thực địa của những dòng vi khuẩn chọn lọc. Đây là một
trong những vi sinh vật có khả năng tổng hợp lysine khá cao từ tinh bột nên được ứng
dụng để sản xuất lysine.
Ở Nhật, người ta dùng Bacillus subtilis để nuôi cấy đậu nành tạo sản phẩm gọi là
Natto, một món ăn luôn có mặt trong bữa ăn truyền thống của người Nhật vì những
công dụng chống mệt mỏi, tim mạch.
Trong y tế, Bacillus subtilis được đóng thành ống 10 ml hoặc là gói dạng bột trị
bệnh tiêu chảy cho người do Coliform gây ra hoặc dùng để đắp vết thương ngoài da.
Bacillus subtilis là vi sinh vật sản xuất ra amylase, xúc tác cho phản ứng thủy phân

các liên kết α - 1,4 glucosid của các polysaccharid như tinh bột, glycogen.
Bacillus subtilis còn được bổ sung vào thức ăn gia súc, dùng làm thành phần của
các chế phẩm sinh học chứa các enzyme tiêu hóa giúp cho tiêu hóa tốt các tinh bột và
điều trị tiêu chảy.
Người ta còn dùng Bacillus subtilis để sản xuất kháng sinh thực vật và ứng dụng
trong nông nghiệp, sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây, làm tăng tổng hợp các
peptide kháng khuẩn của vi khuẩn nốt rễ, được ứng dụng trong kiểm soát sinh học.
Người ta cũng nhận thấy rằng Bacillus subtilis giúp tăng năng suất mùa vụ mặc dù
chưa hiểu nguyên nhân là chúng ức chế mầm bệnh hay chúng giúp cây trồng phát
triển.
Bacillus subtilis có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình
sống như: amylase, protease, phytase…Do đó người ta còn dùng Bacillus subtilis để
sản xuất ra các loại enzyme này.
2.2. Sơ lược về protease
Trong những năm gần đây, ngành công nghệ sinh học phát triển ngày càng mạnh
mẽ và mang lại kinh tế cao. Một trong những lĩnh vực được quan tâm nhiều nhất của
công nghệ sinh học là công nghệ sản xuất ra các chế phẩm enzyme trong đó có enzyme
protease. Enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)
trong phân tử protein và các polypeptid.


8
Endopeptidase

NH2 – CH – CO – NHCH ….NHCHCO – NHCHCO – NHCHCO – NHCHCOOH
R1

R2

R3

R4

Amino peptidase

R5

R6

Carboxy peptidase
Exopeptidase

Hình 2.2. Cơ chế thủy phân của enzyme protease (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.2.1. Lịch sử phát triển (Âu Thị Bích Phượng, 2006)
Enzyme protease đầu tiên được nghiên cứu không phải protease của vi sinh vật
mà là các protease của động vật (chủ yếu là protease trong hệ tiêu hóa của động vật).
Năm 1836, Schwann đã quan sát khả năng của phân giải protein của dịch vị. Sau
30 năm, Corvisart mới tách được enzyme này, đây được coi như protease ở dạng chế
phẩm đầu tiên trên thế giới về enzyme.
Các loại protease của thực vật được nghiên cứu chậm hơn protein động vật. Đến
năm 1874, Besaner mới công bố kết quả nghiên cứu protease từ đậu.
Năm 1879, Wurtz nghiên cứu nhựa quả đu đủ và cho thấy chúng có khả năng phân
giải protein. Sau đó, hàng loạt những nghiên cứu của Wilstaller, Gnassmann, Ambnos
(1926) đã được công bố về bromelin, protease ở động vật.
Vào những năm 1918 – 1919, Wakman đã phát hiện khả năng phân giải protein
của xạ khuẩn. Đến những năm 1950, sau khi hoàn thiện những phương pháp tinh sạch
protein, người ta đã thu nhận được những chế phẩm protease tinh khiết hơn. Cũng từ
đây, các nhà khoa học bắt đầu những nghiên cứu protease từ vi sinh vật. Từ đó đến nay
đã có rất nhiều nghiên cứu được công bố theo chiều hướng này.

9
2.2.2. Nguồn thu nhận protease (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.2.2.1. Từ nguồn thực vật và động vật
a. Pancreatin
Các enzyme này được thu nhận từ tuyến tụy của động vật, bao gồm cả peptidase,
amylsae, lipase. Chúng hoạt động mạnh ở pH = 6 – 8, nhiệt độ 40 – 45 0C.
b. Pepsin
Pepsin được thu nhận từ bao tử heo. Chúng được phối hợp với rennin để sản xuất
phomai. Chúng hoạt động mạnh ở pH 2 - 4, nhiệt độ 50 0C.
c. Rennin
Rennin được thu nhận từ bao tử của cừu, dê, heo. Chúng là loại enzyme rất đặc
biệt, được ứng dụng nhiều trong sản xuất phômai.
d. Papain
Papain là loại enzyme của thực vật. Papain đuợc khai thác từ quả đu đủ (Carica
papaya). Trong thành phần quả đu đủ, hai thành phần protease chiếm khối lượng lớn là
papain và chymopapain. Papain có pH hoạt động tối ưu là 7,5 và nhiệt độ hoạt động là
50 – 60 0C.
e. Bromelin
Bromelin là một loại protease được khai thác từ cây dứa (Ananas cocosus ). Chúng
có nhiều ở đọt dứa phần chồi trên quả. Tính chất của bromelin gần giống papain nhưng
khác là chúng kém bền hơn papain.
f. Ficin
Loại enzyme này được tìm thấy ở quả của cây sung (Ficus glomerata) . Chúng có
tính chất giống papain về mọi phương diện.
2.2.2.2. Từ vi sinh vật
Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều protease như: Bacillus subtilis,
Bacillus cereus, Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus, Aspergillus oryzae,
Aspergillus niger…
2.2.3. Phân loại protease (Âu Thị Bích Phượng, 2006; Nguyễn Tiến Thắng, 2004)

2.2.3.1. Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm
a. Protease nội bào.
b. Protease ngoại bào.


10
2.2.3.2. Dựa vào tính đặc hiệu với sự phân cắt liên kết peptide
a. Endopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở giữa mạch.
b. Exopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch.
2.2.3.3. Dựa vào pH hoạt động
a. Protease acid.
b. Protease kiềm.
c. Protease trung tính.
2.2.3.4. Dựa vào nguồn thu nhận enzyme
a. Protease động vật.
b. Protease thực vật.
c. Protease vi sinh vật.
2.2.3.5. Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme
a. Protease có serin: trypsin, chymotrypsin, substilopeptidase, milk alkaline
protease (MAP)…
b. Protease có nhóm SH: papain, bromelin…
c. Protease có nhóm α –cacboxi: pepsin, renin…
d. Protease có kim loại: carboxylpeptidase A, collagenase.
2.2.4. Cơ chế tác dụng (Âu Thị Bích Phượng, 2006)
Trong trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật, ngoài gốc amino acid đặc
trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác tham gia. Ví dụ, histidine
thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các protease có serine và protease có
nhóm SH; tyrosine là trung tâm hoạt động của các protease có kim loại. Mặc dù trung
tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều
xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:

E + S  E – S  E – S * + P1  E + P2
Trong đó:
E: enzyme
S: cơ chất
E – S: phức chất enzyme – cơ chất
E – S*: phức chất trung gian enzyme – cơ chất hóa
(axilenzyme)


11
P1: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amin tự do
mới được tạo thành)
P2: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự
do mới được tạo thành).
2.2.5. Protease của vi khuẩn (Âu Thị Bích Phượng, 2006)
2.2.5.1. Chức năng sinh học của protease vi khuẩn
Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có thể có
những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật.
a. Protease ngoại bào
Tác dụng là phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung
dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ. Đây là chức năng rõ
ràng nhất của protease ngoại bào. Quá trình tiết protease ngoại bào cũng như quá trình
tổng hợp chúng ở nhiều vi khuẩn bị giảm khi trong môi trường có chứa một lượng lớn
amino acid. Tuy nhiên ảnh hưởng của các dạng đạm đến quá trình sinh tổng hợp
protease đôi khi cũng phức tạp, không phải luôn phù hợp với những điều kiện đã nói
trên.
b. Protease nội bào
Thường là peptidase và một số protease, các enzyme này có thể ở dạng tự do trong
tế bào chất hoặc liên kết với ribosome, mặt trong của màng tế bào chất và chỉ tìm thấy
ở môi trường xung quanh sau khi tế bào bị phá vỡ. Cho đến nay các protease nội bào

còn đang được nghiên cứu và cũng chưa được biết rõ hết vai trò của chúng trong tế
bào.
Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn
protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau:
 Phân giải các peptid được đưa từ môi trường ngoài vào thành các
amino acid để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm
nguồn C, N, S giúp cho vi sinh vật thích nghi với điều kiện thay đổi
của môi trường. Sự phân giải các peptid phân tử bé còn có vai trò
quan trọng ở chỗ loại trừ tác dụng độc hại của nó đối với tế bào vì
một số peptid phân tử bé có thể là kháng nguyên gây kìm hãm sự
sinh trưởng của vi sinh vật.


12
 Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme,
điều này có thể có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào
tử vi sinh vật.
Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptid đã
được tổng hợp (Waller, 1963; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có
tác dụng phân hủy các protein vô dụng, tổng hợp sai do đột biến hoặc cũng có thể tham
gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).
2.2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi khuẩn
(Âu Thị Bích Phượng, 2006; Bùi Thị Phi, 2007)
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật
chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông thoáng,
thành phần môi trường...
a. Ảnh hưởng của yếu tố môi trường
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi
sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt

độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme
không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích
hợp.
Ảnh hưởng của pH môi trường
Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình
tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong
quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại, trong phương pháp bề sâu, pH môi
trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tích lũy protease trong môi trường của vi sinh vật.
Điều này thể hiện khá rõ ở các loài thuộc giống Bacillus. pH môi trường thường có thể
thay đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật. pH ban đầu
thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn là từ 6,2 đến 7,4.
Trong quá trình nuôi cấy tùy theo thành phần môi trường và các sản phẩm trong
quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật, pH của môi trường chuyển dần về phía acid hoặc
kiềm.


13
Đối với các loài thuộc giống Bacillus, có thể căn cứ vào pH của môi trường sau
khi nuôi cấy để dự đoán lượng protease được tích lũy trong môi trường. Do đó, nếu giữ
pH luôn có giá trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, vi sinh vật sẽ tạo một luợng
protease xác định, chiếm ưu thế trong môi trường.
Ảnh hưởng của độ thông khí
Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp
protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo giống vi sinh vật. Trong
một số trường hợp:
 Thiếu oxy, tuy có kiềm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại
làm tăng quá trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm
sự tổng hợp protease.
 Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh
vật có khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự, 1976).

b. Ảnh hưởng thành phần môi trường
Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme.
Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích
hợp, chọn tỷ lệ thích hợp của các thành phần này và đặc biệt cần sử dụng chất cảm
ứng.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Nguồn cacbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các glucid: mono-, di- và cả
polysaccharide (tinh bột), đặc tính tác dụng của nguồn cacbon phụ thuộc vào bản chất
hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn cacbon tự nhiên thường
dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của
chúng.
Ở vi khuẩn Bacillus subtilis, quá trình tổng hợp protease xảy ra khá mạnh khi
nguồn carbon là tinh bột với nồng độ khoảng 8 %. Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống
còn 2 % thì sẽ làm giảm một ít hoạt độ quá trình phân giải protein của dịch môi trường
nuôi cấy.
Theo Ostrosko và cộng sự (1977), tinh bột, glucose, saccarose và maltose là nguồn
carbon có ảnh hưởng nhiều lên quá trình sinh tổng hợp protease của Bacillus subtilis.