NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH VÀNG LÁ GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH
VÀNG LÁ GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊNH

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH
VÀNG LÁ GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. NGUYỄN THỊ NGỌC TRÚC

TRẦN THỊNH

Tháng 9/2008


LỜI CẢM TẠ
Trước hết, con xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến cha mẹ. Con kính chúc cha mẹ
sức khỏe và con sẽ luôn phân đấu để không phụ lòng cha mẹ.
Tiếp đó, tôi xin chân thành cảm ơn:
 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến
thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
 ThS. Nguyễn Thị Ngọc Trúc đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam.
 Toàn thể cán bộ Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam đã quan tâm giúp
đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận.
 Các bạn Trần Thành Danh, Đinh Bá Phước, Dương Thị Kim Phụng đã giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình thực tập.
 Tập thể lớp DH04SH đã chia sẻ buồn vui cùng tôi trong suốt thời gian học và
thực tập.
Sinh viên thực hiện
Trần Thịnh

i

TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu cải tiến quy trình giám định bệnh Vàng lá Greening trên
cây có múi bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)” được tiến hành
tại Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam, từ ngày 15/05/08 đến ngày 30/08/08.
Giáo viên hướng dẫn:
ThS. NGUYỄN THỊ NGỌC TRÚC, Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam,
Việt Nam.
Bệnh Vàng lá Greening là một bệnh rất nguy hiểm và gây thiệt hại rất lớn đối với
cây có múi ở châu Á. Việc giám định bệnh này bằng phương pháp PCR rất hiệu quả
nhưng khá tốn kém và phức tạp. Do đó, để tiết kiệm hóa chất và đơn giản việc giám
định, chúng tôi đưa ly tâm nóng vào quy trình ly trích DNA, giảm hóa chất ly trích
DNA, giảm hóa chất PCR, tạo Kit ở dạng Master Mix, thu được một số kết quả sau:
 Việc sử dụng ly tâm nóng thay ly tâm lạnh cho tỷ lệ PCR thành công là 100 %
với cặp primer OI1/OI2c. Có thể ứng dụng kết quả này trong điều kiện phòng thí
nghiệm cấp cơ sở.
 Hóa chất ly trích DNA giảm từ 750 µl của Cloroform: isopropanol xuống 550
µl, isopropanol giảm từ 650 µl xuống 450 µl và TE 1X 100 µl xuống còn 70 µl vẫn
cho tỷ lệ PCR thành công là 100%.
 Nồng độ primer OI1 và OI2c khảo sát giảm từ 0,5 µM xuống còn 0,2 µM
đều cho lệ PCR thành công là 100%. Mức độ rõ nét của band là như nhau ở các
nồng độ.
 Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát giảm từ 1,25 U xuống còn 0,6 U cho
vẫn cho tỉ lệ PCR thành công là 100%. Mức độ rõ nét của band giảm dần từ nồng độ
cao nhất 1,25 U đến nồng độ thấp nhất 0,6 U.
 Bộ Kit PCR VLG sản xuất thử nghiệm ở tuần thứ 4 vẫn cho hiệu quả PCR là
100%. Hai nồng độ Tween 20 là 0,05% và 0,3% đều cho lệ PCR thành công là 100%
sau 1 tháng bảo quản ở 40C.

ii

SUMMARY
TRAN THINH, Nong Lam University, September 2008 “Improving diagnostic
protocol of Greening Disease on Citrus by PCR”. Work was carried out at Southern
Fruit Research Institute, Vietnam from May 15, 2008 to August 30, 2008.
Supervisor:
NGUYEN THI NGOC TRUC MSc. Southern Fruit Research Institute, Vietnam.
Greening disease is the most destructive disease of citrus in many countries in the
world. It is very serve in Vietnam. One of the most powerful tool to diagnostic this
disease is PCR. However, it is very expensive and complex, not easy for provincal
centers to diagnostic. The experiment were carried out to improve the protocol with
the aim to reduce the cost of testing disease and also to reduce the risk to the
environment due to reducing a lot of toxic chemicals. The results are included:
 Use centrifuge at room temperature instead of use cool centrifugate were not
effect to PCR results with the primers OI1/OI2c. So in the small labs, when they have
not enough good equipments, they can apply this result in diganostic Greening disease.
 In the DNA extraction steps, the chemical were reduced from 750 µl of
Cloroform: isopropanol to 550 µl, isopropanol from 650 µl to 450 µl and TE 1X from
100 µl to 70 µl, the PCR results were 100%.
 The primer OI1 and OI2c concentration was reduced from 0,5 µM to 0,2 µM
the PCR results were 100%. The clearness of the band were same at all concentrations
of this primer.
 The concentration of Taq DNA polymerase were reduced from 1,25 U to 0,6 U
but PCR results were 100%. The clearness of the band were being decreased according
to the reducing of concentration of Taq DNA polymerase.
 The PCR Kit to diagnostic Greening disease were gaven good results after one
month produced (stored at 40C).
 Concentration of Tween 20 at 0,05% and 0,3% were given good result (PCR is
100%) (stored at 40C).

iii


MỤC LỤC
Trang tựa

Trang

Lời cảm tạ ........................................................................................................................ i
Tóm tắt............................................................................................................................ ii
Summary ....................................................................................................................... iii
Mục lục ..........................................................................................................................iv
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Danh sách các bảng .......................................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu..................................................................................................2
1.2.1. Mục tiêu.................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu ..................................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN.................................................................................................3
2.1. Cây có múi................................................................................................................3
2.1.1. Phân loại ................................................................................................................3
2.1.2. Sinh thái.................................................................................................................3
2.1.3. Đặc điểm thực vật..................................................................................................3
2.2. Vi khuẩn Liberibacter và bệnh Vàng lá Greening trên cây có múi .........................5
2.2.1. Vi khuẩn Liberibacter ...........................................................................................5
2.2.1.1. Phân loại .............................................................................................................5
2.2.1.2. Hình thái .............................................................................................................6
2.2.1.3. Đăc điểm genome và cơ sở chẩn đoán bệnh bằng PCR .....................................6

2.2.2. Bệnh vàng lá Greening .........................................................................................8
2.2.2.1. Lịch sử bệnh VLG ..............................................................................................8
2.2.2.2. Triệu chứng.........................................................................................................9
2.2.2.3. Tác nhân gây bệnh VLG...................................................................................10
2.2.2.4. Tác nhân truyền bệnh VLG ..............................................................................10
2.2.2.5. Các phương pháp phát hiện bệnh .....................................................................10

iv


2.2.2.6. Tình hình bệnh VLG trên thế giới và trong nước.............................................11
2.3. Ly trích DNA và phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction) .............................13
2.3.1. Ly trích DNA.......................................................................................................13
2.3.1.1. Nguyên lý .........................................................................................................13
2.3.1.2. Định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA................................................14
2.3.2. Phản ứng PCR .....................................................................................................15
2.3.2.1. Khái niệm chung...............................................................................................15
2.3.2.2. Nguyên lý .........................................................................................................15
2.3.2.3. Các thành phần phản ứng PCR.........................................................................16
2.3.2.4. Các giai đoạn phản ứng PCR............................................................................18
2.3.2.5. Những sai sót trong phản ứng PCR và một số biện pháp khắc phục ...............19
2.3.2.6. Nguyên tắc tạo kít PCR ....................................................................................20
2.3.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .........................................................21
2.3.3.1. Tình hình ngoài nước........................................................................................21
2.3.3.2. Tình hình trong nước ........................................................................................22
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................23
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm...........................................................23
3.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................23
3.2.1. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA......................................................................23
3.2.2. Hoàn thiện quy trình chạy PCR...........................................................................23

3.2.3. Thử nghiệm sản xuất Kit PCR cho giám định bệnh VLG...................................23
3.3. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................23
3.3.1. Mẫu lá cây có múi ...............................................................................................23
3.3.2. Cặp primer sử dụng .............................................................................................23
3.3.3. Hóa chất...............................................................................................................24
3.3.3.1. Hóa chất ly trích DNA, điện di và phân tích sản phẩm....................................24
3.3.3.2. Hóa chất PCR ...................................................................................................24
3.3.4. Thiết bị và dụng cụ ..............................................................................................24
3.4. Phương pháp tiến hành ...........................................................................................25
3.4.1. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA......................................................................25
3.4.1.1. Thí nghiệm 1: Thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi li trích DNA ......................27
3.4.1.2. Thí nghiệm 2: Giảm lượng hóa chất ly trích DNA (chloroform, isopanol) .....27
v


3.4.2. Hoàn thiện quy trình chạy PCR...........................................................................28
3.4.2.1. Thí nghiệm 3: Giảm nồng độ (giảm lượng) primer OI1 và OI2c.....................28
3.4.2.2. Thí nghiệm 4: Giảm nồng độ Taq DNA polymerase .......................................29
3.4.3. Thử nghiệm tạo Kit PCR cho giám định bệnh VLG ...........................................30
3.4.3.1. Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ chất tẩy (Tween 20) .....................................30
3.4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát nồng độ Glycerol .......................................................31
3.4.3.3. Thí nghiệm 7: Bước đầu tạo Kit PCR VLG cho giám định bệnh VLG ...........32
3.4.4. Chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................................33
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................34
4.1. Kết quả hoàn thịên quy trình ly trích DNA ............................................................34
4.1.1. Thí nghiệm 1: Thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi li trích DNA .........................34
4.1.1.1. Kiểm tra chất lượng DNA ly trích....................................................................34
4.1.1.2. Kết quả PCR .....................................................................................................35
4.1.2. Thí nghiệm 2: Giảm lượng hóa chất ly trích DNA (chloroform, isopanol) ........36
4.1.2.1. Kiểm tra chất lượng DNA ly trích....................................................................36

4.1.2.2. Kết quả PCR .....................................................................................................36
4.2. Kết quả hoàn thiện quy trình chạy PCR ................................................................37
4.2.1. Thí nghiệm 3: Giảm nồng độ (giảm lượng) primer OI1 và OI2c........................37
4.2.2. Thí nghiệm 4: Giảm nồng độ Taq DNA polymerase ..........................................38
4.3. Kết quả thử nghiệm tạo Kit PCR cho giám định bệnh VLG..................................38
4.3.1. Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ chất tẩy (Tween 20) ........................................38
4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát nồng độ Glycerol ..........................................................39
4.3.3. Thí nghiệm 7: Bước đầu tạo Kit PCR VLG cho giám định bệnh VLG ..............40
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................42
5.1. Kết luận...................................................................................................................42
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................43
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
VNCCAQMN: Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam.
VLG:

Vàng lá Greening.

HLB:

Huanglongbin.

PCR:

Polymerase Chain Reaction.

NT:

Nghiệm thức.

PVP:

Polyvinylpyrrolidone.

BSA:

Bovine serum albumin.

dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate.
bp:

Base pair.

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid.
Taq:

Thermus aquaticus

ctv:

Cộng tác viên.

MM

Master Mix.

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

Trang

Bảng 3.1. Trình tự primer OI1 và OI2c (Sandrine Jagoueix và ctv, 1995) ................24
Bảng 3.2. Thành phần dịch trích CTAB (Lê Thị Thu Hồng và ctv, 2002) ................24
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR (Lê Thị Thu Hồng và ctv, 2002)....................26
Bảng 3.4. Chu trình nhiệt PCR với cặp primer OI1/OI2c ..........................................26
Bảng 3.5. Các nghiệm thức thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi li trích DNA. ...........27
Bảng 3.6. Các nghiệm thức giảm lượng hóa chất ly trích .........................................28
Bảng 3.7. Thành phần phản ứng PCR với các nồng độ primer khác nhau.................29
Bảng 3.8. Các nghiệm thức giảm nồng độ primer OI1 và OI2c.................................29
Bảng 3.9. Thành phần phản ứng PCR với các nồng độ Taq khác nhau .....................30
Bảng 3.10. Các nghiệm thức giảm nồng độ Taq DNA polymerase .............................30
Bảng 3.11. Thành phần phản ứng PCR với các nồng độ Tween 20 khác nhau ..........31
Bảng 3.12. Các nghiệm thức khảo sát nồng độ Tween 20 ...........................................31
Bảng 3.13. Thành phần phản ứng PCR với các nồng độ Glycerol khác nhau ............32
Bảng 3.14. Các nghiệm thức khảo sát nồng độ Glycerol .............................................32
Bảng 3.15. Các nghiệm thức về tạo Kit PCR VLG.....................................................33
Bảng 3.16. Thành phần PCR trong Kit.........................................................................33
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát thời gian bảo quản Kit MM I và MM II........................40

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

Trang

Hình 2.1.

Cây phát sinh loài dựa trên những trình tự 16S rDNA ................................6

Hình 2.2.

Tế bào Liberobacter.....................................................................................6

Hình 2.3.

Hình minh họa nhóm gene rplKAJL-rpoBC ở E. coli và BLO...................8

Hình 2.4.

Triệu chứng bệnh Vàng lá Greening............................................................9

Hình 2.5.

Diaphorina citri .........................................................................................10

Hình 4.1.

Ly trích DNA .............................................................................................34

Hinh 4.2.

Kiểm tra chất lượng DNA ly trích về thay đổi nhiệt độ trong ly tâm .......34

Hình 4.3.

Kết quả chạy PCR về thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi ly trích DNA ....35

Hinh 4.4.

Kiểm tra chất lượng DNA ly trích về giảm lượng hóa chất ly trích DNA 36

Hình 4.5.

Kết quả chạy PCR về giảm lượng hóa chất ly trích DNA .........................36

Hình 4.6.

Kết quả chạy PCR về việc giảm nồng độ primer.......................................37

Hình 4.7.

Kết quả chạy PCR về việc giảm nồng độ Taq ...........................................38

Hình 4.8.

Kết quả chạy PCR các nồng độ Tween 20 khác nhau ...............................38

Hình 4.9.

Kết quả chạy PCR các nồng độ Glycerol khác nhau .................................39

Hình 4.10. Thử nghiệm Kit PCR VLG vừa mix ..........................................................40
Hình 4.11. Thử nghiệm Kit PCR VLG mix 4 tuần .....................................................41

ix


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây có múi là loài cây ăn quả có giá trị kinh tế cao. Ở nước ta, năm 1995, diện tích
cây có múi là 60.000 ha với sản lượng là 380.000 tấn (Lê Thị Thu Hồng, 2000). Đến
năm 1999, diện tích cây có múi là 63.400 ha với sản lượng là 405.000 tấn (Nguyễn
Văn Kế, 2000). Với diện tích và sản lượng như vậy cây có múi góp phần đáng kể vào
nền kinh tế quốc dân.
Tuy diện tích cây có múi ngày càng tăng nhưng vấn đề bệnh hại đã làm thiệt hại
đáng kể cho nhà vườn. Trên cây có múi có rất nhiều bệnh khác nhau và nhóm gây thiệt
hại mạnh là nhóm có côn trùng truyền bệnh trung gian như bệnh Tristeza do virus
Tristeza, bệnh Vàng lá Greening (VLG) do vi khuẩn mạch dẫn Liberobacter, bệnh
Stubbon do Spiroplasma citri, bệnh Witches blood trên chanh do Phytoplasma, bệnh
vàng lá Xylella fastidiosa và bệnh lùn mất màu do virus (Lê Thị Thu Hồng, 2000).
Trong đó, bệnh Vàng lá Greening hay Huanglongbing đang lan rộng trên 50 quốc
gia, đe dọa nghiêm trọng đến nguồn gen cây có múi các châu Á và thật sự là một hiểm
họa cho nghề trồng cây có múi. Việc xác định mầm bệnh thì khó khăn vì mật số vi
khuẩn trong cây kí chủ rất thấp. Bệnh này không thể chẩn đoán dễ dàng bằng phương
pháp truyền thống như kính hiển vi điện tử, cây chỉ thị, hay ELISA (Hung và ctv, 1999
được trích dẫn bởi Ruangwong và ctv, 2006). Do đó, PCR (Polymerase Chain
Reaction) là phương pháp chẩn đoán phân tử rất hữu hiệu để phát hiện vi khuẩn
Liberibacter - tác nhân gây ra bệnh VLG. Nhưng việc giám định bệnh bằng phương

pháp PCR khá tốn kém.
Từ yêu cầu đó, được sự cho phép của Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam
và Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh,
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cải tiến quy trình giám định bệnh
Vàng lá Greening trên cây có múi bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain
Reaction)”.

1


1.2. Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
Tiết kiệm hóa chất, tiết kiệm thời gian, tiến đến tự động hóa trong việc giám định bệnh
Vàng lá Greening trên cây có múi.
1.2.2. Yêu cầu
 Nắm vững quy trình ly trích DNA và phản ứng PCR.
 Đơn giản hóa quá trình ly trích DNA (đưa ly tâm nóng vào ly trích, giảm hóa
chất ly trích).
 Nắm được khoảng nồng độ cho phép của các hóa chất trong phản ứng PCR để
bố trí nồng độ cho phù hợp.

2


Chương 2

TỔNG QUAN
2.1. Cây có múi
2.1.1. Phân loại
Cây có múi thuộc:

Giới

Plantae

Ngành

Magnoliophyta

Lớp

Magnoliopsida

Phân lớp

Rosidae

Bộ

Spindales

Họ

Rutaceae

Chi

Citrus.

2.1.2. Sinh thái
Vùng trồng cam quýt thường tập trung từ 350 Bắc đến 350 Nam bán cầu. Nhờ kỹ

thuật chọn giống và ghép cây, nó có thể trồng lan rộng ra 430 Bắc bán cầu. Nhìn chung
cam quýt chịu lạnh kém, dưới 130C cây ngừng sinh trưởng, trên 300C cây quang hợp
giảm. Sự thích ứng với khí hậu tùy từng loài. Khi gần tới thời kỳ thu hoạch, hễ trời
lạnh (nhiệt độ thấp) kết hợp với ẩm độ không khí cao sẽ làm mã quả đẹp. Màu quả trở
nên vàng cam hấp dẫn hơn, đây là điểm bất lợi cho Nam bộ.
Cam quýt ưa ánh sáng nhẹ từ 10.000 – 15.000 lux, cao quá sẽ làm giảm quang hợp
và quả dễ bị cháy nắng. Cam quýt rất sợ gió bão, vì vậy chú ý làm đai chắn gió.
Cam quýt cần canh tác sâu độ 1,5 m, nhưng nó còn tùy thuộc vào phương pháp
nhân giống, loại gốc ghép, thủy triều cao thấp,… Độ pH thích hợp từ 5,5 đến 6,5. pH
thấp cần bón vôi để vừa nâng cao năng suất vừa nâng cao tuổi thọ của cây. Cam quýt
cần nhiều K hơn N, vì vậy muốn có quả to, ngon ngọt và đẹp mã không nên quên chất
này (Nguyễn Văn Kế, 2000).
2.1.3. Đặc điểm thực vật
Rễ: Khi trồng bằng hột hay cây ghép, cây con được chuyển từ vườn ươm tới vườn
sản xuất bị bứng đi bứng lại nhiều lần nên rễ cọc thường bị đứt và vì vậy chúng sẽ cho 2
đến 3 rễ cái lớn. Các rễ này phân nhánh nhiều lần cho tới khi có rễ sợi (đường kính nhỏ

3


hơn 0,5 mm), trên các rễ sợi này mới mang lông hút. Trên đất cao theo H. Rebour thì có
tới 60% số rễ phân bố ở tầng đất 0-50 cm; 30% ở tầng đất 50-100 cm và 10% còn lại nằm
dưới 100 cm. Khi trồng bằng cành chiết 80% số rễ nằm ở tầng mặt. Rễ cam có thể ăn lan
rộng gấp đôi hình chiếu của tán. Sự sinh trưởng của rễ thường theo sau sự sinh trưởng
thân cành, nhưng thường chậm và kéo dài hơn. Rễ hút nước và muối khoáng liên tục
nhưng mạnh nhất vào thời kỳ ra hoa và kết quả (Nguyễn Văn Kế, 2000).
Thân cành: Cam quýt có dạng thân trụ hay bán bụi. Trên thân cành có thể có gai.
Táng cây có nhiều dạng tùy theo giống và cách tạo tỉa: hình chổi (cam sanh), hình cầu
(cam ngọt), hình mâm xôi (bưởi). Cành cam quýt sinh trưởng theo kiểu hợp trục. Mỗi
năm có từ 3-4 đợt lộc cành, điều này thể hiện rõ ở những vùng có 4 mùa như Bắc Bộ.

Đợt cành mùa xuân cho ra cành dinh dưỡng và cành quả, đợt cành mùa hè và mùa thu
cho ra cành mẹ của cành quả năm tới và đợt cành mùa đông mọc ra từ những cành quả
không hữu hiệu của mùa xuân. Ở Nam Bộ, do nóng quanh năm nên các đợt lộc cành
chồng chất lên nhau. Đợt cành đầu mùa mưa cho cành quả và cành dinh dưỡng và đợt
cành giữa và cuối mùa mưa là cành mẹ của cành quả năm tới,…
Lá: Bản chất lá cam quýt là lá kép, điều này còn thấy rõ ở cam 3 lá (Poncitrus
trifoliata). Lá của các giống cam trồng trọt gồm một bản lá với cuống có một eo lá hay
còn gọi là cánh lá. Cánh lá rất to ở lá bưởi, lá trúc (Citrus hystrix), nhỏ ở lá cam, rất
nhỏ ở lá quýt, tắc và không có ở chanh tây, thanh yên (Citrus medica),… Lá có hình
dạng thay đổi theo mùa, thường có dạng elip, dày, có tuyến tinh dầu, mặt dưới có
khoảng 500 khẩu bào/mm2. Số lượng lá trên cây rất quan trọng: để tạo ra một quả
bưởi cây cần tối thiểu 60 lá, một quả cam cần 50 lá, một quả chanh cần 20-30 lá,…
nên cần có biện pháp duy trì số lá xanh nhiều và tốt.
Hoa: Hoa đơn hoặc chùm mọc ở nách lá, thơm, thường có màu trắng, nhiều nhị
đực kết thành bó ở phía gốc. Ở phía Bắc bán cầu sự phân hóa mầm hoa xảy ra từ sau
thu hoạch cho tới khoảng tháng 2-3 dương lịch.
Trái: Có hình cầu (cam), hình cầu dẹp (quýt mandarin), hình quả lê (bưởi),…Vỏ
trái có một lớp chứa tinh dầu (lớp flavedo) và một lớp màu trắng xốp (lớp albedo).
Phần ruột chia làm nhiều múi, trong mỗi múi có các lông của nội quả bì mọng nước
biến thành con tép, hình dạng, màu sắc con tép thay đổi theo loài. Dịch quả trong con
tép chứa nhiều chất bổ dưỡng, hương vị thơm đặc trưng tùy loài và các enzyme.

4


Hạt: Phần lớn các loại cam quýt là hạt đa phôi. Gồm một phần phôi hữu tính và
gồm nhiều phôi vô tính phát triển từ phôi tâm. Màu của tử diệp trắng ở bưởi, cam;
xanh ở quýt; xanh nhạt ở các loài lai (cam sành, sảnh) (Nguyễn Văn Kế, 2000).
2.2. Vi khuẩn Liberibacter và bệnh Vàng lá Greening trên cây có múi
Bệnh Vàng lá Greening do vi khuẩn Liberibacter.

Bệnh lây lan nhanh do rầy chổng cánh. Bị nặng trên cam sành, cam mật, quýt;
chanh và bưởi bị nhẹ hơn. Nhà vườn thường gọi là bệnh “vàng lá gân xanh”, Trung
Quốc gọi là bệnh “Hoàng Long”, một số nơi gọi là bệnh CVPD (Citrus Vein Phloem
Discoloration).
Lá bị khảm, gân xanh cứng và uốn cong ra ngoài như hiện tượng lá “tai thỏ” của
dấu hiệu thiếu Zn; nhánh bị khô, quả nhỏ, méo, dễ rụng,…
Cần áp dụng các biện pháp tổng hợp để phòng trừ như: trồng giống sạch bệnh; bón
phân tập trung hơn để cây ra đọt đều phòng trừ rầy chổng cánh dễ hơn như phun thuốc
hay phát triển các thiên địch như kiến vàng,… hủy diệt nguồn bệnh, lưu ý cây hoang
dại cả những cây kiểng trong họ cam quýt; nghiên cứu gốc ghép kháng bệnh như gốc
Citrange Troyer,… (Võ Thị Thu Oanh, 2004).
VLG là bệnh nguy hiểm vì không có gốc kháng, chỉ có bưởi và vài loại quýt tương
đối chống chịu, cam mật, quýt và tangelo là những giống nhiễm nặng. Bệnh không
truyền được qua hạt mà do RCC Diaphorina citri ở châu Á và rầy châu Phi T.
erytreae. Aubert và Quilici (1984) đã sử dụng hiệu quả ong ngoại ký sinh phòng trị
RCC tại đảo Reunion và nhờ vậy công cuộc phòng trị bệnh VLG đã thành công tại đây
(Lê Thị Thu Hồng, 2000).
2.2.1. Vi khuẩn Liberibacter
2.2.1.1. Phân loại
Ở hình 2.1, Liberibacter thuộc α-subdivision của lớp Proteobacteria. Murray &
Schleifer, (1994) đã đề nghị dùng thuật ngữ “Candidatus” để chỉ những vi khuẩn
không nuôi cấy được. Một trong những vi khuẩn không nuôi cấy được này là vi khuẩn
gây bệnh VLG. Cho đến nay, vi khuẩn này gồm có 3 loài: Candidatus Liberibacter
asiaticus (châu Á), Candidatus Liberibacter africanus (châu Phi), Candidatus
Liberibacter americanus (châu Mỹ). Liber có nghĩa là vỏ cây (bark) và bacter để chỉ vi
khuẩn (bacterium) (Bové, 2006).

5

Hình 2.1. Cây phát sinh loài dựa trên những trình tự 16S rDNA
(Nguồn: Teixeira và ctv, 2006).

2.2.1.2. Hình thái
Bové và cộng sự (1980) đã xác định
được hai loài Liberobacter gây bệnh VLG đó
là Liberobacter asiaticum (dòng châu Á) và
Liberobacter africanum (dòng châu Phi), vỏ
có bề dày khoảng 25 nm với 3 lớp của một vi
khuẩn Gram âm thực sự. Vi khuẩn có hai
dạng: dạng dài có chiều dài đo được 1-4 µm,
đường kính 0,15-0,3 µm và dạng tròn có
đường kính 0,1 µm (Trích dẫn bởi Lê Thị
Hình 2.2. Tế bào Liberobacter

Thu Hồng, 2000).

(Nguồn: Bové, 2006).
2.2.1.3. Đăc điểm genome và cơ sở chẩn đoán bệnh bằng PCR
Vùng 16S rDNA
Người ta dựa vào trình tự gene 16S rDNA (gene RNA ribosome 16S) của vi khuẩn
Liberibacter để tìm ra vị trí phát sinh loài của chúng, 16S rDNA của dòng (strain)
Nelpruit Nam Phi và dòng Poona châu Á đã thu được từ DNA tổng số của những cây
dừa cạn bị nhiễm HLB, thông qua việc nhân bản PCR, sử dụng universal PCR-primer
f-D1/r-P1cho việc khuếch đại 16S rDNA của prokaryote (Weisburg và ctv, 1991, trích
dẫn bởi Bové, 2006). Trong những thí nghiệm này, thao tác phải được thực hiện để
ngăn chặn sự can thiệp của những 16S rDNA lục lạp và ti thể của dừa cạn. Điều này
có thể thu được bằng việc cắt 16S rDNA của ti thể với enzyme giới hạn BclI trước khi
6

khuếch đại PCR. Đoạn DNA nhân bản có kích thước khoảng 1500 bp, chứa 16S rDNA
của lục lạp cũng như vi khuẩn. Sự có mặt DNA của vi khuẩn có thể biết chắc bằng
EcoRI, enzyme giới hạn này cắt đoạn nhân bản tạo thành 2 đoạn (khoảng 650 bp và
850 bp), trong khi DNA lục lạp thì không bị cắt. Những 16S rDNA này được clone từ
sản phẩm khuếch đại khoảng 1500bp, và được sequence. Những thí nghiệm lai DNA
và PCR đã được thực hiện với những oligonucleotide chuyên biệt cho những trình tự
khuếch đại đã chỉ ra rằng những đoạn DNA thu được là 16S rDNA của vi khuẩn HLB,
và không có DNA của sinh vật ngoại nhiễm (Jagoueix và ctv, 1994 trích dẫn bởi
Jagoueix và ctv, 1995 ).
Dựa trên vùng trình tự 16S rDNA, người ta có thể thiết kế primer cho việc phát
hiện vi khuẩn Liberibacter. Đó là các primer OI1, OI2c, OA1, cặp primer OI1/OI2c
phát hiện các Liberibacter không phân biệt được dòng châu Á hay châu Phi; còn cặp
OI2c/OA1 chỉ phát hiện riêng dòng châu Phi (L. africanum).
Nhóm gene rplKAJL-rpoBC (β-operon)
Nhóm gene rplKAJL-rpoBC được biết như là β-operon ở vi khuẩn, mã hóa cho
protein ribosome. Các protein ribosome vi khuẩn như L11, L1, L10, L12 và tiểu đơn vị
β của RNA polymerase, được mã hóa bởi các gene tương ứng như rplK, A, J, L và
rpoB. Trong BLO (Bacterial Like Organism), những gene mã hóa cho protein trên
được sắp xếp giống trong E. coli và những loài vi khuẩn khác. Những vùng gene này
giữ vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình phiên mã và dịch mã. Trong E. coli (và
những vi khuẩn thật khác) sự điều hòa quá trình phiên mã của rplKAJL-rpoBC thì
phức tạp (Villechanoux và ctv, 1993).
Vùng giữa gene rplA và rplJ ở dòng châu Á dài hơn dòng châu Phi là 34 bp. Đây
là cơ sở để thiết kế primer xuôi f-rplA2 (dựa gene rplA) và primer ngược r-rplJ5 (dựa
vào gene rplJ) để phân biệt hai dòng châu Á (kích thước khuyếch đại là 703 bp) và
dòng châu Phi (kích thước khuyếch đại là 669 bp) (Hocquellet và ctv, 1999; được trích
dẫn bởi Bové, 2006).

7

Hình 2.3. Hình minh họa nhóm gene rplKAJL-rpoBC ở E. coli và BLO
(Nguồn: Villechanoux và ctv, 1993)
Trong hình 2.3, P: promoter; T: terminator; A: attenuator. Những con số thể
hiện kích thước (bp) giữa các gene, vùng giữa các gene không thể hiện ở đây.

2.2.2. Bệnh vàng lá Greening
2.2.2.1. Lịch sử bệnh VLG
Bệnh VLG có nhiều tên gọi khác nhau theo từng địa phương, ở Trung Quốc có tên
là Hoàng Long (HLB - Huanglongbin), ở Philipine gọi là Lá vàng lốm đốm (Mottle
leaf), ở Indonesia gọi là sự thoái hóa mô libe ở phiến lá (CVPD – Citrus Vein Phloem
Degeneration),... Bệnh này được Reinking mô tả lần đầu tiên vào năm 1919 ở Trung
Quốc (dạng Châu Á), triệu chứng xác định nhờ các đặc tính thể hiện ở điều kiện nhiệt
độ mát và ấm; dạng ở châu Phi được mô tả ở Nam Phi vào năm 1937 với triệu chứng
thể hiện ở điều kiện nhiệt độ từ 20 – 240C. Năm 1956, Lin đã chứng minh bệnh VLG
có thể truyền qua mắt ghép, đây là một phát hiện có ý nghĩa cho việc kiểm soát dịch
bệnh sau này. Năm 1965, A. P. D. McClean và Oberholzer đã chứng minh bệnh có thể
truyền qua mắt ghép cũng như qua rầy chổng cánh Triozea erytreae ở Nam Phi. Năm
1967, tại Ấn Độ, Capoor và cộng sự đã thành công trong việc truyền bệnh này bằng
rầy chổng cánh Diaphorina citri. Từ 1977 – 1984, Garnier và Bove đã chứng minh
được tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Gram âm bằng kính hiển vi điện tử. Năm 1995, tổ
chức IOCV (International Organization of Citrus Virologists) đặt tên chính thức của
bệnh là Huanglongbin (HLB), và đã được chấp nhận. Ngày nay, tên HLB được dùng
rộng rãi cho các dạng bệnh châu Á, châu Phi và châu Mỹ (Bové, 2006).
8


2.2.2.2. Triệu chứng
Theo Hà Minh Trung quan sát triệu chứng bệnh trên các giống cam quýt khác nhau

ở các độ tuổi khác nhau có độ biểu hiện triệu chứng khác nhau. Về cơ bản có mấy nét
chính sau:
 Lúc đầu, bệnh xuất hiện cục bộ trên một vài nhánh bệnh thể hiện qua sự biến
màu vàng của lá.
 Biến màu vàng hầu hết
phiến lá, chỉ gân lá và vùng phụ
cận vẫn còn xanh (giống thiếu
Mn).
 Hầu hết phiến và gân đều
vàng chỉ còn vài điểm xanh như
những đảo nhỏ giữa nền vàng.
 Lá non biến vàng, nhỏ và
cuốn cong (giống thiếu Zn).

Hình 2.4. Triệu chứng bệnh Vàng lá Greening
(Nguồn: VNCCAQMN, 2002)

 Lá già có màu vàng nhạt,
cong vẹo, gân lá bị sưng (giống thiếu Bo).

 Trên hoa và quả: quả trái vụ, quả nhỏ, lệch tâm, hạt lép (Trích dẫn bởi Nguyễn
Minh Quang, 2002).
Những triệu chứng bệnh trên có thể giải thích. Bệnh VLG không ảnh hưởng đến
mạch gỗ nhưng ảnh hưởng đến mô libe, sự vận chuyển đường đến các phần trên của
của cây bị cản trở. Lá bị vàng héo, mau chết, quả mất chất lượng, sự phân chia tế bào
luôn xảy ra khiến gân lá sưng lên. Người ta nghi ngờ rằng vi khuẩn có thể tiết ra chất
độc và chính chất độc này hơn là mật số đã gây ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý của
cây. Do sự hiện diện và mật số vi khuẩn đã làm xáo trộn dinh dưỡng, tắc nghẽn vận
chuyển dinh dưỡng khiến lá cây bị thiếu Zn, thiếu Mn, thiếu Bo, thiếu Mg, … (thể
hiện qua triệu chứng thiếu các vi lượng này) (Lê Thị Thu Hồng, 2000).

9


2.2.2.3. Tác nhân gây bệnh VLG
Bệnh VLG gây ra bởi vi khuẩn Liberibacter. Cho đến nay, dựa vào trình tự
16S

người ta đã xác định được 3 dòng châu Á (L. asiaticus), châu Phi (L.

africanus) và châu Mỹ (L. americanus). Hai dòng châu Á và châu Phi được phát
hiện từ rất sớm và mãi đến năm 1995, Jagoueix và ctv mới đưa ra phương pháp
phát hiện chính xác hai loài này bằng PCR; trong khi dòng châu Mỹ được phát
hiện bởi Teixeira và ctv vào năm 2005.
2.2.2.4. Tác nhân truyền bệnh VLG
Tác nhân truyền bệnh là do hai loài rầy chổng cánh. Loài thứ nhất là Diaphorina
citri Kuwayama chịu được nhiệt độ trên 300C, truyền vi khuẩn Ca.L.asiaticus (dòng
châu Á). Loài này phân bố ở châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia,
Malaysia, Bruney, Ấn Độ,… Loài thứ hai là Triozea erytreae Del Guercio phát triển tốt
ở nhiệt độ 22-250C, truyền vi khuẩn Ca. L. africanus
(dòng châu Phi). Loài này ở châu Phi như Nam Phi,
Sudan, Madagasca.
Người ta cũng ghi nhận vài vùng có cả hai loại
rầy và cả hai loại vi khuẩn như ở Reunion,
Mauritius, Tây Nam Ả Rập. Mỗi loại rầy đều có

Hình 2.5. Diaphorina citri
(Nguồn: VNCCAQMN,

khả năng truyền cả hai loại vi khuẩn (Aubert và

CSV, 1988, trích dẫn bởi Lê Thị Thu Hồng, 2000).
2.2.2.5. Các phương pháp phát hiện bệnh
PCR
Để phát hiện Liberibacter asiaticus và L. africanus ta dùng cặp primer
OI2c/OA1 khuếch đại trình tự 16S rDNA, và cặp primer A2/J5 nhân bản nhóm
gene protein ribosome (rpl). Trong trường hợp có mặt cả Liberibacter dòng châu Á
và dòng châu Phi thì nên sử dụng tổ hợp primer f-(OA1+OI1)/r-OI2c (Jagoueix và
ctv, 1995). Còn đối với Liberibacter americanus (dòng châu Mỹ) được phát hiện
nhờ cặp primer f-GB1/r-GB3 (Teixeira và ctv, 2005). Để phát hiện đồng thời 3
Liberibacter (L. asiaticus, L. africanus, L. americanus) ta sử dụng kỹ thuật
multiplex PCR với hai cặp primer f-A2/r-J5 và f-GB1/ r-GB3 (Bové, 2006).

10


Lai phân tử (Dot blot hay Southern Blot)
Hai probe In-2.6 (2.6 kbp), AS-1.7 (1.7kbp) được xây dựng dựa trên vùng
gene rplKAJL-rpoBC của vi khuẩn gây bệnh VLG. In-2.6 có nguồn gốc từ dòng
vi khuẩn Poona (Ấn Độ) châu Á, lai rất nghiêm ngặt với các dòng châu Á do đó
probe In-2.6 dùng để phát hiện các Liberibacter dòng châu Á rất hiệu quả, trong
khi đó probe AS-1.7 bắt nguồn từ dòng Nelspruit châu Phi, dùng nó có thể phát
hiện được các dòng châu Phi (Bové, 2006).
Do vi khuẩn Liberibacter không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo nên hai
phương pháp dựa trên cơ sở acid nucleic nói trên là rất có ý nghĩa cho việc chẩn đoán
phát hiện bệnh VLG vì nó giúp phát hiện bệnh nhanh, nhạy, đặc hiệu và độ tin cậy cao.
Ngoài ra, người ta cũng sử dụng một số phương pháp khác như dùng cây chỉ thị,
phương pháp ELISA, kính hiển vi điện tử, thử nghiêm Iode. Tuy nhiên, những phương
pháp này vẫn còn một số hạn chế như: độ tin cậy không cao, khó khăn trong việc sản
xuất kháng thể đơn dòng cũng như thời gian chẩn đoán dài.
2.2.2.6. Tình hình bệnh VLG trên thế giới và trong nước

 Tình hình bệnh VLG trên thế giới
Châu Á, Đông Nam Á. D. ctri là vector, Ca. L. asiaticus là tác nhân gây bệnh
HLB, và cả hai đều chịu nhiệt. Những vùng hoặc quốc gia châu Á nơi mà Ca. L.
asiaticus đã được phát hiện bằng phương pháp EM, lai DNA, và/hoặc PCR gồm: tiểu
lục địa Ấn Độ (Ấn Độ, Pakistan, Nepal, Bhutan, Bangladesh, Sri Lanka), Đông Nam Á
(Myanmar, Thailand, Malaysia, Campuchia, Lào, Việt Nam), Đông Nam Trung Quốc,
Đài Loan, Miền Nam Nhật Bản (đảo Ryukyu, Okinawa) (Miyakawa và Tsuno, 1989),
Philipine, Indonesia (Java, Sumatra, miền Đông Kalimantan, miền Nam Sulawasi,
Bali), Đông Timor (Trích dẫn bởi Bové, 2006).
Châu Phi và bán đảo Madagascar. T. erytreae là vector, Ca. L. africanus là tác
nhân gây bệnh HLB, cả hai đều nhạy với nhiệt độ những vùng và quốc gia ở miền
Nam và miền Đông châu Phi nơi mà Ca. L. africanus được phát hiện bằng kỹ thuật
EM, lai DNA và/hoặc PCR gồm: Nam Phi, Zimbabwe, Malawi, Bunruni, Kenya,
Somalia, Ethiopia. Ở miền Tây châu Phi, bệnh này chỉ có ở Cameroon (Bové, 2006).
Bán đảo A-rập. Ở A-rập Saudi, HLB hiện diện ở vùng Biển Đỏ từ Mecca đến
Najan, gần biên giới Yemeni. Vector truyền bệnh là D. citri. HLB xảy ra những ốc đảo
nóng, đó là lý do hình thành dạng chịu nhiệt. Ở Yemen, vector là T. erytreae, và HLB
11


chỉ tìm thấy những vùng đất cao lạnh lẽo. Vì thế, HLB ở Yemen là dạng chịu nhiệt
(Bové và Garnier, 1984, trích dẫn bởi Bové, 2006).
Phía nam biên giới giữa Saudi/Yemen, ở vùng Abha-Khamis Mushayt, có cả hai
vector được tìm thấy , và hai dạng HLB có thể hiện diện. Trường hợp này có thể giải
thích như sau: ở Yemen, HLB dạng châu Phi và T. erytreae đã được tìm thấy chắc
chắn từ Ethiopia gần đó, qua phía Nam Biển Đỏ, thông qua eo biển hẹp, và di chuyển
xuống phía Nam. Ở A-rập Saudi, HLB dạng châu Á và D. citri đã đi vào bán đảo Arập, có thể di chuyển đến Mecca, và đã di chuyển về phía Nam. Cuối cùng, cả hai
vector cũng như hai dạng HLB châu Á và châu Phi, đã được tìm thấy ở vùng AbhaKhamis Mushayt. Sự di chuyển xa hơn của T. erytreae lên phía Nam bị cản trở bởi khí
hậu nóng nhưng sự di chuyển của D. citri về hướng Nam Yemen không bị suy yếu bởi
khí hậu.

Những đảo ở Ân Độ Dương: Reunion và Mauritius. Hai vector và hai dạng
HLB xảy ra ở Reunion và Mauritius (Garnier và cộng sự, 1996). Sự phân bố hai vector
rầy chổng cánh này gắn liền với nhiệt độ/độ cao so mặt nước biển. D. citri hiện diện ở
vùng bờ biển trên mực nước biển khoảng 500 m, trong khi đó T. erytreae phổ biến
dưới độ cao này. D. citri cũng đã được phát hiện ở đảo Rodrigues, phía Tây của
Mauritius. Cả hai Ca. L. asiaticus và Ca. L. africanus đều hiện diện. Vài cây đã chứng
minh là nhiễm đồng thời hai loại liberibacter, một trường hợp được quan sát ở bang
São Paulo với Ca. L. americanus và Ca. L. asiaticus (trích dẫn bởi Bové, 2006).
Nam Mỹ. Florida, USA, đã là vùng thứ hai ở châu Mỹ báo cáo về HLB, vào năm
2005. D. citri đã được ghi nhận trước đó 7 năm. Liberibacter là Ca. L. asiaticus (Trích
dẫn bởi Bové, 2006).
 Tình hình bệnh VLG trên trong nước
Hiện tượng Vàng lá suy tàn cây có múi ở nước ta do nhiều nguyên nhân song quan
trọng nhất là do nhóm bệnh virus và tương tự virus gây ra mà Vũ Khắc Nhượng, 1997
thì đầu những năm 60 điều tra của đoàn Viện sĩ L. A. Canchaveli và Cục Sản Xuất
Nông Nghiệp thì tỉ lệ cây bị vàng lá còn thấp (1-5%), mật độ rầy chổng cánh chưa cao,
đến cuối những năm 60 đầu những năm 70 do việc nhân giống không thận trọng, tốc
độ lây lan lên đến 50-60 % mặc dù mãi đến sau năm 1975 thì nguyên nhân dịch bệnh
mới được xác định rõ. Ở miền Nam, việc nhân giống không quản lý an toàn dịch bệnh
cũng biểu hiện khắp nơi, nhất là tại huyện Chợ Lách tỉnh Bến Tre, nơi sản xuất cây
12


giống quan trọng cho cả vùng với số lượng năm 1992 xấp xỉ hơn 1 triệu cây giống cây
có múi các loại (thông tin Khoa Học Công nghệ, 1993) (trích dẫn bởi Lê Thị Thu
Hồng, 2000).
Kết quả điều tra phân bố và mức độ lây hại của bệnh VLG ở miền Bắc Việt Nam
năm 1990-1991 cho thấy bệnh lan tràn và nhiễm trên hầu hết các vùng trồng cam quýt
chính, gây hại cây bệnh ở mọi lứa tuổi, làm giảm tuổi thọ, năng suất và chất lượng quả
(Đỗ Thành Lâm và Hà Minh Trung, 1993). Biểu hiện đặc trưng và diễn biến triệu

chứng bệnh trên cây có múi ở phía Nam cũng được tác giả ghi nhận và mô tả (Hà
Minh Trung và ctv, 1995). Sự biểu hiện của bệnh VLG trên cây có múi ở ĐBSCL
được khẳng định qua phương pháp giám định DNA tại Đại học Đoài Lan và việc giám
định nhiều mẫu cây có múi thu thấp khắp các tỉnh trong cả nước bằng lai phân tử tại
INRa, Pháp (Bové và ctv, 1995) (Trích dẫn bởi Lê Thị Thu Hồng, 2000).
2.3. Ly trích DNA và phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction)
2.3.1. Ly trích DNA
2.3.1.1. Nguyên lý
DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh các tác
nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này.
Phương pháp tách chiết DNA gồm 3 bước:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông thường người
ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, CTAB) và proteinase
(proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra
môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong các dung dịch phenol và chloroform, dung dịch
phenol: chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời hòa tan các acid
nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa acid
nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:
chloroform. Pha nước có chứa acid nucleic được thu nhận lại.
Bước 3: Tủa acid nucleic. Mục đích của việc tủa là thu nhận acid nucleic dưới
dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của enzyme, mặt khác có
thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Hai cách tủa thông
thường là:
13


Tủa trong ethanol, việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao
(nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 dung dịch ethanol/1 dung dịch mẫu),

nhiệt độ thấp tạo điều kiện thuận lợi cho việc kết tủa. Hầu như toàn bộ acid nucleic
đều tủa trong các điều kiện nêu trên.
Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự
hiện diện của muối, thể tích isopropanol/thể tích dung dịch mẫu là 1/1. Các DNA có
trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa
isopropanol.
Trong cả 2 phương pháp trên, acid nucleic thu nhận lại bằng li tâm. Sau đó, cặn
tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc các dấu vết của ethanol còn
dính lại trên mẫu (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2002).
2.3.1.2. Định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA
Để xác định mức độ tinh sạch và hàm lượng hỗn hợp acid nucleic thu được sau khi
tách chiết, người ta dùng phương pháp đo quang phổ và phương pháp điện di.
 Phương pháp đo quang phổ
Phương pháp đo quang phổ dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng khác nhau của các
base nitrogen của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn. Giá trị mật độ quang ở bước
sóng 260 nm (Optical Density – OD260 nm) cho phép xác định nồng độ DNA trong
dung dịch. Một đơn vị OD có bước sóng 260 nm ký hiệu là A260 nm.
A260 nm = 1 = 50 µg/ml DNA mạch kép.
A260 nm = 1= 33 µg/ml DNA mạch đơn.
A260 nm = 1= 40 µg/ml RNA.
Khi tính nồng độ DNA, cần chú ý đến hệ số pha loãng của dịch chiết. Công thức
tính chung nồng độ DNA là:
CDNA= A260 nm x 50 x độ pha loãng.
Ví dụ, khi tách chiết DNA mạch kép khi pha loãng gấp 2 lần có giá trị A260nm = 0,6
thì dung dịch có nồng độ là:
CDNA= 0,6 x 50 x 2 = 60 µg/ml.
Khi tách chiết DNA có thể còn lẫn tạp với protein. Để đánh giá độ tinh sạch DNA
người ta còn đo dung dịch ở bước sóng 280 nm là phổ hấp thụ cực đại của protein.
Nếu tỉ lệ A260 nm/ A260 nm = 1,8 – 2 thì có thể xem dịch chiết DNA là tinh sạch.
Nếu tỉ lệ A260 nm/ A260 nm ≥ 2 thì dung dịch chiết RNA là tinh sạch.

14