NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUERCETIN TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Trần Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUERCETIN TỪ MỘT
SỐ LOÀI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------Trần Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUERCETIN TỪ
MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội- 2018

2


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn trên, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả
về vật chất, tinh thần cũng như kiến thức chuyên môn, kinh nghiêm của các thầy cô,
gia đình, bạn bè. Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới PGS. TS.
Nguyễn Quang Huy, người thày giúp đỡ em rất nhiều trong việc phát triển tư duy
khoa học, luôn tận tình chỉ bảo em về chuyên môn, kinh nghiệm làm việc cũng như
động viên, giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu khoa
học,thực hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý thực
vật và hóa sinh đã luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để em thực hiện tốt
những thí nghiệm của mình
Trong suốt quá trình học em đã tiếp thu được các kiến thức chuyên sâu của các
thầy cô thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng
dạy.
Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới NCS. Lê Huy Hoàng, người đã
luôn nhiệt tình, chỉ dẫn các thao tác thí nghiệm trong quá trình thực hiện đề tài.
Em gửi lời cảm ơn tới phòng Đào tạo sau Đại học, trường Đại học Khoa học
Tự Nhiên đã tạo điều kiện và đáp ứng nhu cầu,nguyện vọng của em và hoàn thành
chương trình học tập của khóa học.
Cuối cùng xin gửi lời tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, cổ vũ và tạo môi
trường tinh thần thuận lợi nhất trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Học viên cao học

Trần Thị Kiều Oanh

3


MỤC LỤC

4


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp Flavonoids và Quercetin ở A. thaliana...............4
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm flavonols (quercetin, kaempferol,
myricetin và isorhamnetin) ..........................................................................................5
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của nhóm flavones (luteolin, apigenin)...........................5
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học nhóm flavanones (eridictyol, hesperetin, naringenin).....6
Hình 1.5. Cấu trúc nhóm flavan-3-ols (catechins và epicatechins..............................6
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học nhóm theaflavins.............................................................6
Hình 1.7. Cấu trúc hóa học nhóm anthocyanidins (cyanidin, delphinidin, malvidin,
pelargonidin, peonidin và petunidin)...........................................................................7
Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của quercetin...................................................................7
Hình 1.9. Mô tả quá trình loại gốc oxi hóa (R) bởi Flavonoids.................................9
Hình 1.10. Các vị trí thực hiện liên kết với gốc oxi hóa tự do tại vòng A, B..............9
Hình 2.1. Quy trình thủy phân mẫu cho nghiên cứu TLC và HPLC........................26
Hình 3.1. Kết quả đáp ứng tín hiệu khi rửa giải theo hệ 1..........................................37
Hình 3.2. Khảo sát thời gian lưu và độ phân giải theo các hệ pha động khác nhau.....38
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu thử (hoa hòe) tại λ = 370nm rửa giải theo hệ pha động
táchđược lựa chọn (3a-hệ 4) và không tách được (3b-hệ 5).......................................39
Hình 3.4. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu mẫu chuẩn quercetin (4a) và mẫu thử
dịch chiết hoa hòe (4b)...............................................................................................39
Hình 3.5. Ảnh 3D quét phổ ở 4 bước sóng trong điều kiện có chuẩn quercetin........41

Hình 3.6. Thông số sắc ký qua 5 lần thí nghiệm........................................................42
Hình 3.7. Thời gian lưu của đỉnh quercetin chuẩn khi thay đổi áp suất đầu cột từ mức
35 bar lên mức khoảng 59-60 bar...............................................................................43
Hình 3.8. Kết quả chạy mẫu bụp giấm trước thủy phân............................................43
Hình 3.9. Kết quả chạy mẫu đinh lăng trước thủy phân...........................................43
Hình 3.10. Kết quả chạy mẫu hoa hòe trước thủy phân...........................................44
Hình 3.11. Kết quả chạy mẫu rau đắng biển trước thủy phân..................................44
Hình 3.12. Kết quả chạy mẫu rau má trước thủy phân.............................................44
Hình 3.13. Kết quả chạy HPLC mẫu quercetin chuẩn..............................................44

5


Hình 3.14. Kết quả chạy HPLC mẫu quercetin chuẩn................................................45
Hình 3.15. Kết quả chạy HPLC mẫu hoa hòe thủy phân ...........................................45
Hình 3.16. Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh quercetin............45

6


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Định danh và đặc tính của Quercetin.........................................................8
Bảng 1.2. So sánh các phương pháp tiền tách chiết .................................................16
Bảng 1.3. So sánh các phương pháp tách chiết truyền thống ...................................17
Bảng 1.4 So sánh các phương pháp tách chiết hiện đại............................................18
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong hoa hòe.......................................31
Bảng 3.2. Kết quả định tính các nhóm chất trong loài rau đắng...............................32
Bảng 3.3. Kết quả định tính các nhóm chất trong loài bụp giấm..............................32
Bảng 3.4. Kết quả định tính các nhóm chất trong loài rau má..................................33
Bảng 3.5. Kết quả định tính các nhóm chất trong loài đinh lăng..............................33

Bảng 3.6. Định tính quercetin ở dịch chiết MeOH trước và sau thủy phân bằng HCL
...................................................................................................................................34
Bảng 3.7. Đánh giá khả năng DPPH của dịch chiết các mẫu....................................35
Bảng 3.8. Khả năng lực khử của các mẫu thí nghiệm...............................................36
Bảng 3.9. Độ ổn định của hệ thống sắc ký đối với dịch chiết hoa hòe......................42

7


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
ASE
DCM
DEPT

Ý nghĩa
Kỹ thuật chiết nhanh với dung môi
Dichloromethane
Distortionless Enhancement by Polarisation

DMEM
DMSO
DPPH
EA
EtOH
FBS
FT-IR
IUCN
MAE
MetOH

MTT

Transfer
Môi trường Dulbecco’s Modified Eagle
Dimethyl sulfoxide
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
Ethyl acetate
Ethanol
Huyết thanh phôi bò
Phổ hồng ngoại
Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên và Tài nguyên
Kỹ thuật chiết bằng lò vi sóng
Methanol
3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5diphenyltetrazolium

NCI
NMR
SFE
UAE
v/v
w/v

bromide
Viện Ung thư Hoa kỳ
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Kỹ thuật chiết siêu tới hạn
Kỹ thuật chiết bằng sóng siêu âm
Thể tích / Thể tích
Khối lượng / Thể tích

8


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu những hợp chất tự nhiên (bao gồm
tìm kiếm, tách chiết, đánh giá hoạt tính) đang phát triển mạnh mẽ, đặc biệt ở Việt Nam
nơi có hệ động thực vật đa dạng, phong phú và có nhiều loại cây cỏ tác dụng sinh dược
mạnh.
Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đối tượng trong các hợp chất tự
nhiên thực vật được quan tâm nhiều tập trung ở nhóm hợp chất flavonoid vì số lượng
các chất nhiều, tác dụng của các hợp chất không chỉ là chữa bệnh mà còn phòng bệnh.
Quercetin là một flavonoid thực vật có mặt trong nhiều loài, có hoạt tính chống oxy
hóa mạnh, ngay cả ở nồng độ thấp. Trong tự nhiên, quercetin tồn tại ở dạng tự do
(dạng aglycon) hoặc dẫn xuất cho một số flavonoid khác, thường gặp là rutin. Hiện
nay, quercetin được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như thực phẩm chức
năng, thuốc điều trị.
Quercetin tồn tại với hàm lượng lớn trong thực vật do cơ chế thích nghi, được
hình thành trong quá trình chuyển hóa thứ sinh trong cơ thể thực vật. Quercetin tồn tại
với hàm lượng cao trong các loại chè, táo, hành tây... Quercetin có mặt trong nhiều
loại thực vật khác nhau, nhưng trong công nghiệp dược phẩm chủ yếu được thu nhận
nhờ quá trình thủy phân từ rutin (quercetin-3-O-rutinosid). Tại Việt Nam và một số
nước châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn độ quercetin được thu nhận chủ yếu từ
rutin của hoa cây hòe (Sophora japonica L).
Tuy nhiên,các loại thực vật khác cũng được biết đến có nhiều flavonoid nói
chung và quercetin nói riêng tồn tại ở nhiều dạng liên hợp, có mặt trong một số bài
thuốc dân gian lại chưa được đề cập nghiên cứu. Khi thu nhận quercetin aglycol
(quercetin tự do) ở nhóm thực vật này, nếu tiến hành theo cách tinh chế từng dạng
quercetin liên hợp và sau đó thủy phân các dạng liên hợp đã tinh chế đó, theo cách
như thu nhận quercetin tự do từ rutin thì sẽ gặp nhiều khó khăn.
Vì vậy, vấn đề đặt ra hiện nay là cần nghiên cứu điều kiện chiết xuất, thủy phân

để thu nhận quercetinanglycol trực tiếp từ thực vật, không qua giai đoạn trung gian
nhờ vào dạng quercetin liênhợp. Để giải quyết được vấn đề này thì cần phải nghiên

9


cứu các phương pháp đánh giá nhằm xác định quercetin ở dạng tự do và liên hợp,
cũng như độ ổn định của quercetin về hóa lý và sinh học trong quá trình thu nhận.
Để góp phần đáp ứng nhu cầu thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên
cứu tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học của quercetin từ một số loài thực vật ở
Việt Nam”với mục tiêu:
- Xác địnhmột số đặc tính hóa lý và sinh học của dịch chiết methanol chứa
quercetin từ một số loài thực vật tại Việt Nam.
- Xác định các thông số sắc ký phù hợp cho phân tách quercetin trong dịch
methanol từ hoa hòe trên cột sắc ký và hệ thống HPLC.

10


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về flavonoid
1.1.1. Giới thiệu chung về flavonoid
Hợp chất flavonoid là nhóm các sắc tố màu đỏ, xanh da trời và tím ở thực vật.
Từ mô tả đầu tiên về các hiệu ứng axit và bazơ trên các sắc tố thực vật của Robert
Boyle năm 1664 đến sự hình thành các gen cấu trúc và điều tiết hình thành các hợp
chất flavonoid vào cuối thế kỷ 20, hiện nay đã thu thập được rất nhiều thông tin về cấu
trúc, hoạt động hóa học và sinh tổng hợp những hợp chất này.
Flavonoid là nhóm các phân tử có cấu trúc hợp chất vòng thơm, đa dạng và
có nguồn gốc từ axit amin Phenilalanin và malonyl-coenzyme A (CoA; thông qua con
đường chuyển hóa axit béo). Các hợp chất flavomoid bao gồm 6 phân nhóm chính

được tìm thấy trong hầu hết các thực vật bậc cao. Các nhóm này gồm các chalcones,
flavon, flavonol, flavandiols, anthocyanin, và tannin (hoặc pro anthocyanidins); nhóm
thứ bảy là aurones khá hiếm gặp trong tự nhiên [7,19].
Hơn 6000 loại flavonoid khác nhau đã được xác định và số lượng phát hiện
mới hiện vẫn đang tăng lên. Các flavonoid khác nhau có chức năng sinh học đa dạng,
bao gồm bảo vệ chống lại tia cực tím (UV) và tác nhân gây bệnh thực vật, tín hiệu
trong quá trình sần, vận chuyển auxin, cũng như màu sắc của hoa như một tín hiệu thu
hút côn trùng thụ phấn [43,60,65 ].
Hợp chất Flavonoidgiúp cho việc hiển thị màu sắc mùa thu (chuyển màu lá) ở
nhiều loài thực vật, có thể bảo vệ tế bào lá khỏi tổn thương, nâng cao hiệu quả thu hồi
chất dinh dưỡng trong quá trình lão hóa. Flavonol có lẽ là chất flavonoid quan trọng
nhất tham gia vào phản ứng stress; chúng là những flavonoid có hoạt tính được biết
đến từ trước, phổ biến và có tác dụng tới hoạt động sinh lý mạnh [59,65,66].
1.1.2. Sinh tổng hợp flavonoids
Các đột biến ảnh hưởng đến tổng hợp flavonoid đã được phân lập trong một
loạt các loài thực vật. Nhiều nỗ lực đã được thực hiện trong việc làm sáng tỏ các
đường sinh tổng hợp của flavonoid từ góc độ di truyền. Ngô (Zea mays), snapdragon
(Antirrhinum majus), và cây dã yên thảo (Petunia hybrida) được xây dựng thành các
mô hình đầu tiên trong hệ thống này, dẫn đến sự cô lập của nhiều gen flavonoid cấu
11


trúc và điều tiết [60,65]. Gần đây, cây Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) được nghiên
cứu và phân tích sự điều chỉnh và việc chuyển hóa của con đường flavonoid ở thực
vật. Việc sử dụng Arabidopsis để nghiên cứu sinh tổng hợp flavonoid có ưu điểm là
các gen sao chép đơn mã hóa tất cả các enzyme chuyển hóa flavonoid trung tâm,
ngoại trừ flavonol synthase (FLS), được mã hóa bởi 6 gen, nhưng chỉ có 2 gen (FLS1
và FLS3) có hoạt động đã được chứng minh locus di truyền cho cả hai gen cấu trúc và
điều hòa được xác định chủ yếu dựa trên đột biến xóa bỏ hoặc giảm sắc tố hạt; do đó
loci được đặt tên là testa trong suốt hoặc đột biến. Hầu hết các gen cấu trúc, cũng như

một số gen điều hòa có tương quan với locus đột biến cụ thể trong cây Arabidopsis.
Loài này dường như không sử dụng flavonoid theo cách tương tự như một số loài
Falcone Ferreyra et al.

khác tuy nhiên, những đột biến này có ích trong việc xác định vai trò của các hợpFlavonoids
chất in plants
này trong các quá trình như bảo vệ tia cực tím và vận chuyển auxin [14,63,65].
A
FLAVO NO LS

4-coumaroyl CoA
+ 3 malonyl CoA
M Y B 1 1 / 1 2 /1 1 1

KAEMPFEROL

CHS
M Y B 1 1 /1 2 /1 1 1

naringenin chalcone

naringenin

F3H

FLS M Y B 1 1 / 1 2 / 1 1 1
FLS M Y B 1 1 / 1 2 /1 1 1
F3’H
dihydroquercetin
dihydrokaempferol

M Y B 1 1 /1 2 /1 1 1

CHI

QUERCETIN

DFR

M Y B 1 1 / 1 2 /1 1 1
P A P 1 /P A P 2
P A P 1 /P A P 2
DFR T T 8 / G L 3 / E G L 3
T T 8 /G L 3 /E G L 3
TTG 1
TTG 1

LAR
tion
riza flavan-3-ol
leucopelargonin
e
m
y
l
T T 2 /T T 8 /T T G 1
po
ANS
P R O A N T H O C Y A N ID IN S
ANR

poly
pelargonin
m er
flavan-3-ol
izat
T T 2 /T T 8 /T T G 1
ion
UFGT

leucocyanidin

P A P 1 /P A P 2

ANS T T 8 / G L 3 / E G L 3
TTG 1

cyanidin
P A P 1 /P A P 2

UFGT T T 8 / G L 3 / E G L 3
TTG 1

PELARGONIN
3-GLUCOSIDE

A N T H O C Y A N IN S

CYANIDIN
3-GLUCOSIDE

166.659 mm
Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp Flavonoids
và Quercetin ở A. thaliana [65]
n
io
B

iz
er

at

PHLOBAPHENES

Chú thích: Enzymes và các chất trung
m gian được biểu diễn bằng chữ màu đen, các
y
ol

4-coumaroyl CoA
chất điều hoà có màu.
Sàn phẩm
cuối flavan-4-ol
cùngp là chữ in hoa. CHS, Chalcone synthase; CHI,
+ 3 malonyl
CoA
P1
P1
chalcone isomerase; C F3H
Flavanone

3 FNR
hydroxylase;
F3'H, flavonoid-3'-hydroxylase; DFR,
C 1 /P L
P1
P1
1 /P L
R /B

CHS

R /B

C 1 /P L

C 1 /P L

R /B
dihydroflavonol 4-reductase;
FNR,R / B flavanone-4-reductase;
ANS, anthocyanidin synthase,
naringenin chalcone

UFGT, UDP-glucose flavonoid

naringenin
F3’H
CHI
3-O glycosyltransferase,
F3H C 1 / P L

R /B

FLS

F3’H

eriodictyol

P1
C 1 / P L synthase
FLS,F3H
flavonol
C 1 /P L
R /B
R /B

dihydrokaempferol
dihydroquercetin
QUERCETIN biến
Các KAEMPFEROL
flavonoid được
tổng hợp qua đường
phenylpropanoid,
P1
FLS
FLAVONO L

C 1 /P L
R /B

P1

P1
C 1 /P L
R /B

DFR C 1 / P L

P1

DFR C 1 / P L

FLAVONOL

phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA, cuối cùng đi vào con đường sinh tổng hợp
R /B

leucopelargonin

R /B

leucocyanidin

flavonoid (Hình 1.1). Enzyme đầu tiên
đặc hiệu cho conANS
đường
flavonoid là chalcone
C 1 /P L
ANS C 1 / P L
R /B

R /B

cyanidin

pelargonin
UFGT
A N T H O C Y A N IN S

C 1 /P L
R /B

12

UFGT

PELARGONIN
3-GLUCOSIDE

FIGURE 2 | RegulationoftheflavonoidpathwayinArabidopsisthaliana(A)

C 1 /P L
R /B

CYANIDIN
3-GLUCOSIDE

isomerase; F3H, flavanone 3-hydroxylase; F3′ H, flavonoid-3′ -hydroxylase; DFR,

synthase xúc tác cho phản ứng tạo ra các chalcone mà từ đó tất cả các flavonoid được
tổng hợp [65].
Con đường trung tâm cho sinh tổng hợp flavonoid được bảo tồn trong thực vật,
tùy thuộc vào loài một nhóm các enzym như isomerases, reductases, hydroxy-lases, và
một số dioxygenases phụ thuộc Fe2+. Hợp chất 2-oxyglutarate phụ thuộc vào bộ xương
flavonoid cơ bản, dẫn đến các phân lớp flavonoid khác nhau. Cuối cùng, tranferases
thay đổi xương sống flavonoid với đường, nhóm methyl hoặc acyl moieties, điều
chỉnh hoạt động sinh lý của flavonoid kết quả bằng cách thay đổi độ hòa tan, phản ứng
và tương tác với các mục tiêu tế bào [67].
1.1.3 Các dạng khác nhau của flavonoid
Quercetin là một flavonoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Tên này đã được
sử dụng từ năm 1857 và có nguồn gốc từ quercetum (rừng sồi), sau là Quercus.
Quercetin là chất ức chế vận chuyển auxin có tự nhiên[49]. Quercetin là một trong
những chất flavonoid được sử dụng nhiều[16,17] với mức tiêu thụ trung bình hàng
ngày khoảng 25-50 miligam/người.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm flavonols (quercetin, kaempferol,
myricetin và isorhamnetin) [40]

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của nhóm flavones (luteolin, apigenin) [40]

13


Hình 1.4. Cấu trúc hóa học nhóm flavanones (eridictyol, hesperetin, naringenin) [40]

Hình 1.5. Cấu trúc nhóm flavan-3-ols (catechins và epicatechins) [40]

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học nhóm theaflavins [40]
14

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học nhóm anthocyanidins [40]
Các nguồn khác của quercetin có thể là nho, dâu đen, và dầu ô liu. Đồ uống
như trà xanh và rượu vang đỏ (4-16mg/l) cũng chứa một lượng đáng kể các quercetin.
Lợi ích chính của quercetin là loại flavonoid này có chất chống oxy hóa mạnh, hỗ trợ
chống lại các tế bào gốc tự do [21,35].
1.2. Quercetin và một số tính chất đặc trưng
Quercetin, một đại diện lớn của lớp flavonol, chất đã trở thành đối tượng
nghiên cứu nhận được sự chú ý đáng kể. Quercetin và dẫn xuất của nó trong thực
phẩm chứa liên kết đường, đại diện cho 60-75% lượng flavonoid trong rau củ, quả
[10,31].
Quercetin là một trong những chất có màu vàng tự nhiên. Nó được phát hiện
đầu tiên ở dạng aglycon của quercetrin có trong vỏ cây Querceus tinctorial khi thuỷ
phân trong môi trường axit thu được quercetin và một phân tử đường rhamonose:
C21H20O11 + H2O (thuỷ phân trong HCl) → C15H10O7 + CH3(CHOH)4CHO
1.2.1. Định danh và đặc tính của quercetin

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của quercetin[47]
Một phân tử quercetin (hình 1.8) có cấu trúc của năm nhóm hydroxyl, số lượng
các nhóm này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hoạt động sinh học của các
dẫn xuất quercetin.
15


1.2.2. Đặc tính chống oxi hóa của Quercetin
Các chất chống oxi hóa được nghiên cứu, sử dụng được hiểu theo nhiều nghĩa
khác nhau tùy theo hoạt động oxy hóa của nó. Halliwell và Gutteridge định nghĩa của
chất oxi hóa là bất kỳ chất nào giảm thiểu, ngăn chặn hoặc loại bỏ gốc oxi hóa tự do
gây hại cho phân tử mục tiêu. Với định nghĩa này tác dụng sinh lý của các hợp chất

chống oxi hóa là để ngăn chặn những thiệt hại cho thành phần tế bào do những hệ quả
của phản ứng hóa học liên quan đến gốc tự do. Quá trình nhặt các “rác” gốc oxi hóa
tự do của các chất thuộc nhóm Flavonoids được trình bày hình 1.9.

16


Hình 1.9. Mô tả quá trình nhặt gốc oxi hóa (R) bởi Flavonoids [46]
Các chất chống oxi hóa invintro hoạt động phụ thuộc vào cách bố trí các
nhóm chức năng trên cấu trúc lõi của nó. Cả hai cấu hình và tổng số lượng của nhóm
hydroxyl (-OH) ảnh hưởng đáng kể tới cơ chế hoạt động chống oxy hóa.
Các cấu hình vòng B hydroxyl là yếu tố quyết định tới hoạt động chống gốc
oxy hóa. Trong hình 1.9. mô tả hoạt động tách H + (nhóm –OH) của chất chống oxi
hóa và gốc oxi hóa R. làm chúng mất khả năng tác động xấu tới tế bào đích, các gốc
tự do dạng Fl-O có thể phản ứng tương tự. Kết quả của quá trình là tạo ra cấu trúc
Quinine ổn định [46]. Hoạt động chống oxi hóa invitro có thể được tăng lên bằng
phản ứng trùng hợp các flavonoid làm tăng số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử
qua đó hoạt động chống gốc oxi hóa được tăng lên.

Hình 1.10.Các vị trí thực hiện liên kết với gốc oxi hóa tự do tại vòng A, B [46]
Quercetin là chất chống oxi hóa mạnh dựa vào khả năng tách các gốc tự do và
liên kết với các ion kim loại chuyển tiếp. Khả năng chống oxi hóa đó trước hết liên
quan đến sự tồn tại của 2 loại nhóm liên kết chống oxi hóa bên trong phân tử có hình
dạng thích hợp cho việc tách các gốc tự do: nhóm catechol trong vòng B và nhóm OH
trong vòng A (hình 1.10) [46].
Theo tính toán của các nhóm nghiên cứu trong lớp flavonoid, quercetin là chất
tách ROS hữu hiệu nhất, kể cả với việc tách O2 và gốc ONOO-. Với khả năng này,
17

quercetin là chất ức chế sự peoxi hóa lipid. Quercetin gây trở ngại sự peoxi hóa lipid
bằng cách phản ứng với các gốc tự do tạo ra do sự peoxi hóa lipid. Thêm vào đó,
ngoài khả năng ngăn chặn sự phát triển của sự peoxi hóa lipid, quercetin còn làm gia
tăng lượng glutathione góp phần giảm thiểu sự hình thành các gốc tự do. Sự oxi hóa
lipid này có thể gây ra những tác động có hại cho cơ thể như gây ra bệnh tim mạch,
thoái hóa thần kinh và ứng dụng trị liệu[46].
Chính do khả năng phản ứng với các gốc tự do, quercetin làm giảm các bệnh
mãn tính [56]. Đặc biệt, bằng việc ngăn ngừa ion Ca + (trong các tế bào chết) quercetin
có khả năng bảo vệ tế bào khỏi sự oxi hóa, các gốc tự do dẫn đến lão hóa tế bào.
Begum và Terao nghiên cứu cho thấy quercetin aglycone và phức hợp các chất chuyển
hóa của nó (quercetin-3-O--D-glucuronide và quercetin-3-O--D-glucoside) có thể bảo
vệ hồng cầu khỏi sự phá hủy ở những người hút thuốc.Nghiên cứu của McAnulty và
cộng sự trên 40 vận động viên chạy điền kinh [35] cho thấy quercetin có khả năng
giảm thiểu căng thẳng cho các vận động viên.
Nghiên cứu về đặc tính chống oxi hóa của Quercetin đã có những nghiên cứu
so sánh với các chất chống oxi hóa đã được biết tới như vitamin C, vitamin E, các chất
cùng thuộc nhóm flavonoid khác,…Đặc biệt khả năng oxi hóa của quercetin được
tăng lên mạnh mẽ khi cùng tác dụng với vitamin C và axit uric [19].
1.2.3. Một số tác dụng khác của Quercetin đối với cơ thể
Quercetin là thành phần flavonoid có tác dụng tăng cường sức chịu đựng, tăng
sức bền, chống mệt mỏi; tăng quá trình hô hấp tế bào, tăng chức năng của thần kinh
và trí nhớ, có tác dụng chống oxi hóa, tăng hấp thu…
Tác dụng chống lão hóa
Quá trình sinh học liên quan đến lão hóa có thể được khắc phục chủ động bởi
một số yêu tố môi trường, ví dụ như chất chống oxi hóa tự nhiên (như vitamin E,
tỏi…). Thông qua các thuộc tính chống oxi hóa của quercetin và mối liên hệ giữa tuổi
tác và sự stress oxi hóa. Vai trò của quercetin là hình thành ảnh hưởng tích cực lên khả
năng tồn tại, phát triển độc lập, và vòng đời của các nguyên bào sợi nguyên thủy của
người (HFL-1); hơn nữa, khi các tế bào lão hóa được nuôi trong sự có mặt của
quercetin, quan sát được sự trẻ hóa [19].

18


Chống dị ứng
Quercetin là hợp chất tự nhiên có khả năng tác động các chất liên quan đến các
loại dị ứng và hoạt động như một chất ức chế tiết dưỡng bào, dẫn đến sự giảm tiết ra
tryptase, các protein tín hiệu do đại thực bào gây ra: MCP-1 và IL-6 và sự điều chỉnh
giảm histidine decarboxylase (HDC) mRNA từ một số ít dòng tế bào dưỡng bào [55].
Cũng như các hợp chất polyphenol, flavonoids khác có tác dụng chống viêm và
kháng khuẩn và thể hiện hoạt động chống dị ứng, quercetin cũng thể hiện như một
loại thuốc chống dị ứng tiềm năng. Hiện tại, tổ chức nghiên cứu dị ứng thực phẩm
(Food Allergy Herbal Formula -FAHF) đánh giá quercetin có tiềm năng tương tựchất
chống dị ứng an toàn nhưng cần có nhiều những nghiên cứu tác dụng phụ hơn để trở
thành thuốc chống dị ứng thực sự [13].
Khả năng bảo vệ hệ tuần hoàn
Quercetin cũng được đặc biệt chú ý như một hợp chất có tác dụng giúp điều trị
cũng như phòng ngừa các bệnh về tim. Trong thực tế, việc sử dụng quercetin có liên
quan sự giảm tỉ lệ chết do bệnh tim và giảm tỉ lệ đột quỵ. Pashevin [41] báo cáo số
liệu mới về đặc tính bảo vệ tim mạch của quercetin trong nghiên cứu chỉ ra, thử
nghiệm trên thỏ sau một thực đơn giàu cholesterol, sau đó cho thỏ uống trong vòng 1
tháng Corvitn (dạng hòa tan trong nước dẫn xuất Quercetin) thấy giảm đáng kể mọi
loại hoạt động thủy phân protein của phức hệ proteasome trong các mô và bạch cầu
lưu thông trong hệ mạch. Hoạt động của quercetin cũng được biết với vai trò giảm xơ
vữa động mạch [41]. Những nghiên cứu gần đây trên động vật và người huyết áp cao
cho thấy có sự giảm huyết áp sau khi bổ sung quercetin trong thực phẩm chức năng.
Chống viêm, ung thư
Các nghiên cứu về khả năng chống ung thư của quercetin đã khẳng định
quercetin ức chếcác tế bào tăng sinh đó chính là khả năng oxi hóa cũng như ức chế
kinase trong chu trình tế bào và gây ra apoptosis [19].Trước đến nay, quercetin luôn

được biết đến với khả năng ức chế in vitro sự sản xuất các enzymes đáp ứng phản ứng
viêm (ví dụ như: cyclooxygenase COX hay lipoxygenasse [27]), khả năng này cũng
được thực hiện bằng các phản ứng in vivo. Trong các nghiên cứu gần đây [69]đã
chứng tỏ quercetin có khả năng ức chế mạnh các yếu tố tăng sinh nguyên bào [19].

19


Ngăn ngừa béo phì
Quercetin là loại flavonoid phong phú nhất, chúng có khả năng chống lại nhiều
loại bệnh liên quan đến stress oxi hóa stress.
Để xác định các cơ chế phân tử ảnh hưởng bởi quercetin vào tác động sinh lý
tăng lipid máu, một số nghiên cứu nhận thấy rằng quercetin quy định về biểu hiện gen
ở gan liên quan đến quá trình chuyển hóa lipid [24]. Cụ thể, bổ sung quercetin ở chuột
giảm đáng kể bệnh béo phì cảm ứng bởi chế độ ăn uống nhiều chất béo, giảm trọng
lượng cơ thể, gan và mô mỡ trắng hơn so với những con chuột được cho ăn chỉ với
thực đơn giàu chất béo. Các chuột thí nghiệm cũng giảm đáng kể sự tăng cholesterol,
triglyceride và thiobarbituric acid trong máu.
Bổ sung quercetin trong khẩu phần ăn cũng giúp là giảm trọng lượng gan, các
mô mỡ trắng, các giọt lipit tích tụ trong gan. Để tìm ra bằng cách nào để quercetin
giúp giảm béo phì, các nghiên cứu tập trung vào các gen liên quan đến quá trình
chuyển hóa lipid trong gan. So với nhóm chuột đối chứng (bị béo phì) thì nhóm chuột
có thực đơn bổ sung quercetin sửa đổi biểu hiện của một số gen chuyển hóa liên quan
đến lipid bao gồm Fnta, Pon1, Pparg, Aldh1b1, Apoa4, Abcg5, Gpam, Acaca, Cd36,
Fdfft1 và Fasn. Các mô hình biểu hiện của các gen này được quan sát bằng phản ứng
chuỗi polymerase-transriptase và được xác định bằng hệ thống lai miễn dịch. Các kết
quả chỉ ra rằng quercetin ngăn chặn béo phì gây ra bởi chế độ ăn nhiều chất béo trong
chuột C57b1/6, và tác dụng chống béo phì của nó có liên quan đến các quy định của
lipogenesis ở mức độ phiên mã [19].
Điều trị viêm khớp

Trong sự kết hợp với các chất dinh dưỡng khác, quercetin có thể làm giảm các
triệu chứng của viêm xương khớp (viêm khớp): trong nghiên cứu với 20 bệnh nhân
viêm khớp dạng thấp có bổ sung hàng ngày cùng lúc 3 loại thuốc: quercetin (16
6mg/viên); với vitamin C (33 mg/viên), lipoic acid (300 mg/viên) trong vòng 4 tuần
liên tiếp thì thấy rằng nồng độ cytokine gây viêm hoặc protein C-reactive (CRP) trong
huyết thanh không có sự khác biệt đáng kể và cũng chưa có tác dụng điều trị. Nhưng
khi nghiên cứu lên tới 46 người và thời gian kéo dài lên tới 3 tháng có kết hợp với
hoạt động hàng ngày thì đã thấy dịch lỏng được tiết ra trong các mô viêm khớp [30].

20


Giảm nguy cơ mắc hen suyễn
Nghiên cứu về mối quan hệ giữa quercetin hay các dẫn xuất của nó đối với các
triệu chứng của bệnh hen suyễn do các tác nhân môi trường (phấn hoa, côn trùng) gây
nên cũng chưa được rõ nét. Tuy nhiên, các tài liệu cho thấy tác động của một loại
quercetin glycoside là isoquercitrin enzyme đã tác động lên những triệu chứng của dị
ứng dạng trên. Điều trị với 100-200mg/ngày với dạng quercetin glycoside trong vòng
8 tuần có hỗ trợ những hiện tượng dị ứng dạng trên tại mắt nhưng tại mũi thì chưa có
kết quả đáng tin cậy [21].
Điều trị tiểu đường
Nghiên cứu những con chuột mắc bệnh tiểu đường cho thấy sự gia tăng đáng
kể về cácchỉ số tỉ trọng giữa thận/trọng lượng cơ thể, lượng đường trong máu, lượng
albumin bài tiết trong nước tiểu (UAE), creatinine trong huyết thanh (SCR), lượng urê
trong máu (BUN), và độ thanh thải creatinin (CCR). Các biểu hiện của TGF-β1 và
CTGF trong thận là xác định bằng cách sử dụng real-time PCR và phương pháp
Western blot [26].
Các biểu hiện của TGF-β1 và CTGF là trong nhóm bệnh tiểu đường cao hơn so
với nhóm quercetin. Tuy nhiên, những biểu hiện quá mức của cả hai TGF-β1 và
CTGF trong các mô thận của chuột bị tiểu đường đã giảm sau khi tiêm quercetin.

Những kết quả này cho thấy rõ ràng rằng quercetin cải thiện chức năng thận ở chuột
tiểu đường bằng cách ức chế các biểu hiện quá mức của yếu tố TGF-β1 và CTGF
trong thận [26].
Tăng cường thể lực
Một nghiên cứu trên 254 đối tượng đã tham gia thấy rằng lượng O 2 tiêu thụ
max dao động 41-64 ml/kg/phút (trung bình 46 mL/kg/phút), trong khi thời gian điều
trị trung bình là 11 ngày với một liều lượng trung bình 1000 mg quercetin/ ngày. Độ
lớn hiệu quả (ES) được tính là sự khác biệt trung bình chuẩn hóa, và phân tích meta
được thực hiện bằng cách sử dụng một mô hình tác động ngẫu nhiên [21].
Tính trung bình, quercetin cung cấp một lợi ích đáng kể về mặt thống kê trong
khả năng luyện tập thể dục thể thao của con người làm gia tăng thể tích O 2 max và
hiệu suất luyện tập với chỉ số tin cậy ES = 0,15 tương đương chỉ có khoảng 3% số
người được sử dụng với quercetin trong có hiệu quả [21].
21


1.3. Các phương pháp tách chiết hợp chất
Phương pháp tổng hợp quercetin cũng từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên đó là
phương pháp thủy phân Rutin có trong hoa hòe.
1.3.1. Khái quát về phương pháp tách chiết
Việc chiết xuất là cần thiết để cô lập và chiết xuất các thành phần của thực vật
để áp dụng trong ngành công nghiệp y tế dựa trên tầm quan trọng của cây trồng đối
với sức khoẻ. Có nhiều phương pháp tách chiết và mỗi loài cây, thảo dược có thể phù
hợp với một hoặc nhiều phương pháp khác nhau (bảng 1.2). Các bước chuẩn bị cho
tách chiết mẫu thực vật:
Lựa chọn mẫu thực vật phù hợp trước khi tách chiết rất quan trọng. Ta cần lựa
chọn mẫu phù hợp nhất để đem lại các kết quả tốt nhất sau khi tách chiết.
Mẫu tươi và mẫu khô: Các mẫu khô được ưu tiên hơn vì chúng chứa hàm
lượng flavonoid cao hơn so với mẫu tươi và thời gian bảo quản mẫu khô lâu hơn [9].
Mẫu nghiền và mẫu bột: Sử dụng các mẫu này có thể làm tăng bề mặt tiếp xúc

giữa mẫu thực vật và các dung môi chiết xuất. Các mẫu bột chứa các hạt nhỏ hơn các
mẫu nghiền, dẫn đến sự tiếp xúc bề mặt tốt hơn.Trong khi đó việc nghiền mẫu chỉ làm
mẫu nhỏ hơn, do đó mẫu bột phổ biến hơn.
Phương pháp tiền tách chiết: Có 4 phương pháp tiền tách chiết: Sấy khô bằng
khí, sấy bằng lò vi sóng, sấy khô và sấy đông khô (Bảng 1.2) [7].

22


Bảng 1.2. So sánh các phương pháp tiền tách chiết [7]
Phương
pháp
Cách sử
dụng

Thời gian

Đặc điểm

Ưu điểm

Sấy bằng khí

Sấy bằng lò vi
sóng

Sử dụng khí, không

Sử dụng bức xạ

khí để làm khô

điện từ

3 - 7 ngày, vài tháng

Ngắn hơn sấy

cho đến một năm

bằng khí

Không sử dụng nhiệt
độ cao

Sấy đông
khô

Sử dụng

Dựa vào

năng lượng

hiện tượng

nhiệt

thăng hoa

Ngắn hơn
sấy bằng
khí

Qua đêm
(12h)

Có hiện tượng

Làm khô

Làm khô

làm nóng đồng

nước bằng

bằng nhiệt

thời

nhiệt độ

độ thấp

Các hợp chất chịu
nhiệt không bị thay đổi

Nhanh

hoạt tính
Hạn chế

Sấy khô

Không làm
biến tính

Thời gian tiến hành

Đôi khi gây ra

Ảnh hưởng

lâu; Mẫu có thể bị

sự giảm thiểu

đến chất

nhiễm bẩn ở điều kiện

lượng

chống oxi

nhiệt độ không ổn định phytochemicals

hoá

Hàm lượng
phenolic cao
hơn
Mẫu có thể
bị mất.Tốn
kém

1.3.2. Các phương pháp tách chiết
Có nhiều phương pháp tách chiết gồm phương pháp truyền thống và hiện đại
với mục đích là tách được các hợp chất mong muốn. Các phương pháp tách chiết
truyền thống: Ngâm, chiết, thấm và sắc; chiết bằng máy chiết Soxhlet (Bảng 1.3).
Các phương pháp tách chiết hiện đại: Chiết bằng lò vi sóng (MAE), chiết bằng
sóng siêu âm (UAE), chiết nhanh với dung môi (ASE) và chiết siêu tới hạn (SFE)
(Bảng 1.4). Các phương pháp ASE và SFE được sử dụng ít vì tốn kém và hiệu quả
thấp. Mỗi phương pháp tách chiết được sử dụng cần phù hợp với mẫu chiết và dung
môi chiết khác nhau. Dung môi chiết có thể phân cực hoặc không phân cực. Các dung
môi thường sử dụng như ethanol, methanol, n-hexane, ethyl acetate [7].

23


Bảng 1.3. So sánh các phương pháp tách chiết truyền thống [7]
Phươn
g pháp

Ưu
điểm

Đặc điểm

- Ngâm là phương pháp lấy bột thực
vật ngâm với dung môi nhiệt độ
phòng ít nhất 3 ngày để giải phóng
các chất phytochemical hòa tan. Sau
đó, hỗn hợp này được lọc qua màng
Ngâm,
lọc, nhiệt được các dung môi chiết sẽ
truyền,
xác định loại hợp chất chiết xuất.
thấm
- Truyền và sắc có quy trình tương tự
và
như quá trình ngâm nhưng thời gian
sắc
nhanh hơn.
- Thẩm thấu có nguyên tắc tương tự 3
phương pháp trên. Ở phương pháp
này mẫu được ngâm trong thời gian
trên 2 giờ.
- Mẫu mịn được đặt trong một túi xốp
hoặc "bao" được làm từ giấy lọc hoặc
xenlulô nằm trong buồng của thiết bị
Chiết Soxhlet.
bằng
- Dung môi chiết xuất được đun nóng
máy
trong bình đáy, và bay hơi vào buồng
chiết
mẫu, ngưng tụ trong bình ngưng và
Soxhlet nhỏ giọt.

- Khi lượng chất lỏng, dung dịch
trong bình cạn và quá trình chiết lặp
lại.

24

Nhược
điểm

Ứng dụng

Dùng để
Dễ
Chất thải tách chiết các
dàng
vẫn chất trong các
và đơn chứa
loài như
giản
dung
P. guajava
môi
L, G.
atriviridis, P.
oleracea,
C.caudatus,
M.oliefera

Chỉ
cần

một
lượng
nhỏ
dung
môi

Dùng để tách
Dễ cháy, chiết các chất
tốn kém, trong các loài
gây
như A. indica
ô nhiễm (Neem), M.
oliefera,
C.
asiatica


Bảng 1.4 So sánh các phương pháp tách chiết hiện đại [7]
Phương

Đặc điểm

pháp

Ưu điểm

Nhược điểm

Ứng dụng

- Lò vi sóng tương tác với - Thời gian - Hạn chế các cực của vật liệu phân cực và tách
Chiết
bằng lò
vi sóng
(MAE)

chiết hợp

cực có thể gây nóng ở gần bề giảm

Để

chiết

chất xuấttriterpene

phenolic nhỏ

từ

các

loài

mặt của vật liệu và nhiệt - Cải thiện sự

C.asiatica,

được truyền bằng cách dẫn.

D.hispida,

phục hồi của

- MAE là phương pháp cólợi chất

phân

A.paniculata

cho các phân tử cực và tích
dungmôi có hằng số điện môi
cao.
- Sử dụng sóng siêu âm từ 20 - Thời gian - Sóng siêu kHz đến 2000 kHz để tăng bề tách

Chiết
bằng
sóng
siêu âm
(UAE)

chiết âm

mặt tiếp xúc giữa dung môi nhanh.

kHz

và mẫu và độ thấm của thành - Sử dụng ít ảnh
tế bào.

dung môi

trên
có

Để

tách

20 chiết các chất
thể từ

W.

hưởng omnifera, C.

đến các chất formosum

- Tính chất của tế bào thay đổi Chi phí thấp

thông qua sự

tế bào để giải phóng các hợp

hình thành của

chất và tăng cường sự vận

các gốc tự do

chuyển khối lượng của dung
môi vào tế bào thực vật.
1.4. Giới thiệu một số thực vật nghiên cứu
1.4.1. Rau má
Rau má có tên khoa học Centella asiatica là loài cây một năm thân thảo, thuộc
phân họ Mackinlayoideae của họ Hoa tán (Apiaceae), nguồn gốc từ Australia, các đảo
Thái Bình Dương, Melanesia, New Guinea, Malesia và châu Á. Tại Việt Nam, rau má
mọc ở khắp nơi những khu vực ẩm ướt loại cây này đều phát triển tốt. Mùa phát triển
nhất là tháng 4-6 hằng năm.
Rau má có chứa các thành phần như: Triterpen, hợp chất polyacetylen, tinh
dầu, flavonoid (kaempferol, quercetin), steroid (β-sitosterol, stigmasterol, campestrol).

25