BIẾN nạp GEN ở mô sẹo mía (saccharum officinarum l ) BẰNG VI KHUẨN agrobacterium tumefaciens và tái SINH CHỒI SAU CHUYỂN GEN

BIẾN NẠP GEN Ở MÔ SẸO MÍA (Saccharum officinarum L.)
BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
VÀ TÁI SINH CHỒI SAU CHUYỂN GEN


DANH SÁCH NHÓM 7

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Phạm Thiên Phú
Hồ Hữu Trung
Đặng Lê Tú Trinh
Khâu Thị Hoàng Uyên
Hồ Tường Vi
Huỳnh Thanh Phương


Các nội dung chính

1.

CNSHTV và công nghiệp.

2.

Đối tượng nghiên cứu

3.

Phương pháp biến nạp gen

4.

Biến nạp gen ở mô sẹo mía bằng vi khuẩn A. tumefaciens và tái sinh chồi sau chuyển gen.


1. CNSHTV VÀ CÔNG NGHIỆP
1.1. Công nghệ sinh học thực vật trong TK XXI:

-Chọn giống và nhân giống cây trồng là ngành khoa học xuất hiện từ rất lâu đời, từ khi con người
biết trồng trọt.

-Ngày nay cùng với những tiến bộ của công nghệ gene, công nghệ tế bào, những thiết bị hiện đại,
khoa học nhân giống và chọn giống đã phát triển vượt bậc, tiến lên một vị thế mới đó là khoa học công
nghệ sinh học về thực vật.

-Công nghệ sinh học thực vật đã có những bước chuyển biến quan trọng trong nhiều lĩnh vực và
thành tựu vượt xa mong đợi, mang lại nhiều hứa hẹn.


1.2. Quang cảnh của nền công nghiệp:

Trên Thế giới: đang có sự biến động sâu sắc về nhiều mặt và đặt ra những thách
thức mới đối với nền kinh tế của các quốc gia.

CÁC NƯỚC KÉM PHÁT

NHẬT
BẢN
NGA
ĐỨC

TRIỂN

Tại Việt Nam:


2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng: Cây mía – Saccharum officinarum L.
- Nguồn gốc: Xuất hiện từ lâu trên Trái Đất, khi châu Úc và châu Á chưa tách rời.Chúng vốn là
các loài cỏ, có thân cao từ 2-6 m, chia làm nhiều đốt, bên trong có chứa đường. Tất cả các giống
mía trồng đều là các giống mía lai nội chi hoặc nội loại phức tạp.


-

Giá trị kinh tế
+ Xét về mặt công nghiệp: Trong thế kỷ 21, cây mía còn là nguồn cung cấp

nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm, hóa phẩm, dược phẩm, chế biến cồn
sinh học (ethanol) … Ngoài sản phẩm chính là đường, các sản phẩm phụ của mía đường
nếu được khai thác triệt để, giá trị còn có thể gấp 3-4 lần chính phẩm.
+ Xét về mặt sinh học:
. Khả năng tạo ra sinh khối lớn
. Khả năng tái sinh mạnh

. Khả năng thích ứng rộng
Cây mía được coi là một trong sáu cây nhiên liệu sinh học tốt nhất của thế giới
trong tương lai


2.2. Ngành công nghiệp mía đường
- Trên thế giới:
+ Ngành mía đường thế giới phát triển mạnh từ thế kỷ thứ 16. Đầu những năm cách mạng công nghiệp (1750-1830) chỉ khoảng 820 ngàn tấn/năm và
trước thế chiến thứ nhất (1914-1918) là khoảng 18 triệu tấn/năm
+ Theo thống kê của Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc (FAO, 2012), hiện nay hàng năm toàn thế giới sản xuất được khoảng 1.832.541 ngàn tấn
mía. Sản lượng mía toàn thế giới năm 2012 gấp 4,09 lần sản lượng năm 1961.


+ Bước sang thế kỷ 21, do độc canh cây mía với diện tích lớn, lạm dụng hóa học (phân hóa học, thuốc trừ sâu bệnh, thuốc trừ cỏ,…), sử dụng máy móc
cơ giới lớn đã dẫn đến xói mòn, thoái hóa đất, ô nhiễm môi trường, tăng cao giá thành sản xuất
Do vậy một số nước đã và đang nghiên cứu áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật để thiết lập chế độ canh tác mía bền vững thay thế cho chế độ canh tác cũ.


- Thực trạng ở Việt Nam:
+ Từ năm 2001 trở lại đây, diện tích trồng mía trên cả nước giảm so với năm 2000 do không cạnh tranh nổi với một số cây trồng có thu nhập cao hơn
khiến tình trạng thiếu nguyên liệu thường xuyên xảy ra.


+ Dù khoảng cách đã được rút ngắn nhưng năng suất mía
Việt Nam (bình quân chỉ 60 tấn/ha) vẫn thấp hơn bình quân thế
giới (70 tấn/ha) và chất lượng kém hơn.
+ Hiệu suất đường của Việt Nam là 4-5 tấn đường/ha,
trong khi Thái Lan 7-8 tấn/ha, Brazil 9-21 tấn/ha.
=> Cần áp dụng kỹ thuật sinh học trong sản xuất mía để
nâng cao năng suất và chất lượng cho ngành sản xuất mía đường ở

Việt Nam.


3. BIẾN NẠP GIÁN TIẾP THÔNG QUA AGROBACTERIUM

3.1 Agrobacterium
- Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật được sử
dụng như vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật.
- A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là
Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây.

Vi khuẩn A. tumefaciens


3.2 Cơ chế gây bệnh của A. tumefaciens
- Sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối
loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u.
- Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật
theo ý muốn.


3.3. Nuôi cấy phát sinh mô sẹo (Callus)

- Là khối mô phát triển mạnh mẽ vô tổ chức trên hoặc xung quanh
bề mặt vết thương hay vết cắt; hoặc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
- Thông thường, môi trường tạo mô sẹo cần bổ sung auxin ở nồng
độ cao, auxin có thể sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với cytokinin. Tuy
nhiên, đối với mẩu có nồng độ auxin nội sinh cao, khi không có sự bổ
sung của auxin ngoại sinh, mẫu cũng có thể phát sinh mô sẹo.

4. BIẾN NẠP GEN Ở MÔ SẸO MÍA BẰNG VI KHUẨN
A. Tumefaciens VÀ TÁI SINH CHỒI SAU CHUYỂN GEN
4.1. Vật liệu:
- Chồi mía POJ (Proefstation Oast Java) in vitro thuộc loài Saccharum
officinarum L. do Công ty Cổ phần đường Quảng Ngãi cung cấp được dùng làm
nguồn vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm.
- Môi trường: Môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) bổ sung đường
sucrose (20 g/L), agar (8 g/L), nước dừa 10% và các chất khác nhau tùy theo từng
thí nghiệm.


4.2. Các thí nghiệm
4.2.1. Thí nghiệm khảo sát môi trường thích hợp cho sự tạo sẹo
- Bố trí thí nghiệm:
Môi trường cho thí nghiệm 1

- Môi trường MS

+ 1 mg/L 2,4-D (D1)

- Đường Sucrose (20 g/L)

+ 2 mg/L 2,4-D (D2)

- Agar (8 g/L)
- Nước dừa 10%
- Polyvinylpyrrolidone (PVP) (0,8 g/L)

Chồi mía (2-3 mm)

+ 3 mg/L 2,4-D (D3)
+ 4 mg/L 2,4-D (D4)

MS bổ sung PVP

Để trong tối
o
22 – 25 C


- Kết quả:
+ Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy, các khúc cắt thân bắt đầu hình thành sẹo tại vị trí cắt gần với gốc (Bảng 1).
+ Sau 4 - 6 tuần, các mẫu mô sẹo trở nên rắn chắc và ngả sang màu vàng (Hình 1). Các mẫu thân không tạo sẹo thì đen dần và cuối cùng chết đi.

Nghiệm thức

Tỉ lệ mẫu tạo sẹo (%)

D1

a
55,56 ± 3,85

D2

b
64,44 ± 3,85

D3

c
91,11 ± 3,85

D4

d
75,56 ± 3,85

Bảng 1. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tạo sẹo

Hình 1. Mô sẹo sau 6 tuần


4.2.2. Thí nghiệm khảo sát môi trường thích hợp cảm ứng tạo chồi từ sẹo

- Bố trí thí nghiệm:
Môi trường cho thí nghiệm 2
+ 0,0 mg/L BA (B0)
+ 0,5 mg/L BA (B0,5)

- Môi trường MS
- Đường Sucrose (20 g/L)
- Agar (8 g/L)
- Nước dừa 10%

+ 1,0 mg/L BA (B1)
+ 1,5 mg/L BA (B1,5)
+ 2,0 mg/L BA (B2)
+ 2,5 mg/L BA (B2,5)

Chiếu sáng 16h/ngày
3000 lux

Mô sẹo ở TN1 (2-3 mm)

MS bổ sung BA


Nghiệm thức

Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%)

Số chồi / mẫu (chồi)

B0

c
5,56 ± 4,81

0–1

ab

B0,5

22,22 ± 4,81

B1,0

30,56 ± 4,81

B1,5

30,56 ± 4,81

B2,0

19,44 ± 4,81

B2,5

19 ,44 ± 4, 81

a
a

1
2–5
1–2

b
b

Bảng 2. Ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh chồi của sẹo mía

1
1
Hình 2. Ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi từ sẹo sau 5 tuần nuôi cấy

- Sau 10 ngày, sẹo đặt trên các môi trường bắt đầu cảm ứng tạo chồi
- Sau 5 tuần nuôi cấy, các nghiệm thức có sự khác biệt về số chồi phát sinh từ một mẫu mô ban đầu


4.2.3. Thí nghiệm khảo sát nồng độ PPT tối thiểu gây chết 100% cho mô mía
- Bố trí thí nghiệm:
Môi trường cho thí nghiệm 3
+ 0 mg/L PPT (P0)

- Môi trường MS
- Đường Sucrose (20 g/L)
- Agar (8 g/L)
- Nước dừa 10%
- Polyvinylpyrrolidone (PVP) (0,8 g/L)

+ 1 mg/L PPT (P0)
+ 2 mg/L PPT (P0)
+ 3 mg/L PPT (P0)
+ 4 mg/L PPT (P0)
+ 5 mg/L PPT (P5)

Để trong tối
o
(22 - 25 C)

Mô sẹo ở TN1(2-3 mm)

MS bổ sung PVP, PPT

-

Kết quả:

Các mẫu mô sẹo đối chứng trên môi trường không có PPT vẫn giữ nguyên màu sắc như ban đầu và phát triển tốt. Trong khi đó, các mẫu trên môi trường có PPT
sau 1-2 tuần bắt đầu hóa vàng, nâu tùy theo nồng độ.

Nghiệm thức

Tỉ lệ mẫu sống (%)

P0

100,00 ± 0,00

P1

50,00 ± 8,33

P2

38 ,89 ± 4, 81

P3

36,11 ± 4,81

P4

16,67 ± 0,00

P5

0,00 ± 0,00

a

b
c
c
d
e

Bảng 3. Ảnh hưởng của PPT lên khả năng sống của sẹo mía


4.2.4. Thí nghiệm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen và tái sinh chồi sau chuyển gen
- Bố trí thí nghiệm
+ Chuẩn bị dịch khuẩn:

Dịch tạo sẹo ở nghiệm thức D3
Vi khuẩn A. tumefaciens
+ AS đến nồng độ 100μM và
Thu sinh khối

150μM
Lắc đều và để yên trong 30 phút

20 ml YEP lỏng
rifampicin 50 mg/l

kanamycin 50 mg/L

OD600 = 0,6–0,8


+ Ủ mẫu với dịch khuẩn:

15’ hoặc 30’

Thấm khô bằng giấy
thấm vô trùng trong
15’ hoặc 30’

Mô sẹo D3 ở TN1(2-3 mm)

Ngâm vào dịch
khuẩn đã chuẩn bị

Môi trường D3 của
TN1


Thử GUS
Nước cất +
cefotaxime (500
mg/L)

Mô sẹo sau 3 ngày
đồng nuôi cấy

5-6 tuần

Chiếu sáng
Thử GUS

16h/ngày
Cắt là và thân

Môi trường B1 của TN2 + 5mg/L
PPT


- Kết quả:
Tiến hành trên 8 nghiệm thức kết hợp sự thay đổi các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen

Thời gian ủ mẫu với dịch

Thời gian phơi khô mẫu sau

khuẩn

khi ủ

100 μM

15’

15’

T2

100 μM

15’

30’

T3

100 μM

30’

15’

T4

100 μM

30’

30’

T5

150 μM

15’

15’

T6

150 μM

15’

30’

T7

150 μM

30’

15’

T8

150 μM

30’

30’

Nghiệm thức 

Nồng độ acetosyringone

T1