Nghiên cứu ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa để phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật từ rau quả

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VŨ KHÁNH TÙNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ĐỂ
PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT TỪ RAU QUẢ
Chuyên ngành: Hóa phân
tích
Mã
số:60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Vân
Anh

THÁI NGUYÊN - 2017


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn và chỉ bảo tận tình của TS.
Nguyễn
Vân Anh trong suốt thời gian học tập vừa qua cũng như trong thời gian
thực hiện luận văn này.
Xin trân trọng ghi ơn các quí Thầy Cô, nhất là các Thầy Cô trong
khoa Hóa Trường Đại Học Khoa Học Thái Nguyên đã nhiệt tình dạy
những kiến thức, những phương pháp nghiên cứu căn bản và những công
cụ hỗ trợ đắc lực cho quá trình làm luận văn và nghiên cứu hiện tại cũng
như trong tương lai của những người đi sau chúng em.
Xin bày tỏ lòng biết ơn với gia đình, các anh chị em đồng nghiệp và

thủ trưởng cơ quan đã luôn động viên giúp đỡ, làm chỗ dựa tinh thần cho
tôi trong những ngày đi học và làm luận văn, cảm ơn các bạn. Cảm ơn
các anh chị em trong lớp Cao học Hóa Phân tích K9B đã tương trọ cho
tôi tròn quá trình học tập và nghiên cứu.
Luận văn được hỗ trợ kinh phí từ đề tài Bộ Giáo dục và Đào tạo mã
số
B2014-01-65
Trântrọng cảm ơn
Học viên

Vũ Khánh Tùng

a


MỤC LỤC

Danh

mục

các

ký

hiệu

.............................................................................

viết

a

tắt

Mục

lục

................................................................................................................
Danh

mục

b
các

bảng..............................................................................................

d

Danh

mục các hình .............................................................................................. e
MỞ

ĐẦU

............................................................................................................. 1
CHƯƠNG
1.

TỔNG
.........................................................................................3
1.1.
Vấn
đề
dư
lượng
............................................ 3

thuốc

BVTV

1.2.
Nhóm
chất
BVTV
cơ.................................................................. 5

QUAN
trong

họ

nông
lân

1.3.
Cảm
biến

sinh
hóa.......................................................................... 6

hữu

học

điện

1.3.1.
Cảm
Enzyme.................................................................................... 10
1.3.2.
Cảm
biến
miễn
.................................................... 14

dịch

biến

(immunosensors)

1.4.
Polyme
dẫn
......................................................................................... 16
1.4.1.
Giới

thiệu
tổng
................................................ 16

quát

về

polyme

điện
dẫn

điện

1.4.2.
Polyanilin
.................................................................................... 19

(PANi)

1.4.3.
Polypyrrol
...................................................................................... 21
1.4.4. Các phương
........................... 23

pháp

tổng

hợp

điện

sản

hóa

polyme

(PPy)
dẫn

điện

1.5. Tính hình nghiên cứu trong nước về cảm biến điện hóa sinh học
............. 26
CHƯƠNG 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM..28
2.1.
Thực
............................................................................................... 28

a

nghiệm


2.1.1.
Thiết

bị,
dụng
...................................................................................... 28

cụ

2.1.2.
Hóa
chất
sử
..................................................................................... 29

dụng

2.1.3. Lựa chọn hệ cảm biến và nghiên cứu các đặc trưng cơ
bản.................... 30
2.2.
Các
phương
pháp
biến............................... 31
2.2.1. Phương pháp
[61].................. 31

phổ

nghiên
hồng

2.2.2.

Phương
pháp
kính
(SEM)........................................ 32
2.2.3. Phương pháp
.............................. 33

điện

hóa

cứu

đặc

ngoại

biến

hiển

vi

trong

phân

2.2.4.
Các
phương

pháp
..................................................................... 35

a

trưng
đổi

Fourier

điện
tích

của

nồng
phân

tử
độ

cảm
(FT-IR)
quét
chất
tích


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO
LUẬN............................................................39

3.1. Tổng hợp điện hóa màng PANi và đặc trưng tính chất
.............................. 39
3.1.1. Biến tính bằng kỹ thuật von-apme vòng (CV)
........................................ 39
3.1.2. Đặc trưng cấu trúc màng PANi bằng phổ FT-IR
.................................... 40
3.1.3. Hành vi điện hóa của điện cực PANi/SPE
.............................................. 41
3.1.4. Phổ Raman của điện cực PANi-Gr/SPE..................................................
41
3.2. Cố định điện hóa Enzym AChE trên màng PANi - Gr ..............................
43
3.3. Các đặc trưng bề mặt của cảm biến điện hóa trước/sau biến tính
.............. 44
3.4. Ứng dung cam biến sinh hoc điẹn hóa tích hơp xác đinh du luơng
thuốc
BVTV ...............................................................................................................
. 46
3.4.1. Thử nghiệm hoạt tính của enzyme cố định trên điện
cực ....................... 46
3.4.2. Xác định điểm hoạt động tối ưu của cảm biến
........................................ 46
3.4.3. Thử nghiệm xác định thuốc BVTV
......................................................... 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỊNH HƯỚNG....................................................................
52
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................
53

b

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
AChE

Acetylcholinesterase

ADC

Direct current

BChE

Butyrylcholinesterase

BuChE

Butyrylcholinesterase

BVTV

Bảo vệ thực vật

ChE

Cholinesterase

CV

Vôn - ampe vòng (Cyclic voltammetry)

EIS

Phổ tổng trở (Electrochemical Impedance Spectroscopy)

ELISA

enzyme-linked immunosorbent assay

FE-SEM
Scanning

Hiển vi điện tử quét trường phát xạ (Field Emission
Electron
Microscope)

FT-IR

Fourier transform infrared spectroscopy

GA

Glutaraldehylde

GC

Điện cực than thủy tinh (Glassy carbon)

GPRS

General Packet Radio Service

Gr

Graphen

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

ISFET

Transito nhạy ion hiệu ứng trường (Ion Selective Field

Effect Transistor) LNT

Phòng thí nghiệm công nghệ nano

(Laboratory of Nanotechnology MEMS

Hệ vi cơ điện tử (Micro

ElectroMechanical System)
MOSFET
Transitor hiệu ứng trường kim loại-oxit (Metal-OxideSemiconductor
Field Effect
Transistor)
MRL
MS
MWCNTs

Mức giới hạn tối đa (Maximum Residue Limit)
Khối phổ (Mass spectrometry)
Ống nano các bon đa vách (Multi-walled carbon

nanotubes) OP
P(1,5DAN)

Lân hữu cơ (organophosphate)

Poly(1,5-

Diaminonaphthalene) PANi
Polyaniline
PBS

Phosphate Buffered Saline

Ppy

Polypyrrole

PS

Potential static

SEM

Scanning electron
c

microscope SWV
voltammetry TCVN

Square wave
Tiêu chuẩn

Việt Nam

c


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các điều kiện phân ly MS/MS:
........................................................ 37
Bảng 3.1. Kết quả phân tích trên nền nước.
..................................................... 50
Bảng 3.2. Kết quả phân tích trên nền rau.
........................................................ 51

d


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.

Các phương pháp hiện được sử dụng để xác định thuốc bảo
vệ

thực

vật

(giai

đoạn

2005

-

2011)

....................................................... 6
Hình 1.2.
Hình 1.3.

Sơ đồ nguyên lý cấu tạo một cảm biến sinh
học............................... 7

Số các công bố khoa học liên quan đến chủ điểm cảm biến
sinh học xác định thuốc BVTV từ 1989 tới 2011 (theo thống kê
của

Thomson

Reuters

Web

of

Science)

.................................................. 8
Hình 1.4.

Các mô hình cảm biến sinh học xác định chất BVTV
đang

được

nghiên

cứu

............................................................................ 10
Hình 1.5.

Mô hình ức chế xúc tác enzyme của thuốc BVTV. Hình phía
trên:
khi không có chất BVTV; Hình phía dưới: khi có chất BVTV
[13]11

Hình 1.6.

Mô hình ức chế enzyme AChE trong xác định chất BVTV ...........
11

Hình 1.7.
Hình 1.8.
Hình 1.9.

Mô hình chế tạo cảm biến enzym xác định chất BVTV
..................... 12

Cảm biến sinh học phân tích thuốc bảo vệ thực vật (BVTV)
......... 14
Mô hình cảm biến ATZ dựa trên sự thay đổi tín hiệu

signal-

off/signal-

on

của

màng

poly(JUG-HATZ)

[32]............................. 16
Hình 1.10. Một số polyme dẫn điện tử điển
hình.............................................. 17
Hình 1.11. Polyme oxy hóa
khử........................................................................ 17
Hình 1.12. Polyme trao đổi ion

poly(vinylpyridin)........................................... 18
Hình 1.13. Cơ chế hình thành PANi từ Ani bằng phương pháp điện hóa
[38]. 20
Hình 1.14. Công thức tổng quát của PANi
....................................................... 21
e


Hình 1.15. Cơ chế phản ứng trùng hợp PPy [38]
.............................................. 22
Hình 1.16. Mô tả quá trình trùng hợp điện hóa PPy trong hệ ba điện
cực........ 23
Hình 2.1.

Hệ đo điện hóa Palmsen 3 và thiết bị tích hợp phần mềm
đo

điện

hóa........................................................................................... 28
Hình 2.2. Hệ điện cực mạch in tích hợp thương mại của hãng Dropsens®
() ..........................................................
... 28
Hình 2.3. Đồ thị quét thế tuyến tính đa chu kỳ
............................................... 33

e


Hình 2.4. Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong phương pháp

CV.......... 34
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình chuẩn bị chất chuẩn trên nền
nước........................ 35
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình chuẩn bị chất chuẩn trên nền
rau........................... 35
Hình 2.7. Khối phổ (MS) của mẫu Methamidophos
....................................... 37
Hình 3.1.
39

Phổ trùng hợp điện hóa PANi theo phương pháp CV.....................

Hình 3.2. Phổ FT-IR của PANi tổng hợp theo phương pháp điện hóa
........... 40
Hình 3.3.
thuật

Hành vi điện hóa của điện cực PANi/SPE tổng hợp theo kỹ
(a) trong dung dịch HCl 1M
............................................................ 41

Hình 3.4.
42

Phổ Raman của màng Graphene, PANi và PANi/Graphene ..........

Hình 3.5.

Ảnh FE-SEM màng PANi/Graphene đã cố định AChE theo
phương pháp liên kết đồng hóa trị sử dụng glutaraldehyde

(a) phóng đại 10.000 lần và (b) phóng đại 50.000 lần
.......................... 43

Hình 3.6.
.... 44

Phổ CV của vi điện cực điện hóa trong dung dịch K3[Fe(CN)6]

Hình 3.7.
45

Phổ SWV của vi điện cực trước và sau khi cố định........................

Hình 3.8.
bằng

Ghi nhận phản ứng enzyme-cơ chất trên bề mặt điện cực
phương pháp quét thế tại V = + 300 mV.
....................................... 46

Hình 3.9.

Đường đáp ứng dòng của điện cực AChE/PANi-Gr/SPE trong
dung

dịch

PBS

khi

thêm

cơ

chất

ATCh

.......................................... 47
Hình 3.10. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của tín hiệu
.......................... 47
Hình 3.11. Phát hiện thuốc trừ sâu họ lân hữu cơ sử dụng cảm biến điện
hóa
AChE bằng phương pháp áp thế.
f


.................................................... 48
Hình 3.12. Đường chuẩn xác định dư lượng thuốc BVTV họ lân hữu cơ
sử
dụng cảm biến điện hóa AChE bằng phương pháp áp thế
.............. 49

f


MỞ ĐẦU
Ngày nay, hoạt động sản xuất nông nghiệp đòi hỏi một lượng lớn
hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) nhằm kiểm soát côn trùng, vi khuẩn, cỏ

dại… bảo vệ mùa màng. Một điều rõ ràng rằng, cùng với phân bón hóa
học, thuốc BVTV (bao gồm thuốc trừ cỏ, thuốc trừ bệnh, thuốc kích thích
sinh trưởng và thuốc trừ sâu) góp phần đảm bảo an ninh lương thực và sự
phát triển ổn định của kinh tế-xã hội. Tuy nhiên, tình trạng sử dụng
thiếu kiểm soát và sai mục đích các chất BVTV gây ra những ảnh hưởng
tiêu cực tới môi trường sinh thái và sức khỏe của con người. Hầu hết các
loại thuốc BVTV đều là những hợp chất hữu cơ khó phân hủy, có khả
năng tích lũy sinh học, tham gia vào chuỗi thức ăn. Do đó, vấn đề kiểm
soát sử dụng thuốc BVTV đặc biệt trong các sản phẩm nông sản đã trở
thành một vấn đề có tính toàn cầu không chỉ ở trong nước.
Việc kiểm soát dư lượng thuốc BVTV bằng các phương pháp và dụng
cụ thích hợp không những góp phần đảm bảo an toàn cho sức khỏe con
người mà cũng góp phần thúc đẩy việc sử dụng thuốc hợp lý hơn. Về
cơ bản, phương pháp phân tích định lượng tiêu chuẩn được sử dụng hiện
nay để xác định dư lượng chất BVTV trong các sản phẩm nông sản là
phương pháp phân tích sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng, sắc ký lỏng hiệu
năng cao kết hợp khối phổ (GC/MS, LC/MS hoặc HPLC/MS-MS) sắc ký lỏng
kết hợp UV-Vis. Tuy nhiên, các phương pháp này có đặc điểm là thời gian
phân tích lâu, phức tạp, đòi hỏi nhiều kỹ năng khi phân tích, không thể
thực hiện được ngoài hiện trường. Gần đây, xét nghiệm hấp thụ miễn
dịch liên kết với enzyme - ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
đã được ứng dụng để xác định dư lượng các chất BVTV dựa trên
nguyên lý kháng nguyên - kháng thể. Kỹ thuật ELISA có độ nhạy cao, thao
tác tương đối đơn giản, thời gian phân tích nhanh nhưng nhược điểm đó là
kém chính xác trong các nền phức tạp, kém linh hoạt vì phải phụ thuộc
vào hóa chất của nhà sản xuất. Do vậy, việc tìm ra các phương pháp phân
tích mới thuận tiện hơn là mục tiêu của nhiều nghiên cứu trên thế
giới. Các

1

thiết bị cảm biến nói chung và cảm biến sinh học nói riêng với kích thước
nhỏ gọn, có độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định cao ứng dụng trong phân
tích Hóa học và Sinh học đã và đang được kỳ vọng có thể thay thế một
phần hay hoàn toàn các phương pháp phân tích truyền thống.
Xuất phát từ nhu cầu đó, đề tài được lựa chọn:
“Nghiên cứu ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa để phân
tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật từ rau quả„
Nội dung của luận văn sẽ tập trung vào việc ứng dụng các cảm biến
hiện
có trên cơ sở biến tính các hệ điện cực cơ sở để thực hiện các phép
phân tích
hóa học và sinh
học.
- Nội dung 1: lựa chọn cảm biến. Loại cảm biến được lựa chọn là
cảm biến điện hóa sinh học dựa trên sự ức chế enzyme
Acetylcholinesterase được chế tạo và biến tính.
- Nghiên cứu các đặc trưng cơ bản của hệ cảm biến này (đặc trưng
bề mặt, hình thái học, các đặc trưng điện hóa/đáp ứng điện hóa)
- Ứng dụng hệ cảm biến trong xác định các độc chất gây ức chế
thần kinh như các loại thuốc bảo vệ thực vật nhóm lân hữu cơ.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vấn đề dư lượng thuốc BVTV trong nông sản
Là một nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, Việt Nam có
nhiều điều kiện khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của cây trồng nông

nghiệp và công nghiệp. Bên cạnh đó, các điều kiện khía hậu này cũng rất
thuận lợi cho sự phát sinh, phát triển của sâu bệnh, cỏ dại gây hại mùa
màng. Do vậy việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) để phòng trừ
sâu hại, dịch bệnh bảo vệ mùa màng, giữ vững an ninh lương thực quốc
gia là một biện pháp quan trọng. Tuy nhiên, có một thực tế rằng việc sử
dụng thuốc BVTV tràn lan, sai mục đích, không tuân thủ các quy trình sử
dụng an toàn đã gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường đất, nước, không
khí và trầm tích đáy với thời gian tồn dư lâu dài, ảnh hưởng đến hệ sinh
thái nông nghiệp và sức khỏe cộng đồng. Thuốc BVTV tồn dư, thậm chí
được sử dụng như một loại chất bảo quản trên các sản phẩm nông sản
trong nước cũng như nhập khẩu đang là vấn đề nhận được sự quan tâm
của toàn xã hội. Nhiều thuốc BVTV được cho là có khả năng gây ung thư,
thậm chí gây đột biến gen, ảnh hưởng đến chất lượng tăng trưởng và sức
khỏe[1].
Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, lượng thuốc BVTV được
sử dụng ở nước ta tăng nhanh trong những năm gần đây đặc bệt về cả số
lượng và chủng loại. Trong đó, nhiều loại thuốc nhóm lân hữu cơ thuộc
danh mục những loại thuốc cấm sử dụng trên rau vẫn được sử dụng tràn
lan như: Monitor, Azodrin, Endosulfan, Monocrotophos, Methamidophos,
Methyl parathion. Đây là những loại thuốc có độ độc rất cao thời gian
phân hủy kéo dài nếu tồn lưu trong rau thì cần phải trải qua thời gian dài
mới phân hủy hết được. Những sản phẩm này khi bán ra thị trường sẽ ảnh
hưởng trược tiếp đến sức khỏe của cộng đồng. Cũng theo một báo cáo
tổng hợp của Tổng cục Môi trường (Bộ Tài nguyên & Môi trường), nếu như
những năm 1960, chỉ có 0,48% diện tích đất canh tác sử dụng thuốc BVTV
thì nay là 100% diện tích đất canh tác đều có sử dụng thuốc BVTV. Theo
cục Y tế dự phòng và Môi trường (Bộ Y tế), năm

3

2009, các bệnh viện đã tiếp nhận 4.515 người bị nhiễm độc thuốc BVTV,
trong đó 138 người đã tử vong do nhiễm độc quá nặng. Ba vấn đề nổi
cộm nhất liên quan đến sự ô nhiễm môi trường và gây nhiễm độc thuốc
BVTV gồm:
Hệ thống xử lý chất thải tại các cơ sở sản xuất, chế biến thuốc BVTV
không được quan tâm thích đáng. Nhiều cơ sở vì lợi nhuận đã không thực
hiện khâu xử lý chất thải mà xả thẳng vào môi trường.
Hiện tượng lạm dụng và sử dụng sai quy trình, quy cách thuốc BVTV
trong nông dân như sử dụng thuốc trừ sâu vượt ngưỡng cho phép, hoặc
không thực hiện thời gian cách ly đến lúc thu hoạch như quy định. Bên
cạnh đó, người nông dân hầu như chưa có kiến thức trong xử lý dụng cụ,
bao gói thuốc BVTV.
Việc sử dụng sai mục đích các thuốc BVTV làm chất bảo quản, chất
kích
thích tăng trưởng và phát triển cây trồng, vật
nuôi.
Bên cạnh việc quản lý chặt chẽ các loại thuốc BVTV thì công tác
phân tích, kiểm nghiệm thuốc BVTV trong nông sản và môi trường là một
giải pháp quan trọng giúp có một cái nhìn tổng quan về hiện trạng sử
dụng thốc BVTV. Đồng thời hỗ trợ các cơ quan nhà nước đưa ra các giải
pháp ứng phó phù hợp, đồng thời cảnh báo sớm nguy cơ góp phần đảm
bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng[2].
Như trên đã nói, phương pháp thông thường đang được áp dụng để
phân tích hàm lượng chất BVTV trong các sản phẩm nông sản và trong
môi trường nước đó là phương pháp sắc ký kết hợp với khối phổ. Phương
pháp có độ nhạy và độ chọn lọc cao tuy nhiên thời gian phân tích
thường trải qua nhiều giai đoạn và tốn nhiều thời gian, vận hành thiết
bị phức tạp, phân tích phải được thực hiện tại phòng thí nghiệm. Thông
thường, kể từ khi lấy mẫu đến khi có kết quả phân tích thời gian thường

mất từ 1 tới 2 ngày. Đối với xuất-nhập khẩu nông sản: việc kéo dài thời
gian phân tích đối với các sản phẩm nông sản tươi dẫn đến những phản
ứng của doanh nghiệp xuất nhập khẩu do những thiệt hại về kinh tế gây
ra.

4


Trước tình hình thời sự về vấn đề sử dụng tràn lan, thiếu kiểm soát
các loại thuốc BVTV trong trồng trọt và bảo quản nông sản việc tìm ra các
phương pháp khác bổ sung/thay thế phương pháp truyền thống là tất yếu.
Yêu cầu của phương pháp thay thế là có thể xác định nhanh, dễ dàng dư
lượng các thuốc BVTV nhằm phát hiện và ngăn chặn kịp thời các chất
BVTV độc hại trong nông phẩm phù hợp với việc đo đạc ở hiện trường
cũng như giám sát tại chỗ và trực tuyến các chất độc hại. Đây là một
nhu cầu thực tế có ý nghĩa kinh tế-xã hội cao. Do vậy, nghiên cứu ứng
dụng cảm biến sinh học (biosensor) quan trắc các chất gây ô nhiễm môi
trường (hợp chất hữu cơ, kim loại nặng và vi sinh vật gây bệnh) là một
trong các nhiệm vụ ưu tiên triển khai. Với việc tận dụng các nguồn lực về
con người và cơ sở vật chất đã được nhà nước đầu tư tại các đơn vị phối
hợp cho thấy việc chế tạo hệ cảm biến sinh học đo tại thực địa nhằm
kiểm soát dư lượng một số thuốc bảo vệ thực vật trong nông sản và môi
trường nước là nội dung có tính cấp thiết cho định hướng nghiên cứu này.
1.2. Nhóm chất BVTV họ lân hữu cơ
Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus) đều là các este, là các dẫn
xuất hữu cơ của acid photphoric. Nhóm này có thời gian bán phân huỷ
ngắn hơn so với nhóm Clo hữu cơ và được sử dụng rộng rãi hơn. Nhóm
này tác động vào thần kinh của côn trùng bằng cách ngăn cản sự tạo
thành men Cholinestaza làm cho thần kinh hoạt động kém, làm yếu cơ,
gây choáng váng và chết.

Có thể coi việc sử dụng hóa chất BVTV trong sản xuất nông nghiệp
là một thành tựu khoa học giúp đảm bảo an ninh lương thực, an sinh xã
hội. Tuy nhiên ngày nay việc sử dụng tràn lan chất BVTV và không tuân
thủ quy trình sản xuất an toàn khiến tồn dư các chất BVTV trong các sản
phẩm nông sản gây nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Việc kiểm
soát dư lượng chất BVTV bằng các phương pháp và dụng cụ thích hợp
không những góp phần đảm bảo an toàn cho sức khỏe con người mà
cũng góp phần thúc đẩy việc sử dụng thuốc hợp lý hơn. Về cơ bản,
phương pháp phân tích định lượng tiêu chuẩn được sử dụng hiện nay để
xác định dư lượng chất BVTV trong các sản phẩm nông sản

5


là phương pháp phân tích sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng, sắc ký lỏng hiệu
năng cao kết hợp khối phổ (GC/MS, LC/MS hoặc HPLC/MS-MS) [3, 4] sắc ký
lỏng kết hợp UV-Vis [5]. Tuy nhiên, các phương pháp này có đặc điểm là
thời gian phân tích lâu, phức tạp, đòi hỏi nhiều kỹ năng khi phân tích,
không thể thực hiện được ngoài hiện trường.

Hình 1.1.Các phương pháp hiện được sử dụng để xác định thuốc
bảo vệ thực vật
(giai đoạn 2005 –
2011)
Gần đây, xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme - ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) đã được ứng dụng để xác định dư
lượng các chất BVTV dựa trên nguyên lý kháng nguyên – kháng thể [6, 7].
Kỹ thuật ELISA có độ nhạy cao, thao tác tương đối đơn giản, thời gian
phân tích tương đối nhanh nhưng nhược điểm đó là kém chính xác trong
các nền phức tạp, kém linh hoạt vì phải phụ thuộc vào hóa chất của

nhà sản xuất. Do vậy, việc tìm ra các phương pháp phân tích mới thuận
tiện hơn là mục tiêu của nhiều nghiên cứu trên thế giới. Thêm vào đó, để
gia tăng tiện ích các nhà khoa học liên ngành đã và đang hướng tới chế
tạo một bộ thiết bị phân tích hoàn chỉnh có khả năng đo trực tiếp tại hiện
trường đồng thời truyền dẫn dữ liệu về trung tâm tạo lập hệ thống quan
trắc tức thời tại mọi thời điểm.
1.3. Cảm biến sinh học điện
hóa
Cảm biến được coi là kỹ thuật nền tảng cho sự phát triển của khoa
học và công nghệ hiện đại, được đánh giá là một trong mười công nghệ
làm thay đổi cuộc sống[8]. Bên cạnh sự có mặt của các loại cảm biến
trong các ngành công nghiệp, cảm biến ứng dụng trong đời sống như
một thiết bị dân dụng, đã và đang hiện diện ngày một nhiều hơn trong
cuộc sống. Đó có thể là các cảm biến
6


gia tốc, cảm biến ánh sáng, cảm biến khoảng cách, cảm biến lực và con
quay hồi chuyển… trong các thiết bị di động thông minh; cảm biến lưu
lượng, cảm biến áp suất, cảm biến nhiệt độ… trong ôtô; cảm biến báo
cháy, cảm biến chuyển động, cảm biến quang học trong văn phòng và gia
đình v.v… Có thể thấy rằng, cảm biến đo lường các đại lượng vật lý đã có
những bước phát triển mạnh mẽ với độ tin cậy cao, nhỏ gọn và giá thành
ngày càng giảm. Trong khi đó, cảm biến sinh học vẫn còn ở những bước
nghiên cứu khởi đầu, đòi hỏi sự đầu tư, nghiên cứu để biến các ý tưởng
thành các sản phẩm ứng dụng, phục vụ đời sống[8, 9].
Năm 1962, lần đầu tiên khái niệm về cảm biến sinh học đã được
L.C. Clark và C. Lyons đề cập đến trong báo cáo về chế tạo điện cực dùng
enzym glucozơ oxidaza để định lượng glucozơ [10]. Từ đó tới nay, lĩnh vực
cảm biến sinh học đã và đang tiếp tục thu hút được sự quan tâm nghiên

cứu của rất nhiều nhà khoa học liên ngành (hóa học, vật lý, sinh học,
khoa học vật liệu, cơ học, điện tử...) trên toàn thế giới. Cảm biến sinh
học đã cho thấy tiềm năng có thể trở thành phương pháp phân tích mới,
có triển vọng thay thế một phần hay toàn bộ cho các thiết bị và phương
pháp phân tích truyền thống vốn có giá thành cao, tốn nhiều thời gian,
vận hành phức tạp, sử dụng nhiều dung môi, hóa chất. Lĩnh vực ứng dụng
của cảm biến sinh học đa dạng, nổi bật là trong chẩn đoán y-sinh học,
kiểm soát môi trường, an toàn thực phẩm, an ninh, quốc phòng.

Hình 1.2. Sơ đồ nguyên lý cấu tạo một cảm biến sinh
học

7


Cảm biến sinh học ứng dụng trong xác định dư lượng chất BVTV là
một nội dung đang nhận được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các
nhà khoa học cũng như các doanh nghiệp phát triển công nghệ. Mặc dù
còn là chủ đề còn nhiều mới mẻ, nhưng các nghiên cứu gần đây đều cho
thấy cảm biến sinh học ứng dụng trong dư lượng chất BVTV có độ nhạy rất
cao cỡ picomol thậm chí là femtomol, thời gian phân tích nhanh, về mặt
nguyên lý có thể tạo được các thiết bị phân tích nhỏ gọn, thao tác và
hoạt động đơn giản. Với những bước phát triển mạnh mẽ của nhiều
ngành khoa học như sinh học phân tử, hiện nay đã có thể chế tạo được
các đầu do sinh học như các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với từng loại
hoạt chất cho phép phân tích rất chọn lọc trong các nền mẫu phức tạp,
đặc biệt là các loại hoạt chất có độc tính cao và bị cấm sử dụng.
Số lượng công bố khoa học liên quan đến cảm biến sinh học xác
định thuốc bảo vệ thực vật (pesticide biosensors) tăng rất nhanh qua
các năm (Hình 1.3).

Hình 1.3. Số các công bố khoa học liên quan đến chủ điểmcảm
biến sinhhọc xác định thuốc BVTV từ 1989 tới 2011(theo thống
kê của Thomson Reuters Web of Science) [11]
Từ các nghiên cứu cơ bản đến một sản phẩm công nghệ cụ thể đòi
hỏi những đầu tư một cách bài bản và là sự kết hợp của nhiều lĩnh vực.
Nếu theo dõi các công bố trong vòng vài năm trở lại đây chúng ta sẽ tìm
được trên 10.000 công

8


trình thuộc hệ thống ISI, có nội dung liên quan đến cảm biến sinh học. Các
nghiên cứu này phát triển theo hai xu hướng tạm gọi là “phần cứng”
(hardware) và “phần mềm” (software): (1) Chiến lược phát triển “phần
mềm” tập trung chủ yếu vào quá trình cô lập (isolation), nhận biết
(recognition) và khuếch đại cả về độ chọn lọc và cường độ của các tín
hiệu (do các phản ứng sinh hóa đặc trưng giữa enzym- cơ chất; kháng
nguyên-kháng thể… gây nên). (2) Sự phát triển “phần cứng” bao gồm việc
thiết kế các vi thiết bị hiệu quả hơn, đồng thời tối ưu hóa quá trình chế tạo
và tích hợp các thiết bị này trên các vật liệu tương sinh. Song song với quá
trình này là việc cải tiến phương pháp đóng gói (packaging) các hệ này
cũng như giao thức tương tác với thiết bị bên ngoài.
Từ những qua thử nhanh đơn giản có tính định tính hoặc bán định
lượng, việc phát triển các bộ công cụ hiệu quả có khả năng phân tích định
lượng chính xác với độ chính xác, đặc hiệu cao là nhu cầu tất yếu. Việc kết
hợp sử dụng các kỹ thuật khác nhau nhằm tạo ra một bộ thiết bị hoàn
chỉnh có khả năng định lượng chất BVTV trong môi trường và thực phẩm
là một yêu cầu vừa có tính khoa học và thực tiễn. Những thành công của
bộ đo đường huyết theo nguyên lý điện hóa đang được bán rộng rãi trên

thị trường là một kết quả vô cùng khích lệ cho các nhà nghiên cứu cũng
như phát triển công nghệ hướng tới một thị trường tiềm năng, gia tăng tiện
ích, góp phần cho cuộc sống ngày một bền vững hơn.
Nếu dựa trên sự phân loại phần tử nhận biết sinh học (biorecognition elements) thì cảm biến sinh học gồm[8]: cảm biến với đầu
dò enzyme, cảm biến với đầu dò tế bào, cảm biến với đầu dò kháng thể
(cảm biến miễn dịch) và cảm biến với đầu dò ADN (Hình 1.4). Trong đó,
cảm biến với đầu dò enzyme và cảm biến miễn dịch được quan tâm nhiều
hơn cả, với khoảng 40-50% số nghiên cứu dựa trên cơ chế ức chế enzyme
[12]. Đây là các dạng đầu dò có khả năng tiến tới các sản phẩm thương
mại trong thời gian gần. Một số các kỹ thuật mới gần đây như kỹ thuật tạo
khuân phân tử MIP, cảm biến aptame cũng đã được báo cáo.

9


Hình 1.4. Các mô hình cảm biến sinh học xác định chất
BVTVđang được nghiên cứu [12]
Có nhiều nguyên lý đo các tín hiệu được tạo ra do sự tương tác
giữa
thành phần sinh học và hoạt chất BVTV như nguyên lý quang học với các
kỹ thuật có độ nhạy cao như cộng hưởng plasmon bề mặt SPR, phổ raman
tăng cường bề mặt SERS; hay nguyên lý điện hóa với các kỹ thuật đo phổ
tổng trở, con-ampe xung vi phân, sóng vuông, hay ứng dụng nguyên lý
transito hiệu ứng trường... Hiện nay, phần tử chuyển đổi tín hiệu theo
nguyên lý quang học và điện hóa được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên
cứu, phát triển và ứng dụng cảm biến sinh học. Lợi thế của nguyên lý
quang học trong chế tạo cảm biến đó là độ nhạy cao và có khả năng
nghiên cứu sâu về các quá trình sinh học phân tử. Tuy nhiên giá thành kỹ
thuật quang học còn khá đắt do kỹ thuật chế tạo còn phức tạp, việc thu
gọn kích thước gặp nhiều trở ngại; thêm vào đó, việc bảo quản các hệ

quang học trong điều kiện thời tiết nhiệt đới như ở Việt Nam có nhiều khó
khăn. Do đó sử dụng phần tử chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa đã được
chúng tôi lựa chọn để chế tạo cảm biến sinh học.
1.3.1.
Cảm
Enzyme

biến

Nguyên tắc hoạt động dựa trên sự ức chế mạnh một số loại
enzyme khi có mặt một số loại thuốc BVTV, trên cơ sở sự giảm hoạt tính
của enzyme, xác định được hàm lượng chất BVTV trong đối tượng phân
tích (Hình 1.5).

10


Hình 1.5. Mô hình ức chế xúc tác enzyme của thuốc BVTV. Hình
phía trên:
khi không có chất BVTV; Hình phía dưới: khi có chất
BVTV [13]
Tiêu biểu có thể kể đến nhóm lân hữu cơ (organophosphorus),
carbamate

gây

ức

chế

mạnh

men

Cholinesterase

(ChE),

Acetylcholinesterase (AChE) [1416], Butyrylcholinesterase (BChE) [17, 18], Enzyme Tyrosinase bị ức chế
bởi các chất BVTV như Carbamate và Atrazine [19-21]. Một loại enzyme
khác là organophosphorus hydrolase có khả năng thủy phân một số hoạt
chất thuộc nhóm lân hữu cơ như paraoxon, parathion, methyl parathion
cũng đã được nghiên cứu [22, 23].
a. Cảm biến sinh học dựa trên sự ức chế enzyme
Cholinesterase và
Acetylcholinester
ase
Mặc dùđộđặc hiệu của cảm biến enzyme này còn hạn chế, nhưng
đây đượccho là công cụ mạnh mẽkhi phát hiện nhanh và nhạy nhóm
lân hữu cơ (OP) và carbamate (CM).

11


Hình 1.6. Mô hình ức chế enzyme AChE trong xác định
chất BVTV

12

Các nghiên cứu đáng chú ý đưa ra giới hạn phá t hiện hoạt
chất
Trichlorfon trên điện cực màng Nylon và xenlulo nitrat là 0,038 µM
[17,
18]; trên điện cực PbO 2 /TiO2 /Ti là 0,1.10 -3

µM[24]… Với hoạt

chất Diazinon; giới hạn phát hiện 0,147 ppb trên cơ sở điện cực vàng
biến tính bởi polyanilin [25].
Giới hạn phát hiện hoạt chất Carbaryl trên điện cực in (SPE) biến tính bởi
Prussian xanh (PB) là 0,124 µM [26], trên điện cực than thủy tinh biến
tính bởi chitosan- Prussian xanh đạt 3.10-3µM [15], hay trên điện cực
than thủy tinh biến tính bởi TiO2-Graphene là 1,4.10-3µM [27]…

Hình 1.7. Mô hình chế tạo cảm biến enzym xác định
chất BVTV
theo nguyên lý điện
hóa
Một nhóm nghiên cứu đa ngành của Brazil mới đây đã phát triển
một loại cảm biến sinh học giúp đo hàm lượng thuốc trừ sâu trong thực
phẩm, nước và đất. Công nghệ hiện vẫn đang trong giai đoạn phát triển
nhưng nếu trở thành một sản phẩm thương mại, công nghệ có thể mang
lại một giải pháp di động, giá cả phải chăng để giám sát loại hóa chất
độc hại này. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng enzyme acteylcholinesterase
(AChE) - một loại enzyme hoạt hóa cao có trong các nút giao thần kinh
cơ và khớp thần kinh não cholinergic của nhiều loài côn trùng, động vật
13