Ứng dụng phương pháp RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE – POLYMERASE CHAIN REACTION ) để phát hiện vi rút dịch tả lợn trên đoạn gen e2

MỤC LỤC

1

1


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của
bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân và tập thể.
Nhân dịp này cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:
TS. Trần Đức Hoàn khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông - Lâm
Bắc Giang, TS. Trần Thị Thanh Hà, Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y
Quốc gia đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.
Các thầy cô trong khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông - Lâm
Bắc Giang
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đặng Vũ Hoàng và toàn thể các
nhân viên Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi giúp tôi trong quá trình thực tập khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Xin chân trọng cảm ơn!
Bắc Giang, ngày

tháng

năm 2018

Sinh viên

Đặng Phương Anh

2

2


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
3’NTR
BDV
BVDV
cDNA
CSF
CSFV
dNTP
DTL
ELISA
NXB
OIE

3’ nontranslated
Border disease virus
Bovine viral diarrhea virus
Complementary deoxyribonucleotide acid
Classical Swine Fever
Classical Swine Fever virus
deoxy nucleoside triphosphate
Dịch tả lợn
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Nhà xuất bản

Organisation of International Epidemiology (Tổ chức Dịch tễ

học Thế giới)
PBS
Phosphate Buffer Saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
RNA
Ribonucleic Acid
Rnase
Ribonuclease
RT – PCR Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction
Ta
Nhiệt độ gắn mồi
Tm
Nhiệt độ nóng chảy của mồi

3

3


4


DANH MỤC BẢNG BIỂU

5

DANH MỤC HÌNH ẢNH

6


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, với những mô hình chăn nuôi quy mô công nghiệp ngày càng
phát triển thì kéo theo đó dịch bệnh ngày càng trở nên phức tạp. Trong đó, bệnh
Dịch tả lợn (DTL) cổ điển (Classical Swine Fever - CSF) là một trong những bệnh
truyền nhiễm nguy hiểm trên đàn lợn bởi sự lây lan mạnh, tỷ lệ chết cao (85 100%) cho mọi lứa tuổi và gây ra những thiệt hại nặng nề về kinh tế ( Nguyễn Thị
Phương Duyên và cs, 2001). Bệnh DTL do vi rút thuộc chi Pestivi rút,
họ Flaviviridae gây ra; bệnh lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa và đường hô
hấp do tiếp xúc trực tiếp với lợn ốm hoặc gián tiếp qua các chất bài tiết, thức ăn,
nước uống, dụng cụ chăn nuôi Nguyễn Tiến Dũng, 1999; Bhaskar et al, 2015)
Trong công tác chẩn đoán hay phòng và trị bệnh, các phương pháp truyền
thống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khuyết điểm và
không thể theo kịp tình hình diễn biến của bệnh như hiện nay. Trong khi đó hiện
nay việc áp dụng công nghệ sinh học vào chẩn đoán bệnh đang phát huy tác
dụng rất hiệu quả đặc biệt là việc chẩn đoán nhanh và chính xác mầm bệnh và
góp phần không nhỏ trong quá trình điều trị cũng như ngăn chặn dịch bệnh lấy
lan. Trong thú y, sinh học phân tử với trọng tâm là công nghệ di truyền đã được
ứng dụng khá sớm trong chẩn đoán, phòng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gây
bệnh, trong đó có bệnh dịch tả lợn được coi là một trong 4 bệnh “đỏ” của ngành
chăn nuôi Việt Nam.
Để phân tích chính xác virus gây bệnh DTL với những virus khác cùng
chi Pestivirus như BVDV, BDV..., kỹ thuật RT - PCR trở nên hữu ích với những
đoạn gene như 5’NTR, E2, NS5B trong việc phân biệt chủng vi rút DTL và tổng
kết sự phân biệt chủng vi rút DTL ở nhiều nước trên thế giới kể cả châu Á; kết
quả cho thấy mối liên giữa các chủng ở một số nước. Gene E2 là một trong

những gene quan trọng trong bộ gene của vi rút DTL được sử dụng nhiều trong
những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút. Vì vậy việc thực
7


hiện đề tài “ Ứng dụng phương pháp RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE
– POLYMERASE CHAIN REACTION ) để phát hiện vi rút dịch tả lợn trên
đoạn gen E2” nhằm ứng dụng vào công tác chẩn đoán bệnh và tạo tiền đề cho
những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút DTL sau này.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Phát hiện được vi rút DTL dựa trên đoạn gen E2 bằng kĩ thuật RT – PCR.
Xác định trình tự nucleotide của đoạn gen ncE2 vi rút DTL.

8


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hiểu biết về vi rút DTL và bệnh do vi rút DTL gây ra
2.1.1. Lịch sử căn bệnh
2.1.1.1 Trên thế giới
Bệnh DTL được đưa vào danh sách loại A của Tổ chức Thú y Thế giới
(OIE) như 1 bệnh truyền lây mạnh và gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi
lợn của thế giới (Moennig et al, 2003). Những nghiên cứu trước đây cho thấy
bệnh lây lan chủ yếu qua đường mũi và miệng. Ngoài ra, vi rút DTL cũng bị
truyền lây qua tinh dịch hay thức ăn tạp nhiễm (Floegel et al, 2000).
Quá trình phát triển của bệnh DTL khá phức tạp và diễn biến dưới nhiều
thể bệnh khác nhau, tùy thuộc vào độc lực của vi rút, sự tương tác giữa vi rút và
cơ thể vật chủ (Paton and Greiser - Wilke, 2003). Nhìn chung, các thể bệnh có
thể được phân loại như sau: Nhiễm sau khi sinh (post-natal infections): bao gồm
thể quá cấp, cấp tính và á cấp tính; Nhiễm qua nhau thai (trans-placental

infections); Nhiễm mạn tính (persistent infections) (Koenen et al, 1996; Nguyễn
Tiến Dũng, 1999).
Bệnh DTL được mô tả lần đầu vào năm 1810 ở Tennessce và ổ dịch đầu tiên
được ghi nhận vào năm 1833 tại bang Ohio của Mỹ, sau đó bệnh lan rộng ra khắp
Châu Mỹ, Châu Âu và Châu Á ( Nguyễn Tiến Dũng, 1999; Paton and Greiser Wilke, 2003). Năm 1978 bệnh hoàn toàn bị khống chế ở Bắc Mỹ và sau đó cũng
đã được thanh toán ở Úc và toàn bộ các nước ở Tây Âu (Paton and Greiser-Wilke,
2003; Singh and Rajak, 2017). Mặc dù đã có nhiều nỗ lực trong công tác kiểm soát
dịch bệnh, song bệnh DTL vẫn còn xuất hiện ở một số nước thành viên Châu Âu và
gây thiệt hại nặng về kinh tế. Cụ thể: ở Hà Lan, chi phí trực tiếp để khống chế bệnh
DTL lên tới 93 triệu USD năm 1983 - 1985. Nhiều ổ dịch nghiêm trọng đã xảy ra ở
Bỉ, Đức năm 1994, và Pháp năm 1997 (Moennig, 2000). Hơn nữa bệnh DTL vẫn
còn là vấn nạn và lây lan mạnh mẽ ở Nam và Trung Mỹ, vùng Caribbean, Châu Á
và Đông Âu (Moennig, 2000; Moennig et al, 2003). Hiện nay, tuy dịch đã được
9


khống chế, nhưng bệnh vẫn xảy ra lẻ tẻ như ở Hà Lan năm 1997 - 1998 (Crauwels
et al, 2003), và vi rút DTL vẫn lưu hành tại một số nước ở châu Âu (Blome et al,
2010; Bhaskar et al, 2015).
Cộng đồng Châu Âu đã thiết lập và đưa ra một chường trình nhằm phòng,
chống và tiến tới thanh toán bệnh do vi rút DTL cho các nước thành viên dựa
trên việc tiêu huỷ các đàn nhiễm bệnh, đồng thời tăng cường các biện pháp vệ
sinh cũng như pháp chế thú y. Ở Châu Á, các nước phát triển như Nhật Bản,
Hàn Quốc, Singapore dịch đã hoàn toàn bị khống chế. Trong cam kết của các
nước ASEAN, Malaysia đã cam kết thanh toán bệnh DTL vào năm 2015,
Philippine, Indonesia, Brunei, Thái Lan năm 2020, các nước khác đều có lộ trình
khống chế và thanh toán bệnh DTL (Bhaskar et al, 2015; Rios et al, 2017).

Hình 2.1. Bản đồ tình trạng bệnh DTL của các nước thành viên của tổ chức
Thú y thế giới cập nhật lần cuối vào tháng 5 năm 2017

(Nguồn OIE: )

10


2.1.1.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh DTL được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1923 - 1924
bởi Houdener. Từ đó đến nay vẫn còn tồn tại phổ biến và luôn luôn là mối đe
doạ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn nước ta (Đào Trọng Đạt and
Nguyễn Tiến Dũng, 1985; Nguyễn Tiến Dũng, 1999).
Năm 1960 bệnh xảy ra ở Nghệ An, Phú Thọ. Năm 1968 có 481 ổ dịch được
phát hiện ở miền bắc, tiếp đó năm 1971 bệnh DTL đã xảy ra ở 11 trại lợn xung
quanh Sài Gòn. Năm 1974 xảy ra ở 17 tỉnh thành phía bắc làm thiệt hại hơn 4 vạn
con lợn. Bệnh đã lây lan sang các tỉnh ở Nam Bộ năm 1981, Thừa Thiên Huế năm
1990 ( Nguyễn Tiến Dũng, 1999; Nguyễn Thị Phương Duyên và cs, 2001).
Các tỉnh thuộc Trung Trung Bộ dịch xảy ra tương đối rộng vào các năm
1976 - 1978: năm 1976 có 17 ổ dịch, năm 1977 có 36 ổ dịch, năm 1978 có 18 ổ
dịch (Báo cáo dịch tễ tháng 11 năm 1978, Cục Thú y).
Từ những năm 1980 trở lại đây, theo chương trình quốc gia phòng chống
các bệnh truyền nhiễm quan trọng nói chung và bệnh DTL nói riêng trên đàn lợn
bằng việc sử dụng vắc xin đã thu được những thành quả nhất định, do đó đã
phần nào khống chế được dịch bệnh. Mặc dù vậy bệnh DTL vẫn xem là một
trong những bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa tiềm ẩn đối với ngành chăn nuôi ở
nước ta. Bệnh DTL ở nước ta xảy ra quanh năm, tuy nhiên do thời tiết thay đổi
(thể hiện rõ ở miền Bắc) và do biến động số lượng của đàn lợn trong năm nên
bệnh có lúc tăng lúc giảm (Bùi Quang Anh, 2001).
Ngoài ra, sự bùng phát của bệnh DTL còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố
như tỷ lệ tiêm phòng cho đàn lợn, lợn trưởng thành đã có miễn dịch bị giết mổ,
lợn con thay đàn bổ sung vào chưa kịp tiêm phòng làm cho tỷ lệ lợn mẫn cảm
trong đàn tăng lên. Một số nghiên cứu trong nước gần đây đã cho thấy, 40% số

lợn ở lò mổ dương tích với vi rút DTL (Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2002; Trần Thị
Dân và cs, 2003).

11


Việc tiêm phòng theo mùa vụ và tiêm phòng bổ sung thường xuyên góp
phần ổn định và hạn chế sự lây lan của dịch, nhưng trong sản xuất thực tế vì
nhiều lý do nên việc tiêm phòng chưa thực hiện đúng quy định, do đó bệnh DTL
vẫn xảy ra vào các tháng trong năm. Lợn bệnh thường thể hiện ở thể mạn tính và
các trường hợp khác là do nhiễm vi rút khi sơ sinh, bệnh có thể kéo dài và là một
trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn con (Nguyễn Tiến Dũng và cs,
2002; Phạm Hồng Sơn, 2005; Nguyễn Thị Hạnh Thu và Trần Hạnh Từ, 2005).
Theo nghiên cứu của Bùi Quang Anh và cộng sự thì lợn con sau tiêm vắc xin
sau 21 ngày thì tỷ lệ huyết thanh có kháng thể kháng vi rút DTL là 91,81% và tỷ lệ
bảo hộ với vi rút DTL là 84,66%, sau đó giảm dần và đến 90 ngày tuổi giảm xuống
còn 87,77%, tỷ lệ bảo hộ 78,88%. Đến 180 ngày tỷ lệ huyết thanh học có kháng thể
DTL giảm xuống còn 50,9% và tỷ lệ bảo hộ với vi rút DTL chỉ còn 35,15%. Kết
quả cho thấy cần phải tiêm vắc xin nhắc lại sau 6 tháng để lợn duy trì được tỷ lệ
bảo hộ có khả năng chống lại vi rút DTL (Bùi Quang Anh, 2001).
2.1.1.3. Cấu trúc của vi rút DTL
Những mô tả đầu tiên về vi rút gây bệnh DTL đã chỉ ra rằng vi rút DTL
thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Vi rút DTL có quan hệ mật thiết và có
chung tính kháng nguyên với vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV) và vi rút
gây bệnh biên giới ở cừu (BDV), cả hai loại vi rút này đều có khả năng gây bệnh
tiêu chảy trên lợn. Vi rút gây bệnh DTL là thuộc loại RNA vi rút nhỏ một sợi và
có vỏ bọc ngoài là lipoprotein, đường kính 40 - 50nm, khác hẳn với DNA vi rút
lớn gây bệnh DTL châu phi (African swine fever - ASF), mặc dù cả hai loại vi
rút này đều gây những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích tương tự nhau (Meyers
et al, 1989; Hoffmann et al, 2005; Leifer et al, 2010a).

Về mặt cấu trúc, bộ gen của vi rút DTL chỉ gồm một khung đọc mở đơn
lớn (open reading frame - ORF) và có chiều dài khoảng 12,3 kb (Meyers and
Thiel, 1996; Meyers et al, 1996). Dự vào phân tích trình tự toàn bộ genome của
vi rút DTL, các nhà khoa học đã chia vi rút DTL làm 3 nhóm chính và 4 phân
12


nhóm phụ, bao gồm: 1.1, 1.2, 1.3; 2.1, 2.2, 2.3; 3.1, 3.2, 3.3, và 3.4. Nhóm 1 là
nhóm có lịch sử lâu đời nhất và gây bệnh phổ biến ở châu Âu trong giai đoạn
1920 - 1970; nhóm 2 là tác nhân gây ra những ổ dịch vào thập niên 90 (Paton et
al, 2000). Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các ổ dịch ở Hà Lan và Anh gây ra
bởi vi rút DTL thuộc genotype 2.1 (Oleksiewicz et al, 2003; Sarma et al, 2011;
Postel et al, 2012). Vi rút DTL thuộc nhóm 3 là phổ biến nhất ở Châu Á (Sakoda
et al, 1999; Sabogal et al, 2006; Sun et al, 2013).
Những nghiên cứu về cấu trúc của vi rút DTL cho thấy khung đọc mở của
vi rút này mã hóa cho một glycoprotein có kích thước khoảng 3900 amino axit,
gồm 4 protein cấu trúc (C, Erns, E1, và E2), p7 và 7 protein không cấu trúc (N pro,
NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) (Lowings et al, 1996; Meyers and
Thiel, 1996; Crauwels et al, 2003; Deng et al., 2005; Desai et al, 2010; Sun et al,
2013). Một polyprotein lớn được dịch mã từ RNA của vi rút sẽ được xử lý thành
những protein vi rút riêng biệt. Protein đầu tiên mã hoá là N pro một protein
không cấu trúc có nhiệm vụ phân cắt vị trí N pro/C. Peptidase ký chủ phân cắt
những vị trí C/Erns, E1/E2, E2/p7 và p7/NS2 với sự phân cắt không hoàn toàn ở
vị trí E2/p7. NS2 - 3 được phân cắt bởi autoprotease NS2. Sự phân cắt của
polyprotein hình thành NS4A, NS4B, NS5A và NS5B được thuỷ phân bởi
enzyme protease serine NS3 - 4A (Lowings et al, 1996).
- Npro là autoprotease không cấu trúc có hoạt tính thuỷ phân protein. Npro không
cần thiết đối với sự sao chép vi rút. N pro cũng hoạt động như một chất đối kháng của sự
hoạt hoá IRF-3 và sự sản xuất ra interferon (IFN), ức chế sự phiên mã IRF - 3 ở những
tế bào nhiễm vi rút DTL. Những đột biến bỏ đi Npro của vi rút DTL đã được đề xuất để

làm nguyên liệu sản xuất vắc xin vi rút sống (Lowings et al., 1996).
- Protein cấu trúc:
+ C (mã hoá protein p14): là protein của nucleocapsid. Đầu cuối C (C
-terminus) của protein C ở vi rút DTL đã được xác định và được định vị ở phần
kỵ nước của chuỗi peptide tín hiệu bên trong (internal signal peptide) khởi đầu
13


sự di chuyển của Erns vào trong khoang mạng lưới nội chất (Bhaskar et al, 2015).
+ Erns (mã hoá protein gp44/48), E1(gp33), E2(gp55): là các protein vỏ. E2
và Erns có tính kháng nguyên mạnh nhất. Erns có tác dụng hỗ trợ thải vi rút qua một
màng đặc biệt, được tiết ra từ tế bào nhiễm, đặc điểm nổi bật của E rns là hoạt tính
ribonuclease với tính chuyên biệt đối với gốc uridine. Những kháng thể ức chế
hoạt tính ribonuclease có khuynh hướng trung hoà tính nhiễm vi rút, sự đột biến ở
Erns phá huỷ hoạt tính ribonuclease gây nên gia tăng số lượng vi rút. Erns tái tổ hợp
là một độc chất đối với tế bào bạch huyết trong ống nghiệm, có thể kết hợp với sự
giảm bạch cầu ở nhiễm tự nhiên. Mặc dù độc tính tế bào là một đặc điểm nổi bật
của những enzyme ribonuclease hoà tan khác nhưng người ta chưa rõ là hoạt tính
ribonuclease của Erns có liên quan đến độc tính của nó hay không. Vùng đầu cuối
C (C - terminal) của Erns có thể khởi động sự di chuyển của nó qua màng tế bào,
có thể coi như là mục tiêu hoặc chức năng trong tế bào. Tuy nhiên, Erns tái tổ hợp
cũng có thể nối một cách vững chắc với bề mặt tế bào qua sự tương tác với
glycosaminoglycan và ức chế sự lây nhiễm (Lowings et al, 1996).
+ E1 và E2 là những protein màng không thể thiếu. E2 của vi rút DTL tái
tổ hợp có thể kết hợp với các tế bào và ngăn chặn sự lây nhiễm của vi rút DTL.
Mặc dù vai trò quan trọng của những glycoprotein ở vi rút là lắp ráp và tiếp
nhận nhưng những kháng thể đối với E rns hoặc E2 có thể trung hoà tính lây
nhiễm của vi rút và cả hai kháng nguyên này có thể tạo ra tính sinh miễn dịch
bảo vệ.
- Protein p7 theo sau những protein cấu trúc, gồm một vùng đảm đương

nhiệm vụ trung tâm đối với việc tách đầu cuối kỵ nước và protein này là càn
thiết cho sự nhân lên và lây nhiễm của vi rút DTL nhưng không đòi hỏi trong
quá trình sao chép RNA. P7 của pestivirus được phân cắt một cách không hiệu
quả từ E2 qua peptidase đặc biệt. E2 - p7 không phân cắt không cần thiết đối với
sự sao chép trong nuôi cấy tế bào và cả hai E2 - p7 và p7 giúp tế bào kết hợp với
nhau. Tuy nhiên, chưa biết rõ p7 là một protein cấu trúc hay không cấu trúc mặc
14


dù nó không được phát hiện trong vi rút tinh sạch. Pestivirus có p7 thì có thể
hình thành những kênh ion tham gia trong sự lắp ráp và tiếp nhận của vi rút
(Lowings et al, 1996; Rios et al, 2017).
- Protein không cấu trúc:
+ Protein NS2 là một enzyme thuỷ phân protein chứa cysteine đã được
nhận diện. Sự phân cắt NS2 - 3 thiết yếu đối với sự sao chép RNA của pestivirus
và hiệu quả phân cắt NS2 - 3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bào và có
thể xác định tính gây bệnh tế bào. Vùng NS2 - 3 tham gia lắp ráp vi rút.
+ NS3 chứa một vùng protease serine ở đầu cuối N và một helicase RNA
ở đầu cuối C. Protease serine NS3 đòi hỏi NS4A như là một yếu tố hỗ trợ.
Protease serine NS3 - 4A phân cắt giữa leucine và những amino acid không
phân cực nhỏ. Hoạt tính protease serine ảnh hưởng đến sự sao chép RNA vi rút,
đóng vai trò thiết yếu trong khả năng tồn tại của vi rút.
+ NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tính protease serine NS3.
NS4A và NS4B không đóng vai trò thiết yếu trong sự sao chép RNA của vi rút.
+ NS5A và NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phân cắt hoàn toàn
cũng không khác gì NS5A - 5B không phân cắt. Chức năng của NS5A chưa
được biết rõ. NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA
(RdRp - RNA dependent RNA polymerase) (Patil et al, 2012; Rios et al, 2017).
Các protein cấu trúc đóng vai trò quan trọng trong khả năng tạo đáp ứng
miễn dịch của vi rút DTL, trong đó hai protein cấu trúc vỏ, Erns và E2, là những

protein có khả năng sinh miễn dịch mạnh nhất (Paton and Greiser - Wilke, 2003).

15


Hình 2.2. Cấu trúc bộ gen Flavivirus
(nguồn: )
2.1.1.4. Sức đề kháng của vi rút DTL
Sức đề kháng của vi rút DTL phụ thuộc vào trạng thái vật lý của chất chứa
vi rút, vi rút trong dịch nuôi cấy tế bào sẽ bị vô hoạt ở 60 0C trong 10 phút, vi rút
có thể tồn tại 27 ngày ở thịt đông lạnh, 73 ngày ở tuỷ xương và 168 ngày ở thịt
xông khói. Trong môi trường thiên nhiên, ở nhiệt độ thấp dưới 10 0C vi rút sống
và giữ nguyên độc lực gây bệnh hàng tháng. Ở nhiệt độ bình thường 18 - 30 0C,
chúng có thể sống nhiều tuần, nhưng dưới ánh sáng trực tiếp của mặt trời thì
chúng không tồn tại lâu hơn 10 giờ. Trong chuồng và phân, vi rút bị bất hoạt sau
vài ngày.Vi rút dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao trên 75 0C, bị vô hoạt ở 600C trong
10 phút, 560C trong 1 giờ. Vi rút bị tiêu diệt trong môi trường có chất làm tan
lipid, có enzyme protease (Đào Trọng Đạt và Nguyễn Tiến Dũng., 1985).
Vi rút dịch tả lợn bất hoạt ở pH <3 hoặc pH>11, rất nhạy cảm với Ete,
Chloroform, PVP iodine, Benzalkonium, Dezoxicholat Natri, nước vôi 10%,
Formol 1 - 2% Phencol, Hyzol,…nhưng khá bền vững với Trypsin. Thuốc sát

16


khuẩn hữu hiệu thường dùng hiện nay là PVP.iodine 10%, B.K.Vet, Formol 1,5 2%, Virkon.S….(Bùi Quang Anh, 2001).
2.1.2. Bệnh do vi rút DTL gây ra
2.1.2.1 Nguyên nhân
Bệnh do một loại vi rút có cấu trúc RNA thuộc chi Pestivirus,
họ Flaviviridae gây ra. Vi rút tồn tại lâu ở ngoài môi trường, có thể sống sót vài

ngày trong phân lợn, vài tháng đến vài năm trong thịt đông lạnh. Tuy nhiên, đây
là loại vi rút có sức đề kháng yếu, dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao và các chất sát
trùng thông thường như xút (NaOH) 2%, nước vôi 5%...
2.1.2.2. Loài mắc
Vi rút DTL có mặt hầu khắp các quốc gia trên thế giới và lợn là ký chủ
duy nhất (bao gồm cả lợn nhà và lợn rừng). Bệnh có thể lây từ lợn rừng sang lợn
nhà hoặc ngược lại. Các loài động vật khác và người không mắc bệnh này (Đào
Trọng Đat và Nguyên Tiến Dũng, 1985; Nguyễn Tiến Dũng và cs, 2002; Phạm
Hồng Sơn, 2005; Nguyễn Thị Hạnh Thu và Trần Hạnh Từ, 2005). Nhiều tác giả
đã gây bệnh cho chuột nhắt, gà, ngựa, trâu nhưng bệnh không biểu hiện trên
những loài vật thí nghiệm này. Năm 1941, Tenbroek thông báo về việc nuôi cấy
thành công vi rút DTL trong môi trường tế bào dịch hoàn lợn trong dung dịch
Tyrode (1. Anh, 2001). Năm 1950, Corone và Albis thực hiện thí nghiệm tiêm
truyền vi rút DTL vào phôi trứng vịt và đã thích ứng với vi rút DTL trên phôi
vịt. Sau đời thứ 8 cấy truyền qua phôi vi rút đã mất độc lực với lợn nhưng gây
được miễn dịch cho lợn. Fonanelli và cộng sự (1995) đã thử tiêm cho phôi gà
nhưng không thành công (Bùi Quang Anh, 2001).
2.1.2.3. Phương thức truyền lây
Nguồn lây truyền mầm bệnh là các chất bài tiết, dịch tiết, máu, hạch lâm
ba, lách của lợn bệnh chứa vi rút. Những lợn khỏi bệnh sau 2 tháng vẫn bài thải
mầm bệnh ra ngoài môi trường làm nguồn lây nhiễm cho cá thể khác. Những
lợn con bị nhiễm bệnh này sẽ thải ra một lượng lớn vi rút, và các triệu chứng
17


lâm sàng có thể xuất hiện sau một vài tháng. Do đó, chúng bị lây nhiễm trong
suốt đời sống và sẽ không dễ để phát hiện (van Oirschot, 2003).
Theo các nghiên cứu cho thấy vi rút lây truyền theo chiều ngang và theo
chiều dọc: Lây truyền vi rút theo chiều ngang trực tiếp giữa các con ốm với con
khỏe, hoặc lây gián tiếp qua các chất bài tiết, qua thức ăn, nước uống, dụng cụ

chăn nuôi, phương tiện vận chuyển hay do tiếp xúc với các động vật mang mầm
bệnh. Lây truyền vi rút theo chiều dọc từ mầm bệnh trong các phôi (van
Oirschot, 2003). Lây truyền theo chiều dọc thường dẫn đến chết non, hoặc
những con lợn con sinh ra bị bệnh, do lợn mẹ mang bệnh (carrier sows) thường
sinh ra các con lợn con bị nhiễm bệnh (Paton and Greiser - Wilke, 2003; van
Oirschot, 2003).
2.1.2.4. Lứa tuổi
Bệnh thường xảy ra ở mọi lứa tuổi song tập trung nhiều nhất ở lợn con
theo mẹ và lợn mới cai sữa. Trong những năm gần đây việc tiêm phòng đã được
chú ý do vậy tuổi mắc phụ thuộc nhiều vào sức đề kháng và tình trạng miễn dịch
của đàn lợn. Lợn đực và lợn nái không biểu hiện triệu chứng lâm sang nhưng có
tỷ lệ mang trùng vi rút DTL (Đào Trọng Đạt và Nguyễn Tiến Dung, 1985)
Theo Bùi Quang Anh và cộng sự, lợn từ 2 - 6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnh
DTL cao nhất trong tổng số lợn mắc bệnh, lợn con theo mẹ 19,42%; lợn trên 6
tháng tuổi 12,08%; còn lợn nái và lợn đực tỷ lệ mắc bệnh DTL thấp nhất 0,212,46% nhưng lại là nguồn mang trùng và lây lan dịch bệnh (Bùi Quang Anh, 2001).
2.1.2.5. Chất chứa của vi rút
Khi vào cơ thể lợn, vi rút DTL di hành đến khắp nơi, có thể tồn tại và phát
triển ở mọi cơ quan, mô tổ chức của cơ thể. Trong cơ thể con vật ốm, vi rút có
nhiều nhất trong máu (thời kỳ con vật sốt). Các cơ quan phủ tạng: hạch lâm ba, lá
lách, các chất bài xuất, bài tiết (nước mắt, nước mũi, phân,…) chứa nhiều vi rút.

18


2.1.2.6. Triệu chứng
Thời gian nung bệnh từ 3 - 7 ngày và tuỳ theo độc lực của vi rút, lứa tưổi,
giống, thể trạng, trạng thái miễn dịch mà bệnh có thể xuất hiện ở một trong 4 thể
với các triệu chứng như sau:
* Thể quá cấp tính (còn gọi là bệnh dịch tả lợn trắng): Thường xuất hiện ở
đầu ổ dịch, lợn con mẫn cảm với thể này hơn lợn trưởng thành. Con vật ủ rủ cao

độ, sốt kịch liệt, chết nhanh khi chưa xuất hiện triệu chứng bệnh tích đặc trưng,
con vật dẫy dụa rồi chết nhanh trong vòng 24 - 48 giờ, tỷ lệ chết tới 100%.
* Thể cấp tính: Thể này thường gặp, thời gian nung bệnh từ 2 - 4 ngày.
Lợn có các triệu chứng chung: ủ rũ, kém ăn, rồi bỏ ăn, sốt cao 41 - 42 0C kéo dài
đến lúc gần chết, lợn con thường nằm chồng đống lên nhau ở góc chuồng.
Ở những đàn lợn mẫn cảm, lúc đầu chỉ có một số con mắc, nhưng sau
khoảng 10 ngày bệnh sẽ lây ra toàn đàn. Do vi rút tác động đến bộ máy tiêu hoá
nên con vật có biểu hiện nôn mửa. Trong thời gian sốt con vật đi táo, khi thân
nhiệt hạ con vật đi ỉa chảy nặng: phân loãng nhiều nước, thối khắm, có khi có
cục máu và các mảng thượng bì niêm mạc bong tróc ra.
Do vi rút tác động lên bộ máy hô hấp nên con vật có biểu hiện: viêm niêm
mạc mũi, chảy nước mũi lúc đầu trong sau đục đặc dần, có khi đóng lại ở khoé
mũi làm cho vành mũi nứt nẻ. Con vật ho lúc đầu ho ít, ho khan về sau ho nhiều
và ho ướt.
Vi rút tác động lên hệ thần kinh, đặc biệt là não nên con vật có triệu chứng
thần kinh: đi siêu vẹo, loạng choạng, liệt hai chân sau hoặc liệt nửa thân sau.
Lợn bệnh biểu hiện viêm kết mạc và giác mạc mắt, chảy nước mắt lúc đầu
loãng, trong về sau đục và đặc dần.
Vi rút tác động phá huỷ thành mạch nên quan sát trên da có các điểm xuất
huyết to nhỏ không đều nhau bằng đầu mũi kim, đầu đinh ghim. Điểm xuất
huyết nhỏ li ti, tập trung lại thành từng mảng, từng đám giống như vừng cháy.
Có trường hợp nốt xuất huyết to bằng hạt ngô, tím bầm, nằm lặn sâu ở tổ chức
19


liên kết dưới da. Lợn chết trong vòng 1 tuần sau khi biểu hiện triệu chứng bệnh,
tỷ lệ chết có thể 100%.
* Thể mãn tính: Thể này do chủng vi rút có độc lực trung bình gây nên
hoặc từ thể cấp tính chuyển sang. Con vật có triệu chứng như thể cấp tính, gầy
còm, ỉa chảy liên miên, lúc sốt lúc không, bỏ ăn, mắc các bệnh kế phát do vi

khuẩn. Bệnh kéo dài vài tuần hoặc hàng tháng trước khi chết.
Vi rút có thể truyền qua nhau thai nên nếu lợn nái mắc bệnh, tuỳ theo
chủng vi rút và thời gian mang thai, lợn có biểu hiện sảy thai, thai chết lưu hoặc
đẻ non. Nếu lợn nái mắc bệnh khi mang thai lúc 50 - 70 ngày, có thể sinh con có
mang mầm bệnh. Con đẻ ra có thể bị chết ngay hoặc một số lúc đầu sinh ra biểu
hiện bình thường sau có biểu hiện run rẩy, còi cọc, không sốt, chết sau một vài
tuần hoặc vài tháng được gọi là “dịch tả lợn phát muộn”.
* Thể không điển hình: Thể này biểu thị dưới các dạng rất khác nhau như
rối loạn sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản (sảy thai, chết lưu, thai gỗ, dị dạng gây
run rẩy bẩm sinh, rối loạn vận động,…) chậm lớn, chết rải rác. Hơn nữa, trong
các trường hợp không điển hình, vi rút DTL có thể lưu hành một cách không rõ
ràng nhất là ở lợn sinh sản với các trường hợp lâm sàng nổ ra lẻ tẻ khi có các
điều kiện không thuận lợi (Nguyễn Thị Phương Duyên và cs, 2001; Moennig et
al, 2003).
Thể không điển hình là thể khó phân biệt của bệnh DTL vì bệnh kéo dài
và không có các thời kỳ rõ rệt. Thể bệnh nhẹ hơn bình thường và thường chỉ một
loại phủ tạng có bệnh tích: chẳng hạn chỉ phổi, ruột hay thần kinh đặc biệt bị
bệnh. Triệu chứng sẽ dễ quan sát ở những con lợn trong trạng thái có sức khoẻ
kém. Lợn chậm phát triển và suy dinh dưỡng, các bệnh tích và triệu chứng
không giống bệnh DTL thông thường (Moennig et al, 2003)
2.1.2.6. Bệnh tích
Trong thể cấp tính, xác chết thường gầy, phân bết xung quanh hậu môn,
quan sát rõ nhất là hiện tượng xuất huyết. Trên da, đặc biệt ở những vùng da
20


mỏng có nhiều điểm, nốt xuất huyết. Niêm mạc miệng, lợi viêm xuất huyết, có
khi có mụn loét nông hay sâu, phủ bựa màu trắng xám hoặc màu vàng nhạt.
Xuất huyết trên bề mặt phổi: điểm xuất huyết to nhỏ không đều bằng đầu
mũi kim hoặc đầu đinh ghim. Phổi có nhiều đám viêm với màu sắc khác nhau:

đỏ, nâu. Viêm niêm mạc khí quản, phế quản; trên bề mặt niêm mạc có nhiều
dịch nhớt và bọt màu hồnh.
Bệnh tích đặc trưng tập trung tại đường tiêu hoá: viêm niêm mạc dạ dày,
nhất là vùng thân vị và hạ vị có những đám, mảng xuất huyết hoặc loét; xuất
huyết và loét niêm mạc ruột nhất là ở các mảng Payer; có các mốt loét hình cúc
áo trên niêm mạc van hồi manh tràng, đôi khi có nốt loét niêm mạc ruột già.
Hạch lâm ba sưng, xuất huyết đặc trưng; có thể quan sát thấy xuất huyết ở 3
trạng thái: xuất huyết toàn bộ hạch làm cho hạch tím bầm như quả mồng tơi hay
quả mận chín; xuất huyết vùng rìa hạch; xuất huyết thành dải, có vân như đá hoa.
Lách thường không sưng hoặc ít sưng. Trên bề mặt có điểm xuất huyết
bằng đầu kim hoặc đầu đinh ghim. Vùng rìa lách do nhồi huyết hình thành
những đám tổ chức bị hoại tử, thường có màu tím đen, hình tam giác, đỉnh
hướng vào trong, nhìn rìa lách có hình răng cưa lồi lõm không đều.
Thận có nhiều điểm xuất huyết lấm tấm như đầu ghim ở vỏ thận và tủy thận,
bể thận ứ máu hoặc có cục máu. Niêm mạc bàng quang bị tụ huyết, xuất huyết.
Túi mật căng hoặc teo, niêm mạc túi mật xuất huyết li ti, có khi tập trung
lại thành từng đám.
Thể mạn tính, thường quan sát thấy các nốt loét hình cúc áo ở đường tiêu
hoá, nắp thanh quản và thanh quản.
Bệnh tích vi thể không đặc trưng, nếu có là hiện tượng thoái hoá nhu mô
tổ chức hạch lympho, tăng sinh tế bào thành ruột.
Bệnh dịch tả lợn bẩm sinh gây hiện tượng sảy thai, thai chết lưu hoặc đẻ
non. Con non mắc các dị tật bẩm sinh như sự bất thường trong hình thành
myelin thần kinh, tiểu não, phổi không phát triển hoàn thiện, não nhỏ.
21


2.1.2.7. Chẩn đoán
a) Chẩn đoán lâm sàng
Dựa trên các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh: ủ rũ, kém ăn, rồi

bỏ ăn, sốt cao 41- 420C kéo dài đến lúc gần chết, lợn con thường nằm chồng
đống lên nhau ở góc chuồng; con vật có biểu hiện nôn mửa, trong thời gian sốt
con vật đi táo, khi thân nhiệt hạ con vật đi ỉa chảy nặng; viêm kết mạc và giác
mạc mắt, viêm niêm mạc mũi, chảy nước mũi lúc đầu trong sau đục đặc dần, có
khi đóng lại ở khoé mũi làm cho vành mũi nứt nẻ; đi siêu vẹo, loạng choạng, liệt
hai chân sau hoặc liệt nửa thân sau; tỷ lệ chết có thể là 100%.
Cần chẩn đoán phân biệt với một số bệnh sau: bệnh phó thương hàn, bệnh
đóng dấu, bệnh tụ huyết trùng, bệnh giả dại.
b) Chẩn đoán vi rút học
Phân lập vi rút được coi là phương pháp xác định vi rút với độ nhạy và
độ đặc hiệu cao nhất. Có thể phân lập vi rút từ mẫu bệnh phẩm, máu. Vi rút DTL
sau đó sẽ được nuôi cấy trên môi trường thận lợn. Sau đó sử dụng phản ứng
miễn dịch huỳnh quang để xác định sự nhân lên của vi rút.
Phản ứng kháng thể huỳnh quang trực tiếp là phương pháp xác định vi rút
DTL cho kết quả nhanh, đáng tin cậy. Để phân biệt vi rút DTL với các pestivirus
khác, cần phải sử dụng kháng thể đơn dòng. Mẫu thường được sử dụng là hạch
amidan. Trong thể á cấp tính hoặc mạn tính, mẫu thường được lấy để làm phản
ứng là hồi tràng. Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp này không như phân lập
vi rút, tuy phản ứng âm tính nhưng chưa chắc lợn không mắc bệnh DTL.
Phản ứng ELISA dễ thực hiện, có thể sử dụng để chẩn đoán sớm bệnh
DTL ở đàn lợn, cho kết quả sau 36 giờ. Phản ứng sandwich ELISA thường sử
dụng kháng thể đơn dòng phát hiện các loại kháng nguyên của vi rút. Nguyên
liệu được sử dụng để tiến hành là mẫu bệnh phẩm, huyết thanh, huyết tương,
buffy coat, hoặc máu toàn phần được chống đông bằng EDTA.

22


PCR được sử dụng để phát hiện vi rút DTL, RNA của vi rút có thể phát
hiện được từ mẫu máu của lợn sống hoặc mẫu bệnh phẩm. Phản ứng cho kết quả

nhanh, có độ tin cậy cao.
c) Chẩn đoán huyết thanh học
Trong nghiên cứu bệnh DTL, dùng phản ứng ELISA dựa trên nguyên lý
cạnh tranh giữa kháng thể có trong huyết thanh kháng vi rút DTL và kháng thể
đơn dòng đặc hiệu kháng glycoprotein gp 55 của vi rút DTL, giúp hạn chế phản
ứng chéo với các pestivirus khác. Phương pháp này có thể phát hiện kháng thể
sau khi nhiễm 10 - 15 ngày.
Phương pháp trung hòa: để phát hiện kháng thể trung hoà vi rút DTL có
trong huyết thanh. Sử dụng huyết thanh pha loãng theo cơ số 2, trộn với vi rút
DTL nồng độ 100TCID50/ml. Sau khi ủ 1 giờ, hỗn dịch được cho vào đĩa môi
trường tế bào PK 15 (lặp lại thí nghiệm trong 2 giếng). Sau 2 - 4 ngày, tế bào
được nhuộm với kháng thể đặc hiệu kháng vi rút DTL. Hiệu giá kháng thể chính
là logarit của độ pha loãng huyết thanh cao nhất có khả năng ngăn cản sự nhân
lên của vi rút ở 1 - 2/2 giếng phản ứng.
Vì có phản ứng chéo giữa các pestivirus, huyết thanh cần chẩn đoán phải
được trung hoà với các chủng BVDV và BDV chuẩn. Nếu hiệu giá kháng thể
giữa các vi rút chênh lệch nhau ≥ 4 lần thì mới được kết luận về nguyên nhân
bệnh. Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra mang tính sàng lọc
những đàn xung quanh ổ dịch để đề xuất biện pháp phòng chống dịch.
2.1.2.8. Phòng và kiểm soát bệnh
Các quy tắc trong việc kiểm soát bệnh là:
Hạn chế việc tiếp xúc giữa các lợn bằng việc giảm mật độ đàn: Việc hạn
chế lợn tiếp xúc với nhau giúp hạn chế sự lan truyền của mầm bệnh. Lợn tiếp
xúc với nhau trực tiếp bằng mũi, dụng cụ chăn nuôi, phân và con người. Sự lây
truyền mạnh hơn ở những ô chuồng có mật độ cao.

23


Giảm các tác nhân stress vì hệ thống miễn dịch bị kích thích thái quá vi

rút DTL có thể gây bệnh. Những con lợn bị stress thường dễ bị mắc bệnh.
Những yếu tố tạo stress gây rối loạn chức năng sinh lý, làm cho sức đề kháng cơ
thể giảm tạo điều kiện cho các vi sinh vật và vi rút DTL gây bệnh.
Nhu cầu dinh dưỡng phù hợp theo lứa tuổi: Dinh dưỡng tốt giúp cho lợn
tăng trọng, hệ thống miễn dịch hoạt động tốt. Giúp lợn mẹ cung cấp sữa đầu tốt
giúp lợn con sơ sinh chống lại mầm bệnh. Sau khi heo cai sữa cho lợn con ăn
khẩu phần thức ăn chất lượng cao, cân bằng.
Đảm bảo các điều kiện vệ sinh thú y và an toàn sinh học: Vệ sinh và sát
trùng chuồng trại, dụng cụ tốt, sử lý chất thải chăn nuôi giúp giảm thiểu sự lây
lan phát tán mầm bệnh.
Phòng bệnh DTL: tại Việt Nam chương trình phòng chống bệnh DTL luôn
bao gồm hai khâu: kiểm dịch động vật và tiêm phòng vacxin tạo miễn dịch chủ
động cho con vật.
2.2. Phương pháp RT - PCR
Khái niệm: Là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại RNA thành
cDNA. Nhạy và đa năng, RT - PCR được sử dụng để hồi phục và nhân đầu cuối
5’ và 3’ của mRNA và hình thành thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA. Thêm
vào đó, RT - PCR dễ dàng xác định đột biến và những đa hình trong những trình tự
được sao lại và đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế. Bước
đầu tiên là chuyển RNA thành cDNA. Một mồi oligodeoxynucleotide được lai
với RNA và sau đó kéo dài bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA. Kết thúc tiến trình tạo
cDNA là chuyển qua tiến trình PCR để nhân lên một lượng lớn cDNA.
Nguyên lý phản ứng RT - PCR: Thông tin di truyền của các RNA vi rút
được chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase (RT) để có thể
nhân gene đặc hiệu trong PCR. Sau đó tiến hành phương pháp PCR như các quy
trình thông thường.
24


Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mulis và cộng sự

phát minh ra vào năm 1985, ông đã đoạt giải Nobel năm 1993.
Nguyên lý của phản ứng PCR dựa vào đặc điểm sao chép DNA: DNA
Polymerase sử dụng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn mẫu để tổng hợp nên sợi
DNA bổ sung, bắt đầu từ đầu 3’OH của chuỗi Oligo nucleotide (mồi hay primer).

Hình 2.3. Sơ đồ nguyên lý phản ứng RT - PCR
Mồi là đoạn DNA ngắn, có độ dài từ 6 - 30 nucleotide. Đoạn này gắn kết
với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và được enzyme DNA - Polymerase
điều khiển để tổng hợp nên một sợi DNA đặc thù. Tuy nhiên để khuếch đại một
trình tự DNA xác định thì ta phải có được thông tin về trình tự gene của nó đủ
để tạo mồi chuyên biệt. Một cặp mồi gồm một mồi xuôi (forward primer) và
một mồi ngược (reverse primer). Mồi càng dài khả năng tổng hợp mạch càng
chính xác. Mồi ngắn dễ bắt cặp nhưng kết quả kém chính xác. Phải tránh có sự
bổ sung của 2 mồi xuôi, ngược.
Trong phản ứng PCR thì cả 2 sợi DNA đều được dùng làm khuôn cho quá
trình tổng hợp nếu các đoạn mồi được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho

25