ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT 2HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ 2,4DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ CURCUMIN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC
DẪN XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ
2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ
CURCUMIN

Họ và tên sinh viên: ĐẶNG THỊ MỸ LỆ
ĐỖ THỊ XUÂN VUI

Ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
Niên khóa: 2005-2009

Tháng 08/2009


ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN
XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ
2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ CURCUMIN

Tác giả

ĐẶNG THỊ MỸ LỆ
ĐỖ THỊ XUÂN VUI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
Cấp bằng Kỹ sư ngành
Công nghệ hóa học

Giáo viên hướng dẫn
Th.S PHAN THỊ HOÀNG ANH
Th.S LÊ XUÂN TIẾN
Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN

Tháng 08/2009
i


LỜI CẢM ƠN
Sau hơn 4 năm học tập tại trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, chúng tôi đã thật
sự trưởng thành rất nhiều về kiến thức cũng như kinh nghiệm sống. Luận văn này đánh
dấu một bước ngoặc quan trọng trong cuộc đời của chúng tôi. Qua trang giấy này, chúng
tôi xin dành tặng những lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới những người đã giúp
chúng tôi trong suốt thời gian qua.
Trước tiên chúng con xin cám ơn cha mẹ, người đã sinh ra và dưỡng dục chúng
con nên người, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng con học tập, luôn bên cạnh chúng
con, chia sẻ và động viên chúng con trong bất kỳ hoàn cảnh nào.
Chúng em xin chân thành cảm ơn Th.S Lê Xuân Tiến, thầy đã luôn luôn hướng
dẫn giúp đỡ chúng em, đi cùng với chúng em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và nâng
cao kiến thức. Và lời cảm ơn chân thành này xin được gởi đến Th.S Phan Thị Hoàng Anh,
cô là người đã luôn chia sẻ và giúp đỡ chúng em hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn
Th.S Nguyễn Hữu Anh Tuấn, thầy đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em
trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Chúng em xin chân thành cám ơn quý thầy cô ở Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học,
trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt nhiều kiến thức và
kinh nghiệm sống quý báu cho chúng em trong suốt quá trình học tập.
Và cuối cùng xin được gởi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè của chúng tôi. Cảm ơn các
bạn đã luôn cổ vũ động viên chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và trong suốt 4

năm học.
Kính chúc tất cả mọi người sức khỏe và thành công !

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine
2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ
curcumin” được thực hiện tại phòng Thí nghiệm tổng hợp hữu cơ trường Đại Học
Bách Khoa TP. HCM, thời gian từ 02/2009 đến 08/2009.
Nội dung chính của đề tài là tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của dẫn
xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin
từ curcumin nhằm tìm kiếm một hoạt chất có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực dược
phẩm.
Tiến trình thực hiện đề tài như sau:
1/ Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin từ bột curcuminoid
- Phân lập curcumin từ bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội).
- Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm chảy,
xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR.
Kết quả: Đã tổng hợp và phân lập thành công curcumin có độ tinh khiết >95% và có
thể dùng curcumin tinh khiết này cho các quá trình tổng hợp dẫn xuất tiếp theo.
2/ Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất imine
– Tổng

hợp

dẫn

xuất

2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin

(HBTC),

2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC).
– Phân lập sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột.
– Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bảng mỏng TLC, đo điểm chảy.
– Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổ IR, MS, NMR.
Kết quả: Đã tổng hợp và tìm được hệ dung môi thích hợp để phân lập thành công 2
dẫn xuất imine DFPHC, HBTC có độ tinh khiết > 95% để tiến hành khảo sát các hoạt
tính sinh học.

iii


3/ Khảo sát hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất imine - curcumin
–

Hoạt tính kháng ung thư.

–

Hoạt tính kháng oxy hóa.

–

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.

–

So sánh các hoạt tính sinh học của dẫn xuất đã tổng hợp được với hoạt

tính sinh học của curcumin.
Kết quả:
Trong luận văn này, hai dẫn xuất DFPHC và HBTC đều thể hiện hoạt tính
kháng oxi hoá trong thử nghiệm DPPH và MDA tuy nhiên hoạt tính thấp hơn Cur.
DFPHC và Cur đều thể hiện hoạt tính kháng ung thư đối với dòng tế bào
Hep – G2.
Ngoài ra DFPHC và HBTC đều có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm nhưng
hoạt tính này không đáng kể với các chủng vi khuẩn, vi nấm đã khảo sát.

iv


MỤC LỤC
Trang tựa ......................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ................................................................................................................................ii
Tóm tắt........................................................................................................................... iii
Mục lục ............................................................................................................................v
Danh sách các từ viết tắt.............................................................................................. viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ ix
Danh sách các bảng ....................................................................................................... xi
Danh sách các sơ đồ ..................................................................................................... xii
Chương 1: MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................................2
1.3. Nội dung đề tài .........................................................................................................2
1.4. Yêu cầu .....................................................................................................................3
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................4

2.1. Tổng quan về curcumin ............................................................................................4
2.1.1. Curcuminoid ..........................................................................................................4
2.1.1.1. Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid..............................................................4
2.1.1.2. Phân lập các dẫn xuất curcuminoid ..........................................................5
2.1.2. Curcumin ...............................................................................................................6
2.1.2.1. Lý tính.................................................................................................................6
2.1.2.2. Hóa tính ..............................................................................................................7
2.2. Hoạt tính sinh học của Cur và dẫn xuất của Cur. ...................................................14
2.2.1. Hoạt tính kháng ung thư ......................................................................................15
2.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa......................................................................................16
2.3. Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine Cur....................................................17
Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................23
3.1. Sơ đồ thực nghiệm..................................................................................................23
3.2. Phương pháp thực hiện ...........................................................................................24
3.2.1. Phân lập curcumin................................................................................................24
v


3.2.1.1. Kết tinh lại ........................................................................................................25
3.2.1.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) ...................................................................................26
3.2.1.3. Sắc ký cột.........................................................................................................27
3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất imne – curcumin. ...........................................................29
3.2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2 hydrazinobenzothiazolcurcumin ....................................29
3.2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất 2,4 diflorophenylhydrazinocurcumin................................32
3.2.3. Phân tích cấu trúc của các dẫn xuất vừa tổng hợp..............................................35
3.2.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis).......................................................................35
3.2.3.2. Phổ hồng ngoại (IR) .........................................................................................35
3.2.3.3. Khối phổ ..........................................................................................................35
3.2.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ............................................................................35
3.2.4. Khảo sát hoạt tính sinh học ................................................................................35

3.2.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH...................35
3.2.4.2. Đánh giá hoạt tính chống peroxide hóa lipid - phương pháp MDA ................37
3.2.4.3. Đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn- phương pháp MIC...................38
3.2.4.4. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư....................................................................39
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................41
4.1. Phân lập curcumin ..................................................................................................41
4.1.1. Kết tinh lại curcuminoid......................................................................................41
4.1.2. Sắc ký cột.............................................................................................................42
4.1.3. Nhận danh cấu trúc hóa học ................................................................................43
4.1.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng của curcumin ...........................................................43
4.1.3.2. Biện luận cấu trúc của curcumin ......................................................................44
4.2. Tổng hợp dẫn xuất 2-hydrazinobenzothiazolecurcumin ........................................46
4.2.1. Theo dõi phản ứng...............................................................................................46
4.2.2. Sắc ký cột.............................................................................................................47
4.2.3. Nhận danh cấu trúc ..............................................................................................48
4.2.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng.................................................................................48
4.2.3.2. Biện luận cấu trúc của HBTC...........................................................................48
4.3.2. Sắc ký cột.............................................................................................................52
4.3.3. Biện luận cấu trúc ................................................................................................53
vi


4.3.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng.................................................................................53
4.3.3.2. Biện luận cấu trúc của DFPHC ........................................................................53
4.4. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học........................................................................56
4.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa.......................................................................................56
4.4.1.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro- phương pháp DPPH ....................56
4.4.1.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá tiền in vitro phương pháp MDA................58
4.4.2. Hoạt tính kháng ung thư ......................................................................................60
4.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.....................................................................61

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................62
5.1. Kết luận...................................................................................................................62
5.2. Kiến nghị. ...............................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................64
PHỤ LỤC .....................................................................................................................67

vii


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Cur

: Curcumin

DMC

: Demethoxycurcumin

BDMC

: Bisdemethoxycurcumin

HC

: Hydrazinocurcumin

IOZ

: Isoxazolcurcumin

HBTC

: 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin

DFPHC

: 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin

OD

: Mật độ quang

HTCO

: Hoạt tính kháng oxi hoá

CS

: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của hoạt chất được
thử tính theo % so với chất đối chứng

IC50

: Nồng độ hoạt chất để ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư
hoặc gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration)

IC70

: Nồng độ hoạt chất để ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư

hoặc gốc tự do

MIC

: Nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm có khả năng ngăn cản sự phát
triển của vi khuẩn, vi nấm (minimum inhibitory concentration)

HPLC

: Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography)

IR

: Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MS

: Khối phổ (Mass spectrometry)

NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy)

TLC

: Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography).

viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid ....................................................4
Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur ........................................6
Hình 2.3: Các dạng ion của Cur theo pH ..............................................................................8
Hình 2.4: Sự phân huỷ của Cur trong môi trường kiềm ......................................................9
Hình 2.5: Phản ứng cộng H2 của Cur ...................................................................................10
Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá ................................................................................11
Hình 2.7: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng (kobsd) giữa acetone và hydroxylamine
vào pH môi trường. ................................................................................................................12
Hình 2.8: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazolecurcumin ....................................12
Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch ...................................................................13
Hình 2.10: Phức Cur với kim loại ........................................................................................13
Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do .......................................................................14
Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u .......................16
Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur......................................................17
Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC.......................................................................................18
Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC ....................................................................................18
Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ hydrazinoCur với các chủng tế bào ung thư khác
nhau (theo phương pháp MTT) ............................................................................................18
Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN ............19
Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC ................20
Hình 2.18: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine từ Curcuminoid ........................20
Hình 2.19: 3-nitrophenylpyprazolecurcumin ................................................................21
Hình 2.20: Hydrazinocurcumin .....................................................................................21
Hình 2.21: Công thức cấu tạo của CSC...............................................................................21
Hình 3.1: Phương pháp tính Rf .............................................................................................27
Hình 3.2 : Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá ...............................36
Hình 3.3: Cơ chế tạo màu của MDA ...................................................................................37
Hình 4.1: Bản mỏng kiểm tra hỗn hợp curcuminoid sau các lần kết tinh .......................41
ix

Hình 4.2: TLC phân đoạn tinh thu được từ sắc ký cột ......................................................42
Hình 4.3: (A) Sắc ký cột phân lập Cur

(B) Cur: cur thu được qua sắc ký cột. ........42

Hình 4.4: Tinh thể Cur...........................................................................................................43
Hình 4.5: Phổ UV-vis (trong ethanol) của Cur...................................................................43
Hình 4.6: Curcumin, C21H20O6 (M=368). ..........................................................................45
Hình 4.7: TLC theo dõi phản ứng ........................................................................................46
Hình 4.8: Sắc ký cột thô ........................................................................................................47
Hình 4.9: Sắc ký cột tinh .......................................................................................................47
Hình 4.10: (A) TLC của HBTC so với Cur (silica gel ,CH2Cl2:CH3OH: 97:3 v/v) ......48
Hình 4.11: Cấu trúc của HBTC, C28H23SN3O4 (M=497) ..................................................49
Hình 4.12: TLC theo dõi điểm dừng phản ứng ......................................................................
Hình 4.13: Sắc ký cột thô ......................................................................................................52
Hình 4.14: Sắc ký cột tinh....................................................................................................52
Hình 4.15: (A) Dạng tinh thể của DFPHC và.....................................................................53
(B) TLC của DFPHC (silica gel, CH2Cl2:CH3OH: 98:2 v/v) .......................53
Hình 4.16: Cấu trúc của DFPHC, C27H22N2F2O4 (M=476) ..............................................54
Hình 4.17: Hoạt tính kháng oxy hoá của HBTC, DFHTC, Cur theo phương pháp
DPPH .......................................................................................................................................57

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid ..........................................................4
Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất Curcuminoid ..........................................5

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur .........................................7
Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC ................20
Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại ......................................................................................25
Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi .........................................................................26
Bảng 3.3: Bảng nồng độ các dung dịch thử DPPH ............................................................36
Bảng 4.1: Kết quả định lượng của quá trình kết tinh .........................................................41
Bảng 4.2: Tính chất vật lý đặc trưng của Cur .....................................................................44
Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của curcumin ........................................................................45
Bảng 4.4: Tính chất vật lí đặc trưng của HBTC.................................................................48
Bảng 4.5: Dữ liệu phổ NMR của HBTC .............................................................................49
Bảng 4.6: Tính chất vật lý đặc trưng của DFPHC .............................................................53
Bảng 4.7: Dữ liệu phổ NMR của DFPHC ..........................................................................54
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của HBTC, DFPHC, Cur theo
phương pháp DPPH ...............................................................................................................56
Bảng 4.9: Hoạt tính kháng oxy hoá của vitamin C theo phương pháp DPPH ...............56
Bảng 4.10: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá DPPH ....................57
Bảng 4.12: Hoạt tính kháng oxy hoá của Trolox theo phương pháp MDA ...................58
Bảng 4.13: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá MDA .....................59
Bảng 4.14: Kết quả xác định giá trị IC50 trong khảo sát hoạt tính kháng ung thư của
DFPHC, Cur với 3 dòng tế bào Hep-G2, Lu và RD......................................................60
Bảng 4.15: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của HBTC, DFPHC, Cur đối với một số
chủng vi khuẩn, vi nấm .........................................................................................................61

xi


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ thực nghiệm tiến hành nghiên cứu. ........................................................23
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin .............................................................................24
Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC) .................29

Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp 2,4-Diflorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC) ..........32

xii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề

Từ lâu curcumin đã được biết đến như là một hoạt chất có nguồn gốc từ thực
vật đóng vai trò quan trọng trong nền công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm.
Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng tỏ curcumin có nhiều hoạt tính sinh học quan
trọng như: kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng nhiều chủng tế bào ung thư, chống đột
biến, giảm cholesterol, chống đông máu, chữa được một số bệnh như: Alzheimer, đái
tháo đường, viêm khớp, HIV-AIDS... Mặt khác curcumin lại là hoạt chất không gây
độc cho người và động vật ngay cả khi dùng với liều lượng lớn (10g/ngày). Chính vì
những đặc tính trên mà hiện nay curcumin đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà
nghiên cứu khoa học trên thế giới đặc biệt là trong lĩnh vực dược phẩm.
Hiện nay có nhiều phương pháp để nâng cao hoạt tính sinh học cho curcumin.
Tuy nhiên một trong những phương pháp cho nhiều kết quả khả quan là tạo dẫn xuất
imine cho curcumin. Qua các nghiên cứu gần đây cho thấy các dẫn xuất imine này làm
tăng đáng kể hoạt tính sinh học của curcumin và thể hiện tiềm năng được ứng dụng
rộng rãi trong ngành dược.
Nhận thấy được những ưu điểm và tiềm năng của nhóm dẫn xuất này chúng tôi
thực hiện đề tài: “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine
2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ
curcumin”.

1


1.2. Mục tiêu đề tài
- Tổng hợp các dẫn xuất imine: 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và
2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin.
- Khảo sát các hoạt tính sinh học của các dẫn xuất vừa tổng hợp.
•

Hoạt tính kháng ung thư.

•

Hoạt tính kháng oxy hóa.

•

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.

1.3. Nội dung đề tài
Từ các mục đích đã đưa ra đề tài sẽ được triển khai theo các nội dung cơ bản
sau:
a. Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin.
– Phân lập curcumin từ bột curcuminoid.
– Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm
chảy, xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR.
b. Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất
– Tổng

hợp

dẫn

xuất

2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin

(HBTC)

2,4 - Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC).
– Phân lập các sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột.
– Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bản mỏng (TLC).
– Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổ MS, IR và NMR.
c. Khảo sát các hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất
imine - curcumin
–

Hoạt tính kháng ung thư.

–

Hoat tính kháng oxy hóa.
ƒ

Theo phương pháp DPPH.

ƒ

Theo phương pháp MDA.

–

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.

–

So sánh các hoạt tính của dẫn xuất tổng hợp được với hoạt tính sinh học

của curcumin.

2


1.4. Yêu cầu
–

Tách và tinh chế được curcumin tinh khiết.

–

Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin.

–

Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2,4 – Difluorophenylhydrazinocurcumin.

–

Xác định cấu trúc của các dẫn xuất bằng phổ MS, IR và NMR.

–

Khảo sát hoạt tính sinh học của:
•

Curcumin.

•

2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin.

•

2,4–Difluorophenylhydrazinocurcumin.

3


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về curcumin
2.1.1. Curcuminoid
2.1.1.1. Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid
Hỗn hợp curcuminoid là một trong những thành phần quan trọng mang nhiều
hoạt tính đáng quý được chiết từ củ nghệ vàng (Curcuma longa L.). Hỗn hợp
curcuminoid có dạng bột màu vàng và là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng cam
của nghệ [6].
Lượng curcuminoid trong bột nghệ khoảng từ 3 – 6%. Hỗn hợp curcuminoid
có chứa khoảng 77% curcumin (Cur), 17% demethoxycurcumin (DMC), 3%
bisdemethoxycurcumin (BDMC) [7].

OH

OH

R1

R2
O

O

Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid [7]
Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid [7]
Hợp chất

R1

R2

Cur

OCH3

OCH3

C21H20O6

368

DMC

OCH3

H

C20H18O5

338

BDMC

H

H

C19H16O4

308

4

CTPT

M (đvc)


2.1.1.2. Phân lập các dẫn xuất curcuminoid
Để tìm hiểu, nghiên cứu sâu hơn về curcuminoid cũng như các dẫn xuất của nó
thì các dẫn xuất này cần phải được phân lập ra vì mỗi thành phần này có cấu trúc hoá
học khác nhau nên màu sắc và tính chất hoá học cũng khác nhau. Vì vậy việc phân lập

các thành phần của curcuminoid ra là vấn đề cần thiết và mang ý nghĩa thiết thực.
Hiện nay đã có nhiều tác giả dùng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập các
thành phần của curcuminoid.
Opa vajragupta và cộng sự [8] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid bằng sắc
ký cột silica gel 60G, 0.063-0.200mm với hệ dung môi CHCl3:MeOH:AcOH (98:5:2
v/v/v). Theo phương pháp này, Cur được rửa giải đầu tiên, kế tiếp là hỗn hợp của
Cur và DMC, cuối cùng là BDMC tinh. DMC được tách ra khỏi hỗn hợp giữa DMC
và Cur bằng sắc ký cột với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (95:5 v/v ).
G. K. Jayaprakasha và cộng sự [9] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid
bằng sắc ký cột silica gel. Thu được Cur, DMC, BDMC lần lượt với hệ dung môi
benzene : EtOAc (82:18 v/v), benzene : EtOAc (70:30 v/v), benzene : EtOAc (58:42
v/v). Nhiệt độ nóng chảy đo được của Cur, DMC, BDMC tương ứng là 186 - 187, 175
- 176, 231 - 232oC.
W. Chearwae và cộng sự [10] đã cô lập các dẫn xuất curcuminoid từ cao
ethanol trích từ củ nghệ vàng cũng bằng sắc ký cột silica gel với dung môi CHCl3,
sau đó tăng dần độ phân cực của hệ dung môi bằng CH3OH. Thu được các phân
đoạn Cur, DMC, BDMC có độ tinh khiết khoảng 95-99% (HPLC).
L. Péret-Almeida và cộng sự [11] đã cô lập, xác định cấu trúc và một số tính
chất hoá lý của từng dẫn xuất curcuminoid riêng biệt. Hỗn hợp curcuminoid (Merck)
được kết tinh lại 3 lần bằng hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH (5:1 v/v), hiệu suất quá
trình kết tinh ~ 40%.
Cắn thu được từ nước cái của quá trình kết tinh được sắc ký với chất hấp phụ
silica gel tẩm sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4), dung môi rửa giải là
CH2Cl2. Các phân đoạn tinh khiết được xác định cấu trúc và một số tính chất vật lý.

5


Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất curcuminoid [11]
Điểm chảy (oC)

Cur

DMC

BDMC

184

172

222

Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur [11]
Điều kiện HPLC: cột spherical Shi-pack CLC NH2 (5 µm, 4.6 x 150 mm, Shimadzu),
pha động ethanol: nước (85/15 v/v), tốc độ dòng 1ml/phút, 22oC, detector DAD 425nm.
Ngoài ra các thành phần này còn được định tính bằng phổ tử ngoại khả kiến,
hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và bằng phương pháp so màu. Các kết quả
đều cho thấy các thành phần phân lập được chính là Cur, DMC, BDMC.
2.1.2 Curcumin
2.1.2.1. Lý tính
Có dạng bột màu vàng cam huỳnh quang, không mùi [6].
Tỉ trọng: 0.93 g/ml [5].
Điểm chảy: 179- 1830C [5].
Bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng. Khi ở dạng dung dịch Cur dễ bị phân
hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ [6].

6

Tan trong chất béo, ethanol, methanol, dicloromethane, aceton, acid acetic băng
và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan <10 mg ở
250C) [6,12].
Tan trong môi trường kiềm tạo dung dịch màu đỏ máu rồi ngả tím, tan trong
môi trường acid có màu đỏ tươi [4].
Dung dịch Cur trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng từ
420 - 430 nm [6].
2.1.2.2. Hóa tính
a. Quá trình điện ly theo pH
Cur không tan trong môi trường nước ở pH acid và trung tính nhưng tan tốt ở
pH kiềm [12]. Nghiên cứu bằng kỹ thuật HPLC cho kết quả điện ly theo pH của Cur
như sau:
Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur [12].
pH

Màu của dung dịch

Dạng ion tồn tại

<1

Đỏ

H 4A +

1–7

Huyền phù màu vàng

H3A

> 7.5

Đỏ

H2A- , HA2- , A3-

H4A+
OH+

HO

H3CO

OCH3
OH

7

OH


H3A
HO

OH

H3CO

OCH3

O

OH

H2AHO

OH

H3CO

OCH3
O-

O

HA2O-

HO

H3CO

OCH3
O-

O

A3-

O-

O

H3CO

OCH3
O-

O

Hình 2.3: Các dạng ion của Cur theo pH [12]
b. Phản ứng phân hủy
™ Phân hủy trong môi trường kiềm
Cur tương đối bền trong môi trường acid nhưng lại bị phân hủy nhanh chóng
trong môi trường kiềm [12]. Ở pH = 8.5, chỉ sau 5 phút Cur đã bắt đầu phân hủy thành
ferulic acid và feruloylmethane. Sau đó, feruloylmethane còn bị phân hủy thành
vanillin và acetone.

8


O

O

HO

OH
OCH3
OH-

-

OH

OCH3

as radical

O

O
HO

OH

HO
OCH3

OCH3
feruloyl methane

condensation product

CHO

ferulic acid

O

HO

OCH3
vaniline

actone

Hình 2.4: Sự phân huỷ của Cur trong môi trường kiềm [12, 14]
Nghiên cứu của Ying Jan Wang và cộng sự [13] cũng cho thấy 90% Cur bị
phân huỷ sau 30 phút trong môi trường đệm phosphate pH = 7.2, 37oC.
™ Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng [12]
Cur không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch. Khi tiếp xúc với ánh
sáng, Cur bị phân huỷ ngay cả ở dạng rắn và bị phân huỷ nhanh hơn khi ở trạng thái
dung dịch. Sản phẩm phân hủy là vanillin, vanillic acid, ferulic aldehyde, ferulic acid.
Cur có thể bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng ngay cả khi có mặt oxi và không
oxi.
- Không có oxi, Cur có thể bị vòng hóa.
- Khi có mặt oxi và ánh sáng, Cur phân huỷ tạo thành 4-vinylguaialcol và
anilin.

9


c. Phản ứng cộng H2
Trong phân tử Cur có nối đôi trong mạch cacbon nên có thể phản ứng với 1, 2
hoặc 3 phân tử H2 tạo thành các dẫn xuất dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin và
hexahydrocurcumin, khi có mặt xúc tác kim loại hay oxit kim loại (Ni, PtO2) tương
ứng (hình 2.5), các sản phẩm này cũng là các chất kháng oxy hoá [15].
HO

OH

H3CO

+ H2
Ni (PtO2)

OCH3
O

OH

n = 1: dihydrocurcumin
HO

OH

H3CO

OCH3

.

O

OH

. n = 2: tetrahydrocurcumin
HO

OH

H3CO

OCH3
O

OH

n = 3: hexahydrocurcumin
HO

OH

H3CO

OCH3
O

OH

Hình 2.5: Phản ứng cộng H2 của Cur [5]
d. Phản ứng imine hóa
Cur là hợp chất diketone nên có thể cho phản ứng với các amin bậc nhất
(RNH2),

hydroxylamine

(NH2OH),

hydrazine
10

(NH2-NH2),

semicarbazide


(NH2NHCONH2) … tạo các dẫn xuất imine (base Schiff) hoặc dẫn xuất imine tương
ứng [2,3,16,17].
Cơ chế phản ứng imine hoá
O-

O

OH
+

±H
R

C

Y

R

R'NH2

H3O+

C

Y

H
R

+NH2R'

OH2

+

C

Y

R

NHR'

C

Y

NHR'

carbinolamin

R

C

Y

NR'

H3O+

H2O
H

N

R'

R

C

Y

Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá [16]
Giai đoạn đầu của phản ứng là sự tấn công của đôi điện tử tự do trên nguyên
tử nitrogen của amine vào nguyên tử carbon mang một phần điện tích dương của nhóm
carbonyl. Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân thông thường, hình thành
hợp chất trung gian chứa đồng thời hai nhóm chức anion alkoxide và cation
ammonium. Hợp chất trung gian này chuyển hoá nhanh thành sản phẩm trung gian
bền hơn là carbinolamin. Phản ứng này cần một lượng nhỏ acid làm xúc tác, giúp cho
cân bằng chuyển dịch về phía tách nước từ hợp chất trung gian carbinolamine, sinh
ra dạng proton hoá của imine hoặc các dẫn xuất của imine. Cuối cùng là giai đoạn

tách proton, hình thành sản phẩm là imine hoặc các dẫn xuất của imine [2,16].
Trong cơ chế của phản ứng imine hoá, pH của môi trường đóng vai trò quan
trọng. Nếu môi trường phản ứng quá acid, toàn bộ amine bị proton hoá. Các amine
bị proton hoá không có tính ái nhân nên chúng không phản ứng với các nhóm ketone.
Ngược lại, giảm môi trường acid sẽ làm giảm quá trình tách nước tạo imine. Điều
kiện pH thích hợp cho phản ứng imine hoá là khoảng pH~4.5 [17]. Hình 2.7 mô tả sự
phụ thuộc của tốc độ phản ứng giữa acetone và hydroxylamine vào pH môi trường
phản ứng.
11


Hình 2.7: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng (kobsd) giữa acetone và
hydroxylamine vào pH môi trường [17].
Cur cũng là hợp chất β-diketone nên ngoài khả năng tạo các imine và dẫn
xuất imine, Cur còn có thể tạo các hợp chất dị vòng khác nhau. Hiện nay có một số
nghiên cứu tổng hợp các hợp chất dị vòng của Cur như dị vòng pyrazole, isoxazole
Cur. Cơ chế của các phản ứng này tương tự như phản ứng imine thông thường [4].
HO

OH

H3CO

OCH3
O

N

Isoxazole curcumin
HO

OH

H3CO

OCH3
N

NH

Pyrazole curcumin

Hình 2.8: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazole Cur [18].

12