KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PROTEASE NỘI TẠNG CÁ NGỪ TRƯỚC VÀ SAU SẮC KÝ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA
ENZYME PROTEASE NỘI TẠNG CÁ NGỪ
TRƯỚC VÀ SAU SẮC KÝ

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: BẠCH NGỌC MINH
Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 09 năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA
ENZYME PROTEASE NỘI TẠNG CÁ NGỪ
TRƯỚC VÀ SAU SẮC KÝ

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG

BẠCH NGỌC MINH

CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Tháng 09 năm 2009


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức
cho em trong suốt quá trình học tại trường.
Ban quản lý Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo cho em
những điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tại đây.
Thầy Nguyễn Tiến Thắng, Cô Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Các anh chị ở bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, và các
bạn ở phòng thí nghiệm Hoạt Tính Sinh Học đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình
hoàn thành khóa luận.
Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 31 đã động viên, giúp đỡ em trong
thời gian thực tập.

Sinh viên thực hiện
BẠCH NGỌC MINH

iii

TÓM TẮT
Đề tài: “Khảo sát quá trình tách chiết và một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính
của enzyme protease nội tạng cá ngừ trước và sau sắc ký”, được thực hiện tại phòng
Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh. Thời
gian thực hiện đề tài từ tháng 02/2009 đến tháng 07/2009.
Với mục đích tận dụng nguồn enzyme protease trong nội tạng cá ngừ, việc
nghiên cứu và khảo sát nhằm tìm ra các điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết, thu
nhận, tinh sạch enzyme protease và các điều kiện thuận lợi giúp tăng và duy trì hoạt
tính enzyme protease từ nội tạng cá ngừ.
Quá trình nghiên cứu đã thu nhận được một số kết quả. Quá trình tách chiết nội
tạng cá ngừ bằng dung dịch đệm phosphat với tỷ lệ nội tạng / đệm là 1 / 8, thời gian ủ
ở nhiệt độ lạnh 50C – 100C trong thời gian 40 phút. Sau đó, xử lý dịch chiết bằng muối
sulphate amoni với nồng độ muối là 65% trong 40 phút ở điều kiện lạnh 00C – 40C.
Quá trình này sẽ thu được sản phẩm thô có hoạt tính protease cao nhất.
Enzyme protease nội tạng cá ngừ thu được có hoạt tính tốt nhất ở khoảng nhiệt
độ 500C – 600C; với khoảng nồng độ muối ăn là 3 %; hoạt tính ở pH tối thích 7 – 8.
Các ion kim loại kiềm hóa trị 2 như Mn, Mg, Ba, Ca có ảnh hưởng tốt lên hoạt tính
của enzyme protease.
Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel làm tăng hoạt tính lên từ 1,68 – 2,46 lần,
với hiệu suất tinh sạch đạt hơn 60 %.
Kết quả của nghiên cứu này có thể được sử dụng trong quá trình nghiên cứu
tiếp theo sử dụng chế phẩm enzyme thô hay chế phẩm enzyme đã tinh sạch trong sản
xuất thử nghiệm các sản phẩm mới với thành phần dinh dưỡng cao từ protein được
thủy phân.

iv

SUMMARY
Subject “Study process of extraction and purification of protease from intestine
of Tuna fish (Scombridae)”.
The process of research was conducted from Feb, 2009 to Jul, 2009 at Bioactive
Substances Department – Institute of Tropical Biology, Ho Chi Minh city.
This study focussed on tranformation of fish-by-products to food and products
with bioactivity, which brings economic benefits and reduces waste ratio in fishsery
industry.
The study has found optimal conditions for protease extraction from Tuna fish
intestine. Intestine and phosphate buffer ratio 1/8 (w/w); pH 7; extractive time is 40
minutes. Sulphate amoni (NH4)2SO4 is a suitable precipitating agent for protease
purification. The optimal ratio of (NH4)2SO4 is 65 %; temperature 0 – 4 0C.
Some factors have optimal conditions for protease extraction from Tuna fish
intestine. Active temperature 50 – 60 0C; sodium chloride concentration is 3 %; pH 7 –
8; some chemicals such as: Ca2+, Ba2+,, Mn2+ ,etc.
The protease recovery yield is 66 % and the purity degree is 2,46.

v


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iii
TÓM TẮT .................................................................................................................iv
SUMMARY ...............................................................................................................v
MỤC LỤC .................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ......................................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH.........................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU ...................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề............................................................................................................1

1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu .......................................................................2
1.2.1. Mục đích...........................................................................................................2
1.2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................................3
2.1. Một số khái niệm cơ bản về enzyme...................................................................3
2.1.1. Giới thiệu chung về enzyme.............................................................................3
2.1.2. Bản chất, cấu trúc enzyme................................................................................3
2.1.2.1. Bản chất của enzyme.....................................................................................3
2.1.2.2. Cấu trúc enzyme............................................................................................3
2.1.3. Danh pháp và phân loại enzyme ......................................................................4
2.1.4. Cơ chế tác dụng của enzyme ............................................................................4
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme........................................5
2.1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất....................................................................5
2.1.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme...................................................................5
2.1.5.3. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hoá................................5
2.1.5.4. Ảnh hưởng của pH môi trường .....................................................................6
2.1.5.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................6
2.1.5.6. Ảnh hưởng của các ion kim loại....................................................................7
2.2. Enzyme protease và lược sử nghiên cứu .............................................................7
2.2.1. Giới thiệu chung ...............................................................................................7
2.2.2. Phân loại enzyme protease ...............................................................................7
vi


2.2.3. Protease nội tạng cá và các động vật thủy sản .................................................8
2.2.4. Lược sử nghiên cứu về protease.......................................................................9
2.3. Ứng dụng protease và protease của cá trong chế biến thuỷ sản........................10
2.3.1. Giới thiệu chung .............................................................................................10
2.3.2. Nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến thuỷ sản ở Việt Nam........12
2.3.3. Các nguồn thu enzyme protease.....................................................................13

2.3.4. Nguồn thu protease từ cá ngừ.........................................................................13
2.3.5. Ứng dụng enzyme protease ............................................................................14
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................16
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ........................................................................16
3.2. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................16
3.3. Thu thập và bảo quản mẫu ................................................................................16
3.4. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất.............................................................................16
3.4.1. Dụng cụ và thiết bị .........................................................................................16
3.4.2. Hóa chất..........................................................................................................16
3.5. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................17
3.5.1. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano .................................17
3.5.1.1. Nguyên tắc...................................................................................................17
3.5.1.2. Hoá chất và thiết bị......................................................................................17
3.5.1.3. Các bước tiến hành......................................................................................17
3.5.2. Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease ..................19
3.5.2.1. Chiết rút thu dịch chiết ................................................................................19
3.5.2.2. Thu nhận chế phẩm protease .......................................................................19
3.5.2.3. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel ........................................................20
3.5.3. Nội dung thí nghiệm.......................................................................................21
3.5.3.1. Khảo sát dung môi và điều kiện chiết rút enzyme protease........................21
3.5.3.2. Khảo sát chọn tác nhân và điều kiện kết tủa enzyme protease ...................24
3.5.3.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính chế phẩm thô .................25
3.6. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................................28
3.7. Tính toán kết quả...............................................................................................28
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................29
4.1. Khảo sát, lựa chọn dung môi và điều kiện chiết rút enzyme protease ..............29
4.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi chiết nội tạng ..........................................................29
vii

4.1.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi nước cất ...............................................................29
4.1.1.2. Xác định tỷ lệ dung dịch muối sinh lý ........................................................30
4.1.1.3. Xác định tỷ lệ dung dịch đệm phosphate ....................................................31
4.1.2. Lựa chọn dung môi thích hợp ........................................................................31
4.1.3. Xác định thời gian chiết .................................................................................32
4.2. Khảo sát, lựa chọn tác nhân và điều kiện tủa enzyme protease ........................33
4.2.1. Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân tủa enzyme...............................................33
4.2.1.1. Xác định nồng độ (NH4)2SO4 bão hoà để tủa enzyme ................................33
4.2.1.2. Xác định tỷ lệ cồn để tủa enzyme ...............................................................34
4.2.1.3. Xác định nồng độ acetone để tủa enzyme ...................................................35
4.2.2. Lựa chọn tác nhân tủa thích hợp ....................................................................35
4.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính chế phẩm thô .......................37
4.3.1. Xác định ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm thô.....................................37
4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm thô.................................37
4.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt tính chế phẩm thô.........39
4.3.4. Xác định độ bền nhiệt của enzyme protease chế phẩm thô............................40
4.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số kim loại đến hoạt tính chế phẩm thô...........41
4.4. Tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng sắc ký lọc gel........................................41
4.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính sau khi tinh sạch ..................44
4.5.1. Xác định ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký .............................44
4.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký ...........45
4.5.3. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký....46
4.5.4. Xác định độ bền nhiệt của enzyme protease chế phẩm sau sắc ký ................46
4.5.5. Khảo sát ảnh hưởng của kim loại đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký ...........47
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................49
5.1. Kết luận .............................................................................................................49
5.2. Đề nghị ..............................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................50
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Tỷ lệ các loại hóa chất cần thiết để dựng đường chuẩn tyrosine.................. 18
Bảng 4.1 Kết quả quá trình tách chiết của các loại dung môi khác nhau .................... 32
Bảng 4.2 Kết quả quá trình tủa enzyme bằng các loại dung môi khác nhau ............... 36
Bảng 4.3 Hàm lượng và hoạt tính của chế phẩm thô sau sắc ký.................................. 43
Bảng 4.4 Kết quả tinh sạch enzyme protease............................................................... 44

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu........................................................... 22
Hình 3.2 Sơ đồ thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo tỷ lệ dung môi................... 23
Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo thời gian chiết mẫu. ........ 24
Hình 3.4 Sơ đồ thí nghiệm tủa enzyme protease theo tỷ lệ tác nhân tủa......................... 24
Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease............ 25
Hình 3.6 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính ................ 26
Hình 3.7 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính......... 26
Hình 3.8 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease. .................... 27
Hình 3.9 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số kim loại đến hoạt tính .... 27
Hình 4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất đến quá trình chiết protease.......................... 29
Hình 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch muối sinh lý đến quá trình chiết protease. ...... 30
Hình 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch đệm phosphate đến quá trình chiết protease...... 31
Hình 4.4 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết rút protease............................ 32
Hình 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến quá trình kết tủa protease............. 33

Hình 4.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ cồn đến quá trình kết tủa protease............................... 34
Hình 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ acetone đến quá trình kết tủa protease. ................. 35
Hình 4.8 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease chế phẩm thô............................. 37
Hình 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm thô..................................... 38
Hình 4.10 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính chế phẩm thô........................ 39
Hình 4.11 Độ bền nhiệt của protease chế phẩm thô. ................................................... 40
Hình 4.12 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính chế phẩm thô. ................... 41
Hình 4.13 Sắc ký đồ mẫu tủa muối sulphate amoni. ................................................... 42
Hình 4.14 Sắc ký đồ mẫu tủa cồn. ............................................................................... 42
Hình 4.15 Sắc ký đồ mẫu tủa acetone.......................................................................... 42
Hình 4.16 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease chế phẩm sau sắc ký................ 44
Hình 4.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký............................. 45
Hình 4.18 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký. ........... 46
Hình 4.19 Độ bền nhiệt của protease chế phẩm sau sắc ký......................................... 46
Hình 4.20 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký. ........ 47

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong sản xuất và đời sống, các loại enzyme nói chung và protease nói riêng
được sử dụng ngày càng phổ biến. Chế phẩm protease được sản xuất chủ yếu nhờ vi
sinh vật, một số ít có nguồn gốc từ thực vật, mô động vật. Gần đây, do yêu cầu về vệ
sinh an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng ngày
càng cao. Trong khi đó chế phẩm protease thu nhận từ mô động vật và thực vật đuợc
coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các phòng thí
nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương mại. Nguồn
nguyên liệu từ nội tạng động vật để thu chế phẩm protease ngày càng khan hiếm và

không kinh tế do nội tạng động vật thường được dùng làm thực phẩm và dùng để ghép
tạng cho những bệnh nhân đặc biệt. Protease trong cơ thể cá, đặc biệt là ở cơ quan tiêu
hoá đã được biết đến từ lâu nhưng lại chưa được nghiên cứu đầy đủ và cũng chưa có
công nghệ thu nhận, tinh chế protease từ nội tạng cá. Vì vậy, những công trình nghiên
cứu về protease nội tạng và phương pháp chiết rút chúng đang được ráo riết tiến hành
ở nhiều nước có nghề cá phát triển, nhằm thoả mãn nhu cầu to lớn và đang tăng lên
nhanh chóng về chế phẩm protease.
Việt Nam là một trong những quốc gia có nghề cá phát triển, với trên 200 loài
cá kinh tế, sản lượng 1,5 triệu tấn/năm. Tuy sản lượng lớn nhưng phần đựơc sử dụng
hữu ích từ cá chỉ chiếm khoảng gần 50%. Nghĩa là hàng năm có trên 700.000 tấn phế
liệu, trong đó có trên 30.000 tấn nội tạng cá. Theo thói quen, nội tạng cá chỉ được sử
dụng làm bột cá chăn nuôi, một phần được chế biến nước mắm, phần lớn bị thải bỏ
vào môi trường, vừa lãng phí vừa là nguồn gây ô nhiễm.
Tình hình trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là sử dụng hợp lí
và hiệu quả lượng phế liệu cá rất lớn do các nhà máy chế biến cá tạo ra hàng ngày để
sản xuất ra những sản phẩm mới, có giá trị cao.
Với mong muốn góp phần giải quyết yêu cầu trên, em thực hiện đề tài “Khảo
sát quá trình tách chiết và một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme protease
nội tạng cá ngừ trước và sau sắc ký”.
1


1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục đích
Mục đích chung của đề tài là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết
enzyme từ nội tạng cá, cũng như tính chất của enzyme này.
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
a. Xác định quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng
– Xác định tỷ lệ dung môi chiết mẫu.
– Xác định dung môi chiết enzyme protease.

– Xác định thời gian chiết enzyme protease.
– Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân kết tủa thu chế phẩm thô.
– Xác định tác nhân kết tủa thu chế phẩm thô.
– Tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng sắc ký lọc gel.
b. Khảo sát một số tính chất của enzyme protease thu được từ nội tạng cá ngừ
trước và sau khi tinh sạch
– Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nhiệt độ.
– Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease.
– Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo pH.
– Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nồng độ muối ăn.
– Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease khi có mặt một số ion kim loại,
chất đặc hiệu nhóm.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Một số khái niệm cơ bản về enzyme
2.1.1. Giới thiệu chung về enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme tham gia xúc
tác cho hầu hết các phản ứng hoá học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình
chuyển hoá các chất trong cơ thể với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo chiều hướng xác
định. Do đó đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.
Hiện nay người ta đã khám phá hơn 2.000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme
thu được ở dạng tinh thể. Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả
trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt là
công nghiệp chế biến thực phẩm: bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước mắm…
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.1.2. Bản chất, cấu trúc enzyme

2.1.2.1. Bản chất của enzyme
Enzyme là protein có hoạt tính sinh học nên nó có đủ tính chất của protein.
Giống với các protein hình hạt khác, enzyme có thể hoà tan trong nước, dung dịch
đệm phasphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý…
Dung dịch enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước. Enzyme trong dung
dịch dễ dàng bị kết tủa dưới tác dụng của muối trung hoà như sulphatamon hoặc các
dung môi hữu cơ như cồn, acetone ở nhiệt độ thấp nhưng không bị mất hoạt tính xúc
tác. Do đó, có thể dùng các tác nhân này để thu chế phẩm enzyme. Ngược lại, dưới tác
dụng của các yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid hoặc kiềm đặc, muối kim
loại nặng nồng độ cao) enzyme thường bị mất khả năng xúc tác. Và mức giảm hoạt
tính tương ứng với mức độ biến tính của phân tử protein – enzyme. (Nguyễn Tiến
Thắng, 2007).
2.1.2.2. Cấu trúc enzyme
Phân tử enzyme một thành phần cũng như hai thành phần đều chứa phần
protein. Enzyme một cấu tử trong thành phần phân tử chỉ có protein. Enzyme hai cấu
tử trong thành phần cấu tạo gồm: protein (“feron” hoặc “apoenzyme”) và phi protein
3


(“agon” hoặc “coenzyme”). Trung tâm hoạt tính của enzyme chiếm phần rất nhỏ so
với phân tử enzyme nhưng có vai trò quan trọng trong việc tham gia kết hợp đặc hiệu
với cơ chất trong quá trình xúc tác.
Ở các enzyme một cấu tử, trung tâm thường bao gồm một tổ hợp các nhóm
chức acid amin liên kết lại với nhau…Nhờ có cấu trúc bậc 3, 4 các nhóm này tuy nằm
cách xa nhau trong mạch polypeptid, nhưng do xoắn cuộn mạch mà được gần nhau
hơn. Với enzyme hai cấu tử, ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có nhóm
ngoại tham gia trung tâm hoạt tính enzyme. (Nguyễn Tiến Thắng, 2007).
2.1.3. Danh pháp và phân loại enzyme
Theo quy ước quốc tế, tên gọi enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu của
chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó tên enzyme thường có

hai phần: phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng.
Năm 1960, Hiệp hội hoá sinh quốc tế đã thống nhất phân loại enzyme ra làm 6 lớp sau:
– Oxydoreductase: enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử
– Transpherase: enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị
– Hydrolase: enzyme xúc tác cho quá trình thuỷ phân
– Liase: enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 hay phản ứng tách thuận
nghịch phân tử nước.
– Isomerase: enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hoá tương hỗ phức tạp giữa
galactose và glucose.
– Ligase: enzyme này xúc tác cho phản ứng carboxyl hoá pyruvic tạo thành
oxaloacetid acid.
2.1.4. Cơ chế tác dụng của enzyme
Bản chất của phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của enzyme, các
cơ chất sẽ được hoạt hoá mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hoá học của cơ chất, kết
quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng. Do tác dụng của enzyme
mà cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc hoá học, mà còn thay đổi
tính chất hoá học. Theo Nguyễn Tiến Thắng (2007), quá trình xúc tác của enzyme xảy
ra ba giai đoạn:
 Giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ
đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất. Phức hệ này thường không bền. Phản
4


ứng tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất thường xảy ra nhanh và chỉ đòi hỏi một ít
năng lượng.
 Giai đoạn thứ hai: khi cơ chất tạo phức với enzyme thì sẽ bị thay đổi cả cấu
hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả các liên kết
bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm.
 Giai đoạn thứ ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm được tạo thành và tách
khỏi enzyme.

Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme được trình bày như sau:
E + S ↔ ES → E + P
Trong đó E: Enzyme; S: Cơ chất; ES: Phức hệ enzyme – cơ chất; P: Sản phẩm .
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: bản chất và nồng
độ của cơ chất, nồng độ enzyme, pH môi trường phản ứng, nhiệt độ, các ion kim loại,
các chất vô cơ và hữu cơ khác có tác dụng kìm hãm hay hoạt hoá enzyme (Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
2.1.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ enzyme sẽ phụ
thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả nồng
độ enzyme đều tham gia phản ứng để tạo ra phức hợp enzyme – cơ chất, phản ứng sẽ
tạo ra được vận tốc cực đại. Nhưng đôi khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lên thì tốc độ
phản ứng cũng sẽ không tăng.
2.1.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Nồng độ của các enzyme tham gia phản ứng có ảnh hưởng đến chất lượng phản
ứng enzyme. Nhìn chung, trong điều kiện nồng độ enzyme thấp hay thừa cơ chất, thì
tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ
enzyme quá lớn, tốc độ phản ứng tăng chậm, hoặc không tăng.
2.1.5.3. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hoá
Hoạt tính enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu
cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng, hoặc làm giảm hoạt tính enzyme. Tác
dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tuỳ từng chất, từng
enzyme khác nhau.
5


Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ
làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hoá bởi enzyme. Các chất
này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả protein, kìm hãm thuận

nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hay không cạnh tranh. Khi biết được tác
dụng ức chế của các chất này đối với từng loại enzyme trong từng phản ứng cụ thể ta
có thể điều chỉnh được phản ứng
Chất hoạt hoá là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm
cho enzyme chuyển thành dạng hoạt tính từ dạng không hoạt tính. Các chất này
thường có bản chất hoá học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại, hoặc các
chất hữu cơ. Chất hoạt hoá có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của enzyme một
cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Cơ chế của sự kích hoạt này là do các chất tác dụng trực
tiếp với trung tâm hoạt tính của enzyme, làm thay đổi cấu hình không gian của nó theo
hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác hoặc gián tiếp thông qua việc loại trừ các chất ức
chế ra khỏi hỗn hợp phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme.
2.1.5.4. Ảnh hưởng của pH môi trường
pH của môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng enzyme vì nó ảnh
hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, ion hoá enzyme, và độ bền của protein – enzyme.
pH thích hợp của phần lớn enzyme là 7.
pH thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như đặc
tính và nồng độ cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng…
2.1.5.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Do bản chất hoá học của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hoá học,
vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong 1 giới hạn
nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme cho
thấy nhiệt độ hoạt tính thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40 – 500C, trên 500C
hoạt tính thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme. Các enzyme có
nguồn gốc thực vật và một số enzyme vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cao hơn. Nhiệt
độ thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như: thời gian xác
định hoạt tính, pH…Ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều, nhưng
có thể hồi phục khi đưa về nhiệt độ bình thường. Ở nhiệt độ vào khoảng 700C, phần
6

lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính, gọi là nhiệt độ tới hạn. Ở nhiệt độ tới hạn,
enzyme bị biến tính, hiếm khi được hồi phục hoạt tính trở lại.
2.1.5.6. Ảnh hưởng của các ion kim loại
Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hoá enzyme. Các ion kim loại nặng,
ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch enzyme.
Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ
hoạt hoá chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới hạn
xác định, khi vượt quá nồng độ này lại có tác dụng kìm hãm enzyme. Giới hạn nồng
độ có tác dụng hoạt hoá enzyme của mỗi ion kim loại có thể khác nhau, vì vậy ở cùng
một nồng độ, cùng điều kiện phản ứng, đối với một enzyme, hai ion có thể có tác dụng
trái ngược nhau. Hiện tượng này thường xảy ra giữa các ion cùng hoá trị.
2.2. Enzyme protease và lược sử nghiên cứu
2.2.1. Giới thiệu chung
Protease là một nhóm các enzyme có khả năng xúc tác cho quá trình thủy phân
các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong cơ thể cá còn sống các protease là tác
nhân xúc tác quá trình trao đổi chất phục vụ hoạt tính sống của cá. Sau khi cá chết, khả
năng xúc tác quá trình thủy phân của các enzyme này vẫn còn và là nguyên nhân gây
ra sự biến đổi thịt cá sau khi chết. Khi tách ra khỏi cơ thể cá thì protease vẫn giữ được
khả năng xúc tác quá trình thủy phân. Do đó, cần nghiên cứu các đặc tính của protease
nội tạng nhằm sử dụng nguồn enzyme này từ phế liệu cá trong công nghiệp chế biến
thủy sản, tạo ra các sản phẩm có giá trị cao từ thịt cá.
2.2.2. Phân loại enzyme protease
Theo Barett và Donald (1986) thì protease được chia thành hai nhóm lớn là
(proteinase) và exopeptidase.
Nhóm endopeptiase
Là các enzyme phân giải các liên kết ở giữa chuỗi mạch polypeptide. Theo
phân loại của Ủy ban enzyme thuộc Hội Hóa sinh quốc tế, các enzyme nhóm này gồm
4 phân nhóm là:
 Phân nhóm 1: proteinase – xerin; gồm các enzyme như tripsin, chimotrysin.

 Phân nhóm 2: proteinase – xistein hay proteinase – thiol; gồm các enzyme cathepsin.
 Phân nhóm 3: aspactic – protease hay protease acid; gồm các enzyme pepsin, gastricsin
7


 Phân nhóm 4: metalo – proteinase như colagenase, calpain…
Nhóm exopeptidase
Là các enzyme thủy phân liên kết peptide ở đầu mút của chuỗi mạch peptide.
Các enzyme thuộc nhóm này gồm cacboxyl – peptidase, amino – peptidase,
dipeptidase. Các exopeptidase không có khả năng thủy phân liên kết peptide ở trung
tâm mà chỉ tác dụng thủy phân liên kết ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc đầu
amin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide.
2.2.3. Protease nội tạng cá và các động vật thủy sản
Hệ tiêu hóa của cá gồm nhiều bộ phận khác nhau. Mỗi bộ phận có chức năng và
đặc điểm riêng của quá trình chuyển hóa, hấp thu thức ăn. Do đó, hệ enzyme protease
trong các bộ phận này cũng khác nhau. Tuy nhiên hoạt tính của enzyme chủ yếu diễn
ra ở dạ dày và ruột cá. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
a. Enzyme dạ dày
Dạ dày của cá là cơ quan duy nhất có pepsin xúc tác cho quá trình thủy phân
protein trong môi trường acid mạnh. Trong dạ dày cá có hai loại enzyme chính là
pepsin và parapepsin.
Pepsin là enzyme chủ yếu tiêu hóa thức ăn có protein trong dạ dày, được sinh
tổng hợp trong các tế bào màng nhày của dạ dày và tiết ra dưới dạng không hoạt tính
gọi là pepsinogen. Pepsinogen có khối lượng phân tử 39.000 – 40.000 Da, bền trong
môi trường trung tính và acid yếu, nhưng dưới tác dụng của acid clohydric và sự có
mặt của một lượng nhỏ pepsin tự do trong dạ dày, sẽ chuyển hóa thành pepsin dạng
hoạt tính là một chuỗi polypeptide có khối lượng 32.700 Da. Pepsin có tác dụng của
một proteinase, transpeptidase và esterase nhưng chủ yếu có tác dụng của
endopeptidase và thủy phân chủ yếu các liên kết peptide sát gốc L – acid amin thơm
và dicacboxyl.

b. Enzyme đường ruột
Trong màng nhày ruột và trong dịch ruột, người ta xác định được có 22 enzyme
tham gia vào quá trình tiêu hóa thức ăn. Trong đó các enzyme protease gồm:
enterokinase, amino – peptidase, amino – tripeptidase, dipeptidase, cacboxylpeptidase.

8


Enterokinase là enzyme hoạt hóa đặc hiệu tripsinogen và chymotripsinogen.
Enterokinase được tổng hợp từ tế bào màng ruột. nhờ tác dụng của các muối mật mà
xâm nhập vào khe ruột và hoạt hóa tripsonogen trên bề mặt màng nhày của ruột cũng
như trong khoang ruột. Dưới tác dụng của enterokinase, phân tử tripsinogen bị cắt một
đoạn 6 acid amin tại vùng giữa lysin và isoleusin và do đó chuyển thành dạng hoạt
tính. Ngoài ra, tuyến tụy còn tiết ra một lượng enterokinase cân bằng với tripsin để
hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotrtpsin.
Chymotripsin là enzyme thuộc nhóm proteinase – serin, khối lượng phân tử
khoảng 25.000 Da gồm 3 chuỗi polypeptide gắn với nhau bằng hai cầu nối sulfua.
Chymotripsin xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết peptide trong đó có nhóm –
CO– của các acid amin thơm hoặc metionin. Nó cũng xúc tác cho phản ứng thủy phân
este của các acid amin này.
Tripsin và chymotripsin có khả năng cắt dứt các liên kết ở giữa mạch
polypeptide của phân tử protein, kết quả hoạt tính thủy phân protein của chúng tạo
thành các đoạn polypeptide. Các đoạn này khi vào khoang ruột sẽ được các protease
khác tiếp tục thủy phân tạo thành sản phẩm cuối cùng là các acid amin.
2.2.4. Lược sử nghiên cứu về protease
Loài người sử dụng enzyme protease trong sản xuất và đời sống từ lâu đời, trước
khi biết đến chúng. 5000 năm trước công nguyên, con người đã sử dụng renin có trong dạ
day bê như chất đông tụ để sản xuất pho mát. Các thổ dân Nam Mỹ cổ đại đã sử dụng lá
đu đủ để làm mềm thịt và phương pháp này đã được kế thừa, phát triển thành kỹ thuật làm
mềm thịt nhân tạo bằng papain và các enzyme protease khác. Ở Việt Nam, từ lâu đời, ông

cha ta đã chế biến nước mắm trên cơ sở quá trình tự phân giải thịt cá nhờ hệ enzyme có
sẵn trong nội tạng và cơ thịt cá, trong điều kiện nồng độ muối cao.
Đến thế kỷ 18, Reomur mới phát hiện dịch dạ dày của loài chim ăn thịt có khả
năng tiêu hoá thịt; năm 1836 Schwann nghiên cứu hoạt tính phân giải protease của
dịch vị trong dạ dày chó; năm 1857 Corvisart tách được chế phẩm thô tripxin từ dịch
tụy; năm 1862 Danilevxki tách được tripxin và amylaza từ tụy tạng. Từ những năm 50
của thế kỷ 20, các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu, thu nhận và ứng dụng enzyme
protease từ vi sinh vật, đồng thời phát triển và hoàn thiện công nghệ thu nhận protease
từ các mô động vật và thực vật. Từ đó đến nay, hàng loạt các protease từ vi sinh vật, từ
9


động vật và thực vật đã được sản xuất và ứng dụng vào mọi lĩnh vực sản xuất và đời
sống. Đặc biệt, những năm cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ 21, công nghệ enzyme phát triển
vô cùng nhanh chóng, các loại protease được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vục sản
xuất, đời sống, y học và nghiên cứu khoa học. Nếu như năm 1980, cả thế giới sản xuất
và tiêu thụ khoảng 1.300 tấn enzyme các loại trong đó protease chiếm 40,7 % thì đến
năm 1985, thị trường enzyme thế giới đã có sản lượng được mua bán là 45. 000 tấn, trị
giá 650 triệu USD và đến năm 1990, doanh thu từ các enzyme công nghiệp của thế giới
đạt 1,5 tỷ USD, trong đó thị phần enzyme protease là 48%. Như vậy cứ khoảng 5 năm,
lượng enzyme được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới tăng gấp đôi, trong đó lượng
enzyme protease chiếm khoảng 50 %. Các cường quốc về sản xuất và tiêu thụ enzyme
protease công nghiệp là Mỹ, Pháp, Nhật, Đức, Ý, Thụy Điển, Hà Lan, Đan Mạch, Trung
Quốc, …hầu hết thuộc các nước công nghiệp phát triển. Dự báo, trong thế kỷ 21, sản
xuất và tiêu thụ enzyme của thế giới sẽ tăng với tốc độ hàng năm khoảng 20 %.
Tuy protease được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau nhưng cho đến những năm
gần đây, các protease sử dụng trong công nghiệp chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật, các
protease có nguồn gốc thực vật và động vật có vị trí thứ yếu. (www.sinhhocvietnam.com).
2.3. Ứng dụng protease và protease của cá trong chế biến thuỷ sản
2.3.1. Giới thiệu chung

So với các protease có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật trên cạn,
protease của động vật thuỷ sinh nói chung, cá nói riêng ít được ở trong quy mô công
nghiệp. Những nguyên nhân của tình trạng trên có thể là:
 Nguồn nguyên liệu thuỷ sản mang tính mùa vụ lại không tập trung, cố định nên
việc cung cấp nguồn thu enzyme không ổn định, khó tổ chức sản xuất chế phẩm
enzyme ở quy mô công nghiệp.
 Trong cơ thể động vật thuỷ sản, cơ quan tập trung enzyme lớn và có hoạt lực
cao là nội tạng nên thường sử dụng nội tạng của chúng làm nguồn thu enzyme.
Tuy nhiên, nội tạng cá thường có mùi tanh hôi, không hấp dẫn đối vói công
nhân sản xuất, lại rất khó bảo quản ở điều kiện tự nhiên
 Protease của động vật thuỷ sản là một hệ gồm rất nhiều loại protease khác nhau.
Để tách riêng và làm tinh sạch từng enzyme cần trải qua hàng chục bước khác
nhau với kỹ thuật phức tạp. Chính vì vậy, cho đến nay, trên thị trường chưa có
10


chế phẩm protease thương mại từ nguyên liệu thuỷ sản. Để phát triển sản xuất
chế phẩm enzyme từ thuỷ sản phải nghiên cứu, hoàn thiện công nghệ và giảm
giá thành sản phẩm.
Từ những năm 50 của thế kỷ trước, ở nhiều nước đã phát triển công nghệ sản
xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Hàng trăm loại chế phẩm protease từ các
chủng vi sinh vật khác nhau đã được sản xuất và mua bán trên thị trường sản lượng
các chế phẩm protease thương mại tăng nhanh, liên tục và tỷ trọng các protease từ vi
sinh vật trong tổng doanh số enzyme trên thị trường thế giới luôn ở mức cao nhất so
với các protease từ các nguồn khác. Việc sản xuất các chế phẩm protease thương mại
từ vi sinh vật có những ưu điểm như:
 Có rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease, chu kỳ sinh
trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể thu nhận enzyme hàng chục lần trong năm,
có thể chủ động về nguyên liệu.
 Có thể dễ dàng điều hoà, định hướng quá trình sinh tổng hợp enzyme cần thiết

trên cơ sở tác động vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật, chọn lọc hoặc gây đột
biến ở chủng vi sinh vật.
 Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme trong môi trường nuôi cấy tổng hợp cao nên
việc thu nhận enzyme thuận lợi.
 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật dễ chế tạo, chi phí thấp, giá thành enzyme hạ.
Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng các chủng vi sinh vật để sản xuất enzyme công
nghiệp gặp phải một số trở ngại. Các chủng vi sinh vật protease phải được đánh giá, kiểm
tra nghiêm ngặt về độc tính để bảo đảm an toàn, vệ sinh cho sản phẩm. Việc phân tích,
kiểm tra phải tiến hành thường xuyên, liên tục với độ chính xác cao nên cần phải có các
phòng thí nghiệm, phân tích chuyên dùng, trang bị dụng cụ hiện đại, chi phí đầu tư lớn.
Trong khi đó, các enzyme protease có nguồn gốc từ động vật và thực vật luôn
được đánh giá là an toàn, sau khi thu nhận có thể sử dung ngay vào quá trình chế biến mà
không cần kiểm tra độc tính. Với sản lượng 100 triệu tấn cá biển và 30 triệu tấn cá nước
ngọt hàng năm, cả thế giới có tới 6,5 – 9 triệu tấn nội tạng và nếu đưa vào xử lý để thu
nhận enzyme protease, nguồn lợi thu được là không nhỏ. (Phạm Thị Trân Châu, 2006).

11


2.3.2. Nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến thuỷ sản ở Việt Nam
Đến nay trong phạm vi quốc gia, ngành thuỷ sản chưa có một cơ quan, đơn vị
chuyên nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong chế biến thuỷ sản. Các Viện nghiên
cứu, các trường đào tạo cán bộ khoa học công nghệ chuyên ngành thuỷ sản chưa có
chương trình nghiên cứu và ứng dụng enzyme nói chung, enzyme thuỷ sản nói riêng.
Chính vì vậy, có thể nói ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu về enzyme của cá và động
vật thuỷ sinh cũng như các hưóng ứng dụng chúng vào sản xuất và đời sống, vào chế
biến thuỷ sản hầu như chưa có gì. Những năm gần đây, một số nhà khoa học và công
nghệ đã bắt đầu quan tâm đến vấn đề này, nhưng mới chỉ là những nỗ lực cá nhân,
chưa được sự quan tâm của nhiều người, chưa được sự đầu tư về tài, lực cho nghiên
cứu nên kết quả mới là bước đầu và còn rất khiêm tốn. Các tài liệu, số liệu về enzyme

thuỷ sản và ứng dụng enzyme trong ngành thuỷ sản còn nghèo nàn, thiếu hệ thống.
Tuy nhiên có một ngành chế biến có truyền thống lâu đời, chế biến nước mắm.
Các công trình nghiên cứu về nước mắm đều đi đến kết luận là nước mắm là sản phẩm
của quá trình thuỷ phân protein trong thịt cá dưới tác dụng của hệ enzyme protease của
bản thân nguyên liệu. Quá trình thuỷ phân thịt cá bằng enzyme thực hiện trong điều
kiện có muối ăn ở nồng độ cao, để ngăn hoạt tính của các vi khuẩn gây thối rữa, tạo
thành các chất đạm hoà tan, chủ yếu là axit amin và peptit ngắn mạch. Do thuỷ phân
thịt cá bằng hệ enzyme của bản thân nguyên liệu trong điều kiện muối mặn nên quá
trình chế biến nước mắm trong điều kiện tự nhiên có thời gian dài, từ trên 10 tháng tới
1 – 2 năm. Trong quá trình lâu dài ấy, đồng thời với quá trình thuỷ phân thịt cá còn có
các quá trình lên men khác với sự tham gia của hệ vi sinh vật yếm khí hình thành các
hợp chất bay hơi, các acid hữu cơ…Làm cho nước mắm có hương vị, màu, mùi đặc
trưng, có giá trị dinh dưỡng và cảm quan đặc biệt.
Bên cạnh ứng dụng protease trong chế biến nước mắm, các nhà khoa học công
nghệ nứoc ta cũng đã quan tâm mở rộng thêm nhiều lĩnh vực ứng dụng protease trong
chế biến thuỷ sản. Các lĩnh vực sử dụng protease trong chế biến thuỷ sản chủ yếu tập
trung vào lĩnh vực nâng cao hiệu quả sử dụng phế liệu thuỷ sản cũng như nguồn cá
tạp, cá kém giá trị kinh tế.
So với kết quả nghiên cứu về enzyme protease của thực vật, động vật máu nóng
và vi sinh vật có lịch sử phát triển hàng trăm năm thì việc nghiên cứu, ứng dụng
12


enzyme protease cá. Ứng dụng protease trong chế biến thuỷ sản mới chỉ tập trung vào
việc tận dụng enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu. Các lĩnh vực nghiên cứu, ứng
dụng protease trong chế biến thuỷ sản còn hạn chế, và chỉ mới dừng ở trong phòng thí
nghiệm, chưa chuyển giao công nghệ để sản xuất công nghiệp.
Yêu cầu sản xuất chế phẩm protease từ thuỷ sản để sử dụng trong chế biến cũng
như cung cấp cho các ngành khác đang đặt ra trực tiếp và cấp bách. Các công trình
nghiên cứu về protease của cá và các lĩnh vực ứng dụng đang tăng lên nhanh chóng ở

nhiều nước có nghề cá phát triển. Tiềm năng phát triển sản xuất chế phẩm protease từ
thuỷ sản và ứng dụng để chế biến ra những sản phẩm mới là rất to lớn. Trong thời đại
bùng nổ thông tin, sự hội nhập và trao đổi thông tin đang rất khẩn trương và thuận lợi,
các nhà khoa học công nghệ nước ta cần nhanh chóng tiếp thu các thành tựu mới trong
lĩnh vực này để áp dụng vào sản xuất, góp phần phát triển nhanh chóng công nghiệp
chế biến thuỷ sản của đất nước. (Nguyễn Đức Lượng, 2004 và www.agro.gov.vn).
2.3.3. Các nguồn thu enzyme protease
Enzyme nói chung va enzyme protease nói riêng được thu nhận chủ yếu từ ba
nguồn cơ bản: mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật.
Enzyme được tách từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột…của một số động vật
thuỷ sản (mực, cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin, …Từ thực
vật có thể thu được một số enzyme thuỷ phân như: papain từ nhựa đu đủ, bromelin từ
thân, lá và vỏ dứa. Ngoài ra, còn có thể thu được một số enzyme khác như: amylase,
urease, peroxydase…
2.3.4. Nguồn thu protease từ cá ngừ
Cá ngừ thuộc họ cá thu ngừ (Scombridae) có giá trị kinh tế quan trọng nhất ở
biển Việt Nam. Cá ngừ phân bố ở khắp các vùng biển Việt Nam, kích thước cá tương
đối lớn (6 loài có kích thước từ 20 – 70 cm, khối lượng từ 0, 5 – 4 kg. Riêng hai loài
cá ngừ vây vàng và cá ngừ mắt to có kích thước lớn 70 – 200 cm, khối lượng 1, 6 –
64 kg). Căn cứ vào tập tính di cư có thể chia cá ngừ ở Việt Nam thành 2 nhóm nhỏ:
 Nhóm các loài có kính thước nhỏ, di cư trong phạm vi địa lý hẹp.
 Nhóm các loài di cư đại dương.
Mùa vụ khai thác: Mùa vụ khai thác cá ngừ ở vùng biển Việt Nam gồm hai vụ,
vụ chính bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 8, vụ phụ từ tháng 10 đến tháng 2 năm sau. Cá
13


ngừ thường tập trung thành đàn và di cư, trong đàn thường bao gồm một số loài khác
nhau. Sản lượng khai thác các ngừ hàng năm chiếm tới 10 – 15% tổng sản lượng cá
khai thác hàng năm nhưng lại chiếm tới 50 – 60% sản lượng cá xuất khẩu và 60 – 70%

giá trị kim ngạch xuất khẩu cá (www.agro.gov.vn).
2.3.5. Ứng dụng enzyme protease
Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) enzyme nói chung và enzyme protease nói
riêng có thể sử dụng theo hai hướng sau:
Hướng 1: Sử dụng trong quá trình thuỷ phân trong cơ thể. Các enzyme này là
các enzyme nội bào. Chúng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào sống,
nhưng khi sinh vật chết quá trình thuỷ phân protein vẫn diễn ra. Như vậy, protease
tham gia thuỷ phân protein của chính nguyên liệu chứa nó. Việc sử dụng enzyme theo
hướng này rất đơn giản, có thể làm tăng hương vị, màu sắc của sản phẩm. Tuy vậy, chỉ
có thể sử dụng enzyme loại này đối với quy trình chế biến nguyên liệu chứa nó.
Hưóng 2: Tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng chúng
vào trong các quá trình sản xuất. Việc tách chiết enzyme dựa vào tính chất của chúng:
enzyme tan được trong nước, trong dung dịch muối sinh lý, các dung dịch đệm. Dịch
chiết thu được chứa enzyme, protein tạp, các chất hữu cơ và vô cơ nên phải tiến hành
tinh sạch để thu chế phẩm. Các chế phẩm enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều
lĩnh vực khác nhau.
a. Trong ngành thực phẩm
Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm
quan, làm tăng giá trị sản phẩm. Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội tạng
động vật để thuỷ phân làm mềm nguyên liệu, hoặc thuỷ phân nguyên liệu tạo thành
dịch dễ hấp thu, dễ tiêu hoá.
Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease
được sử dụng làm trong dịch quả, dịch bia. Dùng protease trong công nghiệp chế biến
sữa, làm phomat.
Protease được dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của các sản
phẩm có giá trị thấp. Ví dụ như dùng protease để thuỷ phân protein trong phế liệu
công nghiệp thực phẩm (xương, collagen…) thành các dạng hoà tan, thu dịch đạm

14

thuỷ phân làm thức ăn cho người hoặc thức ăn chăn nuôi. Dùng protease để thuỷ phân
màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá.
b. Trong các ngành công nghiệp
Trong ngành công nghiệp dệt, người ta dùng chế phẩm protease dể sản xuất
dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng, không ảnh hưởng đến độ bền của tơ. Protease đựơc
sử dụng trong ngành ảnh để sản xuất gellatin trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái sinh
ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X – quang. Protease còn được sử dụng trong ngành
da để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, lam mềm da, tăng lượng lông thu hồi (tỷ lệ thu hồi
tăng 25 – 30% so với khi dùng phương pháp hoá học), va da có chất lượng cao.
Ngoài ra, protease còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất xà phòng, chất
tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm, protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, kem
đánh răng… có tác dụng tẩy sạch các vết mủ, hay bổ sung protease vào kem bôi mặt
để loại các lớp biểu bì chết, làm mịn da.
c. Trong ngành dược phẩm
Dùng protease để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hoá, thuốc
tiêu mủ ở các vết thương, thuốc chữa nghẽn mạch máu để làm sạch vết thương và
giảm đau cho người bệnh. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm bằng cách thuỷ phân
sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng
các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, và có ưu điểm của việc thuỷ phân
protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản
phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân.
d. Trong chế biến thuỷ sản
Nước mắm được hình thành từ quá trình thuỷ phân protein trong thịt cá dưới tác
dụng của hệ enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu trong điều kiện muối mặn và
thời gian dài. Người ta đã sử dụng chế phẩm protease để bổ sung trong quá trình sản
xuất nước mắm với lượng nhất định nhằm rút ngắn thời gian chế biến. Nhờ vậy mà
làm tăng hiệu quả kinh tế, tăng sự luân chuyển vốn.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng protease vào việc sản xuất bột đạm cá, bột đạm
hoà tan,…từ các loại cá có giá trị kinh tế thấp (như cá mối, cá tạp…). Sở dĩ làm như

vậy vì hướng sản xuất này có thể tận dụng được các phế liệu trong quá trình chế biến,
tiết kiệm nguyên liệu, tăng giá trị sản phẩm, … đem lại hiệu quả kinh tế cao.
15