NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM PHÂN HỦY CHITIN TỪ Bacillus VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN CÁC CƠ CHẤT TỰ NHIÊN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM PHÂN HỦY CHITIN
TỪ Bacillus VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG THỦY
PHÂN CÁC CƠ CHẤT TỰ NHIÊN

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : ĐINH THỊ THÙY HƯƠNG
Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 8 /2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM PHÂN HỦY CHITIN
TỪ Bacillus VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG TRONG THỦY
PHÂN CÁC CƠ CHẤT TỰ NHIÊN

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT

ĐINH THỊ THÙY HƯƠNG

KS. BIỆN THỊ LAN THANH

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Xin được gởi ngàn lời biết ơn sâu sắc nhất đến Ba mẹ, người đã nuôi dưỡng và
dạy dỗ tôi nên người. Cảm ơn hai em đã luôn quan tâm và động viên tôi trong suốt
thời gian qua.
Lời chân thành, xin cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành
phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý
Thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Xin được gởi lời cảm ơn chân thành nhất đến ThS. Nguyễn Như Nhứt và KS.
Biện Thị Lan Thanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt
nhất để tôi hoàn thành khóa luận này.
Xin cảm ơn ThS. Trương Phước Thiên Hoàng đã giúp đỡ, hướng dẫn và góp ý
cho tôi trong thời gian thực hiện khóa luận..
Cảm ơn các anh chị làm việc tại công ty TNHH Gia Tường đã luôn quan tâm,
giúp đỡ và giải đáp những thắc mắc cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp tại công ty.
Cảm ơn những người bạn thân thiết đã luôn gắn bó, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian học tập vừa qua.

Tp. HCM, tháng 8/2009

Đinh Thị Thùy Hương

iii


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phân hủy chitin từ Bacillus và thử
nghiệm ứng dụng trong thủy phân các cơ chất tự nhiên” được thực hiện tại phòng thí
nghiệm công ty TNHH Gia Tường – Chi nhánh Bình Dương từ ngày 02/2009 đến
ngày 07/2009.
Qua thí nghiệm định tính đo đường kính vòng phân giải chitin và thí nghiệm
khảo sát hệ enzyme phân hủy chitin của 10 chủng Bacillus nghiên cứu, chúng tôi đã
chọn ra chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân hủy chitin cao nhất.
Và bằng phương pháp so màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) xác định
hoạt độ enzyme phân hủy chitin để khảo sát pH, tỷ lệ phụ phẩm tôm, thời gian nuôi
cấy ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme phân hủy chitin của chủng đã chọn
lọc. Tiến hành nuôi cấy thu nhận chế phẩm và thử nghiệm ứng dụng chế phẩm trong
thủy phân các cơ chất chitin tự nhiên như vỏ cua, nhộng tằm, nhộng ruồi lính đen và sinh
khối nấm bệnh.
Kết quả cho thấy trong 10 chủng Bacillus nghiên cứu thì chủng Ba01 có khả
năng sinh tổng hợp enzyme phân hủy chitin cao nhất ở 96 giờ nuôi cấy với tỷ lệ phụ
phẩm tôm trong môt trường nuôi cấy là 20 g/l MT, pH thích hợp cho môi trường nuôi
cấy là 7,5. Trong 1 ml chế phẩm thu được sau khi nuôi cấy có chứa 25,9 đơn vị hoạt
độ enzyme phân hủy chitin và 1,2 x 106 tế bào Bacillus. Chế phẩm có khả năng thủy
phân cơ chất tự nhiên giàu chitin như vỏ cua, nhộng tằm, nhộng ruồi lính đen và sinh
khối nấm bệnh.

iv

SUMMARY
Graduating the thesis topic: “Study on colleting chitinolytic preparation from
Bacillus and applying for degrading natural chitin sources”. This thesis was carried out
at the laboratory of the branch of Giatuong Co. Ltd from 02/2009 to 07/2009.
Among 10 reseaches Bacillus, we selected strain that could synthesize hightest
chitinolytic enzyme. We determined chitinolytic activity by colorimetry method with
DNS reactant to investigated effect of culture conditions (pH, shrimp shell rate,
cultural time) on enzyme synthesis process. This preparation was applied in degrading
natural chitin sources such as crab shell, chrysalis and biomass of pathogenic fungies
(sclerotium sp., Sclerotium rolfsii, M 1.3).
Results showed that among 10 reseaches Bacillus, the Ba01 strain is the best
strain which could synthesize chitinolytic enzyme. The culture medium contains 20 g/l
shrimp shell and adjust to pH 7.5. After culturing in 96 hours, the preparation contains
25.9 UI/ml chitinolytic enzyme and 1.2 x 106 CFU/ml Bacillus.
This preraration could degrade some natural chitin sources such as crab shell,
chrysalis and biomass of pathogenic fungies.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................... iii
TÓM TẮT......................................................................................................................iv
SUMMARY....................................................................................................................v
MỤC LỤC .....................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................x
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..........................................................................................xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH.......................................................................................... xii
Chương 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề...............................................................................................................1

1.2. Yêu cầu...................................................................................................................1
1.3. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................2
2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus..............................................................................2
2.1.1. Vị trí phân loại.....................................................................................................2
2.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý..................................................................................2
2.1.3. Phân bố ................................................................................................................3
2.1.4. Tác hại .................................................................................................................4
2.1.5. Lợi ích..................................................................................................................4
2.2. Sơ lược về chitin ....................................................................................................6
2.2.1. Cấu tạo.................................................................................................................6
2.2.2. Sự phân bố của chitin ..........................................................................................7
2.2.3. Đặc tính của chitin...............................................................................................7
2.2.4. Ứng dụng .............................................................................................................8
2.2.5. Các sản phẩm của chitin......................................................................................8
2.2.5.1. Glucosamine và N-acetylglucosamine .............................................................8
2.2.5.2. Chitosan ............................................................................................................9
2.2.5.3. Chitooligosaccharides.....................................................................................10
2.3. Sơ lược về hệ enzyme phân hủy chitin ................................................................10
2.3.1. Định nghĩa .........................................................................................................10
vi


2.3.2. Phân loại ............................................................................................................10
2.3.2.1. Phân loại dựa theo sản phẩm tạo thành ..........................................................10
2.3.2.2. Phân loại dựa theo trình tự amino acid...........................................................11
2.3.3. Các nguồn thu nhận enzyme phân hủy chitin ...................................................12
2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của chitinase .........................................13
2.3.5. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của chitinase..................................................13
2.3.6. Cơ chế tác dụng của enzyme phân hủy chitin ...................................................14

2.3.7. Ứng dụng của enzyme phân hủy chitin .............................................................16
2.3.7.1. Ứng dụng enzyme phân hủy chitin trong nông nghiệp ..................................16
2.3.7.2. Ứng dụng enzyme phân hủy chitin trong y dược ...........................................16
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................17
3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm ........................................................................17
3.2. Vật liệu ................................................................................................................17
3.2.1. Nguồn giống ......................................................................................................17
3.2.2. Nguồn chitin ......................................................................................................17
3.2.3. Nguồn cơ chất sử dụng......................................................................................17
3.2.4. Các môi trường sử dụng trong thực nghiệm......................................................17
3.2.4.1. Môi trường nước chiết giá đậu đường peptone - agar (MT1) .......................17
3.2.4.2. Môi trường cao thịt peptone glucose - Môi trường nhân giống .....................17
3.2.4.3. Môi trường cảm ứng sinh tổng hợp enzyme phân hủy chitin.........................18
3.2.4.4. Môi trường nuôi cấy lỏng (MT4) ...................................................................18
3.2.4.5. Môi trường giữ giống nấm bệnh (PGA) (MT5) .............................................19
3.2.4.6. Môi trường bán rắn thu sinh khối nấm bệnh (MT6).......................................19
3.2.4.7. Cách làm huyền phù chitin (Roberts và Selitrennikoff, 1988).......................19
3.2.5. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất.............................................................................19
3.2.5.1. Dụng cụ...........................................................................................................19
3.2.5.2. Thiết bị............................................................................................................19
3.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................19
3.3.1. Phương pháp nhân giống.....................................................................................19
3.3.2. Phương pháp bảo quản giống..............................................................................20
3.3.3. Phương pháp đếm mật độ tế bào vi sinh vật bằng phòng đếm hồng cầu............20
3.3.4. Phương pháp tách chiết chitin từ phụ phẩm tôm ................................................20
vii


3.3.5. Phương pháp xác định độ ẩm ..............................................................................21
3.3.5.1. Nguyên tắc ......................................................................................................21

3.3.5.2. Cách tiến hành ................................................................................................21
3.3.5.3. Cách tính.........................................................................................................21
3.3.6. Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl .......................22
3.3.6.1. Nguyên tắc ......................................................................................................22
3.3.6.2. Cách tiến hành ................................................................................................22
3.3.6.3. Công thức tính đạm tổng ................................................................................22
3.3.7. Xác định hàm lượng tro toàn phần theo phương pháp nung ở nhiệt độ cao .......23
3.3.7.1. Nguyên tắc ......................................................................................................23
3.3.7.2. Cách tiến hành ................................................................................................23
3.3.7.3. Cách tính.........................................................................................................23
3.3.8. Xác định hàm lượng lipid thô theo phương pháp Soxhlet ................................23
3.3.8.1. Nguyên tắc ......................................................................................................24
3.3.8.2. Hóa chất ..........................................................................................................24
3.3.8.3. Cách tiến hành ................................................................................................24
3.3.8.4. Cách tính.........................................................................................................24
3.3.9.

Phương pháp định tính khả năng phân hủy chitin ..........................................25

3.3.9.1. Nguyên tắc ......................................................................................................25
3.3.9.2. Cách tiến hành ................................................................................................25
3.3.10. Phương pháp xác định hàm lượng N-acetyl-D-glucosamine .........................25
3.3.10.1. Hóa chất .......................................................................................................26
3.3.10.2. Thí nghiệm ...................................................................................................26
3.3.11. Phương pháp nuôi cấy Bacillus để thu nhận enzyme phân hủy chitin ...........27
3.3.12. Phương pháp xác định hoạt độ thủy phân chitin ............................................27
3.3.12.1. Nguyên tắc ...................................................................................................27
3.3.12.2. Cách tiến hành..............................................................................................27
3.3.12.3. Cách tính ......................................................................................................27
3.3.13. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên điều kiện nuôi cấy .............28

3.3.13.1. Phương pháp chọn lọc chủng Bacillus .........................................................28
3.3.13.2. Phương pháp thu nhận enzyme phân hủy chitin..........................................28
viii


3.3.13.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy..................28
3.3.13.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phụ phẩm tôm .........................28
3.3.13.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ...........................29
3.3.14. Phương pháp nuôi cấy bán rắn thu sinh khối nấm bệnh.................................29
3.3.15. Phương pháp thử nghiệm ứng dụng chế phẩm ...............................................29
3.3.15.1. Nguyên tắc ...................................................................................................29
3.3.15.2. Cách tiến hành..............................................................................................29
3.3.16. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................29
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................30
4.1. Kết quả định tính sơ bộ hệ enzyme phân hủy chitin của các chủng Bacillus ......30
4.2. Kết quả xác định một số thành phần của cơ chất dùng để nuôi cấy ....................32
4.3. Kết quả khảo sát và chọn lọc chủng Bacillus.......................................................33
4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH MT nuôi cấy...............................................34
4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ phụ phẩm tôm trong MT nuôi cấy ...........35
4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ............................................36
4.7. Kết quả ứng dụng thủy phân các cơ chất tự nhiên giàu chitin .............................37
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................39
5.1. Kết luận ................................................................................................................39
5.2. Đề nghị .................................................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................40
PHỤ LỤC

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B. cereus

Bacillus cereus

B. coagulans

Bacillus coagulans

B. subtilis

Bacillus subtilis

B. thuringiensis

Bacillus thuringiensis

CP

Chế phẩm

CT

Canh trường

DNS

3,5 – dinitrosalicylic acid

Đvhđ

Đơn vị hoạt độ

GlcNAc

N-acetyl-D-glucosamine

GlcN

Glucosamine

HSHC

Hệ số hiệu chỉnh

MT

Môi trường

NPG

Neopentyl Glycol

OD

Optical density

P

Probability (mức độ tin cậy)

tb

Tế bào

TB

Trung bình

TKtb

Thử không trung bình

TTtb

Thử thật trung bình

UI

Unit International

Vdd

Thể tích dung dịch.

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG

TRANG
Bảng 3.1 Các bước thực hiện tách chiết chitin từ phụ phẩm tôm ..............................21
Bảng 3.2 Dựng đường chuẩn GlcNAc ...............................................................................26
Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải chitin của 10 chủng Bacillus nghiên cứu.........30
Bảng 4.2 Thành phần phụ phẩm tôm dùng để nuôi cấy..............................................32
Bảng 4.3 Hoạt độ enzyme của các chủng nghiên cứu (UI/ml CT) .............................33
Bảng 4.4 Hoạt độ enzyme phân hủy chitin theo pH của MT nuôi cấy.......................34
Bảng 4.5 Hoạt độ enzyme phân hủy chitin theo tỷ lệ phụ phẩm tôm.........................35
Bảng 4.6 Hoạt độ enzyme phân hủy chitin theo thời gian nuôi cấy ...........................36
Bảng 4.7 Nồng độ GlcNAc thu được sau khi thủy phân các cơ chất tự nhiên ...........37

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Hình dạng một số tế bào Bacillus ..................................................................2
Hình 2.2 Bào tử vi khuẩn gây bệnh than ......................................................................4
Hình 2.3 Natto một loại thực phẩm chức năng ở Nhật.................................................5
Hình 2.4 Enzyme Nattokinase ......................................................................................6
Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của chitin............................................................................6
Hình 2.6 Sự sắp xếp các chuỗi polimer trong cấu trúc tinh thể của α-, β- và γ-chitin....7
Hình 2.7 Cấu trúc hóa học của Glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine ..................8
Hình 2.8 Cấu trúc hóa học chitosan..............................................................................9
Hình 2.9 Vị trí cắt của hệ enzyme phân hủy chitin ....................................................10
Hình 2.10 Cơ chế thủy giải tại trung tâm hoạt hóa của enzyme chitinase..................14
Hình 2.11 Các vị trí kết nối giữa cơ chất chitin và enzyme phân hủy chitin..............15
Hình 4.1 Vòng phân giải chitin của các chủng Bacillus nghiên cứu.........................31
Hình 4.2 Phụ phẩm tôm dùng để nuôi cấy thu enzyme phân hủy chitin ...................32
Hình 4.3 Các cơ chất thủy phân..................................................................................38

xii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong vài chục năm gần đây, việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme
trên thế giới đã phát triển với tốc độ mạnh mẽ. Một nhân tố quan trọng có tác dụng thúc
đẩy sự phát triển nhanh chóng của nền công nghiệp enzyme chính là các vi sinh vật những nhà máy sản xuất enzyme. Dựa trên đặc điểm phát triển cực kỳ nhanh và có khả
năng tiết enzyme ngoại bào có hoạt lực cao của vi sinh vật nên ta có thể thu được một
lượng lớn enzyme trong một thời gian ngắn. Ngoài ra, ta còn có thể tận dụng các phế thải
của ngành công nghiệp khác để làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật, do đó chi phí sản
xuất được giảm xuống đáng kể.
Enzyme phân hủy chitin là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng và được
sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y
dược, nghiên cứu khoa học… Nó có tác dụng kháng nấm bệnh, diệt côn trùng, gia tăng
tính miễn dịch thực vật, đặc biệt nó phân hủy các cơ chất giàu chitin trong tự nhiên như
vỏ tôm, cua tạo ra đường amin. Bên cạnh đó, với đối tượng nghiên cứu là Bacillus dễ
nuôi cấy. Chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phân hủy chitin
từ Bacillus và thử nghiệm ứng dụng trong thủy phân các cơ chất tự nhiên”
1.2. Yêu cầu
 Thu nhận chế phẩm phân hủy chitin có hoạt tính cao.
 Chế phẩm thu được có khả năng thủy phân các nguồn cơ chất chitin tự nhiên.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát khả năng tổng hợp hệ enzyme phân hủy chitin của một số chủng vi
khuẩn Bacillus sp. để chọn lọc chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân hủy chitin
cao nhất.
Khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh tổng hợp enzyme phân
hủy chitin của chủng Bacillus sp. chọn lọc.

Thu nhận chế phẩm và thử nghiệm ứng dụng chế phẩm trong thủy phân các cơ
chất tự nhiên giàu chitin.

1


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus
2.1.1. Vị trí phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus sp.
2.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý (Nguyễn Thanh Thủy, 2007; Âu Thị Bích Phượng, 2006).

1

2

Hình 2.1 Hình dạng một số tế bào Bacillus.
1. Bacillus sp. ( />1. Bacillus cereus (http://Articleimages/Bacillus%20cereus%20fig1.jpg).

Tế bào Bacillus sp. thường dạng đơn hoặc chuỗi dài. Chiều dài của chúng có thể
khác nhau tùy vào điều kiện hóa lý trong quá trình phát triển, trong khi chiều rộng tế
bào có nét đặc trưng hơn. Mức độ khác nhau này tùy thuộc vào nguồn carbohydrate
trong môi trường nuôi cấy. Khi phát triển trên môi trường nutrient agar, chỉ một vài loài

Bacillus như Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus mycoide và Bacillus
megaterium có chiều rộng tế bào lớn hơn 1µm.

2


Hình dạng khuẩn lạc tùy thuộc rất lớn vào điều kiện nuôi cấy như thành phần
môi trường, độ ẩm, nhiệt độ, không khí. Ở một vài loài có hiện tượng tạo khuẩn lạc thô
ráp, lởm chởm, tạo dạng vảy hay màng mỏng trong môi trường nuôi cấy, trong khi đó
khuẩn lạc một số loài khác lại trơn nhẵn.
Bacillus sp. là trực khuẩn (tế bào hình que), Gram (+), có khả năng sinh bào tử
dạng hình cầu, elip hay hình trụ. Bất động hay di động nhờ tiêm mao.
Bacillus có khả năng sinh catalase, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý. Phần lớn các
chủng trong giống Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng ở mức trung bình, với nhiệt độ tối
ưu từ 30oC đến 45oC, tuy nhiên cũng có một số chủng có mang các gen chịu nhiệt với
nhiệt độ tối ưu khá cao, khoảng 65oC. Trong điều kiện phòng thí nghiệm với các điều
kiện tối ưu cho quá trình phát triển, các chủng Bacillus có thời gian sinh trưởng khá
ngắn, khoảng 24 giờ.
Hầu hết các chủng Bacillus sp. đều có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ
như đường, amino acid, các acid hữu cơ và chuyển hóa nhiều nguồn carbon như
metanol, cellulose, chitin.
Bacillus sp. có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme ngoại bào cần thiết cho quá
trình sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường như: amylase,
hemicellulase, glucanase…
2.1.3. Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006).
Dựa vào sự đa dạng trong trao đổi chất của loài Bacillus sp. mà chúng có thể tạo
thành những quần thể ở nhiều sinh cảnh khác nhau. Hầu hết là vi khuẩn hoại sinh,
chúng có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, có trong đất, nước, không khí, chúng còn
phân bố rộng rãi trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt
đó. Một vài loài là những vi khuẩn gây bệnh hay ký sinh trên động vật. Chẳng hạn như

B. thuringiensis ký sinh trên côn trùng. Những loài khác như Bacillus subtilis ký sinh
trên vùng rễ của cây nằm giữa rễ và vùng đất xung quanh.
Người ta nhận thấy rằng nhóm vi khuẩn Bacillus có mặt trong các nguyên liệu
dùng để sản xuất như: bột mì, bột gạo, muối hột… đến các sản phẩm thực phẩm truyền
thống như: các loại mắm, tương, mẻ (cơm lên mem chua), chao… Và dường như có vai
trò đáng kể (mặt lợi cũng như mặt hại) trong quá trình biến đổi sinh học.

3


2.1.4. Tác hại của vi khuẩn Bacillus
Do có bào tử chịu nhiệt cao nên Bacillus có thể gây hỏng một số thực phẩm hộp
được thanh trùng nhiệt độ thấp. Lúc đó đồ hộp có mùi vị thối chua rất khó chịu, không
tạo gas hoặc có thể tạo gas trong môi trường có đường.
B. cereus hiện diện trong đất và các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau, quả, hỗn hợp
gia vị, sản phẩm khô…), loại vi khuẩn này có thể tiết ra hai loại độc tố chính diarrhoeal
toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa.
Bacillus anthracis là vi khuẩn than gây bệnh ở trâu, bò, dê, ngựa... lây lan qua
người, tạo các vết thương có màu đen, gây loét ngoài da, viêm đường tiêu hóa và viêm
phổi cấp ( />
Hình 2.2 Bào tử vi khuẩn gây bệnh than
(./benhthan/B.anthracis1.JPG).

2.1.5. Lợi ích của vi khuẩn Bacillus
Bacillus có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình sống để
thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường như: amylase, hemicellulase,
glucanase, protease, phytase…
Ngoài ra, từ Bacillus có thể thu đuợc nhiều kháng sinh chống được nhiều loại vi
trùng gây bệnh như:
-

Subtilin (Humfeld và Feustel, 1943).

-

Eumycin (Johnson và Burdon, 1946).

-

Bacillin (Foster và Woodruff, 1946).

-

Bacillomin (Shtikell và Poplavskii, 1955)

(trích dẫn Nguyễn Thanh Thủy, 2006).
Nông dân thường đưa Bacillus vào đất để tăng khả năng chống chịu bệnh tật của
cây. Vi khuẩn này tạo ra một màng có các đặc tính chống vi khuẩn quanh rễ cây.
4


Vi khuẩn B. thuringiensis subsp. Israelensis có tác dụng diệt lăng quăng trong
nhiều điều kiện sống khác nhau, từ ao tù nước đọng cho đến nước kênh rạch.
Trong chăn nuôi, heo con ăn B. coagulans có tỷ lệ chết giảm và cải thiện việc
tăng trọng lượng, sự chuyển hóa thức ăn tốt hơn heo con không có ăn bổ sung.
Cenbiot, một probiotic chứa B. cereus cải thiện sự tăng trọng và chuyển hóa thức ăn ở
heo con cai sữa sớm và làm giảm sự ảnh hưởng của bệnh tiêu chảy.
Bacillus licheniformis cải thiện trọng lượng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh tiêu
chảy, tỷ lệ chết non.
Trong công nghệ thực phẩm, B. subtilis được dùng để lên men thực phẩm và tạo

nhiều thực phẩm chức năng, trong đó B. subtilis natto được dùng để lên men đậu tương,
tạo sản phẩm Natto (hình 2.3), một loại thực phẩm truyền thống ở Nhật. Natto có chứa
nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe, trong đó, enzyme Nattokinase là một hoạt chất sản
sinh trong quá trình lên men Natto được xem là hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn
ngừa các chứng bệnh tim mạch ( />Ngoài ra, nhiều chủng Bacillus như Bacillus subtils, Bacillus polymyxa, Bacillus
lichenifomis có tác dụng thúc đẩy đáng kể quá trình hình thành mùn từ các chất thải
hữu cơ của các ngành công, nông nghiệp như vỏ cà phê, bùn đáy ao được dùng để sản
xuất phân hữu cơ vi sinh. Ngoài ra, lợi ích lớn nhất mà các chế phẩm này đem lại đã
giảm thiểu tình trạng ô nhiễm môi trường thường thấy ở các cơ sở chăn nuôi.

Hình 2.3 Natto một loại thực phẩm chức năng ở Nhật
( />
5


Hình 2.4 Sản phẩm enzyme Nattokinase.
( />
2.2. Sơ lược về chitin
2.2.1. Cấu tạo
Chitin là một polymer mạch thẳng có cấu tạo dạng chuỗi, thành phần chủ yếu là
các monomer N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) nối với nhau bằng liên kết 1,4-βglucosid. Mỗi phân tử chitin được xác định có độ dài là 10,4 AO. Về mặt cấu trúc,
chitin khác cellulose ở chỗ nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin
được thay thế bằng nhóm hydroxyl (- OH) ở cellulose. Cả hai đều là polymer chính tạo
nên cấu trúc tế bào và bề mặt cơ thể, cellulose giúp cho vách tế bào thực vật thêm vững
chắc, chitin hiện diện trong vách tế bào nấm và bộ xương của động vật chân khớp.

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của chitin.
( />
6

Chitin có 3 dạng cấu trúc tinh thể: α-, β- và γ-chitin (Hackman và Goldberg,
1965), sự khác nhau thể hiện ở sự sắp xếp của các chuỗi bên trong cấu trúc tinh thể.

↑↓↑↓↑↓
α-chitin

↑↑↑↑↑↑
β-chitin

↑↑↓↑↑↓
γ-chitin

Hình 2.6 Sự sắp xếp các chuỗi polymer trong cấu trúc tinh thể của α-, βvà γ-chitin. (→: hướng từ đầu không khử (-NHCOCH3) đến đầu khử (-CH2OH)).
Chitin kết hợp với đường, protein, glycoprotein và proteoglycan cấu trúc nên
vách tế bào nấm và thành tế bào như lớp biểu bì của động vật chân khớp và màng bao
chất nền, trong động vật giáp xác và côn trùng (Kozloff, 1990). Chitin trong động vật
thì liên kết với protein, chitin trong vách tế bào nấm thì liên kết với glucan, mannan, và
polysaccharide khác. Trong vách tế bào nấm, chitin liên kết trực tiếp với glucan bằng
liên kết đồng hóa trị hoặc qua cầu nối peptide (Roberts, 1992).
2.2.2. Sự phân bố của chitin
Chitin là một polymer sinh học phổ biến trong tự nhiên, đứng thứ hai sau
cellulose. Chitin có thể tìm thấy trong động vật biển như trong dạ dày cá và vỏ động vật
giáp xác. Nó cũng được tìm thấy trong tế bào động vật nguyên sinh và côn trùng
(Suhardi, 1993). Trong vỏ động vật giáp xác, hàm lượng chitin chiếm khoảng 20-80 %
trọng lượng khô, còn côn trùng và động vật nguyên sinh thì có khoảng 16-75 % chitin.
Chitin cũng tìm thấy trong nấm và tảo. Hàm lượng chitin trong nấm khoảng 45
%. Gần đây, nguồn chitin được tìm thấy trong Aspergillus niger rất cao xấp xỉ 45 % các
vật chất hữu cơ trong cơ thể của nó (Jolles. P và Muzzarelli. R. A. A, 1999).
2.2.3. Đặc tính của chitin

Là thành phần cấu trúc thành tế bào của hầu hết các loài nấm sợi, côn trùng và là
chất hữu cơ hình thành vỏ ngoài của động vật không xương sống… có tác dụng bảo vệ chúng.
Cấu tạo hóa học và trọng lượng phân tử là hai đặc tính chủ yếu của chitin.
Lượng protein dư thừa, độ ẩm, chất màu, tro, lipid, kim loại nặng và cấu trúc tinh thể là
những thông số thú vị ảnh hưởng đến mục đích sử dụng chitin (Roberts, 1992).
Chitin là chất rắn vô định hình, bền vững, không tan trong nước và hầu hết các
acid cũng như kiềm, alcol và các dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị
thủy giải bởi acid vô cơ mạnh như (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc, HF khan), kiềm

7


mạnh, acid formic với nồng độ cao và N,N-dimethylacetamide (DMAc)-LiCL hoặc
bằng enzyme vi sinh vật.
Trọng lượng phân tử của chitin khoảng 940 - 1060 kg/mol với sai số ± 11%.
Là thành phần cấu trúc thành tế bào của hầu hết các loài nấm sợi, côn trùng và là
chất hữu cơ hình thành vỏ ngoài của động vật không xương sống… có tác dụng bảo vệ chúng.
2.2.4. Ứng dụng của chitin
Chitin và một số dẫn xuất của chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực: như xử lý nước thải và bảo vệ môi trường, y dược, nông nghiệp, công nghiệp và
công nghệ sinh học…
Gần đây, glucosamine (GlcN) được tạo ra và sử dụng bổ sung vào chế độ ăn
uống (Sandford, 2002). Khoảng 65% chitin được dùng để sản xuất GlcN, 25% được
dùng để sản xuất chitosan, 9% sản xuất oligosaccharides và xấp xỉ 1 % sản xuất Nacetylglucosamine (Mustaparta, 2006).
2.2.5. Các sản phẩm của chitin
2.2.5.1. Glucosamine (GlcN) và N-acetyl – D- glucosamine (GlcNAc)
2-amino-2-deoxy-D-glucose (glucosamine) và 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose
(N-acetylglucosamine) là những đường amin cấu thành nên chitin và chitosan. Chúng
được tìm thấy trong phân tử, tế bào và mô.

GlcN

GlcNAc

Hình 2.7 Cấu trúc hóa học của Glucosamine ( />arthritis-news/glucosamine.gif) và N-acetyl-D-glucosamine
(http://wikipedia/commons/9/9b/Glcnac.png).
Trung Quốc sản xuất khoảng 90% GlcN (Sandford, 2002). GlcN được sản xuất
để đẩy lùi triệu trứng viêm khớp cơ (Anderson và cộng sự, 2005), chúng tác động hầu
hết các khớp cơ: tay, chân, khớp xương vai, đầu gối… GlcN có những tác động dược lý
8


trong xương sụn và khớp cơ. Nó được hấp phụ và phân phối trong mô khớp và chống
lại sự viêm, sưng phồng của khớp xương. Tuy nhiên, vấn đề này vẫn còn đang được
tranh cãi.
GlcNAc được bổ sung vào thức ăn ở Nhật Bản (Mustapayta, 2006). Nó cùng với
GlcN được tổng hợp trong tất cả sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm sợi, thực
vật và động vật. Ở người, GlcN và GlcNAc kết hợp với glucose tạo thành đơn vị
disaccharide trong glycosaminoglycan (như acid hyaluronic, chất nền chondroitin, chất
nền karatan) cần thiết cho sự duy trì sức khỏe của xương sụn và chức năng của các
khớp xương.
2.2.5.2. Chitosan
Chitosan là chất hữu cơ, không tan trong nước, có chứa nhóm amin linh động.
Ổn định dưới tác động của bức xạ, có khả năng hấp thụ cao chất béo và kim loại nặng.
Chitosan một polymer mạch thẳng có cấu tạo dạng chuỗi, thành phần chủ yếu là
các monomer GlcNAc hoặc GlcN nối với nhau bằng liên kết 1,4 glucosid. Chitosan là
dẫn xuất đề acetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị
trí C(2). Chitosan có thể phản ứng với alkil, acetyl, sulpite và carboxylic.

Hình 2.8 Cấu trúc hóa học chitosan

(http://commons/thumb/b/bb/Chitosan_Synthese.svg/
712px-Chitosan_Synthese.svg.png).

Chitosan được sử dụng để xử lý nước, bảo quản thực phẩm, bổ sung vào chế độ
ăn, ứng dụng trong nông nghiệp, thẩm mỹ, công nghệ bột giấy và y dược (Sandford, 2002).
9


Chúng có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, có khả năng tự phân hủy sinh học cao,
không gây dị ứng, không gây độc hại cho người và gia súc.
2.2.5.3. Chitooligosaccharide
Chitooligosaccharide là một hemo- hay heterooligomer của GlcNAc hay GlcN
nối với nhau bằng liên kết β-1,4 glucosid. Nó có tác dụng kháng vi sinh, kháng nấm,
chống độc và tác động miễn dịch (Kim và Rajapakse, 2005).
2.3. Sơ lược về hệ enzyme phân hủy chitin
2.3.1. Định nghĩa
Enzyme phân hủy chitin là những enzyme có khả năng thủy phân liên kết 1,4-βglucosid giữa các N-acetyl-β-D-glucosaminide của chitin hoặc chitooligomers.

Hình 2.9 Vị trí cắt của hệ enzyme phân hủy chitin.
(http://Yeast_Beta_Glucan_Structure.Par.0001.Image.589.gif).

2.3.2. Phân loại
2.3.2.1. Phân loại dựa theo sản phẩm tạo thành
Sự thủy phân chitin được thực hiện bởi hai loại enzyme:
Một là enzyme chitinase hay poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucoside
glycanohydrolase thuộc nhóm enzyme thủy phân (Hydrolase) gồm endochtinase và
exochitinase xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết 1,4-β-glucosid trong chitin. Nó
phân cắt dọc theo mạch carbon và sản phẩm tạo thành chủ yếu là chitobiose và
chitotriose.
Hai là chitobiase thuộc nhóm enzyme thủy phân, tiếp tục phân hủy

chitobiose hay chitotriose thành các monomer GlcNAc (Roberts và Selitrennikoff,

10


1988; Botha và cộng sự, 1998; Souza và cộng sự, 2003; Ruiz-Sánchez và cộng sự,
2005; Suginta và cộng sự, 2005).
Endoglucanase và exoglucanase phân hủy nối 1,4-β-glucosid tạo ra các phân tử đường.
Mã số của enzyme phân hủy chitin: EC 3.2.1.14.
Mã số của chitobiase là: EC 3.2.1.30.
Mã số của endoglucanase là : EC 3.2.1.4 ; exoglucanase là : EC 3.2.1.91
Ngoài ra, các enzyme như pectinase, celulase, lysozyme cũng có khả năng phân
hủy chitin.
2.3.2.2. Phân loại dựa theo trình tự amino acid
Dựa trên sự giống nhau về trình tự amino acid của enzyme phân hủy chitin của
các sinh vật, enzyme phân hủy chitin được chia thành 5 nhóm: I, II, III, IV, V.
Nhóm I: Là những đồng phân enzyme trong phân tử có một đoạn giàu cystein, ở
đầu tận cùng có nhóm amin và vùng xúc tác.
Nhóm II: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có vùng xúc tác tương
tự như các enzyme phân hủy chitin ở nhóm I, thiếu đoạn giàu cystein.
Nhóm III: Là đồng phân enzyme có trình tự sắp xếp khác với enzyme ở nhóm I
và nhóm II, mã hóa cho vùng giàu cystein ở nhóm I.
Nhóm IV: Là những đồng phân có trình tự sắp xếp giống enzyme nhóm I
khoảng 41 – 47 %, trong phân tử cũng có đoạn giàu cystein ở vùng xúc tác.
Nhóm V: Là những đồng phân có trình tự khác với các nhóm khác, có trình tự
mã hóa cho hoạt động kháng nấm (Melchers và cộng sự, 1994)
Năm nhóm này lại được chia vào 2 họ glycosyl hydrolase, họ 18 và 19. Hai họ
glycosyl hydrolase 18 và 19 có cấu trúc khác nhau:
Họ glycosyl hydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn /β cuộn tròn.
Họ glycosyl hydrolase 19 có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn.

Các enzyme phân hủy chitin nhóm I, II và IV có nguồn gốc từ thực vật và thuộc
họ glycosyl hydrolase 19.
Các enzyme phân hủy chitin nhóm III có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật, vi
khuẩn và nấm. Enzyme phân hủy chitin nhóm III và V thuộc họ glycosyl hydrolase 18.
Các enzyme phân hủy chitin nhóm V có nguồn gốc chủ yếu từ vi khuẩn. Chúng
có những chức năng sinh học của enzyme phân hủy chitin và lysozyme của Havea
brasiliensis.
11


Các enzyme phân hủy chitin thuộc họ Glycohydrolase 19 và các chitosanase
thuộc họ Glycohydrolase 46 có một số trình tự đặc biệt tương đồng với các lysozyme
thu nhận từ phage T4.
Các enzyme phân hủy chitin thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các
giống:

Aeromonas

hydrophila,

Bacillus

circularis,

Trichoderma

harzianum,

Aphanocladium album, Serratia marcessen…Một số chủng Streptomyces griseus và
một số thực vật bậc cao như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana),

đậu Hà Lan (Pisum sativum)…sẽ tổng hợp các enzyme phân hủy chitin thuộc họ
Glycohydrolase 19.
Đồng phân enzyme phân hủy chitin thuộc nhóm II được tổng hợp ở cà chua khi
nhiễm nấm bệnh, đồng phân enzyme phân hủy chitin thuộc nhóm I được tổng hợp ở
đậu và thuốc lá khi xử lý ethylene. Cả hai đều được tổng hợp ở thuốc lá khi bị nhiễm
virus khảm thuốc lá. Đồng phân enzyme phân hủy chitin nhóm I và III có mặt bên
ngoài tế bào.
2.3.3. Các nguồn thu nhận enzyme phân hủy chitin
Tất cả sinh vật chứa chitin cấu trúc nên vách tế bào và bộ xương ngoài của
chúng thì đều có enzyme phân hủy chitin. Các sinh vật khác không có chitin cũng có
thể tạo ra enzyme phân hủy chitin làm phân rã polymer tạo thành thực phẩm (Roberts
và Selitrennikoff, 1988).
Enzyme phân hủy chitin hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật. Đến nay đã có
nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về enzyme phân hủy chitin của các
vi sinh vật, thực vật và động vật.
Enzyme phân hủy chitin có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy
nhiên trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta đều cho thêm chitin – cơ chất
của enzyme phân hủy chitin – để làm tăng khả năng tổng hợp enzyme phân hủy chitin.
Vi khuẩn tổng hợp enzyme phân hủy chitin nhằm phân giải chitin trong môi trường tạo
nguồn carbon cho vi khuẩn sinh trưởng, phát triển.
Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa
của nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt, ta có
thể thu nhận được enzyme phân hủy chitin. Đối với động vật có xương sống, enzyme
phân hủy chitin được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò
sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ.
12


Enzyme phân hủy chitin ở thực vật được tổng hợp nhằm mục đích chống lại các
nấm ký sinh gây bệnh cho cây trồng. Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enzyme

phân hủy chitin: thuốc lá (Nacotiana sp.), cà rốt, hạt đậu nành… và đặc biệt một số loài
tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme phân hủy chitin.
2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của chitinase
Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu cho enzyme phân hủy chitin ở vi sinh vật hoạt động
là 40oC, ngoại trừ Aspergillus niger tổng hợp enzyme phân hủy chitin hoạt động trên cơ
chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 50oC.
Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà enzyme phân hủy chitin có thể có
những nhiệt độ ưu khác nhau.
Các enzyme phân hủy chitin thực vật thuộc nhóm III. Enzyme phân hủy chitin từ
Bacillus licheniformis phân lập trong suối nước nóng cho thấy có khả năng chịu đựng
nhiệt độ cao đến 80oC. Enzyme phân hủy chitin từ côn trùng (tằm…) không ổn định ở
nhiệt độ 40oC vì côn trùng phát triển ở nhiệt độ 25oC. Do đó, nhiệt độ tối ưu của
enzyme phân hủy chitin côn trùng không cao. Côn trùng thủy phân chitin trong suốt
quá trình lột xác, trong khi đó thực vật phân hủy chitin của các sinh vât khác như mầm
bệnh và vật ký sinh.
Theo P.Jollès và R.A.A.Muzzarelli (1999), enzyme phân hủy chitin do côn trùng
tổng hợp thường có kích thước lớn hơn enzyme phân hủy chitin do thực vật tổng hợp,
chính kích thước nhỏ và mật độ dày đặc của enzyme phân hủy chitin có thể làm cho
tính ổn định nhiệt tăng lên. Do đó, nhiệt độ tối ưu có liên quan mật thiết đến tính ổn
định của enzyme phân hủy chitin.
2.3.5. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của chitinase
Giá trị pH tối ưu của enzyme phân hủy chitin từ 4 – 9 đối với các enzyme ở thực
vật bậc cao và tảo, ở thú là 4,8 – 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5 – 8,0.
Theo các nhà khoa học, pH tối thích của enzyme phân hủy chitin có thể có sự
phụ thuộc vào cơ chất đựợc sử dụng. Đa số các enzyme phân hủy chitin đã được nghiên
cứu có pHop khoảng 5,0 khi cơ chất là chitin, enzyme phân hủy chitin của Streptomyces
griceus có pHop khoảng 6,3, Alteromonas sp. dòng O-7 (Tsujibo, H.Y. và cộng sự,
1993) có pHop khoảng pH kiềm và Bacillus sp. LJ-25 thuộc khoảng pH trung tính. Tùy
mục đích phân tích, những cơ chất hòa tan như glycol chitin và N-acetyl

13