NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH CÔN TRÙNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC GÂY CHẾT SÂU XANH CỦA CÁC LOÀI TUYẾN TRÙNG NHÂN NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI TUYẾN TRÙNG
KÝ SINH CÔN TRÙNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC GÂY CHẾT SÂU XANH CỦA
CÁC LOÀI TUYẾN TRÙNG NHÂN NUÔI

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ HỒNG THỦY
Niên khóa : 2005 – 2009

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 7/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI TUYẾN TRÙNG
KÝ SINH CÔN TRÙNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC GÂY CHẾT SÂU XANH CỦA
CÁC LOÀI TUYẾN TRÙNG NHÂN NUÔI

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

PHAN THỊ HỒNG THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 7/2009


LỜI CẢM ƠN
Xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS. Lê Đình Đôn, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ
dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Ks. Trần Ngọc Hùng đã tận tình hướng dẫn và giúp đõ tôi trong thời gian thực
tập hoàn thành kháo luận.
Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp
giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
Các anh chị phụ trách phòng 118 và 105 Khu Phượng Vỹ thuộc Bộ Môn Bảo
Vệ Thực Vật - Đại học Nông Lâm TP. HCM.
Bạn Trần Phú Duy và những người đã luôn ở bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi
hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình.
Các cô chú nông dân đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài.
Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và
động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tháng 07 năm 2009
Phan Thị Hồng Thủy

iii


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu môi trường nhân nuôi tuyến trùng ký sinh côn trùng trong
phòng thí nghiệm và đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của các loài tuyến trùng nhân
nuôi” được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học – Trường Đại Học Nông Lâm
Tp. Hồ Chí Minh từ tháng 3/2009 đến tháng 8/2009 trên đối tượng là tuyến trùng
Entomopathogenic nematodes (EPNs) được bắt bằng bẫy đặt tại vườn rau thuộc huyện
Củ Chi – Tp. Hồ Chí Minh.
Mục đích của đề tài là nghiên cứu các môi trường nhân số lượng lớn tuyến trùng
kí sinh gây bệnh côn trùng, đánh giá hiệu lực gây chết côn trùng của tuyến trùng được
nhân nuôi và tiến hành thử nghiệm việc nhân nuôi EPNs trong bioreactor nhằm tìm ra
phương pháp nhân nuôi và các điều kiện tối ưu cho việc nhân số lượng lớn EPNs.
Đề tài bao gồm ba nội dung chính: Nhân nuôi tuyến trùng ký sinh gây hại côn
trùng trên 5 công thức môi trường rắn và 4 công thức môi trường lỏng thử nghiệm;
Đánh giá hiệu lực gây chết của tuyến trùng sau khi nuôi cấy trong các môi trường nhân
tạo trên sâu xanh và thử nghiệm nhân nuôi tuyến trùng ký sinh gây hại côn trùng trong
2 loại bireactor tự thiết kế: sử dụng máy lắc và sục khí. Kết quả nhân nuôi thành công
những loài tuyến trùng kí sinh côn trùng được thử nghiệm trên cả hai loại môi trường
rắn và lỏng, với sản lượng cao nhất gần 2 triệu EPNs/ bình nuôi cấy. Độc lực của
tuyến trùng nhân nuôi bằng các môi trường sau 3 ngày chủng tuyến trùng lên đất có sự
khác biệt, các loài tuyến trùng nhân nuôi bằng các công thức môi tường lỏng có độc
lực mạnh hơn các loài tuyến trùng nhân nuôi bằng các công thức môi trường rắn. Sau
6 ngày chủng, mức độ nhộng bị ký sinh bởi tuyến trùng nhân nuôi bằng các công thức
môi trường hơn 90%. Các bình môi trường nuôi bằng cách sục khí cho kết quả tốt hơn
các bình môi trường dùng phương pháp lắc. Kết quả cao nhất trong 6 bình môi trường
sục khí đạt được là 1,9 triệu EPNs/ bình môi trường và thời gian tuyến trùng tồn tại
trong các bình này lâu hơn phương pháp thông thường là 5 – 10 ngày.

iv


SUMARY
The thesis titled “Reseach on the medium culture of Entompathogenic
Nematodes in laboratory and evaluation on the pathogenicity of EPNs are cultured by
using Heliothis Armigera” was carried out at Faculty of Biotechnology – Nong Lam
University, HCMC from March 2009 to August 2009. The object of study is
Entompathogenic nematodes which were trapped in the farm at Cu Chi district.
The purpose of thesis is reseach on the medium culture a large EPNs, evaluation
on the pathogenicity of EPNs were cultured, culture EPNs in bioreactor in order to
finding the best condition and the best method for culture EPNs.
The thesis contents three experiments: Using five formulae of the solid media and four
formulae of the liquid media cultured Entompathogenic nematodes; Assessment of the
EPNs’ pathogenicity that were cultured in the artificial medium and culture
Entompathogenic nematodes in the two kind of bioreactor: shacking and irruption
bioreactor.
Entompathogenic nematodes best grow in the third solid medium and the ninth
solid medium. Only the strain Heterorhabditis of nematodes can survive in the our
media. In a solid medium, the best result was nearly two million EPNs and a number
of EPNs approximately 1,6 millions individuals in a liquid medium one. The largest
number of EPNs was harvested from seventh to ninth day of nematodes’ growing.
When concerning Entompathogenic nematodes, the different medium culture, the
different pathogenic expression they were. Pathogenic EPNs, was cultured in liquid
medium, present a higher level of growing than the others living in solid medium.
After six days applying EPNs in the farm, over 90 percents larvae in the soil was
destroyed by our nematodes. The growing of EPNs in the irrupted medium bottle, was
better than the shacking medium bottle. Among of six bottles gives the large a number
of EPNs, over two million individuals in a bottle.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................. ...iii
TÓM TẮT......................................................................................................................iv
SUMARY................................................................................................................... ....v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT...........................................................................ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG............................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..........................................................................................xii
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề............................................................................................................ …1
1.2.Mục đích và yêu cầu..................................................................................................3
1.2.1.Mục đích.................................................................................................................3
1.2.2.Yêu cầu...................................................................................................................3
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Entomopathogenic nematodes (EPNs)..............................................4
2.2.Vi khuẩn cộng sinh....................................................................................................6
2.2.1. Phân loại vi khuẩn và quá trình đồng tiến hóa với tuyến trùng............................7
2.2.2. Sự quan trọng của các vi khuẩn cộng sinh............................................................7
2.3. Đặc tính của giai đoạn cảm nhiễm (IJ)........ ............................................................9
2.3.1. Sự phân tán

........................................................................................................9

2.3.2. Quá trình tìm kiếm vật chủ ................................................................................10
2.3.3. Nhận diện vật chủ................................................................................................11
2.3.4. Đặc tính cảm nhiễm.............................................................................................12
2.4. Sự phân bố địa lý....................................................................................................13

2.5. Nuôi cấy tăng sinh tuyến trùng...............................................................................13
2.5.1. Nhân nuôi tuyến trùng bằng phương pháp in vivo..............................................14
2.5.2. Nhân nuôi tuyến trùng bằng phương pháp in vitro.............................................16
2.5.2.1. IJ trong sản xuất in vitro...................................................................................16
2.5.2.2 Nhân sinh EPNs bằng môi trường rắn ..............................................................17
2.5.2.3. Nhân sinh EPNs bằng môi trường lỏng............................................................18
2.6. Một vài ứng dụng của EPNs đã được thực hiện.....................................................23
vi


2.6.1. Sâu bướm hại bông vải........................................................................................23
2.6.2. Loài dế dũi...........................................................................................................23
2.6.3. Bướm ngài đêm...................................................................................................24
2.6.4. Sâu hại cam quýt.................................................................................................24
Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu.........................................................25
3.1.1. Thời gian nghiên cứu...........................................................................................25
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu...........................................................................................25
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................25
3.2. Nội dung nghiên cứu..............................................................................................25
3.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm.............................................................................25
3.3.1. Dụng cụ và thiết bị..............................................................................................25
3.3.2. Hóa chất sử dụng.................................................................................................25
3. 4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................26
3.4.1. Bắt mẫu tuyến trùng............................................................................................26
3.4.2. Nhân tăng sinh tuyến trùng bằng nhộng sâu xanh ..............................................26
3.4.3. Nhân sinh tuyến trùng bằng môi trường rắn và môi trường lỏng........................27
3.5. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của tuyến trùng trên vườn rau......................27
3.6. Bước đầu nhân số lượng tuyến trùng bằng bioreactor............................................28
Chương 4 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

4.1. Nhân sinh số lượng EPNs trong các môi trường rắn..............................................29
4.1.1. Qúa trình phát triển của EPNs trong các môi trường rắn ...................................29
4.1.1.1. Giai đoạn thích nghi.........................................................................................29
4.1.1.2. Giai đoạn phát triển số lượng...........................................................................30
4.1.1.3. Giai đoạn suy giảm...........................................................................................31
4.1.2. Đánh giá khả năng phát triển của EPNs trong các môi trường rắn.....................33
4.1.2.1. So sánh sản lượng EPNs nuôi trong các môi trường rắn..................................33
4.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ nuôi cấy ban đầu lên sản lượng tuyến trùng.............35
4.2 Nhân sinh số lượng EPNs trong các môi trường lỏng.............................................38
4.2.1. Quá trình phát triển của EPNs trong các môi trường lỏng..................................38
4.2.1.1. Giai đoạn thích nghi.........................................................................................38
vii


4.2.1.2. Giai đoạn phát triển số lượng...........................................................................39
4.2.1.3. Giai đoạn suy giảm...........................................................................................41
4.2.2. Đánh giá khả năng phát triển của EPNs trong các môi trường lỏng...................41
4.2.2.1.So sánh sản lượng EPNs nuôi trong các môi trường lỏng.................................41
4.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ EPNs chủng ban đầu lên sản lượng EPNs................44
4.3. Hình thái giống và loài EPNs được nuôi trong các môi trường nhân tạo...............46
4.4. Bước đầu nghiên cứu nhân sinh tuyến trùng EPNs trong bioreactor.....................48
4.4.1 Sử dụng máy lắc...................................................................................................48
4.4.2. Bioreactor sục khí................................................................................................49
4.5. Đánh giá hiệu lực gây chết côn trùng của tuyến trùng nuôi...................................50
4.5.1. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của EPNs nuôi trong môi trường rắn........50
4.5.2. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của EPNs nuôi trong môi trường lỏng......53
4.6. Thảo luận………………………………………………..…………………………………53
Chương 5 THẢO LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận..................................................................................................................57
5.2. Đề nghị...................................................................................................................57

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................58
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ĐHNL: Đại học Nông Lâm
EPNs : Entomopathogenic nematodes (Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng).
Js

: Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juveniles)

J1- J5 : Các giai đoạn phát triển của EPNs (Juvenile stages)
TN

: Thí nghiệm

VKCS : Vi khuẩn cộng sinh

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các mối quan hệ đặc trưng của tuyến trùng- vi khuẩn....................................8
Bảng 2.2 Một vài đặc tính được kiểm tra của các loài Steinernema.............................10
Bảng 4.1 Sản lượng tuyến trùng trong các bình môi trường rắn qua………................34
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chủng ban đầu lên sản lượng EPNs……........37
Bảng 4.3 Sản lượng tuyến trùng trong các bình môi trường lỏng……………….........42
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chủng ban đầu lên sản lượng EPNs……........45

Bảng 4.5 Hiệu lực gây chết sâu xanh của EPNs nuôi trong môi trường rắn….............51
Bảng 4.6 Hiệu lực gây chết sâu xanh của EPNs nuôi trong môi trường lỏng……......55

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
DANH SÁCH CÁC BẢNG............................................................................................x ........vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..........................................................................................xii ........vi
3.5. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của tuyến trùng trên vườn rau......................27.......vii
4.1. Nhân sinh số lượng EPNs trong các môi trường rắn..............................................29.......vii
4.1.1. Qúa trình phát triển của EPNs trong các môi trường rắn
4.1.1.3. Giai đoạn suy giảm

...................................29 ....vii

...........................................................................................31 ...vii

4.1.2. Đánh giá khả năng phát triển của EPNs trong các môi trường rắn.....................33 .......vii
4.1.2.1. So sánh sản lượng EPNs nuôi trong các môi trường rắn..................................33.......vii
4.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ nuôi cấy ban đầu lên sản lượng tuyến trùng.............35 .......vii
4.2 Nhân sinh số lượng EPNs trong các môi trường lỏng.............................................38.......vii
4.2.1. Quá trình phát triển của EPNs trong các môi trường lỏng..................................38 .......vii
4.2.2. Đánh giá khả năng phát triển của EPNs trong các môi trường lỏng...................41 ......viii
4.2.2.1.So sánh sản lượng EPNs nuôi trong các môi trường lỏng.................................41......viii
4.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ EPNs chủng ban đầu lên sản lượng EPNs................44 ......viii
4.3. Hình thái giống và loài EPNs được nuôi trong các môi trường nhân tạo...............46......viii
4.5. Đánh giá hiệu lực gây chết côn trùng của tuyến trùng nuôi...................................50 ......viii
4.5.1. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của EPNs nuôi trong môi trường rắn........50......viii
4.5.2. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của EPNs nuôi trong môi trường lỏng......53......viii

4.6. Thảo luận………………………………………………..…………………………………53......viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................................xi
Chương 1 ................................................................................................................................... 1
1. 1.ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................... 1
1.2.MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU ............................................................................................... 3
1.2.2. Yêu cầu ............................................................................................................................ 3
xi


Chương 2 ................................................................................................................................... 4
2.1. Tổng quan về Entomopathogenic nematodes (EPNs)...................................................... 4
Hình 2.1 Vòng đời đơn giản của EPNs (Steinernema spp, Heterorhabditis spp) (J. Adams và
B. Khuong, 2002). ...................................................................................................................... 5
2.2. Vi khuẩn cộng sinh ............................................................................................................ 6
2.2.1. Phân loại vi khuẩn và quá trình đồng tiến hóa với tuyến trùng ............................... 7
2.2.2. Sự quan trọng của các vi khuẩn cộng sinh................................................................... 7
2.3. Đặc tính của giai đoạn cảm nhiễm (IJ)............................................................................ 9
2.3.1. Sự phân tán ..................................................................................................................... 9
2.3.2. Quá trình tìm kiếm vật chủ ......................................................................................... 10
2.3.3. Nhận diện vật chủ ......................................................................................................... 11
Glazer và E.Lewis (2000) nghiên cứu đặc tính xâm nhiễm của loài S. carpocapsae IJs bằng
ghi nhận những phản ứng của chúng trong quá trình xâm nhiễm nhộng bướm ong sáp
G.mellonella và ghi nhận quá trình tấn công vào lớp biểu bì của 9 con nhộng đem thử nghiệm.
Và một lần nữa ông nhận định rằng có sự khác nhau trong quá trình tấn công vào côn trùng
với những vật chủ khác nhau của những loài tuyến trùng khác nhau được nghiên cứu...........12
2.3.4. Đặc tính cảm nhiễm...................................................................................................... 12
2.4. Sự phân bố địa lý ............................................................................................................. 12
2.5. Nuôi cấy tăng sinh tuyến trùng ...................................................................................... 13
2.5.1. Nhân nuôi tuyến trùng bằng phương pháp in vivo.................................................... 13

2.5.2. Nhân nuôi tuyến trùng bằng phương pháp invitro.................................................... 15
2.5.2.1. Giai đoạn IJs trong sản xuất invitro......................................................................... 15
2.5.2.2 Nhân sinh EPNs bằng môi trường rắn hoặc bán rắn.............................................. 16
2.5.2.3. Nhân sinh EPNs bằng môi trường lỏng ................................................................... 17
2.6. Một vài ứng dụng của EPNs đã được thực hiện ........................................................... 22
2.6.1. Sâu bướm hại bông vải................................................................................................. 22
2.6.2. Loài dế dũi..................................................................................................................... 23
2.6.4. Sâu hại cam quýt .......................................................................................................... 23
Chương 3 ................................................................................................................................. 25
xii


3.1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu ............................................................... 25
3.1.1. Thời gian nghiên cứu.................................................................................................... 25
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu..................................................................................................... 25
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................... 25
3.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................................ 25
Tuyến trùng EPNs sau khi được bẫy mang về phòng thí nghiệm được tiến hành: .................. 25
1. Nhân sinh số lượng tuyến trùng bằng nhộng sâu xanh......................................................... 25
3.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ..................................................................................... 25
3.3.1. Dụng cụ và thiết bị........................................................................................................ 25
Đĩa Petri, que gắp tuyến trùng, kẹp, giấy lọc, kéo, lọ đựng nhỏ, bình tam giác, kính hiển vi,
kính lúp, cốc nhựa, đèn cồn, lam và lamen, pipet. ...................................................................25
Autoclave, máy lắc, máy sục khí.............................................................................................. 25
3.3.2. Hóa chất sử dụng .......................................................................................................... 25
3. 4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 26
3.4.1. Bắt mẫu tuyến trùng .................................................................................................... 26

 Cách đặt bẫy bắt tuyến trùng và thu bẫy ........................................................................ 26
3. 4.2. Nhân tăng sinh tuyến trùng bằng nhộng sâu xanh................................................... 26

3.4.3. Nhân sinh tuyến trùng bằng môi trường rắn và môi trường lỏng ........................... 27
3.5. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của tuyến trùng trên vườn rau......................... 27
4.1. Nhân sinh số lượng EPNs trong các môi trường rắn ................................................... 29
4.1.1. Qúa trình phát triển của EPNs trong các môi trường rắn ....................................... 29
Hình 4.1 Sự gia tăng số lượng cá thể EPNs trong các bình môi trường rắn được nuôi cấy sau
2 ngày ở điều kiện nhiệt độ 25 – 28oC. ....................................................................................29
4.1.1.2. Giai đoạn phát triển số lượng................................................................................... 30
Hình 4.2 Sự gia tăng số lượng cá thể EPNs trong các bình môi trường rắn sau 4 ngày nuôi cấy
ở điều kiện nhiệt độ: 25 – 28oC và ẩm độ :70 – 80%).............................................................30
4.1.1.3. Giai đoạn suy giảm .................................................................................................... 31

xiii


.......... 32
Hình 4.5 Ba giai đoạn phát triển của EPNs trong 5 môi trường rắn 1, 3, 5, 7 và 9 ở nồng độ
chủng 800 IJs/ ml...................................................................................................................... 32
4.1.2. Đánh giá khả năng phát triển của EPNs trong các môi trường rắn ........................ 33
4.1.2.1. So sánh sản lượng EPNs nuôi trong các môi trường rắn....................................... 33
Các số liệu là số lượng EPNs được ghi nhận và đánh giá theo từng ngày phát triển của tuyến
trùng trong các môi trường. Có 5 môi trường rắn được đem thử nghiệm với 3 nghiệm thức
khác nhau (được đánh số theo thứ tự là MT1, MT3, MT5, MT7, và MT9)............................. 33
Môi trường rắn 3 và 9 là hai môi trường cho kết quả nghiên cứu khá tốt. Mật độ tối ưu mà
EPNs có thể đạt được trong môi trường rắn 3 là khoảng 1 triệu 800 ngàn EPNs / bình môi
trường nuôi ở điều kiện nuôi cấy tối ưu (nhiệt độ phòng 25 - 28oC). Môi trường rắn 9 cho kết
quả cao hơn, vào ngày thứ 8 hoặc thứ 9 của quá trình nuôi, mật độ EPNs có thể thu được
trong môi trường này lên tới 2 triệu EPNs / bình nuôi cấy. Ở nồng độ chủng ban đầu là 800
EPNs/ ml, có những bình theo dõi có số lượng có thể hơn 2 triệu EPNs/ bình. ......................33
4.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ nuôi cấy ban đầu lên sản lượng tuyến trùng được nuôi
bằng các công thức môi trường rắn ...................................................................................... 35

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ dịch nuôi cấy ban đầu lên sản lượng của EPNs trong các
bình môi trường qua từng ngày ................................................................................................36
4.2 Nhân sinh số lượng EPNs trong các môi trường lỏng ................................................... 37
4.2.1. Quá trình phát triển của EPNs trong các môi trường lỏng ...................................... 37
Hình 4.8 Sự gia tăng số lượng cá thể EPNs trong các bình môi trường lỏng sau 4 ngày nuôi
cấy ở nhiệt độ 25 – 28oC. .........................................................................................................39

xiv


Hình 4.10. Sự giảm số lượng cá thể EPNs trong các bình môi trường lỏng sau 12 -20 ngày
nuôi cấy ở nhiệt độ 25 – 28oC. .................................................................................................40
4.2.2. Đánh giá khả năng phát triển của EPNs trong các môi trường lỏng....................... 41
4.2.2.1 So sánh sản lượng EPNs nuôi trong các môi trường lỏng ...................................... 41
Bảng 4.3 Sản lượng tuyến trùng trong các bình môi trường lỏng qua từng ngày (nhiệt độ 25 –
28oC .......................................................................................................................................... 42
4.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ dịch EPNs chủng ban đầu lên sản lượng tuyến trùng
nuôi trong các môi trường lỏng ............................................................................................. 43
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ dịch nuôi cấy ban đầu lên sản lượng của EPNs trong các
bình môi trường qua từng ngày ................................................................................................44
4.3. Hình thái giống và loài EPNs được nuôi trong các môi trường nhân tạo .................. 45
4.4. Bước đầu nghiên cứu nhân sinh tuyến trùng EPNs trong bioreactor ........................ 47
4.4.1. Sử dụng máy lắc............................................................................................................ 47
Chúng tôi đã tiến hành sử dụng máy lắc với tốc độ lắc rất thấp (khoảng 20 vòng/ phút) nhằm
khuếch tán oxi có trong không khí vào dung dịch và loại bỏ khí.............................................47
cacbonic trong dung dịch, cân bằng nồng độ khí trong môi trường nuôi cấy. ......................... 48
Hình 4.17 EPNs nuôi bằng phương pháp sử dụng máy lắc (tốc độ lắc 20 vòng/ phút, nhiệt độ
25 – 28oC)................................................................................................................................. 48
4.4.2. Bioreactor sục khí......................................................................................................... 48
4.5. Đánh giá hiệu lực gây chết côn trùng của tuyến trùng nuôi bằng các môi trường

nhân tạo trên mô hình thử nghiệm ....................................................................................... 49
4.5.2. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh (Helicoverpa armigera) của tuyến trùng nuôi
trong các bình môi trường lỏng............................................................................................. 53
5.1. Kết luận ............................................................................................................................ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................... 58
Tiếng Việt ................................................................................................................................ 58
PHỤ LỤC ................................................................................................................................ 66
Coefficient of Variation: 22.83% .............................................................................................66
RANGE1 .................................................................................................................................. 66
Coefficient of Variation: 19.81% .............................................................................................67
xv


RANGE1 .................................................................................................................................. 67
Coefficient of Variation: 22.77% .............................................................................................67
Coefficient of Variation: 9.60% ...............................................................................................68
RANGE1 .................................................................................................................................. 68
Coefficient of Variation: 10.52% .............................................................................................69
RANGE1 .................................................................................................................................. 69
Coefficient of Variation: 9.22% ...............................................................................................69
RANGE1 .................................................................................................................................. 70
Coefficient of Variation: 8.50% ...............................................................................................70
RANGE1 .................................................................................................................................. 70
Coefficient of Variation: 11.54% .............................................................................................71
RANGE1 .................................................................................................................................. 71
Coefficient of Variation: 14.59% .............................................................................................72
RANGE1 .................................................................................................................................. 72
Coefficient of Variation: 16.73% .............................................................................................72
RANGE1 .................................................................................................................................. 72
Coefficient of Variation: 19.74% .............................................................................................73

RANGE1 .................................................................................................................................. 73
Coefficient of Variation: 22.17% .............................................................................................74
RANGE1 .................................................................................................................................. 74
Coefficient of Variation: 40.23% .............................................................................................74
RANGE1 .................................................................................................................................. 74
Coefficient of Variation: 27.57% .............................................................................................75
RANGE1 .................................................................................................................................. 75
Coefficient of Variation: 20.45% .............................................................................................76
Coefficient of Variation: 21.37% .............................................................................................76
Coefficient of Variation: 26.28% .............................................................................................77
xvi


RANGE1 .................................................................................................................................. 77
Coefficient of Variation: 43.42% .............................................................................................78
Coefficient of Variation: 20.86% .............................................................................................78
Coefficient of Variation: 19.96% .............................................................................................79
Coefficient of Variation: 19.48% .............................................................................................80
Coefficient of Variation: 15.04% .............................................................................................80
RANGE1 .................................................................................................................................. 80
Coefficient of Variation: 21.52% .............................................................................................81
RANGE1 .................................................................................................................................. 81
Coefficient of Variation: 15.26% .............................................................................................82
RANGE1 .................................................................................................................................. 82
Coefficient of Variation: 17.16% .............................................................................................82
RANGE1 .................................................................................................................................. 82
Coefficient of Variation: 15.96% .............................................................................................83
RANGE1 .................................................................................................................................. 83
Coefficient of Variation: 10.64% .............................................................................................84
RANGE1 .................................................................................................................................. 84

Coefficient of Variation: 9.69% ...............................................................................................84
RANGE1 .................................................................................................................................. 84
Coefficient of Variation: 28.92% .............................................................................................85
RANGE1 .................................................................................................................................. 85
Coefficient of Variation: 17.25% .............................................................................................86
RANGE1 .................................................................................................................................. 86
Coefficient of Variation: 11.08% .............................................................................................86
Coefficient of Variation: 28.24% .............................................................................................87
Coefficient of Variation: 19.88% .............................................................................................87
RANGE1 .................................................................................................................................. 87
xvii


Coefficient of Variation: 22.36% .............................................................................................88
RANGE1 .................................................................................................................................. 88
Coefficient of Variation: 21.33% .............................................................................................89
RANGE1 .................................................................................................................................. 89
Coefficient of Variation: 20.19% .............................................................................................89
RANGE1 .................................................................................................................................. 89
Coefficient of Variation: 24.19% .............................................................................................90
RANGE1 .................................................................................................................................. 90
Coefficient of Variation: 25.06% .............................................................................................91
RANGE1 .................................................................................................................................. 91
Coefficient of Variation: 16.76% .............................................................................................91
RANGE1 .................................................................................................................................. 91
Coefficient of Variation: 27.81% .............................................................................................92
RANGE1 .................................................................................................................................. 92

Hình 2.1 Vòng đời đơn giản của EPNs (Steinernema và Heterorhabditis )...................5
Hình 2.2 Quá trình xâm nhiễm của IJs loài Steinernema carpocapsae…....................12

Hình 2.3 Sự di chuyển của IJs ra ngoàiđĩa Petri...........................................................14
Hình 2.4 Qui trình sản xuất và thương mại tuyến trùng EPNs.....................................20
Hình 2.5 Chi tiết vòng đời của Heterorhabditis s.........................................................22
Hình 3.1 Sơ đồ một ô vuông đặt bẫy nhộng thử nghiệm..............................................28
Hình 4.1 Sự gia tăng số lượng cá thể EPNs sau 2 ngày ở môi trường rắn…...............29
Hình 4.2 Sự gia tăng số lượng cá thể EPNs ở môi trường rắn sau 4 ngày...................30
Hình 4.3 Sự gia tăng số lượng cá thể EPNs ở môi trường rắn sau 8 ngày...................31
Hình 4.4 Sự giảm số lượng EPNs ở môi trường rắn nuôi trong………………….......32
Hình 4.5 Ba giai đoạn phát triển của EPNs trong các môi trường rắn ........................32
Hình 4.6 Ba giai đoạn phát triển của EPNs trong các môi trường lỏng.......................38
Hình 4.7 Sự gia tăng số lượng cá thể EPNs ở môi trường lỏng sau 2 ngày.................39
Hình 4.8 Sự gia tăng số lượng cá thể EPNs ở môi trường lỏng sau 4 ngày.................40
Hình 4.9 Sự gia tăng số lượng cá thể EPNs ở môi trường lỏng sau 7 -10 ngày...........40
xviii


Hình 4.10 Sự giảm số lượng cá thể EPNs ở môi trường lỏng sau 12 -20 ngày............41
Hình 4.11 Cá thể cái loài Heterorhabditis spp1...........................................................46
Hình 4.12 Cá thể đực loài Heterorhabditis spp1..........................................................46
Hình 4.13 Cá thể cảm nhiễm loài Heterorhabditis spp1..............................................47
Hình 4.14 Cá thể cái loài Heterorhabditis spp2...........................................................47
Hình 4.15 Cá thể đực loài Heterorhabditis spp2..........................................................47
Hình 4.16 Cá thể cảm nhiễm loài Heterorhabditis spp2..............................................47
Hình 4.17 EPNs nuôi bằng phương pháp sử dụng máy lắc..........................................48
Hình 4.18 Thiết kế bioreactor kiểu sục khí..................................................................48
Hình 4.19 Thí nghiệm đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của EPNs........................50
Hình 4.20 Sự phân bố nhộng bị kí sinh bởi EPNs sau 3 ngày chủng ........................52
Hình 4.21 Sự phân bố nhộng bị kí sinh trong các ô sau 6 ngày chủng........................53
Hình 4.22 Thử nghiệm hiệu lực của EPNs đối với nhộng sâu xanh………….………...53

xix


Chương 1
MỞ ĐẦU
1. 1.ĐẶT VẤN ĐỀ
Những năm gần đây, sử dụng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp mang lại lợi
ích kinh tế to lớn, song việc lạm dụng thuốc đã gây ra những hậu quả nghiêm trọng
cho sức khoẻ cộng đồng, gây ô nhiễm môi trường, tiêu diệt nhiều loại động vật có ích,
từ đó làm phát sinh nhiều bệnh dịch do sâu hại kháng thuốc và do không còn thiên
địch trên đồng ruộng để đảm nhận chức năng tự nhiên là hạn chế sâu hại phát triển
thành dịch. Trước thực tế đó, nhu cầu cấp bách là phải nghiên cứu các chế phẩm sinh
học có khả năng thay thế, hoặc giảm thiểu thuốc hoá học, tiến tới xây dựng nền nông
nghiệp sinh thái không sử dụng hóa chất, duy trì sự cân bằng tự nhiên.
Trong các giải pháp sinh học, tuyến trùng EPNs (viết tắt tên tiếng Anh
entomopathogenic nematodes - nhóm tuyến trùng ký sinh và gây bệnh cho côn trùng)
được coi là tác nhân có nhiều triển vọng bởi có nhiều ưu thế như: có khả năng ký sinh
và gây bệnh cho nhiều sâu hại khác nhau; an toàn cho người, động thực vật và môi
trường; sâu hại không có khả năng kháng với tổ hợp ký sinh gây bệnh; có khả năng
sản xuất sinh khối lớn bằng công nghệ nhân nuôi in vivo và in vitro; dễ dàng ứng dụng
trong phòng trừ sâu hại bằng các thiết bị phun thuốc chuẩn đang được sử dụng cho
thuốc hóa học; có thể tương hợp (dùng chung) với nhiều loại thuốc hóa học, phân bón
hoặc hệ thống tưới tiêu tự nhiên; có khả năng tìm diệt sâu hại trong vòng 48 giờ; tồn
tại lâu trong đất và nhân nhanh số lượng khi có sâu hại nên chỉ cần phun một lần cho
cả quá trình dài và dễ dàng tuyển chòn di truyền để tạo ra các chủng tốt như mong
muốn. Các thuốc sinh học EPN cho đến nay chỉ có lợi, vô hại nên được miễn đăng ký
sử dụng ở Mỹ, Châu Âu và nhiều nước khác (Nguyễn Ngọc Châu, 2008; Dương Ngọc
Hoa, 2007).
Việc sử dụng tuyển trùng như một yếu tố điều khiển sinh học tiêu diệt côn
trùng có hại đang ngày càng tăng lên nhanh chóng từ hai thập kỉ trước tới nay. Các nhà

khoa học, nghiên cứu, trồng trọt trên thế giới ngày đang có xu hướng dùng tuyến trùng
để chống lại các loại sâu hại, động vật thân mềm, tuyến trùng hại thực vật, và các sinh
1


vật gây hại có trong đất. Tuyến trùng kí sinh động vật (EPNs) (Steinernema và
Heterorhabditis) và tuyến trùng kí sinh sên (Phasmarhabditis) đã được áp dụng rất
thành công và đang được nhân sinh khối một cách rộng rãi để thương mại sản phẩm
trên rất nhiều lục địa để giải quyết các vấn đề trong nông nghiệp, cây trồng, vật nuôi
và con người. Hiện nay EPNs đã được ứng dụng thành công trong phòng trừ sinh học
dế trũi phá hoại sân golf ở Mỹ, sâu xanh bướm trắng ở Indonesia Trung Quốc và
Pakistan, dòi đục thân su hào ở Bỉ, Hà Lan và Đức, sâu đục thân cọ ở Ả-rập Xê-út, và
càng ngày càng có nhiều quốc gia nghiên cứu ứng dụng EPNs trong phòng trừ nhiều
loài sâu hại khác nhau.( />Hiện nay có 2 phương pháp nhân nuôi in-vitro:
1. Nhân nuôi trong môi trường rắn hoặc bán rắn với nguyên liệu là ruột gia súc,
gia cầm: Với phương pháp này có thể thu được tối đa 3 x106 ấu trùng cảm nhiễm cho 1
bình môi trường nhân nuôi ( />2. Nhân nuôi trong môi trường lỏng trong thiết bị lên men tự động: Phương
pháp này cho phép sản xuất EPN tới dung tích 8 ×104 lít với năng suất 0,15 × 106 con
tuyến trùng trong 1ml dung dịch. Phương pháp này hiện đang được ứng dụng rộng rãi
trong các nhà máy sản xuất thuốc trừ sâu sinh học ở Đức, Nhật Bản, Trung Quốc và
Mỹ .( />Tuy nhiên ở nước ta, nền công nghệ sinh học phát triển chưa mạnh, việc nhân
nuôi và tạo ra một số lượng lớn tuyến trùng có thể ứng dụng trong sản xuất và thương
mại gặp rất nhiều khó khăn. Hiện nay có rất ít nhà khoa học chú ý đến lĩnh vưc mới
mẻ này, vì vậy qui trình sản xuất và thương mại sản phẩm EPNs ở Việt Nam còn chưa
được phát triển và mở rộng .
Nhằm hướng tới một nền nông nghiệp phát triển bền vững, hạn chế sử dụng
thuốc hóa học trong phòng trừ sâu hại, cùng với mong muốn tạo ra một chế phẩm sinh
học có thể ứng dụng được trong điều kiện thức tế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Nghiên cứu môi trường nhân nuôi tuyến trùng ký sinh côn trùng trong phòng thí
nghiệm và đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của các loài tuyến trùng nhân nuôi” .

2


1.2.MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
1.2.1.Mục đích
Thực hiện nghiên cứu nhằm tìm ra được phương pháp nuôi tăng sinh tuyến
trùng có hiệu quả cao, cho sinh khối lớn đồng thời có thể dễ dàng thực hiện trong
những điều kiện cơ sở vật chất, thiết bị còn giới hạn.
Tìm ra điều kiện tối ưu, qui trình sản xuất thích hợp để nhân nuôi tuyến trùng
nhanh, số lượng nhiều và có thể áp dụng vào việc sản xuất công nghiệp nhằm thương
mại hóa sản phẩm tuyến trùng hữu ích.
1.2.2. Yêu cầu
Tiến hành bắt tuyến trùng tại các khu vực đất vườn khác nhau nhằm tạo nguồn
giống ban đầu cho việc nhân nuôi. Nhân nuôi tuyến trùng bằng nhộng sâu xanh, tăng
sinh số lượng lớn trong phòng thí nghiệm làm nguồn ban đầu.
Thực hiện nhân nuôi tuyến trùng trên môi trường rắn, môi trường lỏng. Thử
nghiệm trên nhiều công thức môi trường khác nhau nhằm khảo sát tiến trình phát triển,
thời điểm, công thức môi trường và qui trình nhân nuôi tốt nhất.
Đánh giá hiệu lực gây chết sâu xanh của các loài tuyến trùng được nhân nuôi.
Thử nghiệm nhân nuôi tuyến trùng trong bioreactor qui mô nhỏ, đánh giá sự
tăng sinh số lượng của EPNs và triển vọng phát triển của mô hình này.

3


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Entomopathogenic nematodes (EPNs)
Entomopathogenic nematodes (EPNs) bao gồm hai họ Steinernematidae và

Heterorhabditidae có thể kí sinh gây bệnh và giết chết côn trùng. Tác dụng của EPNs
là góp phần vào kiểm soát sinh học nhờ việc kiểm soát số lượng côn trùng, sâu hại có
trong tự nhiên. Những con vi khuẩn cộng sinh (VKCS) chính là tác nhân giúp EPNs
có thể sinh tồn và tiêu diệt vật chủ kí sinh của chúng. Vì có nhiều lợi ích trong quá
trình kiểm soát sinh học, bởi vậy EPNs được đặc biệt quan tâm trong vài thập kỉ gần
đây, đặc biệt là hai giống Heterorhabditis và Steinernematids cùng những loài vi
khuẩn sông cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus theo Nguyen và Smart (1994).
Heterorhabditids và Steinernematids không có mối quan hệ di truyền gần nhau
theo Blaxter (1998) (trích dẫn bởi Parwinder S. Grewal, 2002), nhưng có đặc điểm
giống nhau trong mối quan hệ với côn trùng - loài vi khuẩn kí sinh gây bệnh. Cả hai
giống Steinernematidis và Heterorhabditis đều có một giai đoạn ấu trùng sồng tự do
trong đất, còn gọi là giai đoạn cảm nhiễm (IJ). Đây là giai đoạn cá thể tuyến trùng sẽ
mang theo những vi khuẩn sống cộng sinh trong ruột (Xenorhabdus và Photorhabdus)
vào vật chủ (J. Adams and B. Khuong, 2002). Nếu gặp côn trùng phù hợp, IJs sẽ xâm
nhập vào qua đường ruột, hậu môn, hoặc các lỗ hở khác. Một vài loài có thể xâm nhập
vào bất cứ chỗ nào trên bề mặt lớp biểu bì mỏng của côn trùng. Ở loài Heterorhabditis
sp, điều này được thực hiện thuận tiện bằng việc sử dụng móc lưng (hook) nằm ở đỉnh
đầu của tuyến trùng (Bedding và ctv, 1982- trích dẫn bởi Glazer và E.Lewis,2000).
Khi xâm nhiễm vào trong kí chủ, những ấu trùng IJs sẽ giải thoát những vi khuẩn cộng
sinh vào trong ruột côn trùng. Những con vi khuẩn sẽ sinh sôi và phát triển để tăng
sinh số lượng và tạo độc tố giết chết côn trùng. Côn trùng sẽ chết trong khoảng 24 - 48
giờ. Nhờ đó, tuyến trùng sẽ phát triển qua các giai đoạn (5 giai đoạn) sau đó hoàn
thành vòng đời và tái sản xuất lại các giai đoạn như trình tự ban đầu cho ra các thế hệ
con cháu khác. Một hoặc nhiều thế hệ tuyến trùng phát triển trong xác chết của côn
trùng phụ thuộc vào con côn trùng đó to hay nhỏ hay có nhiều chất dinh dưỡng hay
không. Với giống Heterorhabditids, các thế hệ đầu tiên được tạo ra nhờ sự tự thụ tinh
4


trong hệ sinh dục lưỡng tính, trong khi con cái, con đực và con lưỡng tính sẽ được sản

xuất sau này (Nuchanart, Suebsak và Jariya, 1999). Còn giống Steinernematids, tất cả
các thế hệ sau đều được sản xuất bởi sự giao hợp (sự thụ tinh chéo của cả con cái lẫn
con đực) (Norberto and Mayra, 2001).

Hình 2.1 Vòng đời đơn giản của EPNs (Steinernema spp, Heterorhabditis spp)
(J. Adams và B. Khuong, 2002).
Gần đây, Steinernema đã được tìm thấy có nhiều khác biệt so với dạng bình
thường, các loài trong giống này hầu hết là lưỡng tính, chỉ một phần nhỏ trong mỗi thế
hệ là con cái (Shapiro-Ilan, and R Gaugler, 2002). Vì vậy, giống Heterorhabditids và
một số loài Steinernema spp có thể phát triển tạo ra nhiều thế hệ bên trong vật chủ khi
dạng xâm nhiễm IJ chỉ có một cá thể xâm nhiễm vào côn trùng, trong khi hầu hết các
loài của giống Steinernematids đòi hỏi phải có ít nhất hai cá thể có giới tính khác nhau
cùng xâm nhập vào côn trùng để tạo ra các thế hệ sau. Bên trong những cá thể cái hoặc
lưỡng tính, trứng được ấp bên trong tử cung và sau đó phát triển thành dạng ấu trùng
phá hủy các mô của cá thể mẹ (Ehlers, 1996). Số lượng ấu trùng phát triển tùy thuộc
vào lượng thức ăn cung cấp để tạo thành các dạng trưởng thành, trong môi trường bị
giới hạn thì số lượng cũng bị hạn chế. Một trăm ngàn IJs có thể được tạo ra trong cùng
5


một vật chủ. Sau vài ngày hay vài tuần thì tuyến trùng sẽ đi kiếm vật chủ mới. Những
ấu trùng IJs xuất hiện sau đó sẽ giữ lại lớp biểu bì của giai đoạn thứ hai như là lớp vỏ
bao bọc cơ thể chúng. Đặc biệt với giống Heterorhabditis, lớp vỏ có thể giúp chúng
chống lại sự sấy khô, đóng băng và nấm bệnh. Lớp vỏ bọc rộng của Steinernematids
sớm mất đi khi tuyến trùng di chuyển trong đất, trong khi lớp vỏ vừa vặn của
Heterorhabditid thì rất khó bị mất đi (Glazer và E.Lewis, 2000).
2.2. Vi khuẩn cộng sinh
Những hiểu biết về mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn cộng
sinh rất cần thiết để hiểu về quá trình gây chết côn trùng của EPNs, và đây cũng là
những điều cơ bản cho những sự thành công trong việc tạo ra sinh khối lớn. Những lợi

ích của hai loài: vi khuẩn có tác dụng làm cho côn trùng chết nhanh hơn, và sau đó tạo
ra môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng cho tuyến trùng phát triển và sinh sản, đồng thời
cũng ngăn chặn những vi sinh vật cơ hội xâm nhiễm và phá hoại xác chết côn trùng
bằng những chất kháng sinh thứ cấp.
Sự tác động giữa tuyến trùng - vi khuẩn không bị rằng buộc: mỗi loài có thể
nuôi cấy một cách riêng lẻ, nhưng sự kết hợp giữa tuyến trùng và vi khuẩn sẽ khiến
cho hai loài này tồn tại và phát triển tốt hơn. Quan hệ cộng sinh giữa hai loài là nét đặc
trưng riêng biệt trong vòng đời sống của tuyến trùng, vi khu cộng sinh chỉ tác động lên
con tuyến trùng ở hai giai đoạn. Đầu tiên là giai đoạn phoretic, là giai đoạn vi khuẩn
được giữ lại bên trong ruột EPNs và tác động tương tác với tuyến trùng, cung cấp dinh
dưỡng cho ruột hấp thu và nuôi sống tuyến trùng IJ, giai đoạn này chưa có sự tăng sinh
về số lượng tuyến trùng. Xenorhabdus xuất hiện trong một bọng ruột đặc biệt của
Steinernema IJs (Bird và Akhurst, 1983 – trích dẫn bởi Forst và Clarke, 2002), trong
khi Photorhabdus xuất hiện chủ yếu ở đoạn ruột phía trước của Heterorhabditis
(Nguyễn Ngọc Châu, 2008). Giai đoạn thứ hai là tại một cơ quan sinh dưỡng, khi mà
vi khuẩn vượt qua hệ thống bảo vệ của vật chủ, cho phép tuyến trùng sinh sản tạo ra
các thế hệ mới một cách nhanh chóng với số lượng lớn bên trong côn trùng bị xâm
nhiễm.

6