PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TỪ PHÂN HEO ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN E.coli VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT PROBIOTIC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TỪ PHÂN HEO
ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN E.coli VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT PROBIOTIC

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRẦN TRƯỜNG NHÂN

Niên khóa

: 2004 - 2008

Thành Phố Hồ Chí Minh
Tháng 08/2009
iii


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VI KHUẨN Bacillus subtilis TỪ PHÂN HEO
ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN E.coli VÀ ỨNG
DỤNG TRONG SẢN XUẤT PROBIOTIC

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải

Trần Trường Nhân

Thành Phố Hồ Chí Minh
Tháng 08/2009
iv


LỜI CẢM ƠN
Con xin thành kính khắc ghi công lao khó nhọc của cha mẹ, ông bà nội người đã
sinh thành, dưỡng dục và hy sinh tất cả để anh em con ăn học nên người. Con xin cảm
ơn gia đình là chỗ dựa vững chắc cho con vững bước qua mọi khó khăn.
Em xin chân thành cảm ơn:
 Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, Ban chủ nhiệm Bộ Môn
Công Nghệ Sinh Học, Trường Cao Đẳng Cộng Đồng Cà Mau đã tạo điều kiện
cho em thực hiện thành công khóa luận này.
 PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em những
kiến thức quí báo, quan tâm hết lòng giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện
đề tài.
 Toàn thể Thầy Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báo.

 TS. Lê Anh Phụng và ThS. Nguyễn Thị Thu Năm đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho em hoàn tất khóa luận này.
 Cám ơn các bạn cùng thực tập tại phòng vi sinh luôn động viên khuyến khích
và nhiệt tình giúp đỡ trong suốt thời gian thực tập tại phòng.
Cuối cùng anh xin cảm ơn em rất nhiều, người đã luôn chia sẽ, an ủi cùng anh
trong những ngày tháng khó khăn nhất của anh.

Sinh viên thực hiện
Trần Trường Nhân.

iii


TÓM TẮT
Trần Trường Nhân, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ
Chí Minh “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo đối kháng với vi khuẩn E.
coli và ứng dụng trong sản xuất probiotic”. Đề tài được tiến hành tại phòng Thí
nghiệm vi sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 5 năm 2009.
Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải
Với đối tượng nghiên cứu là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ
phân heo, chúng tôi tiến hành thử đối kháng với vi khuẩn E. coli H28. Qua quá trình
thực hiện đề tài chúng tôi có những ghi nhận sau:
Kết quả thí nghiệm đối kháng trực tiếp giữa Bacillus subtilis và E. coli trên môi
trường TSA cho thấy Bacillus subtilis đối kháng mạnh với E. coli ở nồng độ pha loãng
canh khuẩn E. coli là 10-3 tại thời điểm 24 giờ ủ trong tủ ấm 370C.
Kết quả thí nghiệm thử đối kháng giữa dịch ly tâm từ canh khuẩn Bacillus
subtilis và E. coli trên thạch đĩa TSA cho thấy dịch ly tâm canh khuẩn Bacillus subtilis
sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C có khả năng kháng E. coli mạnh nhất ở nồng độ pha loãng
canh khuẩn E. coli là 10-2.
Kết quả thí nghiệm sau khi nuôi chung giữa Bacillus subtilis với E. coli trong

môi trường TSB cho thấy số lượng E. coli giảm từ 24 đến 48 giờ, còn đối chứng thì số
lượng E. coli tăng dần.
Với chất bảo quản là acid benzoic ở nồng độ 0,1% có nhiều ưu điểm hơn trong
sản xuất chế phẩm dạng lỏng chứa B.subtilis.

iv


SUMMARY
Nhan, Tran Truong, “The antagonism of Bacillus subtilis isolated from pig-fecal
to E. coli and the probable application in probiotic”. Our topic is proceeded from
December, 2008 to May, 2009 at Microbiology - Infectious Diseases Department,
Husbandry and Veterinary Faculty, Nong Lam University, Ho Chi Minh city.
In this study, the following results were:
The experiment showed that Bacillus subtilis has well againsted to E. coli in the
dilution 10-3 of E. coli cultured at 370C for 24 hours.
The Bacillus subtilis bacteria cell-free extract after culturing for 24 hours,
presented in inhibiting E. coli development.
The co-culture of Bacillus subtilis and E. coli in the Soyabean Casein Digest
Medium (Tryptone Soya Broth) showed the total E. coli bacteria through a plate count
considerably decreased in comparison with control.
As these results, the Bacillus subtilis could inhibite the E. coli the development in
some conditions.
Benzoic acid at 0,1% could be the more suistable preserver for B. subtilis product
in liquid.

v


MỤC LỤC

Trang
Lời cảm ơn..................................................................................................................... iii
Tóm tắt............................................................................................................................iv
Summary..........................................................................................................................v
Mục lục ...........................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt ..............................................................................................ix
Danh sách các bảng. ........................................................................................................x
Danh sách các hình .........................................................................................................xi
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Mục đích của đề tài...................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về E. coli ....................................................................................................3
2.1.1. Nhắc lại về E. coli ................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm E.coli .....................................................................................................3
2.1.2.1. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa..........................................................................3
2.1.2.2. Cấu tạo kháng nguyên .......................................................................................4
2.1.2.3. Các chất độc do E. coli tổng hợp nên .................................................................5
2.1.2.4. Các chủng E. coli gây bệnh ................................................................................7
2.1.2.5.Khả năng gây bệnh cho người.............................................................................8
2.2.1. Định nghĩa ............................................................................................................9
2.2.2. Cơ chế tác động .....................................................................................................9
2.2.2.1. Tác động kháng khuẩn của probiotic .................................................................9
2.2.2.2. Tác động của probiotic lên biểu mô ruột.........................................................10
2.2.2.3. Tác động đáp ứng miễn dịch của probiotic ......................................................10
2.2.2.4. Tác động của probiotic đến vi khuẩn đường ruột.............................................10
2.2.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học........................................................................10
vi

2.2.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học ..........................................................................11
2.2.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis ......................11
2.3. Sơ lược về Bacillus subtilis ....................................................................................12
2.3.1. Lịch sử phát triển.................................................................................................12
2.3.2. Tìm hiểu về vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................12
2.3.2.1. Đặc điểm phân loại...........................................................................................12
2.3.2.2. Đặc điểm phân bố.............................................................................................12
2.3.2.3. Đặc điểm hình thái............................................................................................12
2.3.2.4. Đặc điểm nuôi cấy ............................................................................................13
2.3.2.5. Đặc điểm sinh hóa ............................................................................................13
2.3.2.6. Khả năng tạo bào tử..........................................................................................13
2.3.2.7. Các chất kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp...........................................14
2.3.2.8. Tính đối kháng của Bacillus subtilis ................................................................15
2.3.2.9. Độc tính của Bacillus subtilis ...........................................................................15
2.3.2.10. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus subtilis ...............................16
Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ...................................................................18
3.1.1. Thời gian..............................................................................................................18
3.1.2. Địa điểm ..............................................................................................................18
3.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................18
3.2.1. Đối tượng khảo sát...............................................................................................18
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ ..............................................................................................18
3.2.3. Hóa chất...............................................................................................................18
3.2.4. Môi trường nuôi cấy ............................................................................................18
3.2.5. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................19
3.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................19
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo..................................................19
3.4.1.1. Cách lấy mẫu ....................................................................................................19
3.4.1.2. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis...................................................................20

3.4.2. Đánh giá khả năng đối kháng với E. coli ............................................................21
3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Thử đối kháng với E. coli trên môi trường thạch TSA............21
3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát tính đối kháng từ dịch ly tâm.....................................21
vii


3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đối kháng ...........................................................22
3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm sinh học.......................23
3.4.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sinh học ......................24
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả....................................................................................................................25
4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo ..............................................25
4.1.2. Kết quả đối kháng trực tiếp giữa Bacillus subtilis và E. coli .............................27
4.1.3. Kết quả đối kháng giữa dịch ly tâm canh khuẩn Bacillus subtilis ......................29
4.1.4. Kết quả đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis và E. coli trong .......................31
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận...................................................................................................................38
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................39
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B. subtilis:

Bacillus subtilis

E.Agg.E.C:

Enteroaggregative Escherichia coli

E. coli:

Escherichia coli

E.H.E.C:

Enterohaemorrhagic Escherichia coli

E.P.E.C:

Enteropathogenic Escherichia coli

E.I.E.C:

Enteroinvasive Escherichia coli

E.T.E.C:

Enterotoxingenic Escherichia coli

LT:

Heat labile enterotoxin

ST:

Heat stable enterotoxin

TSA:

Trypticase Soya Agar

TSB:

Trypticase Soya Broth

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Một vài kháng nguyên vi khuẩn E.coli và đối tượng gây bệnh của nó……...8
Bảng 3.1 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sinh học ...........................................24
Bảng 4.2 Kết quả đối kháng trực tiếp giữa Bacillus subtilis và E. coli .......................28
Bảng 4.3 Kết quả đối kháng của dịch ly tâm canh khuẩn từ 5 chủng...........................30
Bảng 4.4 Số lượng vi khuẩn B. subtilis còn sống ........................................................32

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn E. coli ................................................................................3
Hình 2.2 Cơ chế tác động của độc tố vi khuẩn E. coli....................................................6
Hình 2.3 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis...............................................................13
Hình 4.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis trên môi trường TSA...............................25
Hình 4.2 Vi khuẩn B.subtilis.........................................................................................26

Hình 4.3 Các phản ứng sinh hóa của B. subtilis ...........................................................27
Hình 4.4 Vòng kháng khuẩn của Bacillus subtilis đối với E. coli................................29
Hình 4.5 Vòng kháng khuẩn của dịch canh khuẩn Bacillus subtilis ............................31
Hình 4.6 Kết quả kiểm tra B. subtilis sau khi lên men. ................................................33
Hình 4.7 Sau khi đóng chai chế phẩm B. subtilis. ........................................................33

Sơ đồ 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis ...............................................................20
Sơ đồ 3.2 Thí nghiệm thử đối kháng với E. coli trên môi trường thạch TSA ..............21
Sơ đồ 3.3 Khảo sát tính đối kháng từ dịch ly tâm của Bacillus subtilis........................21
Sơ đồ 3.4 Khảo sát tính đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli ...........................22
Sơ đồ 3.5 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học…………………..………………...23

Biểu đồ 4.1 Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis và E. coli biểu thị ở dạng log10 ......31

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
E. coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của
người và động vật. Tuy nhiên khi có điều kiện thích hợp thì E. coli gây độc tăng sinh
mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc
biệt là gia súc còn non gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi.
Do tính chất đề kháng rất nhanh với nhiều loại kháng sinh của E. coli thì việc sử
dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn đến xáo
trộn hệ vi sinh vật đường ruột và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi khuẩn
đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho người tiêu dùng. Thay vào đó, việc sử dụng
probiotic ngày càng phổ biến và được xem như là một giải pháp thay thế hiệu quả cho
kháng sinh.

Probiotic là 1 dạng chế phẩm sinh học bao gồm các vi sinh vật có lợi, có tính đề
kháng cao và có khả năng ức chế các vi sinh vật có hại nên đựợc ứng dụng để phòng
trừ bệnh tiêu chảy trên heo con.
Hiện nay, các dạng chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis đang được sử dụng ngày
càng phổ biến đối với bệnh tiêu chảy trên heo do những ưu điểm thuận lợi cho việc sản
xuất probiotic cũng như tính đối kháng mạnh với E. coli. Nhiều nghiên cứu trong và
ngoài nước về Bacillus subtilis đã và đang được tiến hành nhằm tìm ra những chủng
Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh với E. coli.
Được sự phân công môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm
TP.HCM, với sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải chúng tôi thực hiện đề tài
“Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân heo đối kháng với vi khuẩn E. coli và ứng
dụng trong sản xuất probiotic”

1


1.2. Mục đích của đề tài
 Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở trại heo Trường Đại
Học Nông Lâm TP.HCM.
 Chọn lọc được dòng Bacillus subtilis có khả năng kháng khuẩn đối với E. coli.
 Đánh giá khả năng đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E. coli gây bệnh
trong môi trường TSB.
 Xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm sinh học.
 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sinh học.
1.3. Nội dung thực hiện
 Phân lập các chủng Bacillus subtilis từ phân heo và thử đối kháng với E. coli gây
bệnh trên môi trường TSA, TSB.
 Bảo quản chế phẩm sinh học chứa Bacillus subtilis bằng những chất bảo quản khác
nhau.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về E. coli
2.1.1. Nhắc lại về E. coli
Giống Escherichia thuộc họ Enterobactericeae, một kí sinh bình thường trong
đường ruột và được phân lập từ phân của động vật hữu nhũ. Những giống thành lập
nên họ này là những vi khuẩn Gram-, rộng 0,5 - 1µm và dài 1 - 6µm thường di động,
có lông và không sinh bào tử, hiếu khí hay yếm khí tùy nghi(dẫn liệu Lê Thị Mai
Khanh, 2004).

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn E. coli.
/>
Có 5 loài thuộc giống Escherichia:
 E. blattae
 E. coli
 E. fergusonii
 E. hermanii
 E. vulneris
2.1.2. Đặc điểm E.coli
2.1.2.1. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp là 35 370C pH thích hợp 6,4 - 7,5 (tối ưu nhất là 7,2 – 7,4).
Trong môi trường lỏng, sau 4 - 5 giờ E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để lâu
càng đục, có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trường.

3

E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn
lạc dạng S màu xám trắng, tròn ướt, bề mặt láng bóng, kích thước khoảng 2 – 3 mm.
Trên thạch EMB: E. coli tạo khuẩn lạc tím ánh kim.
Trên thạch Macconkey: E. coli tạo khuẩn lạc đỏ hồng, tròn, lồi.
E. coli lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như: Lactose,
Glucose, Manitol….Người ta căn cứ vào khả năng lên men đường Lactose để phân
biệt E. coli với một số vi khuẩn đường ruột khác(dẫn liệu Nguyễn Văn Nghĩa, 2002).
 ONPG (+), Urease (-), H2S (-), LDC (+)
 Nghiệm pháp IMViC: I+M+V-C-, indol (+), methyl red (+), VP (-),
simmons citrate (-)
2.1.2.2. Cấu tạo kháng nguyên
E. coli có đủ 4 loại kháng nguyên O, H, K, F.
- Kháng nguyên O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharide của màng
tế bào, bền với nhiệt và cồn, khi đun nóng ở 1000C trong 2 giờ vẫn giữ được tính
kháng nguyên. Kháng nguyên O có thể được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết,
kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và
có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Các E. coli có chung tính kháng nguyên
O thường có sự tương tác lẫn nhau và nhiều nhóm kháng nguyên O của Shigelle,
Salmonella.
- Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, là các vi nhung
mao của vi khuẩn, tạo nên khả năng di chuyển của E. coli, kém chịu nhiệt, có 56 type
kháng nguyên H.
- Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): kháng nguyên K lúc đầu được xác
định bằng phản ứng ngưng kết. Người ta xác định có sự hiện diện của kháng nguyên K
ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bị đun nóng. Có
hơn 80 type kháng nguyên K đã được xác định.
- Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): tiêm mao (fimbriae) dài khoảng
4µm, đường kính 2,1 – 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn. Tiêm mao không tham gia vào
sự di chuyển, ngắn hơn và nhiều hơn flagella. Tiêm mao giúp vi khuẩn kết dính vào tế
bào niêm mao ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Một vài

E. coli đặc biệt là E. coli tiết độc tố ruột co những lông bám kháng mannose (mannose4


ressistant – MR) cũng được dùng để phân loại về mặt huyết thanh học. Một vài lông
bám kháng mannose (ví dụ như K88 và K89) đã từng được coi là kháng nguyên K. Về
sau khi xác định được thành phần hóa học của những lông bám này có bản chất là
protein nên việc xếp chúng vào kháng nguyên K không còn phù hợp, chúng được xếp
vào nhóm kháng nguyên tiêm mao F.
2.1.2.3. Các chất độc do E. coli tổng hợp nên
Độc tố của E. coli: vi khuẩn E. coli tạo 2 loại độc tố đường ruột (Smith và
Oyles, 1970) sự khác biệt giữa chúng là khả năng chịu nhiệt.
- Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin-LT): độc tố LT của E. coli là
oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (Cholera
toxin-CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như: cấu
trúc, trình tự acid amine (giống nhau khoảng 80%, tương đồng thụ thể, hoạt tính
enzyme và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào).
LT có 2 nhóm chính là LT-I và LT-II, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn
dịch chéo nhau. LT-I được biểu hiện trong các chủng E. coli gây bệnh trên người và
động vật còn LT-II chỉ được tìm thấy trên những chủng E. coli phân lập được trên
động vật và một số rất ít chủng phân lập được trên người. Tuy nhiên không có bằng
chứng cho thấy LT-II có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập
trung chủ yếu vào LT-I.
LT-I là một oligopeptde trọng lượng phân tử là 86 kDa, được cấu tạo từ 1 tiểu
đơn vị A có trọng lượng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa. 5 tiểu đơn vị B
sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự
phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfic. LT-I
có 2 loại LTh-I có độc tính trên người và LTp-I có độc tính trên heo, sau khi độc tố đi
vào nội bào chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận chuyển của golgi (golgi
vận chuyển). Mục tiêu của LT trong tế bào là enzyme adenylate cyclase nằm ở lớp
màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase

chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến protein lien kết GTP (GTP-binding protein) là
Gs, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế
bào. Vì vậy enzyme cAMP sẽ gắn vào và hoạt hóa enzyme protein kinase A. Enzyme

5


này hoạt động làm phosphoryl hóa kênh clorua nằm ở phía trên mằng tế bào biểu mô
ruột vượt quá mức bình thường .
Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl bởi
những tế bào có lông nhung. Do đó hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng làm nước
bên trong tế bào kéo ngược ra ngoài và dẫn đến hiện tượng tiêu chảy.
LT-II giống với LT-I và CT khoảng 55 - 57% ở tiểu đơn vị A, nhưng không
giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ
chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II sử dụng GD1 làm thụ thể thay vì GM1, tuy nhiên
như đề cập ở trên thì không có bằng chứng cho thấy LT-II gây độc cho tế bào của
người và động vật.
- Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin-ST): ST có trọng lượng phân tử nhỏ, trong
cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tính chất này dẫn đến khả năng kháng
nhiệt của độc tố. Độc tố này có 2 loại, có cấu trúc và cơ chế hoạt động khác biệt nhau
là STa và STb.
STa là 1 peptide gồm 18 - 19 acid amine với trọng lượng phân tử khoảng 2 kDa,
Sta được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa) từ E. coli phân lập được trên
heo và STb (ST human hay STIb) của E. coli phân lập trên người.
Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C) GC-C
nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột. Sự kết hợp của STa vào GC-C kích
thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động cuối cùng
dẫn đến sự kích thích tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl gây ra sự tiết chất lỏng
trong ruột.

Hình 2.2 Cơ chế tác động của độc tố vi khuẩn E. coli.
(www.gabs.utmb.edu/microbook/ch025.htm).
6


STb chủ yếu có liên quan đến dòng ETEC phân lập từ heo mặc dù cũng có báo
cáo vài chủng ETEC người cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây ra những tổn
thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô
ruột và teo nhung mao 1 phần. Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây
người ta cho rằng độc tố có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi
vào trong tế bào. Tác động của STb trong tế bào không giống như STa thay vì phân
tiết clourua (Cl-) nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate (HCO3-). STb
không làm gia tăng hàm lượng cGMP nội bào mà tác động của nó làm tăng hàm lượng
calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên ngoài (dẫn liệu Lê Thị Mai Khanh, 2004).
2.1.2.4. Các chủng E. coli gây bệnh
(Dẫn liệu của Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007)
Đối với các E. coli gây bệnh đường ruột người ta chia làm 5 loại sau đây:
 Enteroaggregative E. coli (E.A.E.C hay E.Agg.E.C): E.A.E.C hay
E.Agg.E.C là nhóm E. coli không sinh enterotoxin. E.A.E.C gây tiêu chảy
kéo dài (trên 14 ngày). Trong hầu hết các báo cáo đều mô tả E.A.E.C ở các
ca tiêu chảy lẻ tẻ, nhưng E.A.E.C cũng có thể là tác nhân gây thành ổ dịch
(Keskimaki, 2001)
 Enteroinvasive E. coli (E.I.E.C): rất giống với Shigella về mặt kháng
nguyên sinh hóa và đặc tính gây bệnh. Cả Shigella spp và E.I.E.C đều có
khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô kết tràng và chúng đều tiết 1 hay
nhiều độc tố ruột liên quan đến tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998)
 Enterphathogenic E. coli (E.P.E.C): số lượng rất ít (chỉ nhóm O45 và O108
là hiện diện trên heo) và thường ít liên quan đến các trường hợp tiêu chảy
trên những heo con cai sữa và sau cai sữa (Th. Alogninouwa, 1994)
 Enterohaemorrhagic E. coli (E.H.E.C): gây tiêu chảy xuất huyết trên cả

thú và người, sản sinh độc tố thần kinh verotoxin (VT) hay độc tố shigalike (shiga-like toxin producing E. coli: SLTEC) gây các triệu chứng viêm
ruột xuất huyết và hội chứng viêm huyết niệu (H. Lior, 1994)
 Enterotoxigenic E. coli (E.T.E.C): nhóm này gồm những E. coli tạo ra ít
nhất 1 trong 2 loại độc tố đường ruột là ST và LT. Các ST và LT thường có
1 hay nhiều yếu tố kết dính (F4, F5, F6 và F41) cho phép chúng bám vào các
7


vi nhung mao ruột và định vị trên màng nhày ruột. Các nguồn E.T.E.C
thường kết hợp với bệnh tiêu chảy trên heo còn bú và thường thuộc các
nhóm huyết thanh sau: O8, O9, O138, O141, O147, O149,…(Th.
Alogninouwa, 1994).
Bảng 2.1 Một vài kháng nguyên vi khuẩn E. coli và đối tượng gây
bệnh của nó (trích dẫn bởi Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).
kháng nguyên

Đối tượng gây bệnh

Serogroup O

K 88

Heo con

O8, O45, O138, O141,
O147, O149, O157

s87P

Heo con

O9, O20, O141

K 99

Cừu, bê

O8,O9, O20, O101

K 99

Heo con

O64, O101

K 41

Bê

O9, O101

CFA/1

Người

O15, O25, O63, O78

CFA/2

Người

O6, O8

2.1.2.5.Khả năng gây bệnh cho người
 Gây bệnh cho người
E. coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở
đường tiêu hóa. Tuy là vi khuẩn sống cộng sinh với người nhưng E. coli có thể gây
bệnh cơ hội, chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đường mật,
đường hô hấp và nhiểm khuẩn huyết. Nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày
ruột ở trẻ em.
 Gây bệnh thực nghiệm trên thú
Khả năng gây bệnh cho súc vật yếu, phải đưa một lượng lớn vi khuẩn vào phúc
mạc chuột nhắt hay đường tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết cho súc vật.
E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ hầu hết đều thuộc lớp sản sinh
độc tố ruột hay E.T.E.C
8


2.2. Chế phẩm sinh học (probiotic)
2.2.1. Định nghĩa
Probiotic là những chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật sống có lợi khi đưa vào
trong cơ thể của vật chủ sẽ giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tạo điều kiện cải
thiện tăng trưởng và tăng cường sức đề kháng của vật chủ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)
Probiotic được sử dụng ngày càng nhiều trong chăn nuôi, nhằm phục hồi và
cân bằng hệ vi sinh đường ruột vật chủ bị hư hại do tác động của các yếu tố stress,
dinh dưỡng và sử dụng kháng sinh không đúng cách. Việc sử dụng probiotic trong
chăn nuôi đem lại những hiệu quả sau:
 Tăng suất (thịt, trứng, sữa)
 Cải thiện tiêu tốn thức ăn.
 Tăng cường sức đề kháng bệnh.

2.2.2. Cơ chế tác động
Tuy đã được sử dụng từ rất lâu nhưng cơ chế tác động của probiotic vẫn chưa
được nghiên cứu một cách rõ ràng do hiệu quả tác động của nó chịu ảnh hưởng bởi
nhiều yếu tố khác nhau. Fuller (1992) đã đề nghị cơ chế tác động của probiotic có thể
là:
 Cạnh tranh thụ thể kết dính trên biểu mô tế bào tiêu hóa.
 Cạnh tranh chất dinh dưỡng giới hạn với vi sinh vật gây bệnh, tuy nhiên
cơ chế này chưa được chứng minh 1 cách rõ ràng trong điều kiện in vivo.
 Sản xuất chất kháng khuẩn như các acid hữu cơ, bacteriocin…
 Kích thích hệ miễn dịch.
Probiotic có giá trị khoa học, tuy nhiên lợi ích của nó chỉ thể hiện khi thú có sức
khỏe kém, stress hoặc xáo trộn hệ vi sinh vật đường ruột (Trần Thị Dân, 2005)
2.2.2.1. Tác động kháng khuẩn của probiotic
Làm giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn mầm bệnh, tiết ra chất kháng khuẩn.
Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn gram+ và gram-, gồm có
các acid hữu cơ, hydrogen peroxide…Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ
những vi sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến trao đổi
chất của vi khuẩn và sự tạo ra độc tố. Điều này thực hiện bằng cách giảm pH khoang

9


ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate,
propionate và butyrate nhất là acid lactic.
Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột.
Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống của mầm bệnh.
2.2.2.2. Tác động của probiotic lên biểu mô ruột
Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa các tế bào biểu mô, giảm việc kích thích bài tiết
và những hậu qủa do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn. Đẩy mạnh sự tạo ra các phản
ứng phòng vệ như chất nhầy.

2.2.2.3. Tác động đáp ứng miễn dịch của probiotic
Probiotic như là phương tiện để phân phát các phân tử kháng viêm cho đường
ruột, đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào vật chủ để làm giảm đáp ứng viêm. Tạo đáp ứng
miễn dịch để làm giảm dị ứng.
2.2.2.4. Tác động của probiotic đến vi khuẩn đường ruột
Probiotic điều chỉnh thành phần vi khuẩn đường ruột, sự sống sót của của vi
khuẩn probiotic được tiêu hóa ở những phần khác nhau của bộ phận tiêu hóa thì khác
nhau giữa các giống khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời
của hệ sinh thái ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu
thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi
khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn chỉ định cư một
cách tạm thời trong ruột một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic
sẽ giảm xuống.
Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột.
Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản
trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột.(Đặng Quốc Bảo, 2005).
2.2.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học
Probiotic được sử dụng để phòng và chữa trị các bệnh đường ruột như là bệnh
tiêu chảy do sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh, virus, sử dụng kháng sinh và dinh
dưỡng, bệnh viêm ruột, ngoài ra còn được sử dụng để bổ sung các enzyme tiêu hóa mà
cơ thể tiết ra không đủ như sucrase, maltase.
Probiotic là chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật có lợi được bổ sung vào
thức ăn để nâng cao sự sinh trưởng, sức sản xuất của thú nuôi. Do nó có tác dụng ức
10


chế các vi sinh vật có hại, làm thay đổi hệ vi sinh vật nội tại theo hướng có lợi thông
qua việc sinh ra các chất ức chế, chất kháng khuẩn, ức chế trong cạnh tranh dinh
dưỡng, tăng cường miễn dịch, tăng hoạt tính đại thực bào.
Probiotic giúp thú tăng trọng nhanh hơn trên 1 đơn vị thức ăn do vi sinh vật trong

Probiotic tiết ra các enzyme tiêu hóa như amylase, protease làm tăng hệ số chuyển hóa
thức ăn của thú (Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)
2.2.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học
Những vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm sinh học cần phải thỏa mãn một
số điều kiện sau:
-

Có khả năng sống sót trong đường ruột của vật chủ

-

Có khả năng bám dính lên biểu mô ruột

-

Có khả năng ức chế các loài vi sinh vật gây bệnh

-

Có khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch và sức đề kháng của vật chủ

-

Không gây bệnh và không gây độc

-

Có lợi cho quá trình tiêu hóa của vật chủ

-

Phù hợp với các yêu cầu sản xuất công nghiệp

-

Giữ đặc tính ổn định trong một thời gian tương đối dài ở điều kiện bình
thường (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm sinh học phải phát triển mạnh, qui trình
nuôi cấy và sản xuất phải đơn giản, chi phí thấp, cách sử dụng phải đơn giản.
2.2.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis
Điều khác biệt đối với các sản phẩm probiotic khác là các sản phẩm probiotic có
nguồn gốc từ Bacillus spp được sản xuất ở dạng bào tử do đó những sản phẩm dạng
này có nhiều ưu điểm hơn so với các sản phẩm khác là dễ sản xuất, giá thành rẻ, bào tử
chịu đựng được các điều kiện trong quá trình sản xuất, dễ bảo quản, thời gian bảo quản
dài, bào tử có khả năng đề kháng tốt với acid dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hoá…
Trong các loài vi khuẩn khác nhau thuộc giống Bacillus thì Bacillus subtilis được
tập trung nhiều nhất vì các dòng vi khuẩn của Bacillus sutilis không mang những gene
gây độc cho người và thú, quá trình hình thành bào tử của Bacillus sutilis được nghiên
cứu một cách chi tiết, đồng thời những nghiên cứu gần đây cho thấy bào tử của

11


Bacillus sutilis có khả năng nảy mầm trên phần đầu của ruột non. Điều này làm cho
việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic được đẩy mạnh.
2.3. Sơ lược về Bacillus subtilis
2.3.1. Lịch sử phát triển
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chức y
học Nazi của Đức. Lúc đầu chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các chiến sĩ

Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Đến năm 1949 - 1957 khi Herry, Albot và các cộng sự tách được các chủng
thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó, “sutilistherapie” có nghĩa là sutilin ra đời trị
các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá.
Ngày nay vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và đựơc sử dụng rộng rãi
trong chăn nuôi, y học, thực phẩm….(Nguyễn Duy Khánh, 2006).
2.3.2. Tìm hiểu về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.3.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1994). Bacillus subtilis thuộc
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis.
2.3.2.2. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng
được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước…..
Phần lớn tồn tại trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100
triệu cfu/g. Đất nghèo dinh dưỡng như ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất
hiếm.
Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào
sinh dưỡng Bacillus subtilis.
2.3.2.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram+, kích thước
0,5 – 0,8µm × 1,8 - 3µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 - 12 lông,
sinh bào tử từ. Bào tử Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của vỏ,
12


không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ….(Tô Minh
Châu, 2000)

Hình 2.3 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis.
/>
2.3.2.4. Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370C
Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển
trong môi trường thiếu oxy.
Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4
Môi trường thạch đĩa TSA có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, tâm sẫm
màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo màu hơi
nâu.
Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis làm đục môi trường, tạo màng nhăn,
lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
2.3.2.5. Đặc điểm sinh hóa
Các phản ứng sinh hoá được sử dụng để khẳng định Bacillus subtilis:
Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), khả năng phân giải tinh
bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP
(+), indol (-), lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, mannitol,
saccharose, xylose, abrbinose.
2.3.2.6. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào
tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử
trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi (dinh dưõng trong
môi trường bị kệt quệ, nhiệt độ….) (Tô Minh Châu, 2000).
13


Bào tử là 1 hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp vi khuẩn vượt qua những
điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích hợp,
môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi….Mỗi vi khuẩn chỉ tạo 1 bào

tử. Khi gặp điều kiện thuân lợi bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào sinh dưõng.
2.3.2.7. Các chất kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp
Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như:
subtilin, subtilosin A, Tas A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins,
difficidin….
 Subtilin
Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave ở
pH = 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với
màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với
nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển
các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton.
 Subtilosin
Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria
monocytogenes và Bacillus cereus.
 Sublancin
Sublancin không tác động với vi khuẩn Gram- nhưng có khả năng ức chế mạnh
đối với vi khuẩn Gram+ kể cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử. Sublancin là bacterocin rất
bền, bảo quản ở điều kiện bình thường trong thời gian 2 năm không làm mất hoạt tính
của sublancin.
 TasA
TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA có phổ kháng
khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử
được bắt đầu, đồng thời TasA cũng được chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào
tử sau đó định vị trong lớp peptidoglycan vách lõi bào tử, TasA giúp Bacillus subtilis
chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm.

14