XÂY DỰNG QUY TRÌNH MUTIPLEX PCR PHÁT HIỆN PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2, HAEMONPHILUS PARASUIS ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE GÂY BỆNH HÔ HẤP PHỨC HỢP TRÊN HEO

 
 

BỘ
B GIÁO D
DỤC VÀ ĐÀO
Đ
TẠO
TRƯỜN
NG ĐẠI HỌ
ỌC NÔNG
G LÂM TH
HÀNH PHỐ
Ố HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔN
NG NGHỆ
Ệ SINH HỌ
ỌC

K
KHÓA
A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆP
P

X
XÂY
DỰN
NG QUY

Y TRÌNH
H MULTIIPLEX P
PCR PHÁ
ÁT HIỆN
N
Poorcine cirrcovirus type
ty 2, Haemoph
H
ilus paraasuis, Acttinobacilllus
pleuropneum
moniae GÂ
ÂY BỆN
NH HÔ HẤP
H
PHỨ
ỨC HỢP TRÊN H
HEO

Ngành
h học

: CÔNG
G NGHỆ S
SINH HỌC
C

Sinh viiên thực hiiện : ĐOÀN
N THỊ NH
HUNG
Khóa

: 2009 - 2013

háng 6/2013
Th


BỘ
B GIÁO D
DỤC VÀ ĐÀO
Đ
TẠO
TRƯỜN
NG ĐẠI HỌ
ỌC NÔNG
G LÂM TH
HÀNH PHỐ
Ố HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔN
NG NGHỆ
Ệ SINH HỌ
ỌC

K
KHÓA
A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆP
P

X
XÂY
DỰN
NG QUY
Y TRÌNH
H MULTIIPLEX P
PCR PHÁ
ÁT HIỆN
N
Poorcine cirrcovirus type
ty 2, Haemoph
H
ilus paraasuis, Acttinobacilllus
pleuropneum
moniae GÂ
ÂY BỆN
NH HÔ HẤP
H
PHỨ
ỨC HỢP TRÊN H
HEO

ọc:
Hướng dẫẫn khoa họ

Sinh viên thực hiện:
h

TS. NGUY
YỄN TẤT TOÀN

ÀN THỊ NHUNG
ĐOÀ

ThS. ĐỖ TIẾN DUY
Y

háng 6/2013
Th


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên con xin gửi lời biết ơn chân thành đến Bố Mẹ đã sinh thành, không
quản nắng mưa vất vả nuôi nấng, dạy dỗ con được như ngày hôm nay. Gia đình mình
đã luôn bên con mọi lúc mọi nơi, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong cuộc
sống này.
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, ban chủ
nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tâm tạo điều
kiện thuận lợi nhất và truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trường cũng
như thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành biết ơn:
TS. Nguyễn Tất Toàn và ThS. Đỗ Tiến Duy đã hết lòng hướng dẫn, động viên
em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
BSTY. Lê Thị Hạnh Dung và BSTY. Nguyễn Phạm Huỳnh đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực tập tốt nghiệp.
Xin cảm ơn:
Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.
Các anh chị đang công tác và cùng làm đề tài tốt nghiệp tại Bệnh Viện Thú Y
đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực tập.

Tập thể lớp DH09SH đã quan tâm, giúp đỡ, động viên chia sẻ những vui buồn
cùng tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn.
ĐOÀN THỊ NHUNG
 

i


TÓM TẮT
Đề tài “Xây dựng quy trình multiplex-PCR phát hiện Porcine circovirus type 2
(PCV2), Haemophilus parasuis (HP), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) gây
bệnh hô hấp phức hợp trên heo” được thực hiện từ 15/12/2012 đến 30/06/2013 tại
Phòng xét nghiệm sinh học phân tử - tế bào thuộc Bệnh Viện Thú Y, Khoa Chăn Nuôi
Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình Multiplex-PCR phát hiện đồng thời 3
mầm bệnh chính như Porcine circovirus type 2 (PCV2), Haemophilus parasuis (HP),
Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) chính xác và hiệu quả. Các kết quả nghiên
cứu đạt được gồm: (1) kiểm tra cả ba quy trình s-PCR phát hiện riêng lẻ PCV2, APP,
HP là hoàn toàn đặc hiệu; (2) quy trình m-PCR có nồng độ mồi tối ưu HPF-cysS,
HPR-cysS; APPF-cpxA, APPR-cpxA; PCV2F-ORF2, PCV2R-ORF2 lần lượt là 0,5
µM, 0,5 µM; 0,5 µM, 0,5 µM; 1 µM,1 µM; (3) chu trình luân nhiệt của phản ứng mPCR tối ưu như sau: tiền biến tính ở 95oC trong 5 phút; biến tính ở 94oC trong 30 giây;
bắt cặp ở 56oC trong 1 phút; kéo dài ở 72oC trong 1 phút; giai đoạn kéo dài cuối cùng
ở 72oC trong 7 phút.
Quy trình multiplex – PCR sau khi tối ưu hóa đã được ứng dụng khả thi trên
mẫu thực địa, tuy nhiên chưa đạt được kết quả mong muốn trong việc phát hiện PCV2
nên cần có sự điều chỉnh nhỏ để ứng dụng khả thi hơn ngoài thực tiễn.

ii

SUMMARY
The study entitled "Development of multiplex-PCR to detect the porcine
Circovirus type 2 (PCV2), Haemophilus parasuis (HP), and Actinobacillus
pleuropneumoniae (APP) causes complex respiratory disease in swine" carried out
from 15/12/2012 to 30/06/2013 in molecular biology - the cell laboratory of Veterinary
Hospital, Faculty of Animal Husbandry and Veterinary Sciences, Ho Chi Minh city
Agriculture and Forestry University.
This study aimed to develop a procedure of Multiplex-PCR for simultaneous
detection of three major pathogens such as porcine Circovirus type 2 (PCV2),
Haemophilus parasuis (HP), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) accurately and
efficiently. The research results achieved include (1) all three individual s-PCRs
detected PCV2, APP, and HP were completely specific, (2) the m-PCR primer
concentrations optimized HPF-cysS, HPR-cysS; APPF-cpxA, appr-cpxA; PCV2FORF2, PCV2R-ORF2 were 0.5 uM, 0.5 uM; 0.5 uM, 0.5 uM; 1 uM, 1 uM,
respectively (3) m-PCR thermal cycling reaction optimized as follows: predenaturation at 95 °C for 5 minutes, denaturation at 94oC for 30 seconds, and
annealing temperature at 56 °C in one minute, then extension at 72oC for 1 minute;
final phase of last elongation for 7 minutes at 72oC. This multiplex-PCR procedure
after optimization was possible applications in field samples, however, a bit have not
achieved the desired results in the detection of PCV2 then still need a minor
adjustment to external applications more feasible in pratice.
Keywords: multiplex PCR, Porcine circovirus type 2, Haemophilus parasuis,
Actinobacillus pleuropneumoniae, swine.

iii


MỤC LỤC
 
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................i

Tóm tắt ............................................................................................................................ ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình .........................................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1

Đặt vấn đề:............................................................................................................. 1

1.2

Yêu cầu của đề tài ................................................................................................. 1

1.3

Nội dung thực hiện ................................................................................................ 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1

Tổng quan về bệnh do virut Porcine circovirus type 2 (PCV2) ........................... 3

2.1.1

Đặc điểm của Porcine circovirus type 2 (PCV2) .............................................. 3

2.1.2

Dịch tễ học của Porcine circovirus type 2 (PCV2) ........................................... 4

2.1.3

Bệnh liên quan đến Porcine circovirus type 2 (PCV2) ..................................... 5

2.2

Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) .......... 5

2.2.1

Đặc điểm của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) ................................... 5

2.2.2

Dịch tễ học của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) ................................ 6

2.2.3

Cơ chế sinh bệnh của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) ....................... 6

2.2.4

Triệu chứng bệnh do Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) ........................ 7

2.3

Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Haemophilus parasuis (HP) .............................. 7

2.3.1

Đặc điểm của Haemophilus parasuis (HP)........................................................ 7

2.3.2

Dịch tễ học của Haemophilus parasuis (HP)..................................................... 8

2.3.3

Cơ chế sinh bệnh của Haemophilus parasuis (HP) ........................................... 8

2.3.4

Triệu chứng bệnh do Haemophilus parasuis (HP) ............................................ 8

2.4

Tổng quan về bệnh hô hấp phức hợp .................................................................... 9

2.5

Polymerase chain reaction (PCR) .......................................................................10
iv


2.5.1

Định nghĩa phản ứng PCR ...............................................................................10

2.5.2

Các giai đoạn của phản ứng PCR ....................................................................10

2.5.3

Các thành phần của phản ứng PCR..................................................................11

2.5.4

Đọc kết quả phản ứng PCR ..............................................................................11

2.5.5

Ứng dụng của kỹ thuật PCR ............................................................................12

2.5.6

Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật PCR .....................................................12

2.6

Phản ứng Multiplex – PCR .................................................................................13

2.7

Quy trình ly trích DNA .......................................................................................14

2.8

Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang ......................................15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................17
3.1

Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................17

3.2

Vật liệu ................................................................................................................17

3.2.1

Nguyên liệu ......................................................................................................17

3.2.2

Thiết bị và dụng cụ ..........................................................................................17

3.2.3

Hóa chất ...........................................................................................................17

3.3

Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................18

3.3.1

Kiểm tra độ đặc hiệu của các mồi ....................................................................19

3.3.2

Phản ứng s-PCR phát hiện Haemophilus parasuis (HP) .................................19

3.3.3

Phản ứng s-PCR phát hiện Porcine circovirus type 2 (PCV2) ........................20

3.3.4

Phản ứng s-PCR phát hiện Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) .............20

3.3.5

Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện PCV2, APP, HP ......................21

3.3.5.1.

Kiểm tra khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp giữa các mồi ......................21

3.3.5.2.

Đánh giá khả năng hoạt động của mồi .........................................................21

3.3.5.3.

Xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR ....................................22

3.3.5.4.

Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng m-PCR ...............................23

3.3.5.5.

Xác định nồng độ DNA tối thiểu phát hiện bởi phản ứng m-PCR...............24

3.3.5.6.

Ứng dụng quy trình m-PCR đã tối ưu trên mẫu thực địa .............................24

3.3.5.7.

Điện di sản phẩm PCR .................................................................................25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................26
4.1

Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của các mồi...........................................................26

4.2

Kết quả thực hiện phản ứng s-PCR phát hiện HP ...............................................28

4.3

Kết quả thực hiện phản ứng s-PCR phát hiện PCV2 ..........................................30
v


4.4

Kết quả thực hiện phản ứng s-PCR phát hiện APP .............................................31

4.5

Kết quả xây dựng quy trình m-PCR phát hiện đồng thời PCV2, APP, HP ........32

4.5.1

Kết quả kiểm tra khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp giữa các mồi .............32

4.5.2

Kết quả đánh giá khả năng hoạt động của mồi ................................................33

4.5.3

Kết quả xác định nồng độ mồi tối ưu ...............................................................34

4.5.4

Kết quả xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu .........................................................35

4.5.5

Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu phát hiện bởi phản ứng m-PCR .....36

4.5.6

Kết quả áp dụng quy trình m-PCR trên mẫu bệnh ...........................................36

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................39
5.1.

Kết luận ...............................................................................................................39

5.2.

Đề nghị ................................................................................................................39

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................40
 

 

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APP

Actinobacillus pleuropneumoniae

DNA

Deoxyribonucleoic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetra acetate

HP

Haemophilus parasuis

m-PCR

Multiplex polymerase chain reaction

NT

Nghiệm thức

OD

Optical density

PCR

polymerase chain reaction

PCV2

Porcine circovirus type 2

PMWS

Post – Weaning Wasting Syndrome

SDS

Sodium dodecyl sulfate

s-PCR

Single polymerase chain reaction

TBE

Tris borate EDTA

TE

Tris EDTA

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng s-PCR và m-PCR ........................... 18
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện HP ............................................... 19
Bảng 3.3 Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát hiện HP .................................. 19
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện PCV2 .......................................... 20
Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát hiện PCV2 ............................. 20 
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện APP............................................. 21

Bảng 3.7 Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát hiện APP ............................... 21
Bảng 3.8 Thành phần phản ứng m-PCR đánh giá khả năng hoạt động của mồi ...... 22
Bảng 3.9 Chu trình luân nhiệt m-PCR đánh giá khả năng hoạt động của mồi ......... 22
Bảng 3.10 Thành phần phản ứng m-PCR xác định nồng độ mồi ............................. 23
Bảng 3.11 Thành phần phản ứng m-PCR xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu.............. 23
Bảng 3.12 Chu trình luân nhiệt xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu ............................. 24
Bảng 3.13 Nồng độ DNA với các lần pha loãng ...................................................... 24
Bảng 4.1 Các đặc tính cơ bản của các cặp mồi ......................................................... 26
Bảng 4.2 Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất ............................ 27
Bảng 4.3 Các cấu trúc thứ cấp giữa các mồi mang năng lượng tự do thấp nhất ...... 32
Bảng 4.4 Kết quả phản ứng m-PCR và s-PCR trên các mẫu thực địa ...................... 37

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Phản ứng multiplex PCR ........................................................................... 13
Hình 3.1 Bố trí khảo sát ............................................................................................ 18
Hình 4.1 Kết quả s-PCR của HP ............................................................................... 28
Hình 4.2 Kết quả BLAS sản phẩm của phản ứng s-PCR phát hiện HP ................... 29
Hình 4.3 Kết quả s-PCR của PCV2 .......................................................................... 30
Hình 4.4 Kết quả BLAS sản phẩm của phản ứng s-PCR phát hiện PCV2 ............... 31
Hình 4.5 Kết quả s-PCR của APP............................................................................. 31
Hình 4.6 Kết quả đánh giá khả năng hoạt động của mồi .......................................... 33
Hình 4.7 Kết quả xác định nồng độ mồi tối ưu......................................................... 34
Hình 4.8 Kết quả xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu ................................................... 35
Hình 4.9 Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu phát hiện bởi phản ứng m-PCR36
Hình 4.10 Kết quả áp dụng quy trình m-PCR trên các mẫu bệnh học ..................... 37

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi heo chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu,
đặc biệt ngành chăn nuôi heo ở nước ta là một trong những ngành chăn nuôi chủ chốt,
chiếm 58% GDP nông nghiệp hằng năm (FAO, 2012). Hiện nay ngành chăn nuôi đang
đối mặt với nhiều dịch bệnh nguy hiểm ảnh hưởng đến năng suất đàn heo, gây tổn thất
kinh tế nặng nề. Trong đó, viêm phổi đa màng thanh dịch do Haemophilus parasuis
(HP), hội chứng còi cọc trên heo cai sữa (PMWS) do Porcine circovirus type 2
(PCV2) và viêm phổi, viêm màng phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)
được xem là những bệnh phổ biến nhất trên heo.
Theo Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2006) cho biết tỉ lệ huyết thanh dương tính
với PCV2 ở một số tỉnh thành phía nam Việt Nam tăng dần qua các năm: 38,97
(2000); 84,90% (2003-2004) 90,26% (2005). Lê Tiến Dũng (2006) khảo sát trên 22
trại chăn nuôi tại địa bàn Tp Hồ Chí Minh thì có đến 17 trại phát hiện dương tính với
PCV2. Ở nước ngoài, theo kết quả phân tích 219 mẫu phổi lấy từ lò mổ ở Slovakia, có
14,2% dương tính APP và 0,91% dương tính với HP (Hicinova , 2010).
Việc chẩn đoán các mầm bệnh bằng kỹ thuật PCR cho kết quả nhanh chóng,
chính xác, đặc hiệu, ít tốn kém và phù hợp với điều kiện nghiên cứu và ứng dụng ở
nước ta. Các nghiên cứu trước đây chỉ nghiên cứu quy trình PCR thường quy để phát
hiện một loại mầm bệnh. Việc phát triển kỹ thuật Multiplex PCR là hết sức cần thiết
để chẩn đoán nhanh cùng lúc nhiều mầm bệnh với độ đặc hiệu cao. Xuất phát từ thực
tiễn trên, được sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Khoa Chăn Nuôi – Thú
Y và dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Tất Toàn và ThS. Đỗ Tiến Duy, chúng tôi
thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện Porcine circovirus type
2 , Actinobacillus pleuropneumoniae , Haemophilus parasuis gây hô hấp phức hợp
trên heo”.
1.2

Yêu cầu của đề tài
Tìm ra quy trình multiplex PCR có tính ưu việt để phát hiện đồng thời ba mầm

bệnh PCV2, APP, HP để phục vụ cho nhu cầu chẩn đoán các mầm bệnh này ở phòng
xét nghiệm.
1


1.3

Nội dung thực hiện
Thực hiện quy trình s-PCR thường quy cho việc phát hiện từng mầm bệnh là

PCV2, APP, HP.
Đánh giá khả năng hoạt động giữa các mồi đặc hiệu cho PCV2, APP, HP.
Xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR phát hiện HP, APP, PCV2.
Xác định chu trình luân nhiệt tối ưu cho quy trình m-PCR phát hiện HP, APP,
PCV2.
Áp dụng quy trình m-PCR phát hiện HP, APP, PCV2 trên những mẫu thu thập
từ thực địa.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Tổng quan về bệnh do virut Porcine circovirus type 2 (PCV2)
Porcine circovirus type 2 - PCV2 được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1991 trên

đàn heo phía tây Canada, kháng thể chống PCV2 đã được phát hiện trong huyết thanh.
Từ những nghiên cứu cho thấy PCV2 khi gây nhiễm trên heo, heo có một số biểu hiện
tổn thương đặc trưng của hội chứng còi cọc trên heo cai sữa (Postweaning
multisystemic Wasting Syndrome – PMWS) (Allan và ctv, 1998; Chea, 2004). PCV2
là nhân tố sơ khởi nhưng không phải là duy nhất gây ra PMWS mà nguyên nhân gây
bệnh là do sự nhiễm thứ cấp của một số vi khuẩn và virut như Porcine parvovirus,
procine reproductive and respiratory syndrome - PRRSV, Mycoplasma hyopneumonia.
Ngoài ra, PCV2 cũng có thể được phát hiện trên heo khỏe, do đó việc chuẩn đoán
PMWS phải đảm bảo 3 yêu cầu: dấu hiệu bệnh lâm sàng đặc trưng trên heo, bệnh tích
vi thể đặc trưng và PCV2 có hiện diện trong mẫu bệnh phẩm từ heo đó (Nguyễn Ngọc
Hải, 2007). Một số nghiên cứu còn cho thấy việc nhiễm PCV2 cũng liên quan đến hội
chứng viêm da thận (PDNS – Porcine Dermatitis And Nephropathy Syndrome), hội
chứng hôi hấp phức hợp trên heo (PRDC – Porcine Respiratory Disease Complex)
(Gresham và ctv, 2000).
2.1.1 Đặc điểm của Porcine circovirus type 2 (PCV2)
Bộ gen của PCV2 có kích thước là 1767 – 1768 bp (Mahe và ctv, 2000), có 6
khung đọc mở, trong đó có hai khung đọc mở lớn nhất là: ORF1 và ORF2. Đây là
vùng được xem là cần thiết cho sự nhân lên của virut. PCV tái bản thông qua dạng
mạch kép trung gian (Meehan và ctv, 1998). Các chủng phân lập của PCV2 có nhiều
kiểu gen khác nhau và được xếp vào 4 nhóm: PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d (Guo
và ctv, 2010).
Gen ORF1 của PCV2 có kích thước là 942 bp và mã hóa cho protein liên quan
đến sự nhân lên của virut, sản phẩm protein mã hóa có kích thước 35,7 kDa (Mandezt
và ctv, 1998). Gen ORF1 còn được gọi là rep gene.
Gen ORF2 của PCV2 có kích thước khoảng 702 bp, mã hóa protein vỏ capsid,
còn được gọi là protein vỏ cap với kích thước 30 kDa (Hamel và ctv, 1998;
Nawagitgul và ctv, 2000). Khi giải mã trình tự gen ORF2 của vỏ capsid virut, những
3

phân lập gen ORF2 ở các nơi trên thế giới có độ tương đồng cao (Larochelle và ctv,
2002; Kamstrup và ctv, 2004). Mặc dù có một số khác biệt về gen ORF2 nhưng vùng
gen mã hóa đầu N cuối (N-terminal region) của ORF2 gần như không thay đổi ở các
chủng phân lập virut trên thế giới (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Theo các nghiên cứu,
protein cap kích thích sự hình thành khác thể trung hòa có trong huyết thanh
(Nawagitgul và ctv, 2000). Do đó protein này là một protein triển vọng trong việc phát
triển các vaccine tái tổ hợp (Blanchard và ctv, 2003; Kamstrup và ctv, 2004) hay dùng
làm kháng nguyên trong các phản ứng huyết thanh học (Nawagitgul và ctv, 2002;
Blanchard và ctv, 2003; Liu và ctv, 2004; Shang và ctv, 2008).
Ngoài ra ORF3 cũng được nghiên cứu gần đây. Gen ORF3 có kích thước
315bp, mã hóa protein có kích thước 11,8 kDa (Liu và ctv, 2005). Gen ORF3 không
cần thiết cho sự tái bản của virut nhưng có vai trò trong sự lan truyền của PCV2. Gen
ORF3 liên quan đến hiện tượng apoptosis và là tác nhân virut gây bệnh trên chuột (Liu
và ctv, 2005; trích dẫn Phạm Thanh Hồng, 2012).
2.1.2 Dịch tễ học của Porcine circovirus type 2 (PCV2)
Người ta đã chứng minh có sự lây truyền ngang PCV2 qua tiếp xúc trực tiếp
miệng - mũi của những heo còn nhỏ. Các chuồng lân cận có thể lan truyền virus PCV2
qua khí dung. Thực nghiệm đã cho thấy, trộn lẫn heo khỏe với heo bệnh PMWS hoặc
nuôi trong những ô chồng cạnh nhau chỉ sau 3 - 4 tuần đã phát hiện những heo khỏe
đều mắc bệnh PMWS (Kristensen và ctv, 2006). Hình thức lan truyền ngang xảy ra
ngay cả khi heo nhiễm PCV2 không biểu hiện triệu chứng lâm sàng và bệnh tích liên
quan.
Truyền dọc được chứng minh trên những cá thể nái trong tự nhiên cũng như
trong thí nghiệm (Johnson và ctv, 2002). West và ctv (1999) và Meehan và ctv (2001)
nhận thấy rằng có sự lây nhiễm từ heo mẹ bị nhiễm qua heo con ngay sau khi sinh
bằng cách phân lập PCV2 từ mẫu mô thai chết. PCV2 cũng được phát hiện trong tinh
dịch những heo đực nhiễm bệnh và sẽ truyền lây khi giao phối (Kim và ctv, 2001).
Ngoài ra, PMWS còn có thể truyền lây thông qua động vật trung gian như chim,
chuột (Kackinnon, 2000), qua thức ăn có chứa sản phẩm heo nhiễm PCV2 chưa được

làm chín (Opriessnig, 2006). Trong các trại chăn nuôi, PMWS có thể tồn tại rất dai
dẳng từ 4 - 18 tháng. Virut PCV2 có thể tồn tại trong heo mang trùng từ 5 - 6 tháng
(trích dẫn Phạm Thanh Hồng, 2012).
4


2.1.3 Bệnh liên quan đến Porcine circovirus type 2 (PCV2)
Biểu hiện lâm sàng thường xảy ra trên heo từ 1 - 2 tuần cai sữa với diễn biến
chậm và có thể kéo dài trong vài tháng (Harding, 1997). Heo mắc PMWS thường gặp
nhất là còi cọc và viêm phổi mãn tính (thở gấp, khó thở). Heo đang bình thường trở
nên xanh xao, gầy ốm nhanh trong vòng 3 - 7 ngày và xuất hiện những con gầy nhất
đàn. Một số heo ho nhẹ, sốt, biếng ăn, khó thở, hoàng dản, rối loạn thần kinh trug
ương, viêm kết mạc và tiêu chảy nhẹ. Heo bệnh có thể chết nhưng không chết ngay, số
còn lại trong đàn khỏe mạnh và phát triển bình thường, tỉ lệ heo bệnh trong đàn có thể
từ 3 - 50 %, tỉ lệ chết có thể lên đến 80 % trong số những heo nhiễm.
Ngoài triệu chứng gây còi, heo trong những trại bị PMWS có biểu hiện đặc
chưng khác là viêm da. Những đốm đỏ hồng thường xuất hiện không đều ở chân trước,
vùng chậu, vùng mông và bụng. nếu bênh kéo dài da trở nên cứng. những heo bệnh có
tỉ lệ chết cao do tổn thương thận nặng. những heo qua khỏi thường biểu hiện suy
nhược, đây là dấu hiệu của việc viêm da sưng thận cũng do PCV2 gây ra (trích dẫn
Bùi Thị Kim Hằng, 2010).
2.2

Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)
Vào năm 1902, Ligniere và Spritz đã mô tả căn bệnh nhưng chưa hề đề cập ở

nước ta. Hiện nay, APP đã xuất hiện ở Việt Nam và trong nền chăn nuôi công nghiệp
Úc, APP được xem là nguyên nhân chính gây viêm màng phổi trên Heo (Mireya,
2004; trích dẫn Phạm Đức Hiền, 2005). Heo là ký chủ tự nhiên duy nhất của bệnh này,
có mức độ truyền lan bệnh rất cao từ đàn này sang đàn khác qua các phương tiện vận

chuyển MasInnes và Rosendal, (1988). Triệu chứng do APP rất thay đổi, có thể gây
chết hoặc mãn tính hoặc không có triệu chứng.
APP gây bệnh trên đường hô hấp của heo là vi khuẩn Gram âm, hình que có vỏ
bọc, trực khuẩn có capsule, không di động, không lông rung, không nha bào, kị khí tùy
nghi. APP biovar 1 chia thành 12 loại serovar. Serovar 5 chia thành 2 type 5A và 5B.
tính đặc hiệu của huyết thanh được xác định bởi lớp vỏ polysaccharide và
lipopolysaccaride của màng tế bào (trích dẫn Lê Kim Sơn, 2004).
2.2.1 Đặc điểm của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)
Yếu tố quan trọng tạo nên độc lực của vi khuẩn APP là ngoại độc tố,
lipopolysaccharide và capsule. Chúng đóng vai trò bảo vệ và nhận diện kháng nguyên
APP. Các yếu tố độc lực được tóm tắt như sau:
5


Ngoại độc tố: liên quan đến dấu hiệu lâm sàng (Rosedal và ctv, 1980) dịch
huyền phù từ APP có thể gây hoại tử và xuất huyết kết hợp với viêm màng phổi. Ở
nồng độ cao, độc tố APP là cytolysin có khả năng phân giải hồng cầu và giết chết các
tế bào lympho, tế bào biểu mô, lympho T và đại thực bào (Macinnes và Smart, 1993,
trích dẫn Quách Thanh Sinh, 2005).
Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chủ yếu cấu tạo nên màng bên ngoài
của APP và có khả năng gây hư hại mô. LPS tinh khiết có khả năng gây hư hại phổi
khác với những tổn thương do xuất huyết và hoại tử do nhiễm APP (Udeze và cs,
1987). Sự tương tác giữa LPS và ngoại độc tố làm tăng độc lực của APP (Izana, 1991)
Vỏ capsule của APP đóng vai trò quan trọng trong việc phòng thủ chống lại hệ
thống miễn dịch của vật chủ (Macinnes và Smart, 1993). Capsule APP có tính kháng
nguyên yếu (Fenwick và Osburn, 1986; Inzana và Mathison, 1987), vai trò chính là
bảo vệ vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi bổ thể trong trường hợp có và không có kháng
thể capsule đặc hiệu (Inzana và ctv, 1988). Các serovar có capsule lớn thì có độc lực
cao hơn (IJensen và Bertran, 1986).
2.2.2

Dịch tễ học của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)
APP không tồn tại lâu trong môi trường xung quanh, đăc biệt trong môi trường

khô ráo. APP có thể truyền trực tiếp từ heo bệnh sang heo nhạy cảm (Wilson và ctv,
1987) hay truyền qua các dụng cụ chăn nuôi, và phương tiện đã bị nhiễm chất tiết của
heo bệnh (Nicolet, 1992). Thời gian ủ bệnh rất thay đổi, trong thực nghiện thời gian từ
lúc biểu hiện bệnh đến khi chết khoảng giờ đến vài ngày. Bệnh xảy ra ở nhiều lứa tuổi
nhưng nhạy cảm nhất là heo choai. Trong heo nhiễm bệnh APP trú ẩn ở hạch hạnh
nhân, xoang mũi và vùng phổi bị tổn thương ( trích dẫn Phạm Đức Hiền, 2005).
2.2.3

Cơ chế sinh bệnh của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)
Gây bệnh thực nghiệm chỉ ra rằng vi khuẩn sinh sống ở hạch hạnh nhân và định

cư vào biểu mô phế nang. Trong tự nhiên vi khuẩn kết bám nhờ fimbriae. Trong phổi,
A. pleuropneumoniae bị thực bào nhanh chóng bởi các đại thực bào phế nang và sản
sinh độc tố ApxI, ApxII và ApxIII. Tất cả các độc tố đó đều độc tiềm tàng cho đại thực
bào, tế bào nội mô, tế bào biểu mô của phế nang và tế bào nội bì của mao mạch ở
thành phế nang. Vi khuẩn được bảo vệ bởi hiện tượng đại thực bào nhờ lớp vỏ của
chúng và cũng đề kháng với hoạt động của bổ thể (Rycroft và Cullen, 1990). Cảm
nhiễm đi cùng với các cytokine chẳng hạn như interleukin-1β và IL-8 trong dịch phế
6


nang, và các yếu tố hoại tử bướu (TNF) cũng xuất hiện trong mô bệnh tích rất sớm
(Baarsch và ctv,1995, trích dẫn Ngô Phương Nghi, 2003).
2.2.4

Triệu chứng bệnh do Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)

Triệu chứng thay đổi theo thú, tình trạng miễn nhiễm của chúng, điều kiện môi

trường và mức độ bộc phát của yếu tố gây bệnh. Bệnh có thể chia làm 3 dạng quá cấp,
cấp tính, mãn tính.
Trong thể quá cấp, một hay nhiều heo trong bầy hoặc khác bầy đột ngột yếu ớt
với thân nhiệt cao 41,5oC, có thời kỳ ói mửa tiêu chảy, chảy máu mũi, miệng. Thú
bệnh nằm dẹp không có triệu chứng hô hấp nhưng tim và tuần hoàn yếu. Thú chết
trong vòng 24 - 36 giờ, trước khi chết trong miệng có nhiều dịch tiết lẫn bọt máu.
Trong thể cấp tính, thân nhiệt tăng 40,5 - 41oC. Thú khó chịu và hôn mê, triệu
chứng hô hấp trầm trọng với khó thở, ho và đôi khi há miệng để thở, tuần hoàn và tim
yếu, tụ máu ở các phần thấp.
Trong thể bán cấp và mãn tính, thú sốt hoặc ho liên tục hoặc ngắt quãng với
cường độ khác nhau, thú ít ăn, giảm tăng trọng, thể mãn tính thường chỉ phát hiện lúc
giết mổ với bệnh tích đặc trưng của phổi. Bệnh mãn tính là nguyên nhân lây lan mần
bệnh giữa các đàn (Taylor, 1999; trích dẫn Phạm Đức Hiền, 2005).
2.3

Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Haemophilus parasuis (HP)
Haemophilus parasuis là vi trùng gây bệnh truyền nhiễm trên đường hô hấp với

đặc điểm là ho, khó thở, thở ngồi kiểu chó ngồi, viêm đa khớp, viêm phổi dính sườn,
viêm tràn dịch, viem màng não và có thể dẫn đến chết. căn bênh được Glasser phát
hiện đầu tiên vào năm 1910, trên những heo viêm đa khớp – viêm thanh dịch, căn bệnh
đã được Hiare và Wramby nghiên cứu năm 1943 và đặt tên haemophilus suis. Bệnh
xảy ra ở hầu hết đàn heo trên thế giới, tỉ lệ mắc bệnh từ 30 – 100 %, tỉ lệ chết có thể là
5 – 10 % (Trần Thanh Phong, 1996).
2.3.1 Đặc điểm của Haemophilus parasuis (HP)
Haemophilus parasuis là vi khuẩn có hình trực khuẩn, gram âm, có tiêu mao và
giáp mô, hiếu khí hay hiếm khí tùy nghi, nhiệt độ thích hợp là 37oC và pH 7,4 - 7,8.
Vi khuẩn có sức đề kháng kém, dễ bị tiêu diệt bởi các chất sát trùng thông thường,

nhạy cảm với sự khô hạn và ánh sáng mặt trời. Những yếu tố stress như thay đổi thời
tiết, thức ăn, cai sữa,.thường là yếu tố mở đường cho sự phát triển của bệnh. Tính sinh

7


bệnh của HP liên quan tới protein 39 Kda của màng ngoài, độc tố dung giải tế bào
(Cytotoxin) đã được đề cập nhưng chưa được xác định (Trần Thanh Phong, 1996).
2.3.2 Dịch tễ học của Haemophilus parasuis (HP)
Heamophilus parasuis gây viêm màng phổi, viêm phế quản phổi, viêm đa thanh
dịch trên heo, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức sống và sức tăng trọng của heo.
Việc lây truyền có thể qua tiếp xúc trực tiếp, qua những giọt khí dung và cũng có thể
lây truyền gián tiếp qua công nhân trong trại. Bệnh cấp tính có thể xảy ra ở nhiều ô
chuồng, do khí dung và không khí chuyển động làm lan truyền mầm bệnh, chỉ cần một
lượng nhỏ Heamophilus parasuis khoảng 102 - 104 cũng đủ để gây nhiễm.
Miễn dịch từ mẹ truyền giảm sau 2 - 4 tuần, vì vậy thời kỳ này bệnh có thể xảy
ra trên heo 2 - 15 tuần, nhưng heo thời kỳ cai sữa 5 - 8 tuần tuổi thường mắc phải, tỉ lệ
tử vong là 5 – 10 % và có thể lên tới 50 %. Có nhiều hơn một serotype có thể gây bệnh
cho một đàn và có nhiều serovars không độc lực ở mũi heo. Miễn dịch thường chỉ
chống với serovars nhiễm, đối với serovars khác thì kém (Trần Thanh Phong, 1996).
2.3.3 Cơ chế sinh bệnh của Haemophilus parasuis (HP)
Các yếu tố gây stress như thay đổi thời tiết, vân chuyển, thay đổi thức ăn, cai
sữa,.. là yếu tố mở đường cho bệnh phát triển nhanh. Sau khi xâm nhập qua đường hô
hấp vào phổi, vi khuẩn cư trú và nhân lên ở phế nang, sau 12 giờ ủ bệnh Heamophilus
parasuis vào máu và gây bại huyết (septicemia) và hậu quả là gây viêm thanh lịch,
viêm đa khớp, viêm màng não có mủ, khi cảm nhiễm qua đường phế quản có thể gây
viêm khí quản phổi, Haemophilus parasuis nhân lên ở niêm mạc phế quản hơn là tế
bào có tiêm mao đường hô hấp. Triệu chứng bệnh xuất hiện rất sớm sau khi nhiễm với
biểu hiện sốt và suy hô hấp. ở trường hợp phổi bị cấp tính phổi bị phù và xuất huyết,
biểu hiện rõ viêm màng phổi nhiều sợi huyết (Nguyễn Trung Ngoan, 2005).

2.3.4 Triệu chứng bệnh do Haemophilus parasuis (HP)
Triệu chứng bệnh có thể thay đổi tùy theo sức khỏe và khả năng miễn nhiễm
của thú, môi trường và mức độ bộc phát của của yếu tố gây bệnh.
Ở thể cấp tính bệnh có thể xảy ra trên heo 3 - 6 tuần tuổi, ở một hay nhiều heo
trong cùng một bầy hoặc khác bầy thú đột nhiên yếu ớt, sốt với thân nhiệt 40 - 41,5oC.
Heo bỏ ăn, có triệu chứng hô hấp, ho, khó thở, thở thể bụng, đặc biệt heo bị khập
khiễng hoặc ngồi kiểu chó ngồi, hầu hết các khớp đều sưng phồng và đau đớn, có thể

8


thấy thủy thũng ở mi mắt, ở tai và mặt. Thú sẽ chết trong vòng 2 - 5 ngày, hiếm khi có
heo chết mà không có heo chết mà không có đỏ đến tím xanh trên da.
Ở thể mãn tính sẽ phát triển khi biểu hiện bệnh cấp tính biến mất sau 5 ngày,
những heo sống sót sẽ chuyển qua viêm khớp mãn tính, viêm nội tâm mạc, viêm dính
ruột, viêm màng não. Heo mãn tính có thể chết đột ngột (Nguyễn Trung Ngoan, 2005).
2.4

Tổng quan về bệnh hô hấp phức hợp
Thuật ngữ bệnh hô hấp phức hợp được sử dụng để mô tả viêm phổi do nhiều

nguyên nhân trên heo phổ biến ở giai đoạn15 đến 20 tuần tuổi, các tác nhân gây bệnh
chính là các tác nhân vi - rút như PRRSV, SIV, PRV, PRCV, PCV2 và các tác nhân vi
khuẩn như Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus
pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Streptococcus
suisvà Arcanobacterium pyogenes. Ngoài các tác nhân gây bệnh đã biết từ lâu, một số
tác nhân gây bệnh mới nổi cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh
hô hấp phức hợp. Sự xuất hiện của PRRSV vào cuối những năm 1980 dẫn đến những
thay đổi đáng kể trong tình trạng sức khỏe của heo trên khắp thế giới. Ngoài PRRSV,
còn có PCV2, PRCV và những sub - type mới của SIV (H3N2) cũng góp phần làm

cho bệnh hô hấp trở nên ngày càng phức tạp (Bùi Thị Hương Linh, 2013).
Cơ chế gây bệnh cụ thể của bệnh hô hấp phức hợp chưa thực sự rõ ràng. Yếu tố
độc lực của vi khuẩn và vi - rút giúp chúng vượt qua hàng rào bảo vệ tự nhiên ở đường
hô hấp và gây bệnh cho vật nuôi. Cơ chế làm thay đổi cấu tạo của hệ thống bảo vệ
đường hô hấp do các tác nhân gây bệnh chính chưa được hiểu một cách cặn kẽ mà qua
bệnh lý mô học cho thấy sự hư hại tế bào biểu mô hoặc mô phổi, thay đổi chức năng
của các đại thực bào phổi, tăng tiết adhesins mà có thể được sử dụng bởi các vi khuẩn
khác đểtấn công tế bào biểu mô đường hô hấp. Một số tác nhân gây bệnh có thể kết
hợp với nhau để phá vỡ hệ thống phòng thủ làm cho đường hô hấp nhạy cảm với các
vi sinh vật gây bệnh khác (Susan và ctv, 2002).
Phân loại mầm bệnh theo tác nhân gây bệnh chính và tác nhân gây bệnh cơ hội
(Susan và ctv, 2002). Tác nhân gây bệnh chính có khả năng phá vỡ cơ chế bảo vệ và
tạo sự nhiễm trùng trên cơ thể vật chủ. Các tác nhân gây bệnh cơ hội xâm nhập và gây
bệnh khi cơ thể bị giảm sức đề kháng bởi tác nhân gây bệnh chính. Một vài tác nhân vi
khuẩn có thể hoạt động với vai trò vừa là nguyên nhân chính vừa là cơ hội tùy thuộc
vào từng tình huống.
9


Ngoài ra, bệnh hô hấp phức hợp còn là hậu quả của các tác nhân không nhiễm
trùng. Nguyên nhân không nhiễm trùng (quản lý và các yếu tố môi trường) góp
phầngia tăng bệnh trên đường hô hấp, bằng cách làm tăng sự lây lan của các mầm
bệnh, tạo ra “stress” cho heo do điều kiện sống không thuận lợi. Trong 30 năm qua,
ngành chăn nuôi đã phát triển với quy mô đàn lớn hơn với mật độ nuôi nhốt caovà hệ
thống thông gió không phù hợp có thể dẫn đến quá nóng hoặc lạnh, tăng stress và tăng
nồng độ amoniac và bụi, gây tác động tiêu cực đối vớihàng rào phòng thủ củahệ hô
hấp. Trong các trại, sự pha trộn heo từ nhiều nguồn và nhóm tuổi khác nhau cũng đóng
góp vào sự lây lan của bệnh (Susan, 2002; trích dẫn Bùi Thị Hương Linh, 2013).
2.5

Polymerase chain reaction (PCR)

2.5.1 Định nghĩa phản ứng PCR
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA
dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng
bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym DNA
polymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này. Nhờ enzym DNA
polymerase xúc tác trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới. Các
mạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp
mạch mới của chu kỳ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia
của các primer tạo các nhóm 3’ OH tự do. Các nucleotid được gắn ở vị trí nhóm OH
kéo dài tạo thành mạch đơn mới (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
2.5.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR
Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính, nhiệt độ được nâng lên 95oC. ở nhiệt độ này,
tất cả các đoạn soắn kép của DNA đều được tách ra. Có thể biến động trong khoảng từ
93 - 100oC.
Giai đoạn 2: là giai đoạn lai, hạ nhiệt độ phản ứng xuống (thấp hơn nhiệt độ
nóng chảy của mồi được sử dụng 3 - 5oC) cho phép các mồi bắt cặp với DNA khuân
mẫu. mức dao động vào khoảng 40 - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi và kéo dài từ 30
giây đến 1 phút.
Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài, nâng nhiệt độ lên 72oC. ở nhiệt độ này Taqpolymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất để kéo dài các mạch DNA. Đoạn DNA nằm
giữa 2 mồi được tổng hợp.thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của
DNA mẫu, thường kéo dài từ 1 giây đến nhiều phút.
10


Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Đây là sự
nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n
chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.
2.5.3 Các thành phần của phản ứng PCR

Primer (mồi): mồi là những đoạn DNA ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản
ứng dây truyền tổng hợp DNA. Chúng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và
tạo ra vị trí bắt đầu tái bản. các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi
(F: forward primer) và một mồi ngược (R: reverse primer). Thiết kế mồi cần tuân thủ
một số nguyên tắc nhất định: dài khoảng 18 - 24 base, Tm của mồi gần nhau, thành
phần nucleotic của các mồi cần trách các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần, mồi phải đặc
trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không hình thành primer dimer, không phải là
trình tự lặp lại.
DNA bản mẫu: hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa
các chất ức chế phản ứng: SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin…).
PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay những mẫu DNA
không được bảo quản tốt.
Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động của Taq-polymerase, hàm lượng quá cao sẽ
tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme.
Nồng độ tối ưu phải được xác định cho phản ứng qua nhiều thử nghiệm.
dNTP: thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng, sự mất cân bằng làm tăng các lỗi
sao chép của polymerase; hàm lượng thường không đổi tùy điều kiện thực tế.
Taq-polymerase: là DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi
khuẩn suối nước nóng có tên Thermus aquaticus do nhà vi sinh vật học Thomas Brock
phát hiện Tap-polymerase xúc tác sự tổng hợp theo chiều 5’- 3’ và hoạt động tốt nhất ở
70 - 72oC (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.5.4 Đọc kết quả phản ứng PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc của phương pháp điện di được dựa trên đặc tính cấu trúc DNA. DNA là
các đại phân tử điện tích âm, DNA sẽ di chuyển về điện cực dương của từ trường.
Dưới tác động của điện trường, sự di chuyển của các phân tử trong bản gel phụ thuộc
vào khối lượng phân tử (số nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel, điện thế của
điện trường. Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc thẳng đứng, để nhận
11

biết phân tử DNA di chuyển đến đâu trong bản gel, người ta có thể sử dụng một dung
dịch có màu (loading dye) được nhuộm chung với sản phẩm PCR khi cho chúng vào
những lỗ nhỏ trên gel. Trong một số dung dịch đệm vẫn có thể có màu, khi đó không
cần dùng đến loading dye. Trong quá trình điện di, phân tử có màu này sẽ di chuyển
nhanh hơn phân tử DNA và ta có thể nhìn thấy một vạch dài có màu này. Sau khi điện
di, bản gel sẽ được nhuộm với dung dịch ethidium bromide. ethidium bromide có khả
năng gắn xen giữa các base của nucleic. Chất này sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng
của tia UV (bước song λ=300 nm) tạo thành vạch đỏ da cam (Nguyễn Thị Lang và Bùi
Chí Bửu, 2005). Để ước lượng kích thước phân tử DNA trên gel agasore, người ta sử
dụng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker – MWM).
Đây là một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết (DNA ladder).
2.5.5 Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phẩn tử, với
nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp… Trong y khoa và
thú y, PCR được sử dụng nhằm chẩn đoán các mầm bệnh, các gen ảnh hưởng đến
phẩm chất thịt, chọn giống vật nuôi, phát hiện đột biến… Trong trong trồng trọt và
công nghiệp thực phẩm, PCR được sử dụng để phát hiện các sản phẩm mang gen đột
biến, chẩn đoán các bệnh trên cây trồng, tạo ra các giống cây đột biến có năng xuất
cao, kháng sâu bệnh mang lại hiệu quả kinh tế cao… Trong sinh học, PCR sử dụng để
phát hiện đột biến, phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm, lựa chọn các cặp cha
mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn, nghiên cứu tiến hóa phân tử, xác định các loài
mới, các loài đặc hữu bằng phương pháp di truyền phân tử. Trong y khoa, PCR sử
dụng chẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền, xác định huyết
thống, truy tìm dấu vết tội phạm…
2.5.6

Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật PCR
Ưu điểm: độ nhạy cao, thời gian thực hiện nhanh, thao tác đơn giản, yêu cầu về

độ tinh sạch của mẫu không cao, lượng mẫu cần ít.
Nhược điểm: bên cạnh những ưu điểm đáng kể trên, để thực hiện phương pháp
PCR cần có DNA mồi đặc chưng cho DNA cần khuếch đại, để có đoạn mồi này cần
phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại. DNA cần khuếch đại không vượt
quá 3kb, cần thận trọng đặc biệt trong thao tác tiến hành dễ dẫn đến ngoại nhiễm.

12


2.6

Phản ứng Multiplex – PCR
Phản ứng multiplex PCR là một dạng khác của phản ứng PCR thông thường, ở

đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng. Phương
pháp này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng thành công
trong nhiều nghiên cứu gồm có phân tích mất đoạn, đột biến, đa hình hoặc trong các
phương pháp định lượng và kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR). Cho đến nay
chưa có nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối ưu hóa phản ứng
multiplex-PCR. Do đó, ứng với mỗi phản ứng cần phải điều chỉnh cho phù hợp với
mục đích mong muốn.
Có 2 dạng m-PCR là phản ứng dùng cùng một khuân mẫu nhưng có thể dùng
nhiều cặp mồi và phản ứng m-PCR trong đó dùng nhiều khuân mẫu và nhiều cặp mồi
trong cùng một phản ứng.

Hình 2.1 Phản ứng multiplex
PCR.( )
Các thông số quyết định trong phản ứng multiplex PCR (Henegariu,1994):
Mồi và nồng độ mồi: Việc lựa chọn mồi tuân theo các quy tắc đơn giản sau:
chiều dài mồi khoảng 18 – 24 bp hoặc hơn và phần trăm GC chiếm 35 % - 60 %, do

vậy, nhiệt độ gắn mồi vào khoảng 55 – 58oC hoặc cao hơn. Những mồi dài hơn cho
phép phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn và thu được ít sản phẩm
không đặc hiệu hơn. Việc kết hợp nhiều mồi trong các hỗn hợp phản ứng khác nhau và
13


nhân lên đồng thời nhiều locus đòi hỏi sự thay đổi và tối ưu các thông số của phản
ứng. Lần đầu khi thực hiện phản ứng multiplex PCR, nên sử dụng các mồi với một
đương lượng gram tương đương nhau (cùng nồng độ). Kết quả này sẽ cho ta thấy
những nồng độ mồi nào hay các thông số nào cần phải thay đổi. từ đó tăng nồng độ
mồi đối với các locus “yếu” và giảm lượng mồi đối với các locus “mạnh”. Nồng độ
cuối cùng của các mồi thay đổi đáng kể giữa các locus và được tính toán tuỳ theo kinh
nghiệm.
Nhiệt độ gắn mồi: đối với các locus được nhân lên riêng biệt, thời gian gắn mồi
(30 – 120 giây) và thời gian kéo dài (30 – 150 giây) không ảnh hưởng rõ rệt tới kết
quả, nhưng tính đặc hiệu của sản phẩm PCR tăng lên hoặc giảm đi phụ thuộc rất nhiều
vào sự thay đổi nhiệt độ gắn mồi. Thấy rằng việc hạ thấp nhiệt độ gắn mồi từ 4-6oC là
cần thiết đối với các locus được nhân lên đồng thời trong phản ứng multiplex PCR.
Nồng độ Mg2+ và dNTP: Nồng độ Mg2+ yêu cầu cho một phản ứng PCR chuẩn
là 1.5mM và nồng độ dNTP vào khoảng 200µM mỗi loại. Ở nồng độ Mg2+ phù hợp
việc khuếch đại trở nên đặc hiệu hơn, các sản phẩm thu được có độ tập trung cao, và
nồng độ Mg2+ cao phản ứng bị ức chế, sản phẩm trở nên khó có thể quan sát. dNTP
với nồng độ cao làm cho việc khuếch đại tức thời bị ức chế, nồng độ dNTP thấp hơn
cho phép khuếch đại phản ứng PCR nhưng với lượng sản phẩm ít hơn. Để làm việc
một cách có hiệu quả, Taq ADN polymerase đòi hỏi phải có Mg2+ tự do, Đây có thể là
lý do việc gia tăng nồng độ dNTP có thể ức chế tức thời phản ứng PCR, ngược lại việc
tăng nồng độ Mg2+ thường mang lại hiệu quả rõ rệt.
Nồng độ DNA khuân và enzyme: ở lượng ADN khuôn vào khoảng 30 và
500ng/25 µl phản ứng, tuy nhiên, dưới 30 ng, sản lượng của một vài sản phẩm PCR bị
giảm xuống. Khi lượng ADN khuôn rất nhỏ (tính bằng pg), việc khuyếch đại đặc hiệu

và có hiệu quả vẫn có thể thu được bằng cách hạ thấp hơn nữa nhiệt độ gắn mồi, đôi
khi xuống từ 10 - 12oC. Nồng độ enzyme hiệu quả nhất vào khoảng 0.4 ul hoặc
2U/25µl thể tích phản ứng.
2.7

Quy trình ly trích DNA
Bước 1: Phá vỡ màng tế bào: thông thường tế bào hoặc mô được nghiền trong

hỗn hợp dung dịch chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7,5), NaCl 5M, EDTA 0,5M, sodium
dodecyl sulfat 10% (SDS). Hỗn hợp này phá vỡ tế bào và màng nhân, giải phóng DNA
ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA, ngoài ra trong thành
14