TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT ALKALOID TRONG CÂY TƠ XANH (Cassytha filiformis L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT
ALKALOID TRONG CÂY TƠ XANH
(Cassytha filiformis L.)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

:NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT
ALKALOID TRONG CÂYTƠ XANH
(Cassytha filiformis L.)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. BÙI THẾ VINH

NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện thành công khóa luận nàyxin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:
Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, thầy Lê Đình
Đôn, cô Tô Thị Nhã Trầm, các Thầy - Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng tất cả
các Thầy - Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi.
PGS. TS. Trần Công Luận, Giám đốc trung tâm Sâm và Dược Liệu, Thầy đã tạo
điều kiện cho em được thực hiện đề tài ở trung tâm.
ThS. Bùi Thế Vinh đã dành nhiều thời gian và công sức, nhiệt tình giúp đỡ, trực
tiếp hướng dẫn và giải đáp các thắc mắc trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.
Tập thể các anh chị (Đan, Thảo, Khoa, Mạnh, Dung, Thương, Mai, Phong, Huấn,
Hiền) đã hết lòng giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài này.
Các bạn làm việc tại Bộ môn Hóa - Chế phẩm đã chia sẻ dụng cụ và dung môi,
động viên và cùng tôi vượt qua nhiều khó khăn.
Các bạn phòng 504, tập thể lớp DH09SH đã chia sẻ những niềm vui, khó khăn và
hỗ trợ để tôi kết thúc đề tài kịp thời gian.

Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Cha Mẹ, Cha Mẹ đã tạo mọi điều kiện
cho tôi học tập, động viên khi tôi khó khăn. Cha Mẹ đã luôn yêu thương, lo lắng và là
nguồn động lực lớn nhất để tôi làm việc.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 6 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Hồng Vân

i


TÓM TẮT
Tơ xanh là một dược liệu truyền thống phổ biến nhiều nơi trên thế giới để chữa trị
ung thư, ho, liệt dương, vàng da, kí sinh trùng châu Phi và nhiều bệnh khác. Loài cây này
có chứa các alkaloid như neolitsine, cassythine, dicentrine, nomeolitsine, cassythidine,
cathaformine, cassyformine,... Ở nước ta, hướng nghiên cứu về dược liệu này còn khá
mới, do đó đề tài này được thực hiện để nâng cao giá trị cây tơ xanh và tận dụng nguyên
liệulàm thuốc.
Nội dung nghiên cứu bao gồm chiết xuất nguyên liệu bằng phương pháp chiết hồi
lưu và dung môi MeOH : AcOH (99:1, v/v). Sau đó kiềm hóa tới pH = 10, lắc với CHCl3,
thu dịch chiết, làm bay hơi bớt dung môi, thu được cao alkaloid tổng. Cao alkaloid tổng
được phân tách tiếp bằng sắc kí cột để thu các alkaloid tinh khiết và các alkaloid này được
xác định cấu trúc bằng dữ liệu phổ NMR và phổ MS.
Kết quả thu được 4 lit dịch chiết đậm đặc. Khối lượng cao tổng là 65 g. Định tính
dịch chiết và cao alkaloid tổng bằng sắc kí lớp mỏng cho thấy có sự hiện diện của
alkaloid. Alkaloid tinh sạch phân lập từ cao alkaloid tổng được xác định cấu trúc bởi dữ
liệu phổ NMR, phổ MS và so sánh với các tài liệu tham khảo.

ii

SUMMARY
Cassytha filiformis L.is a medicinal plant traditionally and popularly used for the
treatment of cancer, cough, impotency, jaundice,African trypanosomiasis and many other
related diseases. The total alkaloid of this plant including neolitsine, cassythine,
dicentrine, nomeolitsine, cassythidine, cathaformine, cassyformine, etc.In our country, the
direction of this plant research is still fairly new, this thesis was made in order to advance
the value of Cassytha filiformis L. and apply the materials for medicine.
The content of this research consists of extractingmaterial by solvent MeOH:
AcOH (99:1, v/v) and reflux extraction. Then the extract was alkalised to pH 10,
extracted with chloroform, obtained and dried the organic layer to yield the total alkaloid
residue. The total alkaloid residue was continously purified by column chromatography to
give the purified alkaloid and elucidated the structure by NMR and MS spectrum data.The
results showed thatextract of raw material obtained 4 litre the bold extract. The weight of
total alkaloid residue is 65 g. Alkaloidis determined to be present in the extract and the
total alkaloid residue by thin-layer chromatography.Alkaloid isolated from total alkaloid
extract was elucidated the structure by NMR spectra, MS spectra and the comparision of
previous references.
Keywords: Cassytha filiformis L., purify alkaloid, determinate the structure of
alkaloid, alkaloid, aporphine.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .............................................................................................................................i 
Tóm tắt ................................................................................................................................. ii 
Summary ............................................................................................................................. iii 
Mục lục ................................................................................................................................iv
Danh sách chữ viết tắt ........................................................ Error! Bookmark not defined. 

Danh sách các bảng ........................................................................................................... vii
Danh sách các hình ........................................................................................................... viii 
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 
1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1 
1.2 Yêu cầu của đề tài ........................................................................................................... 1 
1.3 Nội dung thực hiện ......................................................................................................... 1 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 2 
2.1 Giới thiệu cây tơ xanh .................................................................................................... 2 
2.2. Giới thiệu về alkaloid .................................................................................................... 6 
2.2.1 Khái niệm và cấu tạo alkaloid ..................................................................................... 6 
2.2.2 Danh pháp của alkaloid ............................................................................................... 7 
2.2.3 Phân bố trong tự nhiên của alkaloid ............................................................................ 7 
2.2.4. Tính chất chung của alkaloid ...................................................................................... 8 
2.2.4.1 Lý tính của alkaloid .................................................................................................. 8 
2.2.4.2Hóa tính của alkaloid ................................................................................................. 8 
2.2.5.Chiết xuất, tinh chế và phân lập alkaloid .................................................................... 9 
2.2.5.1 Chiết xuất alkaloid .................................................................................................... 9 
2.2.5.2 Tinh chế và phân lập alkaloid ................................................................................. 11 
2.2.6 Phân loại alkaloid ...................................................................................................... 12 
2.3. Kỹ thuật chiết, tách hợp chất tự nhiên ......................................................................... 13 
2.3.1 Phương pháp chiết hợp chất tự nhiên ........................................................................ 13 
2.3.2 Lựa chọn dung môi chiết ........................................................................................... 13 
2.3.3 Kỹ thuật chiết hồi lưu ................................................................................................ 14 
2.4. Phương pháp sắc kí ...................................................................................................... 14 
2.4.1.Sắc kí lớp mỏng ......................................................................................................... 14 
2.4.1.1 Sắc kí lớp mỏng phân tích ...................................................................................... 15 
2.4.1.2 Sắc kí lớp mỏng chế hóa......................................................................................... 18 
2.4.2 Sắc kí cột ................................................................................................................... 18 
2.5 Phương pháp phân tích phổ NMR ................................................................................ 20 
iv

2.6 Phương pháp phân tích phổ MS ................................................................................... 21
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................................22
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 22 
3.2 Vật liệu ......................................................................................................................... 22 
3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................. 22 
3.3.1 Chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu cây tơ xanh ......................................................... 22 
3.3.2 Chiết alkaloid tổng bằng CHCl3 ................................................................................ 22 
3.3.3 Định tính alkaloid trong dịch chiết và cao alkaloid tổng bằng SKLM .................... 23 
3.3.4. Tinh sạch hợp chất alkaloid ...................................................................................... 23 
3.3.4.1 Sắc kí cột ................................................................................................................ 23 
3.3.4.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế ....................................................................................... 24 
3.3.4.3 Xác định cấu trúc hợp chất alkaloid ....................................................................... 24
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................................25
4.1 Chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu cây tơ xanh ............................................................ 25 
4.2 Chiết alkaloid bằng CHCl3 ........................................................................................... 25 
4.3 Định tính alkaloid trong dịch chiết và cao alkaloid tổng bằng SKLM......................... 26 
4.4. Tinh sạch hợp chất alkaloid ......................................................................................... 27 
4.4.1 Sắc kí cột ................................................................................................................... 27 
4.4.2 Sắc kí lớp mỏng điều chế .......................................................................................... 32 
4.5 Xác định cấu trúc hợp chất alkaloid ............................................................................. 32
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................................36
5.1 Kết luận......................................................................................................................... 36 
5.2 Đề nghị ......................................................................................................................... 36 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 37 
PHỤ LỤC

v

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
AcOH

: Acid acetic

COSY

: Correlation spectroscopy

Ctv

: Cộng tác viên

DEPT

: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

Et2O

: Diethyl ete

h

: Hour (giờ)

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC

: Heteronuclear Single Quantum Coherence

KLPĐ

: Khối lượng phân đoạn

MeOH

: Methanol

MS

: Mass spectrometry

NMR

: Nuclear magnetic resonance

OD

: Optical Density

PĐ

: Phân đoạn

PE

: Petroleum ete

SKC

: Sắc kí cột

SKLM

: Sắc kí lớp mỏng

UV

: Ultraviolet

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Những hiện tượng thường gặp trong SKLM ......................................................17
Bảng 3.1 Thông số các cột sắc kí .......................................................................................23
Bảng 4.1 Thông tin về các phân đoạn cột sắc kí O ............................................................29
Bảng 4.2 Thông tin vềcác phân đoạn cột sắc kí O1............................................................30
Bảng 4.3 Thông tin về các phân đoạn cột sắc kí O1.2.........................................................32
Bảng 4.4 So sánh dữ liệu phổ proton, carbon, HMBC của O1 và Cassythidine ................35

 
 

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây tơ xanh ...........................................................................................................2
Hình 2.2 Cấu trúc khung aporphine .....................................................................................3
Hình 2.3 Cấu trúc của Nicotine .........................................................................................12
Hình 2.4 Cấu trúc của Strychnine ......................................................................................12
Hình 3.1 Sơ đồ các cột sắc kí .............................................................................................24
Hình 4.1 Chiết xuất alkaloid từ cây tơ xanh ......................................................................25
Hình 4.2 Chiết alkaloid bằng CHCl3 .................................................................................26
Hình 4.3 SKLM dịch chiết cây tơ xanh .............................................................................27
Hình 4.4 SKLM cao alkaloid tổng .....................................................................................27
Hình 4.5 Cột sắc kí O.........................................................................................................27
Hình 4.6 Chất thu được từ phân đoạn A ............................................................................27
Hình 4.7SKLM chất A1 trên các hệ dung môi ...................................................................28
Hình 4.8 SKLMcác phân đoạn cột sắc kí O ......................................................................29
Hình 4.9 Cột sắc kí O1 .......................................................................................................30
Hình 4.10 SKLM các chai hứng của cột sắc kí O1 ............................................................30
Hình 4.11 Cột sắc kí O1.2 ...................................................................................................31
Hình 4.12 SKLM các chai hứng của cột sắc kí O1.2 ..........................................................31
Hình 4.13 SKLM chất O1...................................................................................................32
Hình 4.14 Công thức cấu tạo của Cassythidine .................................................................34
Hình 4.15 Tương quan HMBC của chấtO1 ....................................................................... 34

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, người ta đã tổng hợp hóa học nhiều hợp chất dùng làm thuốc nhưng
cũng không thể nào thay thế được các hợp chất từ thiên nhiên, vì nó ít gây tác dụng phụ
và có hoạt lực tốt. Do đó, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên luôn là sự lựa chọn
hàng đầu của mọi người. Xung quanh chúng ta có nhiều cây thuốc mà ta chưa biết tận
dụng hết. Bên cạnh những loại dược liệu đã biết thì còn các loại dược liệu mới chưa được
nghiên cứu nhiều, chẳng hạn như cây tơ xanh (Cassytha filiformisL.). Trong y học cổ
truyền, tơ xanh là vị thuốc có nhiều tác dụng như chữa thận hư, liệt dương, đau xương,
chữa ho, bệnh lậu, chữa lở loét, vàng da, ho ra máu, chảy máu mũi.
Tơ xanh chứa khoảng 0,43% các alkaloid có khung aporphin gồm cassyfiline,
cassythine,
nomeolitsine,

cassythidine,
cathafiline,

laurotenanine,

neolitsine,

cathaformine,

dicentrine,

cassyformine,

actinodaphnine,

N-methylactinodaphnine,

predicentrine và ocoteine. Gần đây, Tung-Hu Tsai (2008) và ctvđã công bố chiết tách

được 2 alkaloid mới là isofiliformine và cassythic acid cùng 22 hợp chất alkaloid và
flavonoid đã biết khác. Trong nước, Ong Tuấn Khoa (2012) đã tách thành công
cassythine từ cây tơ xanh. Mặc dù công dụng của tơ xanh được biết đến nhiều nhưng các
nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của đối tượng này còn ít. Do đó, đề
tài “Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid trong cây tơ xanh (Cassytha
filiformisL.)” được thực hiện để đóng góp thêm thông tin cho nguồn dược liệu mới.
1.2 Yêu cầu của đề tài
Chiết xuất alkaloid từ cây tơ xanh. Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất
alkaloid từ alkaloid tổng.
1.3 Nội dung thực hiện
- Chiết xuất alkaloid từ cây tơ xanh rồi chiết alkaloid tổng bằng CHCl3.
- Định tính hợp chất alkaloid trong dịch chiết và cao alkaloid tổng bằng SKLM.
- Tinh sạch hợp chất alkaloid bằng các phương pháp sắc kí.
- Xác định cấu trúc hợp chất alkaloid.
1


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu cây tơ xanh
Cây tơ hồng xanh còn được gọi là cây tơ xanh.
Tên khoa học:Cassytha filiformisL.
Họ: Long não(Lauracea)

A

B

Hình 2.1Cây tơ xanh. A:Dây và hoa cây tơ xanh;B: Cây tơ xanh sống bám trên cây
khác.( /> Mô tả: Cây thân dây leo, khi non có lông sau nhẵn. Thân cành dạng sợi, mọc xoắn
vào nhau, màu lục sẫm. Lá không có hoặc tiêu giảm thành vảy.Cụm hoa gồm nhiều hoa

nhỏ, màu trắng, không cuống, xếp thành bông dài 1,5 - 5 cm, lá hình tròn, có lông dạng
mi, bao hoa có ống ngắn, gồm 6 thùy, 3 thùy ngoài nhỏ, tròn, có lông, 3 thùy trong lớn
hơn, nhị 6 hoặc 9. Quả hạch, hình cầu, bao trong ống cùng lớn lên và hóa nạc, tựa như
một quả mọng. Khoảng tháng 10-12, cây cho hoa và kết quả(Nelson S. C., 2008).
 Phân bố, sinh thái: Chi Cassytha L. gồm khoảng gần 20 loài, phân bố chủ yếu ở
vùng nhiệt đới, nhất là Australia có 15 loài, trong đó 13 loài là đặc hữu. Ở Việt Nam chi
này có 2 loài. Tơ xanh phân bố rộng rãi khắp các vùng nhiệt đới ở cả 2 bán cầu, từ châu
Phi đến châu Đại Dương và châu Á. Loài tơ xanh phân bố rộng rãi khắp các vùng nhiệt
đới ở cả hai bán cầu từ châu Phi đến châu Đại Dương và châu Á. Ở châu Á, tơ xanh có
mặt hầu như khắp các nước vùng Nam Á (Ấn Độ, Sri Lanka) đến vùng Đông Nam Á
(Indonesia, Philippine, Thái Lan, Malaysia, Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam), đảo
Hải Nam, vùng Trung và Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, tơ xanh cũng phân bố phổ biến
2


hầu như khắp các tỉnh miền núi (dưới 1500m), trung du và đôi khi gặp cả ở các tỉnh đồng
bằng ven biển và hải đảo(Wu Y. C. và ctv, 1997).
Tơ xanh là một dạng sống khá đặc biệt. Toàn cây có diệp lục nhưng lại sống bán kí
sinh trên các loại cây cỏ thuộc nhiều họ thực vật khác nhau, cây ưa sáng, chịu được khí
hậu khô nóng ở các vùng đồi cây bụi, nương rẫy và rừng thưa. Khi tơ xanh bám trên các
loại cây 2 lá mầm như sim, mua, xoài thì nó thường cắm các giác mút vào vỏ cây chủ để
trở thành đối tượng kí sinh. Ngược lại, khi nó bám trên các thân, lá các loài cỏ cây có một
lá mầm) như cỏ tranh, cỏ lông, cỏ bông thì không thấy có giác mút nữa mà chỉ là cây phụ
sinh, các tế bào diệp lục trên thân làm chức năng quang hợp và bảo đảm toàn bộ quá trình
dinh dưỡng của cây.Tơ xanh ra hoa quả nhiều hằng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt.
Tuy nhiên, quá trình nảy mầm của hạt cần có sự cộng sinh của một loại vi khuẩn làm
mềm vỏ hạt. Cây còn có khả năng tái sinh vô tính từ những đoạn thân, cành khi được tiếp
xúc với cây chủ hoặc cây giá thể(Stevigny C. và ctv, 2002).
 Thành phần hóa học của cây tơ xanh: Tơ xanh chứa khoảng 0,43% alkaloid gồm
gồm neolitsine, cassythine, dicentrine, actinodaphnine, nomeolitsine, neolitsine và

cassythidine,

cathafiline,

cathaformine,

cassyformine,

N-methylactinodaphnine,

predicentrine và ocoteine. Ngoài ra,trong tơ xanh còn có các hợp chất khác như: các hợp
chất lignan, aldehyd thơm và phytosterol(Pelletier S. W. và ctv, 2001).

R3
R2
N

R1

H

R7

R4

R6
R5
Hình 2.2Cấu trúc khung aporphine
(Caroline Stevigny, 2004)

3


 Bộ phận dùng: Toàn cây, thu hái quanh năm, chủ yếu vào mùa hè, cắt ngắn, rửa
sạch, phơi khô trong bóng râm(Collins D. J. và ctv, 1990).
 Tác dụng dược lý: Tơ xanh có vị ngọt, hơi đắng, tính mát, hơi có độc, tác dụng
thanh nhiệt, lợi thấp, lợi tiểu, hoạt huyết.Dùng chủng Salmonella typhi TA 98 tiến hành
thí nghiệm gây đột biến cho thấy dịch chiết từ tơ xanh có tác dụng làm giảm đột
biến.Alkaloid lautotetanine có tác dụng giống strychnine, gây co giật với liều lớn có thể
gây tử vong.Aporphinoid alkaloid trong tơ xanh là các độc tố tế bào, có khả năng chống
và ngăn ngừa các tế bào ung thư (thử nghiệm invitro trên tế bào ung thư HeLa), tác dụng
kháng ki sinh trùng (thử nghiệm in vitro trên Tripanosoma brucei brucei)(Chang và ctv,
1997).
 Công dụng: Ở Việt Nam, tơ xanh làm thuốc bổ, chữa thận hư, liệt dương, mắt mờ,
chân tay yếu mỏi, đau xương, chữa ho, bệnh lậu, chữa lở loét. Ở Trung Quốc, tơ xanh
chữa phế nhiệt sinh ho, gầy mòn do can nhiệt, vàng da, ho ra máu, chảy máu mũi, mụn
nhọt, bỏng(Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, 2004).
 Tầm quan trọng của alkalloid trong dược liệu: Alkaloid nói chung là những chất có
hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc. Tác dụng của alkaloid thường khác nhau và tác
dụng của các sản phẩm dược liệu không phải bao giờ cũng giống như các alkaloid tinh
khiết đã được phân lập.
Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương: Các chất gây trầm cảm như morphine,
codeine, scopolanine, reserpine; các chất gây kích thích như strychnine, caffeine, lobeline.
Tác dụng trên hệ thần kinh tự chủ: Chất kích thích giao cảm: ephedrine, hordeine;
chất gây liệt giao cảm: ergotanine, yohimbine; chất kích thích phó giao cảm: pilocarpine,
eserine; chất làm liệt phó giao cảm: hyoxiamine, atropine; chất phong bế hạch giao cảm:
nicotine, sparteine, xicutine.
Thuốc gây tê trị co giật: Gây tê tại chỗ: cocain; gây giãn cơ: d-tubecurarine; trị co
giật: papaverine.
Thuốc tác dụng trên tim: -fagarine, ajmaline và quinidine là thuốc chống rung

tim; quinine, emetine có tác dụng gây trầm cảm.
Thuốc huyết áp: Gây tăng huyết áp có ephedrine, hydrastine; làm hạ huyết áp:
alkaloid trong cây ba gạc.
4


Tác dụng trên vi khuẩn,kí sinh trùng: Nhiều alkaloid chỉ có tác dụng diệt vi khuẩn
ở liều cao; diệt kí sinh trùng sốt rét: quinine; diệt lỵ amip: emetine, conexine; trị giun sán:
penlentierine, arecoline(Đỗ Xuân Ngọc, 2012).
 Bài thuốc chứa tơ xanh: Viêm thận, sỏi bàng quang: Tơ xanh 30-60 g, mộc thông
20 g, sắc uống.Trẻ suy dinh dưỡng, lòng bàn chân bàn tay nóng, tinh thần uể oải:Tơ xanh
đổ ngập nước, sắc lấy còn nửa bát, chia thành 2 phần uống trong ngày.Vàng da ở trẻ nhỏ:
Tơ xanh 15-30 g, nấu với đậu phụ thành món canh, ăn với cơm hằng ngày.Chảy máu
cam:Tơ xanh 15-30 g, thịt lợn nạc 50 g, thêm nước và rượu (lượng bằng nhau) hầm lên
ăn.Tiểu tiện nhỏ giọt, nước tiểu lẫn máu: Tơ xanh 15-30 g, sắc với nước, thêm đường đen
vào uống hết trong ngày.Mộng tinh, di tinh, xuất tinh sớm: Tơ xanh 60 g, xương sống lợn
đực 150 g, thêm 100 ml rượu tốt, ninh chín để ăn.Âm nang sưng to: Tơ xanh 20-30 g nấu
cùng trứng vịt vỏ xanh. Ăn trứng, uống nước thuốc.Ghẻ, chàm, mụn nhọt lở loét: Dùng tơ
xanh nấu nước rửa.Bỏng lửa: Tơ xanh nghiền thành bột mịn, trộn với dầu vừng, bôi vào
chỗ bị bỏng.Eczema và mụn nhọt: giã cây tươi và đun sôi trong nước để rửa.Viêm thận
mạn tính: Tơ xanh, cỏ bờm ngựa, cỏ ban, mỗi vị 30g, sắc uống. Chữa thận hư mắt mờ, liệt
dương, chân tay yếu mỏi: Tơ xanh 10-20g sắc uống hằng ngày, phối hợp với cà gai leo,
ngũ gia bì, dây gắm, dây đau xương(Đỗ Tất Lợi, 2004).
 Một số nghiên cứu về cây tơ xanh: Năm 2002, Caroline Stevigny vàctvđánh giá
các aporphinoid alkaloid là thành phần hoạt chất có họat tính trong tơ xanh gồm
actinodaphnine, cassythine, dicentrine, có tác dụng độc tế bào trên một số dòng tế bào ung
thư như HeLa, Mel-5, HL-60, chống ngưng tập tiểu cầu và kháng kí sinh trùng
Trypanosoma brucei brucei gây bệnh ngủ, đặc biệt, nghiên cứu dược lý của tác giả này
chứng minh actinodaphnine là alkaloid có tác dụng ức chế chọn lọc trên các dòng tế bào
ung thưin vitro (trên dòng tế bào thường 3T3 IC50: 66,4 µM, trên các dòng tế bào ung thư

HeLa: 30,9 µM, Mel-5: 25,7 µM, HL-60: 15,4 µM).
Đến năm 2004, Caroline Stevigny và ctv, đã so sánh hoạt tính gây độc tế bào của 7
hợp chất aporphine trên dòng tế bào Hela. Glaucine có hoạt tính cao nhất (IC50 = 8,2 µM).
Để làm rõ cơ chế hoạt động, sự gắn kết với phân tử DNA được nghiên cứu bằng độ hấp
thu tia tử ngoại. Kết quả đo OD cho thấy 7 aporphine đều gắn kết hiệu quả với DNA như
5


một chất xúc tác điển hình. Thử nghiệm sinh hóa cho thấy actinodaphnine, cassythine và
dicentrine ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của topoisomerase trái với 4 aporphine khác.
Năm 2008, Tung-Hu Tsai và ctv đã chiết tách được 2 aporphine alkaloid mới, đặt
tên là isofiliformine và cassythic acid cùng 22 hợp chất alkaloid và flavonoid đã biết
khác. Họ đã thí nghiệm co động mạch chủ ở chuột bởi phenylendrinecủa các hợp chất
cassythic acid, cassythine, neolitsine và dicentrine với IC50 trong khoảng 0,08 - 2,48 µM
so với acetylcholine 3 µM để đánh giá hoạt tính giãn mạch máu.
Năm 2008, Nelson S. C. đã nghiên cứu tổng quát về cây tơ xanh ở Hawaii như đặc
điểm sinh thái, công dụng, ảnh hưởng của cây chủ đến tơ xanh.
Năm 2011, tại Ấn Độ, Mythili S. và Gajalakshmi S. nghiên cứu nhiều kích thước
khác nhau của Cassytha filiformis L. và cáctính chất, tác dụng dược lý của tơ xanh để ứng
dụng cho ngành công nghiệp dược phẩm.
Năm 2012, Ong Tuấn Khoa đã cô lập và tinh sạch thành công chất cassythine trong
cây tơ xanh.
2.2. Giới thiệu về alkaloid
2.2.1 Khái niệm và cấu tạo alkaloid
Meissner là người đầu tiên đưa ra khái niệm về alkaloid và có định nghĩa:
“Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và lấy từ thực vật
ra”.Sau này, Polonopski đã đưa ra định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có
chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi
trong động vật, thường có hoạt tính sinh học mạnh và cho phản ứng hoá học với một số
thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid”( />Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có các nguyên tố nitơ, cacbon và hidro, đồng

thời cũng hay gặp oxy. Vì vậy,alkaloid chia làm hai loại: loại mang oxy và loại không
mang oxy. Những alkaloid không có oxy cấu tạo hóa học chỉ là C, H, N như: conine
(C8H17N), nicotine (C10H14N2), spacteine (C15H28N2), semperoirine(C19H16N2). Những
alkaloid có nhiều oxy là: morphine (C17H19O3N), codeine (C18H12O3N), orpheus
(C17H23O3N), cocaine (C17H21O4N), orpheu (C20H24O2N2)(Đỗ Xuân Ngọc, 2012).

6


2.2.2 Danh phápcủa alkaloid
Các alkaloid trong dược liệu thường có cấu tạo phức tạp nên người ta thường gọi
chúng theo một tên riêng. Tên của các alkaloid luôn có đuôi “ine” và xuất phát từ
 Tên chi hoặc tên loài của cây +ine:
Ví dụ: Papaverine từ Papaver somniferum, Strychnine từ Strychnos.
 Đôi khi dựa vào tác dụng của alkaloid đó:
Ví dụ: Emetine do từ emetos có nghĩa là gây nôn, morphine do từ 7orpheus là gây ngủ.
 Có thể xuất phát từ tên người:
Ví dụ: Pelletierine từ tên riêng Pelletier, nicotine từ tên riêng Nicot J.
Những alkaloid phụ tìm ra sau hoặc có cấu trúc tương tự thường được gọi tên bằng
cách thêm tiếp đầu ngữ hoặc biến đổi tiếp vĩ ngữ của alkaloid chính (biến đổi ine→idine,
amine, aline, imine), hoặc biến đổi vần (narcotine → cotarnine, tarconine). Tiếp đầu ngữ
Nor diễn tả một chất đã mất 1 nhóm methyl. Ví dụ: Ephedrine (C10H15ON)→
norephedrine (C9H13ON). Các đồng phân thường có tiếp đầu ngữ: Pseudo, iso, epi, neo,
allo, homo, meso,…(Ong Tuấn Khoa, 2012).
2.2.3 Phân bố trong tự nhiên của alkaloid
Ở nấm, alkaloid có trong nấm cựa khỏa mạch (Claviceps purpurea), nấm Amanita
phalloides.
Ở động vật, cũng đã tìm thấy nhiều alkaloid hơn. Samandarine, samandaridine,
samanine có trong tuyến da của loài kỳ nhông Salamandra maculosa và Salamandraaltra.
Bufotenine, bufotenidine, dehydro bufotenine lấy từ nhựa cóc (Bufo bufogagorizans,

B.bufo asiaticus, B. melansiticus). Batrachotoxine có trong tuyến da của loài ếch độc
(Phyllobates aurotenia).
Alkaloid tập trung ở một số họ nhưApocynaceae (họ Trúc Đào) có gần 800
alkaloid, Papaveraceae (họ thuốc Phiện) gần 400 alkaloidvới cấu trúc và hoạt tính sinh học
rất đa dạng. Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa
ít nhất 0,05% alkaloid so với mẫu cây khô. Trong cây, alkaloid thường tập trung ở một số
bộ phận nhất định(Bùi Thế Vinh, 2008).

7


2.2.4. Tính chất chung của alkaloid
2.2.4.1 Lý tính của alkaloid
Thể chất: phần lớn alkaloid trong công thức cấu tạo có oxy thường ở thể rắn ở nhiệt
độ thường. Vídụ: morphine (C17H19NO3), codeine (C18H21NO3).
Những alkaloid trong công thức cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng. Ví dụ:
coniine (C8H17N), nicotine (C10H14N2). Tuy nhiên, trong thiên nhiên cũng có một số
alkaloid trong công thức cấu tạo có oxy vẫn ở thể lỏng như arecoline (C8H13NO2), và một
vài chất không có oxy vẫn ở thể rắn như sempervirine (C19H16N2).
Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng
có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi chảy.
Những alkaloid ở thể lỏng thì bay hơi được, thường bền vững và không bị phân hủy
ở nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu.
Về mùi vị, đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như
capsaicine, piperine. Về màu sắc, hầu hết các alkaloid đều không màu, trừ một vài
alkaloid có màu vàng như berberine, palmatine, chelidonine.
Về độ tan, các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước mà thường tan tốt
trong dung môi hữu cơ, trái lại các alkaloid ở dạng muối thường dễ tan trong nước và hầu
như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực. Có một số trường hợp ngoại lệ,
alkaloid dạng base lại tan tốt trong nước như nicotine, colchicine, caffeine, alkaloid dạng

muối lại ít tan trong nước như berberin nitrat. Một số alkaloid có chức phenol như
morphine, cepheline tan trong dung dịch kiềm.
Năng suất quay cực: phần lớn alkaloid có khả năng quay cực vì trong cấu trúc có
carbon không đối xứng, một số không có tác dụng với ánh sáng phân cực (vì không có
carbon không đối xứng trong cấu trúc). Năng suất quay cực là hằng số giúp kiểm tra độ
tinh khiết của alkaloid. Khi có hai dạng D và L thì alkaloid dạng L có tác dụng sinh lý
mạnh hơn dạng D(Bùi Thế Vinh, 2008).
2.2.4.2Hóa tính của alkaloid
Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tính base mạnh
(nicotine), cũng có chất tính base rất yếu (caffeine, piperine), vài trường hợp ngoại lệ có
những alkaloid không có phản ứng kiềm như colchicine, ricinine, theobromine và đặc
8


biệtcó chất có phản ứng acid yếu như arecaidine, guvacine.Do có tính base yếu nên có thể
giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung tính và mạnh như
NH4OH, MgO, carbonat kiềm, NaOH. Khi định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid,
phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp.
Khi tác dụng với các acid, alkaloid cho các muối tương ứng.Alkaloid kết hợp với
kim loại nặng (Hg, Bi, Pt) tạo ra muối phức.Các alkaloid cho phản ứng với một thuốc thử
chung của alkaloid. Những phản ứng chung này được chia làm hai loại.
● Phản ứng tạo tủa:Có hai nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid
- Nhóm thuốc thử thứ nhất cho kết tủa rất ít tan trong nước, có nhiều thuốc thử tạo
tủa với alkaloid:Thuốc thử Mayer (K2HgI4-kali tetraiodomercurat): cho tủa trắng hay vàng
nhạc; thuốc thử Bouchardat (iodo-iodid): cho tủa nâu; thuốc thử Dragendorff (KBiI4-kali
tetraiodobismutat

III):

cho

tủa

vàng

cam

đến

đỏ

cam;

muối

Reinecke

[acid phosphovonframic-H3P(W3O10)4]; thuốc thử Scheibler [acid silicovonframicH2Si(W3O10)4]; thuốc thử Sonnenschein [acid phosphomolybdic-H3P(Mo3O10)4].
- Nhóm thuốc thử thứ hai cho kết tủa ở dạng tinh thể: Dung dịch vàng cloride, dung
dịch platin cloride, dung dịch nước bão hòa acid picric, acid picrolonic, acid styphnic. của
Các dẫn chất này thường được đo điểm chảy để góp phần xác định các alkaloid.
● Phản ứng tạo màu: Có một số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu
đặc biệt khác nhau, do đó có thể dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid. Phản ứng
tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho ta biết có alkaloid
nào trong đó. Những thuốc thử tạo màu quan trọng là: acid sulfuric đậm đặc, acid nitric
đậm đặc, thuốc thử Frohde (acid sulfomolibdic), thuốc thử Marquis (sulfoformol), thuốc
thử Mandelin (acid sulfovanadic), thuốc thử Erdmann (acid sulfonitric), thuốc thử
Wasicky (p.dimetylaminobenzaldehyl hòa trong H2SO4), thuốc thử Merke (acid
sulfoselenic)(Bùi Thế Vinh, 2008).
2.2.5.Chiết xuất, tinh chế và phân lập alkaloid

2.2.5.1 Chiết xuất alkaloid
 Phương pháp chiết tách alkaloid dưới dạng base
Ưu điểm: Hiệu suất chiết các chất cao hơn vì dịch chiết sạch, dễ tinh chế và loại
được các tạp chất; các dung môi hữu cơ không phân cực thường là các dung môi có khả
9


năng chiết chọn lọc đối với alkaloid ở dạng base.Nhược điểm: Dung môi hữu cơ thường
là các dung môi đắt tiền, khi sử dụng các dung môi này để chiết đòi hỏi các thiết bị phức
tạp,kinh phí đầu tư lớn.
Phương pháp tiến hành gồm các giai đoạn sau:
● Giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu: Để tăng khả năng chiết, phải xay nhỏ dược liệu
trước khi chiết nhằm làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa hai pha rắn và lỏng, giúp đẩy nhanh
quá trình khuếch tán. Tuy nhiên, khi dược liệu xay quá nhuyễn, dung môi sẽ khó chuyển
động qua khối dược liệu và thời gian thu dịch chiết lâu hơn. Như vậy, tùy vào từng loại
dược liệu mà xay nhỏ với kích thước phù hợp để vừa đảm bảo đẩy nhanh quá trình
khuếch tán, vừa dễ dàng lấy dịch chiết. Kiềm hóa và làm trương nở nguyên liệu bằng
dung dịch kiềm (thường dùng Ca(OH)2, NH4OH, Na2CO3) để chuyển alkaloid trong
nguyên liệu sang dạng base.
● Giai đoạn chiết: Sử dụng các dung môi chiết là các dung môi hữu cơ không phân
cực (các dung môi tan trong nước).
● Giai đoạn tinh chế: Thu các alkaloid bằng cách chuyển dạng muối với acid và
chuyển dạng base bằng kiềm, sau đó, phân chia chúnggiữa hai pha dung môi hữu cơ
không phân cực và nước để loại các tạp chất không phải là alkaloid.
 Phương pháp chiết tách alkaloid dưới dạng muối
Ưu điểm: Dung môi rẻ tiền, dễ tìm, thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít.Nhược
điểm: Dịch chiết lẫn nhiều tạp chất, khó tinh chế làm cho hiệu suất chiết thấp; đối với
dược liệu chứa nhiều nhựa, chiết bằng nước sẽ gây khó khăn khi lấyalkaloid từ dịch chiết.
Phương pháp tiến hành gồm các giai đoạn sau:
● Giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu: Nguyên liệu được xay thô, rồi làm ẩm cho trương

nở bằng nước.
● Giai đoạn chiết: Chiết alkaloidbằng nước dưới dạng muối tự nhiên hoặc muối của
acid vô cơ, hoặc bằng cồn hay dung môi methanol khi muốn chiết alkaloid cả dưới dạng
muối và base.
● Giai đoạn tinh chế: Khi chiết bằng nước, alkaloid base được giải phóng từ dịch chiết
bằng cách thêm kiềm, sau đó chiết với một dung môi hữu cơ không tan trong nước. Làm
bốc hơi dung môi và cô cạn lại trong dung môi hữu cơ hoặc chuyển sang dạng muối rồi
10


cô cạn. Khi chiết bằng cồn, dịch chiết cồn được cô đặc, thêm acid và loại tạp chất bằng
cách chiết với dung môi hữu cơ khôngphân cực, thêm kiềm để chuyển alkaloid sang dạng
base, rồi chiết alkaloid bằng một dung môi hữu cơ khác. Cô cạn dung dịchđể thualkaloid
hoặc chuyển sang dạng muối(Đỗ Xuân Ngọc, 2012).
2.2.5.2Tinh chế và phân lập alkaloid
Sau khi chiết tách, ít khi thu được một alkaloid tinh khiết mà thường là một hỗn
hợp các alkaloid còn lẫn tạp chất.Nếu chỉ có một alkaloid thô thì tinh chế bằng cách
chuyển nó từ dung môi hữu cơ sang dung môi nước và ngược lại, cuối cùng làm bốc hơi
dung môi thu được một alkaloid tinh khiết. Nếu là hỗn hợp nhiều alkaloid, để tinh chế và
phân lập riêng từng alkaloid thường dùng một số phương pháp dưới đây.
● Phương pháp trao đổi ion: Đối với các alkaloid khó tách, có thể sử dụng phương
pháp trao đổi ion để nghiên cứu tiến hành thuận lợi hơn.Phương pháp trao đổi ion dựa vào
sự trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch muối alkaloid và các ion đã bị hấp
phụ trên chất mang (nhựa trao đổi ion). Các nhựa trao đổi này không tan trong nước và
các dung môi hữu cơ. Các alkaloid trong hỗn hợp thường có độ kiềm khác nhau, do đó khi
qua cột trao đổi ion có sự hấp phụ khác nhau và trong lớp ionid xảy ra sự trao đổi kép nối
tiếp nhau, chất có độ kiềm lớn bị giữ lại ở trên và chất có độ kiềm nhỏ chuyển sâu vào cột
ionid, nhờ đó mà tách riêng các alkaloid ra (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2005).
● Phương pháp sắc kí cột: Dựa trên nguyên tắc các thành phần trong hỗn hợp
alkaloid có độ hấp phụ khác nhau trên chất hấp phụ đã nạp trong cột. Để tách hoàn toàn

các alkaloid trong cột, phải dùng một dung môi hay một hệ dung môi chạy qua cột để rửa
giải các alkaloid đã hấp phụ trong cột (Nguyễn Viết Kình, 2006).
● Sắc kí lớp mỏng điều chế (chế hóa): Dựa theo nguyên tắc của SKLM, dịch chiết
đậm đặc alkaloid được chấm lên những tấm kính đã tráng chất hấp phụ. Sau khi khai triển
bằng một hệ dung môi thích hợp, các chất khác nhau được tách ra ở những vị trí khác
nhau. Để xác định vị trí các alkaloid đã tách ra một cách dễ dàng dưới ánh sáng tử ngoại,
thường dùng chất hấp phụ có trộn thêm chất phát quang. Ví dụ silicagel GF254, silicagel
GF254+365, oxyt nhôm GF254, oxyt nhôm GF254+365 của hãng MERCK. Nếu chất hấp phụ
không có chất phát quang thì dùng tấm kính khác phủ lên tấm sắc kí, phun thuốc thử lên
một phần nhỏ ở bên phải và bên trái tấm sắc kí, từ đó đánh dấu từng dải chất hấp phụ chứa
11


alkalooid. Sau đó,, cạo lấy riêêng từng phhần chất hấpp phụ có chhứa các alkaloid riêng biệt, rồi
chiết riêng lấy từ
ừng chất bằằng dung môi
m thích hợ
ợp, sau đó, cho bốc hơ
ơi để thu đư
ược từng
V Kình, 2006).
alkalooid riêng biệệt(Nguyễn Viết
2.2.6 Phân loại alkaloid
a
Alkaloid là
l những baase bậc 1, bậc
b 2 hay bậc
b 3 đôi khi
k là các am
moni hydraat bậc 4.

Hầu hết
h các alkaloid có nitơ
ơ tham gia vào
v nhân dịị vòng, nhưnng cũng có alkaloid mà
m nitơ ở
ngoài vòng. Ngàày nay, tùyy theo cấu trúc của nhhân mà cácc alkaloid đó
đ được phhân loại
k
có nhhân dị vòngg, có nhân dị vòng, có
c nhân steerol và có cấu
c trúc
thành alkaloid không
terpenn.
- Alkaloid
d không có nhân dị vòòng:Những alkaloid thuuộc loại nàày có các am
min còn
gọi làà proto alkaaloid và có nitơ đính vào
v mạch ngang,
n
ví dụ
d hordeninne trong mạạch nha,
epheddrine trong ma
m hoàng, capsaicine
c
t
trong
ớt.
- Alkaloid
d có nhân dị
d vòng: cácc alkaloid looại này có thể

t có một vòng hay có
c nhiều
vòng. Có các nhó
óm chính:
+ Những alkaloid làà dẫn xuất của nhân pyrrol:
p
Pyrrrolidine troong cà rốt, hygrine
trong lá coca.
+ Những alkaloid là dẫn xuất của
c nhân pyyridin: Areccoline trongg hạt cau; nicotine
n
trong thuốc lá.
+ Những alkaloid làà dẫn xuất của nhân indol:Strychhnine, bruxxine trong mã
m tiền,
cocainne trong lá coca.

Cấu trúc củaNicotine
Hình 2.3C

c Strychnnine
Hình 2.44Cấu trúc của

C
Stevvigny, 2004)
(Caroline

12


+ Dẫn xuất của nhân imidazol: Theophylline trong chè, theobromine trong cacao,

caffeine trong chè và cà phê.
+ Dẫn xuất của nhân quinoline:Quinine, quinidine, xinchonine, xinchonidine từ
trong vỏ canhkina.
+ Dẫn xuất của nhân isoquinoline:Berberine trong Hoàng liên gai, papaverine,
narcotine trong thuốc phiện.
+ Dẫn xuất của nhân phenanthren:Morphine, thebaine, codeine trong thuốc phiện,
colchicine trong tỏi độc.
+ Alkaloid có nhân sterol: Có một khung cyclopentanoperhydrophenantren và có
một hoặc hai nitơ trong mạch nhánh đã đóng vòng ở vị trí C - 17 hoặc ở vị trí C - 3. Ví dụ
ancamine trong họ cà (Đỗ Xuân Ngọc, 2012).
2.3. Kỹ thuật chiết, tách hợp chất tự nhiên
2.3.1 Phương pháp chiết hợp chất tự nhiên
Phương pháp chiết dùng để tách chất ra khỏi hỗn hợp chất rắn, huyền phù hoặc
dung dịch bằng dung môi thích hợp ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ sôi của dung môi. Cơ
sở vật lí của phương pháp này là dựa vào định luật phân bố Nernst: Khi thêm một cấu tử
thứ ba vào hệ dung dịch có hai cấu tử không tan hoàn toàn vào nhau hoặc tan có giới hạn
thì sự hòa tan của cấu tử này vào hai cấu tử theo một tỉ lệ nhất định tại nhiệt độ không đổi,
gọi là hằng số Nernst K. K được xác định như sau:
K=

S1 C1
=
S2
C2

C1, C2 là nồng độ của các cấu tử trong dung môi
S1, S2 là độ tan của hai cấu tử
K càng lớn khi S1/S2càng lớn, khi đó việc lấy chất rắn ra rất khó khăn, phải dùng dung
môi chiết nhiều lần( />2.3.2 Lựa chọn dung môi chiết
Khi lựa chọn dung môi chiết phải chú ý đến các điều kiện sau: Khả năng hòa tan

chất cần chiết xuất và không hòa tan chất khác (hòa tan có chọn lọc), khả năng thấm vào
nguyên liệu và khuếch tán qua màng tế bào, khả năng phản ứng với chất cần chiết xuất,
13


các tính chất vật lý (tỷ trọng, độ nhớt, độ sôi, gây cháy nổ), độc tính và giá cả. Khi chiết
phải lắc kĩ hỗn hợp cho tan đều. Tuy nhiên, nếu có hiện tượng tạo huyền phù, nhũ tương
khi lắc thì phải phá đi(Nguyễn Thượng Dong, 2008).
2.3.3 Kỹ thuật chiết hồi lưu
Kỹ thuật chiết hồi lưu không đòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể dễ dàng thao tác với
một mẫu lớn. Ngâm bột cây trong bình thủy tinh, bình thép không rỉ. Không nên sử dụng
bình nhựa vì một số dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa. Chiết ở nhiệt độ cao hơn
nhiệt độ sôi nhưng phải cao hơn nhiệt độ phòng, thông thường chiết trong 5-10 giờ. Do có
sựgia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao và ít
tốn dung môi hơn.Sự đun hồi lưu (còn gọi là hoàn lưu) là sự chuyển chất trở lại môi
trường phản ứng thông qua hệ thống ngưng tụ, cơ sở của phương pháp là sự tách các chất
có nhiệt độ sôi khác nhau ra khỏi hỗn hợp của chúng, theo thuật ngữ gọi là "reflux".
Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến tỉ lệ thích hợp. Trong quá trình tiến
hành, cần xốc đều, đun nóng trên bếp (tùy mẫu mà sử dụng nhiệt độ thích hợp). Sau đó,
dịch chiết được lọc qua giấy lọc, thu hồi dung môi sử dụng, được cao chiết. Tiếp tục rót
dung môi mới vào bình chứa nguyên liệu, chiết thêm vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt
chất trong mẫu(Trần Hùng, 2006).
2.4. Phương pháp sắc kí
Sắc kí là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra
riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó
đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: pha động và pha tĩnh). Đến thập kỉ 19301940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều loại sắc kí khác nhau. Các
loại sắc kí phân chia dựa vào bản chất pha, cơ chế tách hay cấu hình của hệ sắc kí. Một số
loại sắc kí thường được sử dụng là sắc kí lớp mỏng, sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel, sắc
kí lỏng hiệu nâng cao, điện di(Nguyễn Viết Kình, 2006).
2.4.1. Sắc kí lớp mỏng (SKLM)

SKLM còn gọi là sắc kí phẳng, chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu trong đó pha
động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua pha tĩnh là một
chất hấp thu trơnhư silicagel hoặc alumina. Pha tĩnh này được trán thành một lớp mỏng,
đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic.
14


Nguyên tắc: Dung dịch mẫu thử được chấm lên một lớp mỏng chứa chất hấp phụ,
đóng vai trò là pha tĩnh. Dung môi khai triển di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di
chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành sắc kí đồ gồm nhiều
vết có Rf khác nhau.
SKLM có ưu điểm: Sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích (vi lượng),
quá trình triển khai sắc kí nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả
mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau.
Trong một hệ dung môi giải ly (khai triển) xác định, trên cùng một bản mỏng, có
thể dựa vào giá trị Rf (Rf< 1) để so sánh xem hai chất có giống nhau hay không. Trong
một điều kiện ổn định, giá trị Rf của mỗi chất không đổi. Qui ước Rfcó hai con số lẻ sau
dấu phẩy. Công thức tính Rf:
Rf =

Đoạn đường di chuyển của chất
Đoạn đường di chuyển của dung môi

Nếu vết mẫu hiện trên bản mỏng là vết tròn, nhỏ thì đo khoảng cách từ mức xuất
phát đến tâm của nó. Nếu vết mẫu quá to thì phải thực hiện lại, giảm lượng mẫu chấm vào
để vết gọn hơn. Giá trị Rf phụ thuộc vào loại bản mỏng silicagel hay alumina của hãng
Merk hoặc Prolabo, thời gian tồn trữ, độ dày của bản, thành phần dung môi giải ly, lượng
mẫu chấm trên bản mỏng, kỹ thuật giải ly. Không nên dùng dịch chiết quá thô (ví dụ dịch
chiết methanol toàn phần) để chấm lên bản mỏng vì làm sắc kí đồ kéo vệt, khó phân tích.
Quan sát kết quả: Sau khi khai triển trên hệ dung môi, quan sát kết quả dưới đèn

UV 254 nếu dùng bản mỏng F254. Các vết trên sắc kí đồ sẽ làm tắt huỳnh quang bản
mỏngF254 và tạo vệt tối trên nền sáng. Dưới đèn UV với bước sóng khác thì các vết của
tạp chất sẽ phát quang.
2.4.1.1 Sắc kí lớp mỏng phân tích
● Ứng dụng
- Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được: Chấm tương đối đậm
mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác
nhau. Nếu cả 3 sắc kí đồ đều cho một vết gọn trong vùng Rf khoảng 0,3 - 0,75 thì có thể
kết luận sơ bộ là chất tinh khiết.

15