xây dựng một quy trình ly trích và định lượng vitamin E trên mẫu cây rau ngót phù hợp với tình hình thực tế Việt Nam

BỘ GIÁO
O DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG
Ư
ĐẠI HỌC
H
NÔNG
G LÂM TH
HÀNH PHỐ
Ố HỒ CHÍ MINH
M
B MÔN CÔNG
BỘ
C
NGH
HỆ SINH HỌ
ỌC

KHÓA
K
A LUẬ
ẬN TỐ
ỐT NG
GHIỆ
ỆP
XÂY
Y DỰNG PHƯƠN
NG PHÁP
P PHÂN TÍCH
T
AL

LPHA-TO
OCOPHE
EROL
Ý LỎNG CAO
C
ÁP
P TRÊN CÂY
C
RAU
U NGÓT
T
BẰNG SẮC KÝ
(Sauroopus andrrogynus)

Ngành họọc
Sinh viên
n thực hiện
Niên khóóa

: CÔN
NG NGHỆ SINH
S
HỌC
: NGU
UYỄN THỊ LỆ
L HẰNG
: 2009 - 2013

T
Tháng

7/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ALPHA-TOCOPHEROL
BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP TRÊN CÂY RAU NGÓT
(Sauropus androgynus)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. LÊ VĂN HUY

NGUYỄN THỊ LỆ HẰNG

ThS. NGUYỄN THANH ĐIỀN

MSSV: 09126052

Tháng 7/2013


LỜI CẢM ƠN
Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám Hiệu trường đại học Nông
Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện tốt nhất cho

em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường đại
học Nông Lâm đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học
tập tại trường.
Xin được gửi lời tri ân sâu sắc tới Thạc sĩ Lê Văn Huy và Thạc sĩ Nguyễn Thanh
Điền đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt lại cho em nhiều kiến thức, kỹ năng,
thao tác thực hành và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành tốt đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, anh chị đang làm việc tại Viện nghiên cứu Công
nghệ Sinh học và Môi trường đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề
tài.
Xin cám ơn các bạn bè cùng tập thể DH09SH đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt
quá trình học tập tại trường.
Con thành kính ghi ơn ba mẹ và những người thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện, động viên trong suốt quá trình con học tập tại trường.
Sau một thời gian thực tập Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường,
em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Do kinh nghiệm phòng thí nghiệm còn non yếu,
kiến thức khoa học còn hạn hẹp nên không thể tránh khỏi sai sót trong bài luận văn này.
Kính mong nhận được sự góp ý chân thành từ phía các thầy cô, Hội đồng tốt nghiệp và
các bạn.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013

Nguyễn Thị Lệ Hằng

i


TÓM TẮT
Vitamin E là một chất có vai trò hết sức quan trọng trong việc bảo vệ và phòng
ngừa bệnh tật cho cơ thể.Trong đó, α-tocopherol có hoạt tính sinh học cao nhất trong các
dạng cấu trúc của vitamin E nên rất được quan tâm nghiên cứu.Song song đó, rau ngót là
loại thực phẩm có hàm lượng α-tocopherol cao nhất trong 62 loài thực vật ăn được thuộc

khí hậu nhiệt đới với hàm lượng là 426,8 mg/kg rau (Mohamed và Ching, 2001).Chính vì
vậy, đề tài được tiến hành nhằm xây dựng một quy trình ly trích và định lượng vitamin E
trên mẫu cây rau ngót phù hợp với tình hình thực tế Việt Nam.
Kết quả đã tối ưu được quy trình ly trích mẫu phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt
Nam dựa trên quy trình của Koning và ctv công bố năm 1996 là ly trích vitamin E trên rau
ngót trong điều kiện có sục khí N2 với áp suất 1 atm, nồng độ KOH trong Ethanol sử dụng
là 0,375 mol/l, xà phòng hóa ở 80°C trong 40 phút cho kết quả ổn định dựa trên hình ảnh
sắc ký đồ. Trong đó điều kiện về khí N2 là hết sức quan trọng trong việc đảm bảo hiệu quả
ly trích. Hàm lượng vitamin E có trong rau ngót ở Việt Nam đã được khảo sát trên hai loại
mẫu là mẫu lá và mẫu ngọn bằng HPLC phát hiện ở phút thứ 7 của quá trình chạy máy
với điều kiện sắc ký lỏng cao áp pha đảo, sử dụng pha động là dung dịch KH2PO4 20 mM
và ACN 3,5 % với tốc độ dòng 0,5 ml/phút, đầu dò UV với bước sóng 254 nm và hiệu
suất thu hồi là 110,66%. Đây là quy trình đã được tối ưu. Kết quả cho thấy hàm lượng của
vitamin E có trong mẫu lá và ngọn lần lượt là 1238,99 và 446,99 mg/kg mẫu.

ii


SUMMARY
Nguyen Thi Le Hang, Nong Lam University- Ho Chi Minh City, June 2013. “The
development of the analytical methodto determine vitaminE in Sauropus androgynous
was conducted by usinghigh pressure liquidchromatography”.
Instructors: MSc. Le Van Huy - MSc. Nguyen Thanh Dien - Research Institute for
Biotechnology and Environment, Nong Lam University - Ho Chi Minh city.
The thesis was carried out from December 2012 to June 2013 at Research Institute
for Biotechnology and Environment, Nong Lam University, Ho Chi Minh city.
This thesis was conducted in order to setup an analytical method to determine
vitamin E on Sauropus androgynous by employing high pressure liquid chromatography.
The opitmized extraction procedure of α-tocopherol in Sauropus androgynous,
demonstrated by chromatographic profile, was determined at the concentration 0.375 mol

of KOH in ethanol, saponification at 80°C for 40 minutes under the neccesary present of
N2 at 1 atm.
Optimized conditions of HPLCanalysis was built up by running the mobile phaseof
20mMphosphatebuffersystem consisting 20 mM KH2PO4, and 3.5% ACN inreversed
phasechromatographicconditions atflowrateof 0.5ml/ min, UV at 254 nm. The retention
time was record at7th minute, and the coresponding recovery yieldis110.66%.
Content of vitaminE in leaves and eatable stem of Sauropus androgynous was
1238.99and446.99mg/kg ofthe vegetable samples, respectively.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ............................................................................................................................ i
Tóm tắt ................................................................................................................................. ii
Summary ............................................................................................................................. iii
Mục lục ............................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. vii
Danh sách các hình ........................................................................................................... viii
Danh sách các bảng ............................................................................................................ ix
Chương 1  MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 
1.1 

Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 

1.2 

Yêu cầu đề tài......................................................................................................... 1 

1.3 

Nội dung thực hiện ................................................................................................. 1 

Chương 2  TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 2 
2.1 

Giới thiệu về cây rau ngót ...................................................................................... 2 

2.1.1 

Phân loại khoa học ................................................................................................. 2 

2.1.2 

Đặc điểm của cây rau ngót ..................................................................................... 3 

2.1.2.1 

Phân bố ............................................................................................................... 3 

2.1.2.2 

Đặc điểm hình thái.............................................................................................. 3 

2.1.3 

Thành phần hóa học ............................................................................................... 3 

2.1.4 

Các ứng dụng truyền thống và trong các nghiên cứu gần đây ............................... 3 

2.2 

Vitamin E ............................................................................................................... 5 

2.2.1 

Khái niệm vitamin E .............................................................................................. 6 

2.2.2 

Lịch sử phát hiện của vitamin E ............................................................................ 6 

2.2.3 

Đặc điểm cấu trúc .................................................................................................. 6 

2.2.4 

Tính chất lý - hóa ................................................................................................... 8 

2.2.5 

Hoạt tính sinh học .................................................................................................. 8 

2.2.6 

Các hướng ứng dụng .............................................................................................. 9 

2.2.6.1 

Vitamin E trong điều trị bệnh ............................................................................. 9 

2.2.6.2 

Vitamin E trong bảo vệ cơ thể dưới tác động của tia UV ................................ 10 
iv


2.2.7 

Các nghiên cứu đã tiến hành về tác dụng của vitamin E ..................................... 10 

2.3 

Phương pháp phân tích vitamin E ........................................................................ 11 

2.3.1 

Nguyên tắc ........................................................................................................... 12 

2.3.1.1 

Giới thiệu về HPLC .......................................................................................... 12 

2.3.1.2 

Nguyên tắc ........................................................................................................ 12 

2.3.2 

Hệ thống HPLC.................................................................................................... 12 

2.3.3 

Giới thiệu về pha tĩnh........................................................................................... 13 

2.3.4 

Giới thiệu về pha động ......................................................................................... 14 

2.3.5 

Các công việc cần tiến hành để tối ưu hóa HPLC ............................................... 14 

Chương 3  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................. 15 
3.1 

Thời gian, địa điểm và phương pháp tiến hành ................................................... 15 

3.1.1 

Thời gian .............................................................................................................. 15 

3.1.2 

Địa điểm ............................................................................................................... 15 

3.2 

Vật liệu ................................................................................................................. 15 

3.2.1 

Thu thập mẫu rau ngót ......................................................................................... 15 

3.2.2 

Hóa chất ............................................................................................................... 15 

3.2.3 

Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm ................................................................. 16 

3.2.3.1 

Dụng cụ............................................................................................................. 16 

3.2.3.2 

Thiết bị .............................................................................................................. 16 

3.3 

Phương pháp ........................................................................................................ 16 

3.3.1 

Pha dung dịch chuẩn ............................................................................................ 16 

3.3.1.1 

Chuẩn bị dung dịch stock ................................................................................. 16 

3.3.1.2 

Pha các dung dịch chuẩn .................................................................................. 17 

3.3.2 

Phương pháp chiết tách ........................................................................................ 17 

3.3.2.1 

Quy trình chiết tách .......................................................................................... 17 

3.3.2.2 

Tối ưu quy trình chiết tách ............................................................................... 18 

3.3.3 

Tối ưu điều kiện chạy HPLC ............................................................................... 18 

3.3.4 

Hiệu suất thu hồi của quy trình ............................................................................ 19 

3.3.4.1 

Quy trình chuẩn bị mẫu để đánh giá hiệu suất thu hồi ..................................... 19 
v


3.3.4.2 

Phương pháp đánh giá độ thu hồi ..................................................................... 20 

Chương 4  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 21 
4.1 

Định tính vitamin E .............................................................................................. 21 

4.2 

Xây dựng đường chuẩn vitamin E ....................................................................... 22 

4.3 

Hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích ............................................................ 23 

4.4 

Xây dựng quy trình ly trích vitamin E ................................................................. 24 

4.4.1 

Điều kiện tối ưu.................................................................................................... 24 

4.4.2 

Quy trình đề nghị ................................................................................................. 26 

4.5 

Điều kiện chạy HPLC .......................................................................................... 27 

4.5.1 

Khảo sát điều kiện chạy HPLC ............................................................................ 27 

4.5.2 

Điều kiện chạy HPLC .......................................................................................... 28 

4.6 

Vitamin E trên cây rau ngót ................................................................................. 29 

4.6.1 

Khảo sát sự phân bố của vitamin E trên cây rau ngót.......................................... 29 

4.6.2 

So sánh kết quả với các nghiên cứu trước đây..................................................... 30 

Chương 5  KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 32 

5.1 

Kết luận ................................................................................................................ 32 

5.2 

Đề nghị ................................................................................................................. 32 

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 33 

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µg :

microgam

µl :

microlite

ctv :

cộng tác viên

mg :

miligam

g:

gam

mmol :

milimol

ml :

mililite

kg :

kilogam

HPLC:

High Pressure Liquid Chromatography – Sắc ký lỏng cao áp

FDA :

Food and Drug Administration

FAO :

Food and Agriculture Organization

UV :

Ultra Violet - tia cực tím

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây rau ngót (Sauropus androginus) ................................................................. 2
Hình 2.2 Một số nguồn vitamin E..................................................................................... 5
Hình 2.3 Các dạng cấu trúc của vitamin E ....................................................................... 7
Hình 2.4 Sơ đồ minh họa hệ thống HPLC ...................................................................... 12
Hình 3.1 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 15
Hình 3.2 Hệ thống HPLC ............................................................................................... 16
Hình 3.3 Quy trình chuẩn bị mẫu để đánh giá hiệu suất thu hồi .................................... 19
Hình 4.1 Sắc ký đồ khi chạy HPLC mẫu rau ngót.......................................................... 21
Hình 4.2 Sắc ký đồ khi chạy HPLC mẫu rau ngót có thêm chuẩn 1191 μg/ml.............. 22
Hình 4.3 Đường chuẩn α-tocopherolvới 4 điểm chuẩn .................................................. 23
Hình 4.4 Sắc ký đồ của mẫu rau ngót trong điều kiện ly trích không có khí N2 ............ 24
Hình 4.5 Sắc ký đồ mẫu rau ngót trong điều kiện ly trích có khí N2.............................. 25
Hình 4.6 Sắc ký đồ mẫu rau ngót trong điều kiện ly trích với nồng độ ......................... 26
Hình 4.7 Sắc ký đồ của mẫu rau trong điều kiện chạy HPLC với pha động .................. 27
Hình 4.8 Sắc ký đồ mẫu rau trong điều kiện chạy HPLC với pha động là..................... 28
Hình 4.9 Đồ thị so sánh hàm lượng vitamin E giữa mẫu lá và ngọn rau ngót ............... 30
Hình 4.10Đồ thị so sánh kết quả hàm lượng vitamin E trên mẫu lá và ngọn ................. 30

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang

Bảng 3.1 Quy trình pha các dung dịch α-Tocopherol chuẩn .......................................... 17
Bảng 4.1 Thời gian lưu và diện tích peak của các nồng độ chuẩn.................................. 22
Bảng 4.2 Kết quả sau khi chạy HPLC đánh giá hiệu suất thu hồi .................................. 24
Bảng 4.3 Các điều kiện trong quy trình chạy HPLC phân tích....................................... 28
Bảng 4.4Hàm lượng vitamin E có trong các mẫu rau ..................................................... 29

ix


Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Vitamin E từ lâu được đánh giá là một loại chất dinh dưỡng có vai trò hết sức quan
trọng với sức khỏe của con người. Tác dụng rõ nét nhất là chất chống oxy hóa và được
xem như là hàng rào đầu tiên chống lại những tác động có hại của gốc tự do đối với tế bào
(FAO, 2002), phòng ngừa ung thư (Jihyeung và ctv, 2010), bảo vệ cơ thể trước tác động
của tia UV (Dreher và ctv, 1998; Thiele và ctv,1998; Lin và ctv, 2003). Mà cơ thể người
lại không có khả năng tự tổng hợp nên vitamin E (Drouin và ctv, 2011) nên cơ thể chỉ có
thể thu nhận vitamin E từ nguồn thực phẩm tiêu thụ hàng ngày, chủ yếu từ mỡ thực vật
(vegetable fats) và các loại dầu và những sản phẩm từ dầu(Ryynänen và ctv, 2004). Đáng
chú ý, cơ thể người lại ưu tiên hấp thu vitamin E có nguồn gốc tự nhiên (RRR-alphatocopherol) hơn các α-tocopherol tổng hợp (Traber và ctv, 1992). Đặc biệt, trong nghiên
cứu đánh giá hàm lượng α-tocopherol của Ching và Mohamed (2001) cho biết trong rau
ngót chứa hàm lượng vitamin E cao nhất trong 62 loài thực vật ăn được thuộc vùng khí
hậu nhiệt đới đã được khảo sát (426,8 mg/kg). Đây là loại thực phẩm rất phổ biến ở Việt
Nam và các nước thuộc vùng khí hậu nhiệt đới bỡi hàm lượng dinh dưỡng cao. Do đó đề
tài “Xây dựng phương pháp phân tích α-tocopherol bằng sắc ký lỏng cao áp trên cây rau
ngót (Sauropus androgynous)” đã được tiến hành nhằm cung cấp thêm cơ sở dữ liệu về
vitamin E trên rau ngót ở Việt Nam, cũng như phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về

phương pháp phân tích hàm lượng vitamin E và cây rau ngót.
1.2 Yêu cầu đề tài
Xây dựng phương pháp định lượng vitamin E trên rau ngót bằng HPLC.
1.3 Nội dung thực hiện
-

Xây dựng được phương pháp ly trích vitamin E từ cây rau ngót phù hợp với điều
kiện thực tế.

-

Xây dựng quy trình HPLC trong định lượng vitamin E trên cây rau ngót.

-

Xác định được hàm lượng của vitamin E trên mẫu cây rau ngót ở Việt Nam.

1


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây rau ngót
Rau ngót, bù ngót, rau tuốt hay bồ ngót (Sauropus androgynus) là một loài cây bụi
mọc hoang ở vùng nhiệt đới châu Á nhưng cũng được trồng làm một loại rau ăn ở một số
nước, trong đó có Việt Nam( />2.1.1 Phân loại khoa học
Bộ:

Malpighiales

Họ:

Phyllanthaceae

Tông:

Phyllantheae

Phân tông:

Flueggeinae

Giống:

Sauropus

Loài:

androgynus

Danh pháp 2 phần: Sauropus androgynous

Hình 2.1 Cây rau ngót(Sauropus androginus)
( />
2


2.1.2 Đặc điểm của cây rau ngót

2.1.2.1 Phân bố
Rau ngót phân bố ở một số vùng thuộc khí hậu nhiệt đới của châu Á như: Ấn Độ,
nam Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia và Indonesia. Ở Việt
Nam, cây này mọc hoang và cũng được trồng ở nhiều nơi.
( />2.1.2.2 Đặc điểm hình thái
Cây bồ ngót thuộc dạng cây thân gỗ, mọc thẳng đứng, phân nhiều cành.Vỏ thân
xanh, lục rồi nâu nhạt. Cây cao khoảng 1,5 m đến 2 m. Lá mọc so le, dài 4 – 5 cm, cuống
ngắn có 2 lá kèm nhỏ. Phiến lá nguyên hình trứng dài hoặc hình bầu dục, mép nguyên,
màu xanh đậm. Hoa rau ngót đơn tính, mọc thành xim ở nách lá, có cả hoa đực lẫn hoa cái
hoặc chỉ có hoa cái. Hoa đực có đài màu vàng điểm chấm đỏ, hoa cái có đài màu vàng
hoặc đỏ thẫm.Quả dạng nang hình cầu dẹp màu trắng, hạt hình tam giác có vân nhỏ.
( />2.1.3 Thành phần hóa học
Đánh giá về thành phần rau ngótcó chứa papaverine, protein chiếm 34% đến 49%,
chất xơ chiếm 14 – 18%, các vitamin A, B, C, … và các muối khoáng:K chiếm tỷ lệ
2,77%, Ca là 2,77%, P chiếm 0,61%, Mg là 0,55%, Fe là 0,0199%; hàm lượng dinh
dưỡng có trong mỗi 100 g rau ngót là khoảng 74 Kcal năng lượng, 7,6 g protein, 1,8 g
chất béo, 6,9 g carbohydrate ( />Chính vì vậy rau ngót được xem như là một loại thực phẩm bổ dưỡng, chống oxy
hóa, giải nhiệt và kháng sinh.Đáng chú ý,Ching và Mohamed (2001),rau ngótđã được
phát hiện chứa lượng α-tocopherol cao nhất trong 62 loại thực vật ăn được thuộc vùng khí
hậu nhiệt đới được khảo sát với 79,65 mg α-tocopherol trên 100 g rau.
2.1.4 Các ứng dụng truyền thống và trong các nghiên cứu gần đây
Rau ngót là một loại thực phẩm được người dân ở các nước thuộc vùng khí hậu
nhiệt đới sử dụng rất phổ biến.Ở Việt Nam, rau ngót thường được chế biến thành các món
canh vừa bổ dưỡng vừa có tác dụng chữa bệnh.Cụ thể rau ngót nấu canh với hến có tính
mát, là một món canh giải nhiệt vào mùa hè.Rau ngót nấu với xương lợn thì có tác dụng
3


chữa nhức xương.Rau ngót nấu với nấm rơm góp phần trị chứng nước tiểu vàng đục và
đau phần thắt lung. Còn canh rau ngót nấu với thịt lợn nạc hoặc giò sống (hoặc trứng tôm,

trứng cáy, cá rô, cá quả, …) lại là một món canh rất bổ dưỡng, dùng để bồi bổ sức khỏe
cho người mới ốm dậy, người già yếu hay phụ nữ sau sinh. Rau ngót nấu canh cùng với
bầu đất và quả bầu dục lợn có tác dụng trị chứng đổ mồ hôi trộm,táo bón ở trẻ em, đây
cũng là một vị thuốc giúp trẻ ăn ngon miệng.
Nghiên cứu của Narumon và ctvvề xác định khả năng chống oxy hóa và giá trị
dinh dưỡng của rau ngót vào 2008 cho biết hàm lượng đạm trong rau ngót là 4,8 g trong
100 g rau gồm nhiều loại acid amin cần thiết cho cơ thể nên có thể dùng rau ngót thay thế
đạm động vật mà ít gây hại cho cơ thể đối với các bệnh nhân bị bệnh gout, sỏi thận.
Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy khả năng xóa vết nám, ngăn ngừa các bệnh về
mắt, tăng cường hệ miễn dịch và sinh sản nhờ hàm lượng cao vitamin A, C, E, và nhiều
loại muối khoáng tốt cho cơ thểcó trong rau ngót. Rau ngót là một trong những loại thực
phẩm hiếm hoi có chứa vitamin K – một chất làm giảm nguy cơ gãy xương ở người già.
Có một vài nghiên cứu cho thấy trong rau ngót có chứa nhiều hợp chất
phytochemical nên có tác dụng như dược liệu nên rau ngót cũng được sử dụng để làm
thuốc (Narumon và ctv, 2008).Người ta thường chọn những cây rau ngót hai năm tuổi trở
lên để làm thuốc.
Theo Đông y thì rau ngót có tính mát, vị ngọt nên được dùng làm thuốc thanh
nhiệt, giải độc, tăng tiết nước bọt, hoạt huyết, tiêu ứ, bổ huyết, cầm máu, nhuận tràng, sát
khuẩn, tiêu viêm, sinh cơ. Rau ngót còn có khả năng làm tăng sự hấp thụ của hệ tiêu hóa,
chữa các chứng mụn nhọt, viêm loét, tăng thị lực, ngừa các bệnh mãn tính của mạch máu,
giảm cholesterol, hạ huyết áp, hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường và được xem là thực phẩm
tốt cho nam giới vì làm gia tăng chất lượng cũng như số lượng tinh trùng.Còn theo kinh
nghiệm dân gian thì lá rau ngót được dùng làm thuốc để trị một số bệnh: tưa lưỡi, thanh
nhiệt, hạ sốt, các chứng ho do phế nhiệt,chảy máu cam, trị chứng sót nhau thai, giúp làm
sạch máu và bồi bổ cơ thể cho phụ nữ sau sinh. Rau ngót cũng có tác dụng phòng chứng
táo bón và bệnh trĩ cũng như phòng chống lão hóa.

4

Tuy nhiên, trong nhiều tài liệu cũng cảnh báo việc uống nhiều nước rau ngót tươi
có thể dẫn đến một số phản ứng phụ:gây ra bệnh nghẽn phổi (Yu và ctv, 2007), co thắt cơ
trơn tử cung gây sẩy thai, tiêu chảy, co thắt mạch máu gây đau nhức cơ, mất ngủ, nhức
đầu, cao huyết áp hoặc thiếu máu não ở người lớn tuổi. Nguyên nhân của các hiện tượng
này là vì trong rau ngót tươi có chứa một hàm lượng papaverin cao (580 mg/100 g rau)
(một loại alkaloid có trong á phiện) (Bender vàIsmail, 1973). Dượcthư Việt Nam 2002 ghi
rõ khuyến cáo: “Không dùng papaverin cho người có thai”. Ngoài ra, glucocorticoid có
trong lá rau ngót có thể gây cản trở cho quá trình hấp thụ Ca và P.Chính vì vậy, khi sử
dụng rau ngót, tốt nhất là ta nên nấu chín vì quá trình đun sôi giúp loại bỏ phần nào các
yếu tố có thể là nguyên nhân gây phân hủy hoạt chất trong lá và quá trình phát sinh các
chất gây hại (Ger và ctv, 1997).
2.2 Vitamin E

Hình 2.2 Một số nguồn vitamin E
( />
Vitamin E là một trong những chất nằm trong nhóm vitamin có tính chất góp phần
rất quan trọng trong các quá trình chuyển hóa của cơ thể, giúp cho cơ thể khỏe mạnh,
chống lại sự sản xuất dư thừa gốc tự do, chống lại quá trình chết tế bào, kìm hãm quá
trình lão hóa, giúp da mịn màng, …và còn nhiều tác dụng khác giúp nâng cao chất lượng
cuộc sống của con người.
5


2.2.1 Khái niệm vitamin E
Vitamin E là tên gọi chung để chỉ hai lớp các phân tử (bao gồm các tocopherol và
các tocotrienol) có hoạt tính vitamin E (α-tocopherol) trong dinh dưỡng. Vitamin E không
phải là tên gọi cho một chất hóa học cụ thể, mà chính xác hơn là cho bất kỳ chất nào có
trong tự nhiên mà có tính năng vitamin E trong dinh dưỡng.Chức năng chính của αtocopherol trong cơ thể người là một chất chống ôxi hóa.Các dạng phân tử được đề cập ở
trên có thể chuyển hóa lẫn nhau trong cơ thể.
2.2.2 Lịch sử phát hiện của vitamin E

Vào năm 1922, Herbert M. Evans và Bishop K.S. đã phát hiện ra một yếu tốkhông
xác địnhtrong dầu thực vậtcần thiết chosinh sản ởchuột cái.Đầu tiên yếu tố này được gọi
là“yếu tốX” hay“yếu tố chống vô sinh”. Đến năm 1925 thì nó đượcđổitênthànhvitamin
E.Evans và Emerson đã phân lập được vitamin E từ một số nguồn như dầu mầm lúa mì,
dầu bắp, dầu hạt bông vào năm 1936.Bởi vìhợp chất nàyliên quan đến khả năng cócon của
động vật, nhóm nghiên cứuđã đặttênlà tocopherol vìtừ‘tocos’theo tiếng Hy Lạpcó nghĩa
làsinh convà ‘ferein’(mang lại), liên quan đếnsự thiết yếucủa nóđểchuộtcó thể mang thai.
Sau đó đuôi‘ol’cũng đã được thêm vào.Cấu trúc chính xác của vitamin E được công bố
vàonăm 1938. Cũng trong năm này, Paul Karrer lần đầu tiên tổng hợp được vitamin E.
Đến năm 1968, vitamin E chính thức được hội đồng Thực phẩm và Dinh dưỡng của học
viện Khoa học Quốc gia của Hoa Kỳ(National Academy of Sciences) công nhận là một
chất dinh dưỡng thiết yếu.
( />2.2.3 Đặc điểm cấu trúc
Vitamin E được sử dụng được chia thành 2 loại dựa theo nguồn gốc tạo ra: vitamin
E tự nhiên (thu nhận từ các nguồn chứa vitamin E từ tự nhiên) và vitamin E tổng hợp (sản
phẩm của quy trình tổng hợp vitamin E theo con đường hóa học).
Xét về mặt cấu trúc, vitamin E trong thiên nhiên gồm 8 dạng khác nhau của 2 loại
hợp chất: tocopherol và tocotrienol. Mỗi hợp chất có 4 dạng cấu trúc khác nhau dựa theo
những khác biệt về vị trí nhóm methyl và cấu trúc không gian của phân tử:α-, β-, γ- và δ-.

6


Hìn
nh 2.3Các dạng
d
cấu trúúc của vitam
min E
(http://w
www.vita-dosse.com/beneffits-of-vitam

min-e.html).

Trong thự
ực vật, vitam
min E thườnng có mặt ở dạng tocoopherol, tronng đó α-toccopherol
là thànnh phần có
ó hoạt tính sinh
s
học caao nhất của vitamin E. Tocopherool có cấu trúúc vòng
với một
m chuỗi dàài bão hòa bên
b cạnh vàà được phânn biệt bằng số và vị tríí nhóm metthyl trên
vòng.Tocotrienol được phâân biệt với tocopheroll nhờ chuỗii bên cạnh bất bão hòòa và ít
được phân bố rộ
ộng rãi tronng thiên nhiiên.Đối tượ
ợng quan tââm của chúnng ta trongg nghiên
opherol với cấu trúc nhhư trong hìnnh 2.3.
cứu này làα-toco
Dạng thiêên nhiên củaa vitamin E,
E dưới tên gọi
g RRR-alpha-tocophherol được tìm
t thấy
Dạng tổng hợp của viitamin E làà một hỗn hợp
h gồm 8 đồng phânn quang
từ dầuu thực vật.D
học.C
Cả hai dạng
g tự nhiên lẫn dạng tổnng hợp củaa vitamin E đều có cùùng một công thức
phân tử, nhưng khác
k

nhau về
v cấu trúcc không giaan ba chiều..Đặc biệt, các
c cơ quann và các
c huyết tương
t
và nãão ưu tiên thhu nhận
mô troong cơ thể bao gồm phhổi, gan, tế bào hồng cầu,
vitam
min E nguồn
n gốc tự nhiêên hơn so với
v vitamin E nguồn gốốc tổng hợpp.
( />m.html?tr=V
Vitamin%200E).
Vitamin E được đo bằng đơn vị
v là đươngg lượng RR
RR-alpha-toocopherol (α-TE
(
).
Một α-TE
α
là hoạt tính củaa 1 mg RRR
R-α-tocophherol. Mỗi mg vitaminn E dạng tự
ự nhiên
7


tương đương với 1,49 IU và mỗi mg vitamin E dạng tổng hợp tương đương với 1
IU(Gąsior và ctv,2009).
Các nghiên cứu đã khẳng định ở người dạng tự nhiên của vitamin E có hoạt tính
sinh học lớn hơn dạng tổng hợp, dạng tự nhiên của vitamin E được lưu giữ lại tốt hơn 2

đến 3 lần so với dạng tổng hợp (Traber và ctv, 1992).
2.2.4 Tính chất lý - hóa
Khi bảo quản ở nhiệt độ phòng, vitamin E có dạng dịch dầu, nhớt, màu vàng,
không tan trong nước nhưng tan tốt trong mỡ và các dung môi của mỡ (ether, acetone,
chloroform, methanol, …).
Ở dạng tự do, vitamin E là chất chống oxy hóa: chúng bị phá hủy bỡi oxy và các
chất oxy hóa. Khi thiếu oxy, chúng ổn định ở nhiệt độ phòng (khi chế biến thức ăn,
vitamin E trong đó sẽ bị mất khoảng 20%(Joy và ctv, 2007)) và môi trường acid, nhưng
chúng nhạy cảm với ánh sáng. Vì vậy cần bảo quản vitamin E trong các lọ tối màu được
đậy nắp kín.
2.2.5 Hoạt tính sinh học
Theo FAO, 2002 đã công bố thì chức năng chính của vitamin E trong cơ thể là tác
động như là chất chống oxy hóa. Nó được xem là hàng phòng thủ trước tiên chống lại quá
trình peroxyd hóa lipid. Vitamin E tác động ở mức độ tế bào để bảo vệ màng tế bào khỏi
sự tấn công của gốc tự do làm tổn hại đến màng tế bào. Trong vai trò là một chất thu dọn
gốc tự do, vitamin E bảo vệ các acid béo không bão hòa (PUFA) và cholesterol trong
màng tế bào. Vitamin E có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào hồng cầu (có hàm lượng PUFA
cao) khỏi bị tán huyết.Không chỉ vậy, vitamin E còn có chức năng giống như là một chất
chống oxy hóa nội tế bào, giúp tiết kiệm Selenium, chất này chứa trong enzym Glutathion
peroxydase. Đây là thành phần khác của hệ thống phòng thủ chống oxy hóa của cơ thể và
bảo vệ những chất tương tự chất béo khác như vitamin A khỏi bị phân
hủy.( Vitamin E có
khả năng ngăn chặn phản ứng của gốc tự do lipoperoxyd (LOO•) rất hoạt động (sinh ra từ
sự oxyd hóa của acid béo màng tế bào) bằng cách nhường 1 hydro của gốc phenol cho
gốc lipoperoxyl (LOO•) để biến gốc tự do này thành hydroperoxyd (LOOH).
8


Bên cạnh đó, vitamin E có tác dụng bảo vệ những chất tạo nên tế bào như protein,
acid nucleic, …Vitamin E cũng có những tác động khác trong cơ thể bao gồm sự chuyển

hóa nucleic và protein, chức năng phân bào và sản xuất hormone và vitamin E cũng cần
thiết cho sự sinh sản bình thường.
2.2.6 Các hướng ứng dụng
Với những tác động sinh học hết sức đa dạng đối với cơ thể: chất chống oxy hóa,
điều hòa sự ngưng tập tiểu cầu, đảm bảo cho quá trình sinh sản bình thường, …Vitamin E
đã được ứng dụng rộng rãi trong công tác phòng, chữa bệnh cũng như đảm bảo sức khỏe
bền vững cho con người.
2.2.6.1 Vitamin E trong điều trị bệnh
Với chức năng như chất chống oxy hóa, vitamin E có thể tác dụng lên các gốc tự
do sinh ra từ các quá trình trao đổi chất trong cơ thể nên chúng có tác dụng:phòng chống
lão hóa, bảo vệ não, làm giảm bệnh Alzheimer,bảo vệ mắt, phòng và trị bệnh cườm mắt,
phòng và điều trị bệnh tiểu đường, ...(Bourne và Clement, 1991).
Bên cạnh đó, vitamin E còn được biết đến với tác dụng tích cực đối với sự sinh sản
vì nó không những có tác dụng tốt đối với quá trình thai nghén mà còn có những tác động
tốt với cơ quan sinh sản: Vitamin E làm giảm nhẹ các triệu chứng chuột rút, đau các bắp
cơ hoặc đau bụng khi hành kinh. Nếu các bạn nữ được sử dụng vitamin E ngay từ đầu chu
kì sẽ giảm được 36% đau khi hành kinh.Qua nghiên cứu thực nghiệm, các nhà khoa học
nhận thấy, vitamin E có thể ức chế quá trình oxy hóa của DNA nên có thể ức chế hoạt
động của chuỗi tế bào ung thư vú, làm giảm 95% sự gia tăng tế bào ung thư ở những
người có sử dụng alpha-tocopherol. Nghĩa là, vitamin E có thể gây độc có tính chọn lọc
đối với các tế bào ung thư vú. Cùng lúc đó, các nghiên cứu khác lại cho thấy những phụ
nữ được bổ sung vitamin E thì có tỷ lệ bị ung thư buồng trứng thấp hơn 67% so với nhóm
không được sử dụng. Ngoài ra, vitamin E còn góp phần cải thiện tình dục, giúp noãn và
tinh trùng phát triển tốt hơn, nâng cao kết quả điều trị vô sinh.
Hơn thế nữa, vitamin E còn giúp nâng đỡ hệ miễn dịch như làm gia tăng chức năng
của thực bào, kích hoạt các sát bào đối vớicác mầm ung thư và tế bào đã nhiễm virus nên
có thể góp phần đẩy lùi bệnh tật và giúp tăng sức đề kháng của cơ thể.
9

2.2.6.2 Vitamin E trong bảo vệ cơ thể dưới tác động của tiaUV
Vitamin E có khả năng hấp thu tia UVB nên có thể bảo vệ cơ thể trước những tác
hại của tia UV. Vitamin E giúp bảo vệ tế bào da: khi không có vitamin E, 85% tế bào da
sau khi bị bức xạ còn sống sót trong khi nếu có vitamin E thì gần như tất cả mọi tế bào bị
bức xạ đều sống. Ngoài ra, vitamin E cũng có tác dụng trong điều trị các chứng ban đỏ,
dày biểu bì và tróc da sau khi da bị chịu tác động của tia bức xạ.Ngoài ra, vitamin E cũng
bảo vệ cơ thể trước những nguy hại về gen từ tia UV vì nó tác động trực tiếp lên sự tấn
công của tia UV trên DNA làm Thymidine gắn kết trở lại vào DNA.
2.2.7 Các nghiên cứu đã tiến hành về tác dụng của vitamin E
Một số nghiên cứu về tác dụng của vitamin E đã tiến hành:
-

α-tocopherol có tác dụng tích cực đến khả năng sinh sản của giun tròn sống tự do
Turbatrix aceti: giai đoạn sinh sản đến sớm hơn và kéo dài lâu hơn (Monica và
Hildegard, 1982).

-

Sự thiếu hụt vitamin E trong khẩu phần ăn kéo dài gây ra hiện tượng biến mất của
các tế bào thần kinh (Bourne và Clement, 1991).

-

Vitamin E có tác dụng bổ sung sự thiếu hụt trong dẫn truyền xung thần kinh do tác
động của các gốc tự do ở các con chuột bị bệnh tiểu đường (Cotter và ctv, 1995).

-

Tình trạng thiếu vitamin E trong cơ thể sẽ làm tăng mức độ nghiêm trọng của
những tổn thương gây ra do xơ vữa động mạch (Yuko Terasawa và ctv, 2000).

-

Hỗn hợp tocopherol giàu γ-tocopherol có tác dụng ức chế ung thư ruột kết, tuyến
tiền liệt, vú và phổi (Jihyeung và ctv, 2010).

-

Huyết thanh α- và γ-tocopherol có thể gây oxy hóa một loại enzyme mà enzyme
này liên quan đến nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt (Cheng và ctv, 2011)

-

Khi trong chế độ ăn uống hoặc bổ sung có chứa vitamin E thì: nếu trong thành
phần giàu γ- và δ-tocopherol thì có tác dụng chống ung thư còn việc bổ sung αtocopherol ở liều cao lại không có tác dụng chống ung thư (Yang và ctv, 2012).

10


2.3 Phương pháp phân tích vitamin E
Vitamin E có ứng dụng hết sức quan trọng. Đặc biệt là vitamin E tự nhiên vốn dễ
hấp thu hơn dạng tổng hợp. Điều này đòi hỏi chúng ta cần tìm ra quy trình ly trích vitamin
E hiệu quả nhất.
Vì vitamin E thuộc nhóm các hợp chất phenol nên theo Nguyễn Kim Phi Phụng
(2007), khi tiến hành ly trích cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần:
Benzene, Ethyl eter, Chloroform, Ethyl acetate, Ethanol, … Tương tự vậy, tác giả Koning
vàctv (1996) đã đưa ra quy trình ly trích vitamin E sử dụng dung môi ly trích là hỗn hợp
n-Hexane và Ethyl acetate có thêm Butylated hydroxytoluene (trong 1 lít dung môi có 900
ml n-Hexane, 100 ml Ethyl acetate cộng với 20 mg Butylated hydroxytoluene (BHT)
dạng khan).

Trong đó, kết quả nghiên cứu của Ching và Mohamed tiến hành vào 2001 dựa trên
việc áp dụng quy trình ly trích Koning và ctv đã công bố năm 1996 thì rau ngót có chứa
hàm lượng vitamin E cao nhất trong 62 loài thực vật đã được tiến hành nghiên cứu (426,8
mg/kg phần ăn được).
Tiếp theo việc xác định loại dung môi ly trích vitamin E nói riêng và quy trình ly
trích vitamin E nói chung đạt hiệu quả thì việc lựa chọn phương pháp phân tích vitamin E
đảm bảo độ chính xác cũng rất quan trọng trong việc giúp vitamin E dạng thiên nhiên
được ứng dụng rộng rãi hơn trong cuộc sống. Các phương pháp phân tích vitamin E gồm
có phương pháp sinh hóa (cho phản ứng với HNO3 và FeCl3) và phương pháp sắc ký
(phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao - HPLC). Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu
vitamin E trên thực vật áp dụng phương pháp phân tích là HPLC: nghiên cứu về các
vitamin có tác dụng chống oxy hóa có trong ớt đỏ (Daood và ctv, 1996), dùng phương
pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng tocopherol và tocotrienol có trong các loại rau
(Koning và ctv, 1996), phân tích vitamin E thu được từ tỏi (Mazhar và ctv, 1997), xác
định hàm lượng α-tocopherol trong 62 loài thực vật ăn được thuộc vùng khí hậu nhiệt đới
(Ching và Mohamed, 2001), … Cho thấy HPLC tỏ ra là phương pháp phân tích vitamin E
hiệu quả và khả thi.Trên cơ sở đó, kỹ thuật HPLC được lựa chọn là phương pháp phân
tích vitamin E trong nghiên cứu này.
11


2.3.1 Nguyên tắc
2.3.1.1 Giới thiệu về HPLC
HPLC (High Performance Liquid Chromatography: sắc ký lỏng hiệu năng cao),
trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)
ra đời từ năm 1967 - 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ
điển. Từ đó đến nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự
phát triển nhanh của nghành chế tạo máy phân tích.Chính vì vậy, HPLC đã và đang được
ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực phân tích.
2.3.1.2 Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách mà trong đó pha động là
chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi
bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ.
2.3.2 Hệ thống HPLC

Hình 2.4 Sơ đồ minh họa hệ thống HPLC
( />Theo như sơ đồ trên hình 2.4, một hệ thống HPLC gồm có:
-

Bình chứa dung môi giải ly cột với nút lọc bằng kim loại: nơi chứa và bảo quản
dung môi giải ly cột (pha động) trong suốt quá trình chạy máy HPLC phân tích.

-

Máy bơm cao áp: giúp bơm pha động vào cột sắc ký (pha tĩnh).
12


-

Van bơm mẫu vào máy: giúp đưa mẫu cần phân tích vào cột tách của máy HPLC
để tiến hành phân tích mẫu.

-

Cột sắc ký (pha tĩnh): nơi diễn ra hiện tượng bắt giữ các hợp chất trong hỗn hợp
cần phân tích nhờ vào tương tác giữa hợp chất với hệ thống pha tĩnh, pha động và
giữa pha động và pha tĩnh với nhau của máy HPLC. Mỗi loại hợp chất khác nhau

thì những lực tương tác cũng khác nhau, dẫn đến thời gian hợp chất bị giữ lại trong
cột sẽ khác nhau.

-

Đầu dò: theo dõi dòng chảy của dung môi giải ly để biết khi nào thì hợp chất đi ra
khỏi cột (thời gian lưu của hợp chất – tR). Trong phương pháp phân tích được sử
dụng trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng loại đầu dò hấp thụ quang phân tử
vùng phổ UV.

-

Thiết bị ghi: ghi sắc ký đồ thể hiện được dòng chất đi ra khỏi cột sau khi mẫu phân
tích được bơm vào cột.

-

Thiết bị lưu dữ liệu: lưu trữ và trích xuất dữ liệu sắc ký đồ.

-

Bình chứa chất thải: chứa các chất đã ra khỏi cột phân tách.
Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) vì

phương pháp có thể lựa chọn nhiều loại dung môi giải ly, có thể áp dụng kỹ thuật giải ly
với dung môi có độ phân cực tăng dần, hệ thống đạt sự cân bằng nhanh và nhất là kỹ thuật
này sử dụng dung môi giải ly chủ lực là nước kết hợp với những loại dung môi hữu cơ
như Methanol, Acetonitrile là những dung môi dễ kiếm, giá cả hợp lý nên rất phù hợp với
điều kiện thực tế.
2.3.3 Giới thiệu về pha tĩnh

Với kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (hay còn được gọi là sắc ký lỏng
pha tạo nối), pha tĩnh là dạng tạo nối hóa học trên giá mang silica.Người ta điều chế pha
tạo nối bằng cách biến đổi các nhóm silanol bề mặt thành các nhóm dẫn xuất. Có các loại
pha tạo nối như sau:
-

Các nhóm alkyl như: octadexyl (C18H37), ngoài ra còn có những nhóm khác với
dây carbon ngắn hơn: C1, C2, C8 và aryl.

-

Các nhóm phân cực như amino, cyanopropyl, eter, diol.
13


-

Các nhóm trao đổi ion như acid sunfonic, amino, ammonium tứ cấp.
Vì vậy, để phù hợp với điều kiện tiến hành phân tích, cần sử dụng pha tĩnh là pha

tạo nối với nhóm dẫn xuất là nhóm alkyl. Cụ thể là nhóm octadexyl (C18H37, C18).
(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
2.3.4 Giới thiệu về pha động
Các loại pha động thường được sử dụng trong phân tích vitamin E là sự kết hợp
của nước cất với các dung môi hữu cơ như Methanol, Acetonitrile, Methyl alcohol ... nên
rất đa dạng. Ví dụ: hỗn hợp Methanol/nước cất (94/6) (Chingvà Mohamed, 2001); Methyl
alcohol (Ubaldi và ctv,2005); hỗn hợp Acetonitrile trong nước cất (95 - 100% Acetonitrile
trong hỗn hợp giải ly) (Korchazhkina và ctv,2006). Chính vì vậy, cần tiến hành tối ưu hóa
pha động cho phù hợp với điều kiện thực tế để quá trình phân tích đạt hiệu quả cao nhất.
2.3.5 Các công việc cần tiến hành để tối ưu hóa HPLC

Số lượng và loại công việc cần tiến hành để đánh giá độ tin cậy của một phương
pháp HPLC khác nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng của phương pháp.Những công
việc này cần được lên kế hoạch, sắp xếp thành những thí nghiệm bổ sung vào quá trình
thực hiện phương pháp HPLC để thể hiện được độ tin cậy của phương pháp phân tích ta
đã sử dụng. Một trong những công việc phổ biến thường được dùng là xác định giới hạn
phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), xác định độ tuyến tính, độ đặc hiệu, độ
thu hồi, độ lặp lại trên chất cần phân tích, độ chính xác của phương pháp phân tích (dựa
trên độ thu hồi, độ lặp lại và độ chính xác trung gian của kết quả chạy HPLC đối với mẫu
cần phân tích) , độ bền của chất cần phân tích của hệ thống HPLC khi phân tích những
chất có mặt trong lượng mẫu đem đi phân tích. Tuy nhiên, trong phân tích các thành phần
hoạt động trong dược phẩm (Active Pharmaceutical Ingredient, API) thì không cần phải
xác định LOD và LOQ vì thường nồng độ cần phân tích lớn hơn ngưỡng định lượng LOQ
của phương pháp HPLC rất nhiều (Ashley, 2005).
Chính vì vậy, trong nghiên cứu này sẽ không tiến hành xác định LOD, LOQ mà
tiến hành công việc xây dựng đường chuẩn (xác định độ tuyến tính) và đánh giá độ thu
hồi để đánh giá về độ tin cậy của phương pháp HPLC được sử dụng.

14