NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI TỪ MÔ SẸO VÀKHẢ NĂNG NHÂN CHỒI SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) TRONG ĐIỀU KIỆN in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI TỪ MÔ SẸO
VÀKHẢ NĂNG NHÂN CHỒI SÂM NGỌC LINH
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
TRONG ĐIỀU KIỆN in vitro

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRƯƠNG PHI YẾN

Niên khóa

: 2009-2013

Tháng 6/2013

 
 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI TỪ MÔ SẸO
VÀKHẢ NĂNG NHÂN CHỒI SÂM NGỌC LINH
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH

TRƯƠNG PHI YẾN

KS. TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 6/2013
 
 


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh, đến thầy Lê Đình Đôn, trưởng Bộ môn Công nghệsinh học,
cùng tất cả các thầy cô đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề
tài này.

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến cô Trần Thị Lệ Minh và cô Tô Thị Nhã
Trầm đã tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quí báo và
giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đề tài tại bộ môn Công nghệ sinh học.
Cảm ơn chân thành đến chị Đỗ Ngọc Thanh Mai, đến các anh, các chị, các bạn
cùng làm việc tại Bộ môn Công nghệ sinh học và toàn thể sinh viên lớp DH09SH đã
giúp đỡ và chia sẻ những kinh nghiệm, những khó khăn, những vui buồn trong quá
trình học tập và nghiên cứu.
Cảm ơn bạn Marchand Antoine tận tình giúp đỡ, đã chia sẽ thời gian và kinh
nghiệm trong quá trình thực hiện cùng tôi.
Đặc biệt hơn cả, con xin cảm ơn cha mẹ đã sinh thành và nuôi dưỡng con, cảm
ơn các anh đã luôn ủng hộ, tin tưởng và tạo điều kiện tốt đẹp cho em học tập.
Kính chúc quý thầy cô, gia đình và bạn bè luôn mạnh khoẻ, hạnh phúc.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013
Sinh viên thực hiện đề tài
Trương Phi Yến

i 
 


TÓM TẮT
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensisHa et Grushv.) là một trong những loài
sâm quý được tìm thấy trên thế giới, có dược tính tốt cho sức khoẻ con người và được
sử dụng trong y học. Tuy nhiên do chỉ thích nghi với môi trường đặc trưng, bị giới hạn
về khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh và sự khai thác quá mức, sâm Ngọc Linh có
nguy cơ tuyệt chủng cao, được xếp vào một trong 250 loài nguy cấp ở Việt Nam. Vì
vậy, việc bảo tồn và phát triển loài thực vật quý hiếm này đã đặt ra nhiều vấn đề đáng
quan tâm. Đây là nhiệm vụ quan trọng và cấp bách, có ý nghĩa đặc biệt về mặt kinh tế,
xã hội và đa dạng sinh học.
Áp dụng phương pháp hiện đại, phương pháp nuôi cấy mô trong nhân giống

sâm Ngọc Linh rất cần thiết, nhằm mục đích nhân giống và bảo tồn, nâng cao chất
lượng, nâng cao giá trị của loài cây quý này trong thị trường dược liệu, thông qua nuôi
cấy phát sinh phôi, tái sinh chồi và tăng trưởng chồi. Mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên
môi trường SH có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng IBA, TDZ, kinetin và nước
dừa với nồng độ khác nhau.
Mô sẹo được sử dụng nuôi cấy trên môt trường có chứa 0,7 mg/l IBA cho sự
phát sinh phôi tốt nhất (88,33%) sau 8 tuần nuôi cấy. Phôi được nuôi cấy trên môi
trường có bổ sung 0,5 mg/l TDZ để tái sinh chồi tỷ lệ tạo chồi cao (58,33%). Môi
trường nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển chồi sâm Ngọc Linh là môi trường SH có
bổ sung 0,2 mg/l kinetin và 3% nước dừa và môi trường SH có bổ sung 13% nước dừa
cho tỷ lệ hình thành chồi 57,78%, chồi có màu xanh đậm, lá to và khỏe.

ii 
 


SUMMARY
The thesis: Embryogenesis from callus and shoot multiplication of Vietnamese
ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) is one of rare ginseng over
the world, used for the treatment of many serious diseases and for enhancing human
health. Because of specific habitat and exploited more than reasonable, Vietnamese
ginseng is endangered, on list Vietnam's Red Data Book. So its preservation, which is
meaning in economy, society and biodiversity, is very important issue.
The in vitro multiplication of Vietnamese ginsengincludes embryo induction,
shoot’s regeneration and shoot development. Callus of Vietnamese ginseng was
cultured in SH medium supplemented with TDZ, BA, kinetin and coconut water in
different concentration.
The somatic embryo regenerate from callus in SH medium supplemented with
IBA 0.7 mg/l after 8 weeks. The somatic embryo culture in SH medium supplemented

with TDZ 0.5 mg/l, that show the best result for shoot’s regeneration (58,33%). The
high shoot‘s development (57,78%) form the plant which cultured in SH medium
supplemented with kinetin 0,2 mg/l and coconut water 3% or SH medium
supplemented with coconut water 13%.
Key words: Vietnamese ginseng, regenerate, embryo, multiplication, shoot

iii 
 


MỤC LỤC
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... i
Tóm tắt ............................................................................................................................ ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục .......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. vi
Danh sách các bảng ...................................................................................................... vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................................ 1
1.2. Yêu cầu đề tài .......................................................................................................... 1
1.3. Nội dung thực hiện .................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Đặc điểm sinh học của cây sâm Ngọc Linh ............................................................ 3
2.1.1. Phân loại cây sâm Ngọc Linh ................................................................................ 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái của sâm Ngọc Linh................................................................. 4
2.1.3. Phân bố và địa điểm sinh thái của sâm Ngọc Linh ................................................ 5
2.1.4. Đặc tính dược liệu của sâm Ngọc Linh ................................................................. 5
2.1.4.1 Khái niệm của saponin ....................................................................................... 6
2.1.4.2 Tác dụng của sâm Ngọc Linh đối với sức khỏe ................................................. 6

2.2. Giá trị kinh tế, khoa học và bảo tồn sâm Ngọc Linh .............................................. 7
2.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật .................................................................... 7
2.3.1. Giới thiệu chung về kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật ................................... 7
2.3.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng....................................................... 8
2.3.2.1 Ảnh hưởng của auxin ......................................................................................... 8
2.3.2.2 Ảnh hưởng của cytokinin ................................................................................... 8
2.3.3. Ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ ................................................................ 9
2.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh ................... 9
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................................11
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .........................................................................11
iv 
 


3.2. Vật liệu ..................................................................................................................11
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................11
3.2.2. Môi trường nuôi cấy ............................................................................................11
3.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................11
3.3.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ...............11
3.3.2. Ảnh hưởng của TDZ đến sự tái sinh chồi từ phôi của sâm Ngọc Linh ...............12
3.3.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh chồi sâm Ngọc Linh .............12
3.3.4. Ảnh hưởng của kinetin và nước dừa đến sự phát sinh chồi sâm Ngọc Linh .......13
3.4. Xử lý số liệu ..........................................................................................................13
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................14
4.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh ................14
4.2. Ảnh hưởng của TDZ đến sự tái sinh chồi từ phôi của sâm Ngọc Linh ................18
4.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh chồi sâm Ngọc Linh ..............19
4.4. Ảnh hưởng của kinetin và nước dừa đến sự phát sinh chồi sâm Ngọc Linh ........22
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................25
5.1. Kết luận .................................................................................................................25

5.2. Đề nghị ..................................................................................................................25 
Tài liệu tham khảo .........................................................................................................26
Phụ lục

v 
 


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
2,4 – D

2,4 – diclorophenoxyacetic acid

Ctv

Cộng tác viên

CW

Coconut water, nước dừa

IBA

Indole – 3 – butyric acid

MS

Murashige và Skoog, 1962

NAA

α – naphthalene acetic acid

SH

Schenk and Hildebrandt, 1972

TDZ

Thidiazuron

vi 
 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của IBA đến phát sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh..............12
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của TDZ đến tạo chồi từ phôi của sâm Ngọc Linh ..........................12
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tăng sinh chồi sâm Ngọc Linh ........................13
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin và nước dừa đến sự nhân chồi sâm Ngọc Linh........13
Bảng 4.1 Tỷ lệ phôi vô tính hình thành từ mô sẹo của sâm Ngọc Linh .......................14
Bảng 4.2 Sự phát triển của phôi vô tính của sâm Ngọc Linh .......................................17
Bảng 4.3 Tỷ lệ phôi vô tính của sâm Ngọc Linh phát sinh chồi sau 8 tuần .................18
Bảng 4.4 Số lượng chồi sâm Ngọc Linh in vitro được hình thành ...............................19
Bảng 4.5 Tỷ lệ hình thành chồi mới của sâm Ngọc Linh .............................................20
Bảng 4.6 Đặc điểm của chồi sâm Ngọc Linh sau 6 tuần nuôi cấy................................21
Bảng 4.7 Số chồi sâm Ngọc Linh mới được hình thành sau 6 tuần nuôi cấy ...............22
Bảng 4.8 Tỷ lệ (%) chồi sâm Ngọc Linh sống sau 6 tuần nuôi cấy ..............................23

vii 

 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây sâm Ngọc Linh ......................................................................................... 3
Hình 2.2 Cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên ................................................................. 4
Hình 4.1 Phôi vô tính được soi dưới kính hiển vi 40X. ................................................15
Hình 4.2 Sự phân cực của phôi vô tính sâm Ngọc linh ................................................16
Hình 4.3 Mô sẹo của sâm Ngọc Linh phát sinh phôi sau 8 tuần nuôi cấy....................16
Hình 4.4 Chồi sâm được quan sát dưới kính hiển vi 40X. ...........................................19
Hình 4.5 Cụm chồi sâm Ngọc Linh sau 6 tuần nuôi cấy ..............................................20
Hình 4.6 Chồi sâm Ngọc Linh sau 6 tuần nuôi cấy ......................................................24

viii 
 


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha & Grutzv.) là loài đặc hữu hẹp của
Việt Nam, được biết đến trên thế giới với tên gọi Vietnamese ginseng. Sâm Ngọc Linh
có thành phần ginsenoside, dược chất chính trong Nhân sâm, được đánh giá vào loại
nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới. Theo kết quả nghiên cứu từ
năm 1978 của Bộ Y tế Việt Nam, sâm Ngọc Linh có chứa 26 hợp chất saponin đã biết
cấu trúc và 24 hợp chất saponin có cấu trúc mới chưa phát hiện ở các loại nhân sâm
khác trên thế giới.Tuy nhiên, với địa bàn phân bố hẹp (có ở vùng núi Ngọc Linh và
Kon Tum) và quá trình phát triển dài, do thu hoạch quá nhiều, sâm Ngọc Linh là một
trong 250 loài nguy cấp, có nguy cơ tuyệt chủng cao (Dương Tấn Nhựt và ctv, 2009).
Với nỗ lực của những địa phương có sâm Ngọc Linh phân bố, hiện nay loài dược liệu
này đã có thể tránh bị tuyệt diệt. Tuy nhiên để đưa Sâm Ngọc Linh thành cây thuốc

ngang hàng với các loại nhân sâm có trên thị trường dược liệu cả về số lượng và chất
lượng cần có sự nổ lực rất lớn.
Từ năm 1973 đến nay, đã có nhiều cơ quan, nhà khoa học trong và ngoài nước
nghiên cứu về sâm Ngọc Linh, và gần 50 nghiên cứu sinh đã bảo vệ thành công luận
án thạc sĩ, tiến sĩ từ các công trình nghiên cứu về loài cây quý hiếm này. Trong những
năm gần đây,việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật đã rất thành công trong
sản xuất các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, bao gồm các nguyên liệu thô trong dược
phẩm, các sắc tố và các hợp chất khác (Nguyễn Thị Liễu và ctv, 2010). Vì vậy việc
đưa nghiên cứu cây sâm Ngọc Linh phát triển theo hướng hiện đại và mang lại hiệu
quả kinh tế cao là vấn đề quan trọng. Với mong muốn được phát triển tiếp việc nhân
giống, nuôi trồng và bảo tồn loài cây quý, loài cây có giá trị kinh tế cao này. Xuất phát
từ cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu khả năng phát sinh phôi từ mô sẹo và khả năng nhân
chồi sâm Ngọc Linh (Panaxvietnamensis Ha et Grushv.) trong điều kiện in vitro” được
thực hiện.
1.2. Yêu cầu đề tài
Đề tài được thực hiện nhằm xác định môi trường thích hợp cho quá trình phát
sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh. Từ đó xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng
1
 


thích hợp cho quá trình nhân chồi từ phôi và nồng độ thích hợp của dịch chiết tự nhiên
cho sự tăng sinh chồi của sâm Ngọc Linh.
1.3. Nội dung thực hiện
Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh phôi từ mô sẹo, nhằm tìm ra nồng
độ thích hợp làm tăng khả năng phát sinh phôi, đồng thời thúc đẩy quá trình tạo phôi
để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm sau.
Tiếp tục tái sinh chồi con từ phôi vô tính sâm Ngọc Linh bằng cách bổ sung thêm
TDZ ở nhiều nồng độ khác nhau. Để thúc đẩy quá trình lớn nhanh của chồi, quá trình
tăng sinh của chồiđược thực hiện thông qua việc nuôi cấy sâm Ngọc Linh trong môi

trường có bổ sung nước dừa ở các nồng độ khác nhau.

2
 


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm sinh học của cây sâm Ngọc Linh
2.1.1. Phân loại cây sâm Ngọc Linh
Trước khi có sự phát hiện của các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu, sâm Ngọc
Linh đã được các đồng bào thiểu số biết đến như một loại thần dược, được sử dụng trị
bệnh theo phương pháp cổ truyền.Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là sâm, tuy
nhiên chỉ có bốn loài sâm thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae). Bốn chi Panax gần gũi với
cây Nhân Sâm Panax gingseng C. A. Meyerlà sâm Ngọc Linh, sâm Tam Thất, sâm
Nam và sâm Vũ Diệp.
Năm 1973, khu y tế Trung trung bộ cử một tổ 4 cán bộ do dược sĩ Đào Kim
Long làm trưởng đoàn, kĩ sư Nguyễn Bá Hoạt, dược sĩ Nguyễn Châu Giang, dược sĩ
Trần Thanh Dân là thành viên, đi điều tra và phát hiện cây sâm hướng chân núi Ngọc
Linh thuộc huyện Đắc Tô tỷnh Kon Tum. Dược sĩ Đào Kim Long đã đặt tên khoa học
của cây sâm Ngọc Linh này là Panax articulatus KL Dao (trong kháng chiến để giữ bí
mật nên thường gọi là Sâm K5), hay Panax articulatus Kim Long Đào theo tên người
phát hiện. Sau đó tên khoa họcPanax vietnamensis Ha et Grushv. của cây chính thức
được công bố tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị
Dung và I. V. Grushvistky đặt tên.Cây sâm Ngọc Linh trong hệ thống phân loại:
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Bộ: Apiales
Họ: Cam Tùng (Araliaceae)
Chi:Panax
Loài: Panax vietnamensis

Tên khác: sâm Việt Nam, sâm Ngọc Linh, sâm
Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng).
Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng.
Hình 2.1Cây sâm Ngọc Linh
( />
3
 


2.1.2. Đặc điểm hình thái của sâm Ngọc Linh

Hình 2.2Cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên
()

Cây thân thảo, sống lâu năm, cao 40 - 80 cm, có 2 loại thân: thân khí sinh và
thân rễ. Thân khí sinh mọc thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có đường kính thân
4-8 mm, mang 2 – 4 lá kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng
ngược hoặc hình mác, dài 10 – 14 cm, rộng 3 – 5 cm. Gốc cây hình nêm, đầu thuôn dài
thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ, thân thường tàn lụi hàng năm, ngoài ra một số cây
có thể tồn tại vài năm. Thân rễgồm nhiều đốt, phân nhánh, nằm ngang, đường kính 1,5
– 2,5 cm, phần đầu có nhiều vết sẹo do thân khí sinh tàn lụi hằng năm để lại, không
phân nhánh, dài 30 – 40 cm, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, nằm sâu dưới đất
2 – 3cm. Trên đỉnh của thân mang loại lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá.
Cuống lá kép dài 6-12 mm, mang 3-6 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn với độ dài 12–
15 cm, rộng 3–4 cm. Lá chét có phiến hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá
có lông ở cả hai mặt.
Cây 4-5 năm tuổi hình thành cụm hoa có hình tán đơn, mọc dưới các lá và
thẳng với thân, cuống hoa dài 10–20 cm có thể kèm 1-4 tán phụ hoặc một hoa riêng lẻ
ở phía dưới tán chính. Mỗi tán có 60-100 hoa, cuống hoa ngắn 1-1,5 cm, lá đài 5 răng
dài, hoa có 5 cánh, màu vàng nhạt với nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Quả thường mọc

tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1 cm và rộng khoảng 0,5 -0,6 cm, sau hai
tháng quả bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục và khi chínngả màu đỏ
4
 


cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả. Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa
2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả.
2.1.3. Phân bố và địa điểm sinh thái của sâm Ngọc Linh
Cây sâm được phát hiện ở độ cao từ 1.200m trở lên (có tài liệu cho biết cao độ
tìm thấy sâm Ngọc Linh là khoảng 1.500m), đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1.7002.000m dưới tán rừng già và cho tới nay chỉ có hai tỷnh Kon Tum và Quảng Nam là có
cây sâm này. Đây cũng là giới hạn xa nhất về phía nam (ở 150 vĩ Bắc) của bản đồ phân
bố chi Panax trên thế giới. Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi
cao 2.598m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50 cm, có độ mùn cao, tơi xốp
và rừng nguyên sinh còn rộng, tuy nhiên theo một số nghiên cứu thực địa mới nhất cho
thấy sâm còn sống được ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn,
tỷnh Quảng Nam và đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kon Tum.
Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo đặc biệt ưa ẩm và bóng, thường mọc dưới
tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20°C-25°C, ban đêm
15°C-18°C, sâm Ngọc Linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng
khá chậm. Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng
lá và rễ con. Sâm sinh trưởng mạnh trong mùa xuân – hè. Mùa hoa quả của cây từ
tháng 5 đến tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hằng năm.Sau khi quả chín rụng
xuống đất tồn tại đến đầu tháng 1, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí
sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành có 1 tán hoa.Từ tháng 4 đến tháng 6, cây
ra hoa và kết quả.Tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9.Cuối tháng 10,
phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và cây bắt đầu
giai đoạn ngủ đông hết tháng 12.
Căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mỗi mùa đông đến mà người ta có thể nhận biết
cây sâm bao nhiêu tuổi, phải ít nhất 3 năm tuổi có nghĩa là trên củ có một sẹo (sau 3

năm đầu sâm chỉ rụng một lá) mới có thể khai thác, nên khai thác cây trên 5 năm tuổi.
Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm.
2.1.4. Đặc tính dược liệu của sâm Ngọc Linh
Sâm Ngọc Linh cũng là loại nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới. Theo
kết quả nghiên cứu từ năm 1978 của Bộ Y tế Việt Nam, phần thân rễ của cây sâm
Ngọc Linh Việt Nam chứa 26 hợp chất saponin có cấu trúc hóa học đã biết và 24
saponin có cấu trúc mới không có trong các loại sâm khác, trong khi sâm Triều Tiên
5
 


có khoảng 25 saponin. Những kết quả nghiên cứu, phân lập thành phần hóa học mới
nhất được công bố còn kéo dài danh sách saponin của sâm Ngọc Linh hơn nữa, lên
tổng cộng 52 loại.
Như vậy, sâm Việt Nam là một trong những loại sâm có hàm lượng saponin
nhiều nhất, tương tự một số cây sâm quý đã từng được nghiên cứu sử dụng từ lâu trên
thế giới. Ngoài ra, sâm Ngọc Linh còn chứa các thành phần khác như các chất chống
oxy hóa, peptides, polysaccharides, axit béo, rượu và vitamin (Nguyễn Trung Thành
và ctv, 2008). Với nhữnghợp chất hóa học đa dạng và tác dụng thực tiễn đối với sức
khỏe của con người, sâm Ngọc Linh hiện nay được bán trên thị trường với giá càng
ngày càng cao.
2.1.4.1 Khái niệm của saponin
Tên gọi saponin hay saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong
thực vật.Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây sâm
Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới.Các saponin dammaran được
xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học. Mặc dù có một thân rễ
(rhizome) phát triển như các loài Panax khác, sâm Ngọc Linh là một ngoại lệ vì nó
chứa chủ yếu saponin thuộc nhóm damaran và có rất ít saponin thuộc nhóm olean
(Nguyễn Minh Đức và ctv, 1993)
Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh) chứa 49 hợp chất saponin

gồm 25 saponin đã biết và 24 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosidR1-R24.Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin
đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8.
2.1.4.2 Tác dụng của sâm Ngọc Linh đối với sức khỏe
Trước khi có những nghiên cứu kỹ lưỡng về tác dụng của sâm Ngọc Linh đối
với sức khỏe con người, sâm đã được các dân tộc thiểu số Việt Nam (như người Xê
Đăng) thường dùng như một loại thuốc trong những bài thuốc cổ truyền như cầm máu,
lành vết thương, làm thuốc bổ và một số thuốc trị sốt rét, đau bụng, phù nhũng.
Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, sử dụng ở liều thấp làm tăng hoạt động
vận động và trí nhớ, chống trầm cảm. Tác động tăng sinh lực, trong thí nghiệm ở chuột
bạch, sâm Ngọc Linh làm tăng sinh lực chống lại sựmệt mỏi, giúp phục hồi sức lực.
Tác dụng chống stress vật lý, stress tâm lý và trầm cảm.Kích thích hệ miễn dịch,

6
 


chống ôxi hóa, lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan.Kháng các độc tố gây
hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới.
Nghiên cứu dược lý lâm sang của sâm Ngọc Linh giúp bệnh nhân ăn ngon, ngủ
tốt, lên cân.Tăng thị lực, hoạt động trí tuệ và thể lực cải thiện.Gia tăng sức đề kháng,
cải thiện các trường hợp suy nhược thần kinh và suy nhược sinh dục, nâng cao huyết
áp ở người bị huyết áp thấp. Đặc biệt, sâm Ngọc Linh có những tính năng mà sâm
Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tính kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm
lo âu, chống ôxi hóa, và hiệp lực tốt với thuốc kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường.
2.2. Giá trị kinh tế, khoa học và bảo tồn sâm Ngọc Linh
Sâm Ngọc Linh là loài đặc hữu của Việt Nam, phát hiện năm 1973, đến năm
1985 được xác định là loài mới đối với khoa học. Kết quả điều tra năm 1980 đã xác
định trữ lượng sâm tự nhiên ở vùng núi Ngọc Linh tới trên 10 tấn. Do khai thác quá
mức sâm Ngọc Linh đã lâm vào tình trạng bị đe dọa tuyệt chủng cao.
Tuy nhiên, với sự nỗ lực của tỷnh Quảng Nam, đã kịp thời thu thập, trồng lưu

giữ được khoảng 1 ha sâm dưới tán rừng. Từ nguồn sâm giống này, hiện đã nhân trồng
thêm tại chỗ được gần 10 ha sâm (1 – 3 tuổi) ở vùng núi Ngọc Linh, thuộc tỷnh Quảng
Nam và phát triển sang cả phía Kon Tum. Việc phát triển trồng sâm Ngọc Linh hiện
tại không phải là vấn đề kỹ thuật hay vốn kinh phí, mà chủ yếu phụ thuộc vào biện
pháp tổ chức và quản lý, trong cơ chếthị trường ngày nay.
2.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
2.3.1. Giới thiệu chung về kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Thuật ngữ “nuôi cấy mô, tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói về
việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật, bao gồm tế bào đơn, mô, cơ quan trong điều
kiện vô trùng (in vitro). Tế bào thực vật hay động vật tồn tại trong một tổ chức mô và
chịu ảnh hưởng của các chất như hormone và các chất tăng trưởng khác để có thể tăng
trưởng và biệt hóa. Điều này dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật.
Trong giai đoạn hiện nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng mạnh mẽ
vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính
sinh học và vào nghiên cứu lý luận duy truyền thực vật bậc cao. Các vấn đề cơ bản về
đời sống mô và tế bào đơn trong môi trường nhân tạo, nhu cầu về khoáng, vitamin,
chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbon của chúng, kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy,
điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng ngày càng được hiểu
7
 


biết sâu sắc hơn. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đã mở rộng tiềm năng nhân giống vô
tính một cách kinh tế, hiệu quả các loại cây quan trọng, các loài cây quý hiếm và có
giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hằng ngày của con người.
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, nuôi cấy mô đã trở thành một trong
những lĩnh vực được quan tâm trong ngành trồng trọt. Nuôi cấy mô đã và đang có
những đóng góp to lớn trong việc phục tráng, nhân giống và chọn giống cây trồng, góp
phần vào sự phát triển của ngành khoa học nông, lâm nghiệp (Nguyễn Đức Lượng, 2006).
2.3.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

Có bốn chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật:
auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic. Năm 1957, Skoog và Miller đã nhận thấy
tỷ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phân hóa cơ quan tế bào của thực vật được nuôi
cấy. Phát hiện này giúp các nhà nghiên cứu nắm được nguyên tắc và điều khiển sự sinh
trưởng, phát triển và phát sinh cơ quan của mô, tế bào trong suốt quá trình nuôi cấy.
Ngoài ra, còn một số hợp chất hữu cơ được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
nhằm mục đích tạo thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô.
2.3.2.1 Ảnh hưởng của auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên
trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh
dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng mô sẹo, huyền phù tế
bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó sử dụng phối hợp với các
cytokinin.Năm 1935, Went và Thimann phát hiện chất điều hòa sinh trưởng đầu tiên là
indole β-acid acetic (IAA). Con người đã tổng hợp được rất nhiều các chất có bản chất
rất khác nhau nhưng chúng có hoạt tính sinh lý tương tự như IAA gọi là auxin tổng
hợp. Các auxin thường được sử dụng như: IBA; NAA; 2,4-D; 2,4,5-T.
Auxin là yếu tố cần thiết cho sự phát triển của phôi, nó có ảnh hưởng khác nhau
trong từng giai đoạn của quá trình phát sinh phôi. Sự hiện diên của auxin cần thiết cho
sự thành lập các tế bào hay nhóm tế bào có khả năng sinh phôi từ các tế bào hay nhóm
tế bào cô lập (Nguyễn Đức Lượng, 2006).
2.3.2.2 Ảnh hưởng của cytokinin
Cytokinin là một trong nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật ít có ảnh hưởng
trên một thực vật nguyên vẹn và nó có hiệu quả trong việc kích thích tổng hợp sinh
protein. Ảnh hưởng của cytokinin trong nuôi cấy mô và cơ quan phụ thuộc vào loại
8
 


cytokinin được sử dụng, kiểu nuôi cấy, loài thực vật được nuôi cấy và mẫu được thu từ
mô còn non hay mô đã trưởng thành. Các loại cytokinin thường dùng : IPA, Zeatin,

TDZ, BA, kinetin.
Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián
tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng trên mô thực vật nuôi cấy in vitro(Nguyễn Đức
Lượng, 2006). Điều này đạt hiệu quả cao hơn nếu có sự hiện diện của auxin trong môi
trường.
2.3.3. Ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ
Các hợp chất hữu cơ được bổ sung vào môi trường: nước dừa, dịch chiết nấm
men, dịch chiết khoai tây, dịch chiết lúa mạch, cam, cà chua, chuối.
Nước dừa có chứa một số acid amin, acid hữu cơ, acid nucleic, một số vitamin,
đường và đường đơn ancohol, chất kích thích tố (auxin, cytokinin), chất khoáng và các
chất khác thúc đẩy sự tăng trưởng, sinh trưởng của tế bào nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô
việc bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy sẽ hạn chế bớt (hay không cần) sử
dụng chất điều hòa sinh trưởng, hạn chế xảy ra các biến dị bất lợi do quá trình nuôi cấy
in vitro trong thời gian dài (Trần Văn Minh, 2004).
2.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh
Thuật ngữ “nhân sâm” xuất phát từ Trung Quốc, dựa trên nguồn gốc của một số
loài nhân sâm chủ yếu là sâm Hàn Quốc hay sâm Châu Á (Panaxginseng), sâm Siberia
(Eluetherocuccus senticosus), nhân sâm Mỹ (Panax quiquefolius) và nhân sâm Việt
Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) có nguồn gốc từ đây (Dương Tấn Nhựt và
ctv, 2011).
Ở Ấn Độ, năm 1993, Sarita Arya, Inder Dev Arya và Tage Eriksson đã cùng nhau
nghiên cứu “Sự nhân nhanh phôi soma của sâm Panax”, họ cho rằng phôi soma được
tái sinh từ phôi bất định, sự phát triển và sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào các chất
kích thích sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy.
Vào năm 1999 ở Canada, nhóm nghiên cứu của Wang và ctv đã thực hiện
nghiên cứu “Sự phát sinh phôi và tái sinh cây nhanh của nhân sâm Mỹ: ảnh hưởng của
auxin và mô cấy”. Nghiên cứu này đã chứng minh hiệu quả của ba chất điều hòa sinh
trưởng 2,4 – D, NAA và dicamba đến sự cảm ứng hình thành phôi của sâm Mỹ (Panax
quiquefolium L.). Sau 8 tuần nuôi cấy, môi trường có bổ sung 2,4 – D phát sinh

9
 


nhiềuphôi soma. Sự phát triển này là bước đầu cần thiết cho sự nhân giống và cải thiện
di truyền của sâm Mỹ.
Năm 2001, nhóm Bonfill và ctv đã tiến hành nghiên cứu “Ảnh hưởng của auxin
lên sự phát sinh cơ quan và sản xuất ginsenoside trong mô sẹo Panax ginseng” tại Tây
Ban Nha. Mô sẹo của sâm (Panax ginseng C. A. Meyer) được nuôi cấy trên môi
trường MS có bổ sung kinetin, 2,4 – D, IBA hoặc NAA. Sau 5 tuần nuôi cấy, mô sẹo
bị ức chế khả năng phát sinh cơ quan do 2,4 – D gây ra, trong khi IBA và NAA lại làm
tăng khả năng này. Chất điều hòa sinh trưởng IBA gây cảm ứng hình thành một số
lượng lớn chồi và rễ, nhưng rễ thường mỏng và yếu. Mô sẹo được nuôi cấy trong môi
trường có NAA phát sinh ít chồi và rễ hơn trong môi trường có IBA, nhưng rễ thường
dày và phát triển tốt. Cho đến nay, các nghiên cứu về các loài nhân sâm trên thế giới
vẫn đang được thực hiện và nhiều công trình đã được công bố.
Ở Việt Nam, sâm Ngọc Linh không còn xa lạ, có rất nhiều công trình nghiên
cứu được công bố. Từ năm 1993, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Minh Đức và ctv đã
xác định được cấu trúc của các hợp chất saponin có trong sâm qua nghiên cứu
“Saponin từ sâm Việt Nam thu nhận trong trung tâm Việt Nam. I”. Một năm sau, họ
tiếp tục nghiên cứu tìm ra các hợp chất mới. Đây chính là bước đầu đưa sâm Ngọc Linh
lên ngang tầm với các loại sâm khác trên thế giới.
Trong những năm gần đây, nhóm nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và ctv đã
thực hiện rất nhiều nghiên cứu. Năm 2011, Dương Tấn Nhựt cùng ctv thực hiện
nghiên cứu “Ảnh hưởng của spermidine, proline và nguồn cacbonhydrat lên sự phát
sinh phôi soma từ tế bài lớp mỏng của rễ chính sâm Việt Nam”. Tế bào lớp mỏng được
nuôi cấy trên môi trường MS được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng. Kết quả cho
thấy spermidine và proline có ảnh hưởng đến sự phát sinh phôi, cho tỷ lệ phôi soma
cao nhất (93,3 % và 86,7 %). Và hàm lượng đường sucrose cũng có ảnh hưởng đến sự
phát sinh phôi, cho tỷ lệ phần trăm số phôi phát sinh cao nhất (86,7 %). Nghiên cứu

này cho thấy sự quan trọng của spermidine, proline và đường sucrose lên sự phát triển
của phôi soma.

10
 


Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2012 đến hết tháng 6 năm 2013 tại phòng
Thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật của Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại
học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh
3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mô sẹo nuôi cấy từ lá sâm Ngọc Linh in vitro(Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) được nuôi cấy ở phòng Thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật của bộ môn
Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông Lâm.
3.2.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm của nghiên cứu này là môi
trường SH (Schenk and Hildebrandt, 1972) có bổ sung 30g/l sucrose, 8g/l agar.
Trong từng thí nghiệm khác nhau, tùy vào từng mục đích thí nghiệm mà môi
trường SH được bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau, hay
các hợp chất hữu cơ khác. Môi trường được chứa trong chai thủy tinh 500 ml (thể tích
môi trường 50 ml) và trong chai thủy tinh 250 ml (thể tích môi trường 25 ml). Môi
trường nuôi cấy được điều chỉnh đến pH đạt 5,7 – 5,8 trước khi hấp khử trùng trong
autoclave ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm, trong 20 phút. Các mẫu cấy được nuôi ở
phòng tăng trưởng với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ

chiếu sáng 3000 lux dưới ánh sáng trắng, độ ẩm 60 – 65%.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh
Mẫu mô sẹo sâm Ngọc Linh được nuôi cấy vào môi trường SH có bổ sung IBA
với các nồng độ khác nhau, thay đổi lần lượt là 0,1 mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l;
1 mg/l; 1,5 mg/l.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại
gồm 20 mẫu cho một nghiệm thức. Các mẫu cấy được nuôi ở phòng tăng trưởng với
điều kiện chiếu sáng trong thời gian 8 tuần.

11
 


Bảng 3.1Các nghiệm thức ảnh hưởng của IBA đến phát sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc
Linh
Nghiệmthức
A1

Môi trường
SH

IBA (mg/l)
0,1

Số mẫu/chai
4

Tổng mẫu
20

A2

SH

0,3

4

20

A3

SH

0,5

4

20

A4

SH

0,7

4

20

A5

SH

1,0

4

20

A6

SH

1,5

4

20

Chỉ tiêu theo dõi : tỷ lệ (%) mẫu phát sinh phôi vô tính, hình thái phôi.
3.3.2. Ảnh hưởng của TDZ đến sự tái sinh chồi từ phôi của sâm Ngọc Linh
Mẫu phôi sau 8 tuần nuôi cấy được chuyển sang môi trường SH có bổ sung
TDZ với nồng độ thay đổi lần lượt là 0 mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l; 1mg/l.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại
gồm 20 mẫu cho một nghiệm thức. Các mẫu phôi được nuôi trong phòng tăng trưởng
với thời gian chiếu sáng 8 tuần.
Bảng 3.2Các nghiệm thứcảnh hưởng của TDZ đến tạo chồi từ phôi của sâm Ngọc Linh
Nghiệm thức

C1

Môi trường
SH

TDZ (mg/l)
0

Số mẫu/chai
4

Tổng mẫu
20

C2

SH

0,3

4

20

C3

SH

0,5

4

20

C4

SH

0,7

4

20

C5

SH

1,0

4

20

Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ (%) phôi phát sinh chồi, số lượng chồi con hình
thành từ phôi.
3.3.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh chồi sâm Ngọc Linh
Mẫu chồi hình thành từ phôi, nuôi cấy trong 6 tuần, tách thành từng cụm nhỏ
(3 – 4 chồi) được đưa vào môi trường SH có bổ sung nước dừa với nồng độ thay đổi
lần lượt là 5%, 7%, 10%, 13%, 15%, 20%.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại
gồm 15 mẫu cho một nghiệm thức. Mẫu được nuôi cấy trong phòng tăng trưởng với
điều kiện chiếu sáng 6 tuần.
12
 


Bảng 3.3Các nghiệm thứcảnh hưởng của nước dừa đến sự tăng sinh chồi sâm Ngọc Linh
Nghiệmthức

Môi trường

Nước dừa (%)

Số mẫu/chai

Tổng mẫu

D1

SH

5

4

15

D2

SH

7

4

15

D3

SH

10

4

15

D4

SH

13

4

15

D5

SH

15

4

15

D6
SH
20
4
15
Chỉ tiêu theo dõi: sốchồi mới hình thành, tỷ lệ (%) cụm chồi hình thành chồi
mới, đặc điểm chồi.
3.3.4. Ảnh hưởng của kinetin và nước dừa đến khả năng phát sinh chồi sâm Ngọc
Linh trong in vitro
Chồi sâm Ngọc Linh in vitro được tách riêng từng chồi, nuôi cấy trên môi trường
SH có bổ sung kinetin (0; 0,2; 0,5; 1; 1,5 mg/l) và nước dừa (0; 3%). Thí nghiệm được bố
trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 20 mẫu cho một nghiệm
thức. Các mẫu cấy được nuôi trong phòng tăng trưởng với thời gian chiếu sáng 6 tuần.
Bảng 3.4Các nghiệm thức ảnh hưởng của kinetin và nước dừa đến khả năng nhân chồi
sâm Ngọc Linh
Nghiệm
thức
B1

SH

Kinetin

(mg/l)
0

Nước dừa
(%)
0

B2

SH

0,2

B3

SH

B4

Môi trường

Số mẫu/chai

Tổng mẫu

4

20

0

4

20

0,5

0

4

20

SH

1,0

0

4

20

B5

SH

1,5

0

4

20

B6

SH

0,2

3

4

20

B7

SH

0,5

3

4

20

B8

SH

1,0

3

4

20

B9
SH
1,5
3
4
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ (%) mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi

20

3.4. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC, kết quả được đọc dựa trên
bảng ANOVA, LSD và phương pháp Ducan’s multiple range test.
13
 


Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vât đặc biệt là auxin, có vai trò trong sự

thành lập các tế bào có khả năng sinh phôi do chúng ảnh hưởng lên tính hữu cực của tế
bào và kích thích các phân chia không cân xứng đó (Nguyễn Đứu Lượng và ctv,
2006). Ngoài ra lượng auxin nội sinh của tế bào cũng có ảnh hưởng rất lớn đến quá
trình phát sinh phôi. Lượng auxin nội sinh thích hợp trong mẫu cấy có thể là yêu cầu
chủ yếu trong quá trình phát sinh phôi (Dương Tấn Nhựt, 2009).Auxin (nội sinh hay
ngoại sinh) rất cần thiết cho sự biểu hiện của các quá trình phát sinh phôi, nó đảm bảo
cho sự sống sót của tế bào, cung cấp các điều kiện sinh lý phù hợp, cảm ứng sự phân
bào. Đó là lý do vì sao trên môi trường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác
nhau, các loại mô có khả năng đáp ứng khác nhau.
Bảng 4.1Tỷ lệ phôi vô tính hình thành từ mô sẹo của sâm Ngọc Linh
Nghiệm thức
A1

Môi trường
SH

IBA (mg/l)
0,1

Phôi vô tính (%)
73,33abc

A2

SH

0,3

78,33ab

A3

SH

0,5

61,67c

A4

SH

0,7

88,33a

A5

SH

1,0

68,33bc

A6

SH
CV (%)

1,5

68,33bc
11,38

Các giá trị trung bình trong cùng một cột có các ký tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về
thống kê (p<0,05).

Sau 2 tuần nuôi cấy, mô sẹo có đáp ứng với môi trường và bắt đầu quá trình
phát sinh phôi. Các mẫu được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung nồng độ IBA cao
hơn 0,5 mg/l quá trình hình thành phôi nhanh hơn sau 4 tuần nuôi cấy. Sự hình thành
phôi trải qua các bước: sự biệt hóa các tế bào có thể phát sinh tế bào phôi, sự phát triển
của tế bào phôi mới hình thành thông qua các giai đoạn như phôi hình cầu, phôi hình
trái tim và phôi hình cá đuối (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2006). Sau 4 tuần nuôi cấy,
phôi được soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40X và xác định được các hình dạng
khác nhau của phôi (hình 4.1).

14
 


Ở các nghiệm thức có bổ sung nồng độ IBA (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,5 mg/l) khác
nhau, hầu hết các mô sẹo đều phản ứng với môi trường và hình thành phôi. Nhưng ở
nghiệm thức A4 có bổ sung 0,7 mg/l IBA cho tỷ lệ hình thành phôi cao nhất (88,33%),
phôi phát triển nhanh, đều và dễ tách. Khi sử dụng IBA ở nồng độ cao hơn 1 mg/l tỷ lệ
hình phôi đạt 68,33%, tuy nhiên phôi có hiện tượng hóa nâu và có xu hướng tạo
rễ.Điều này cho thấy IBA ở nồng độ cao chỉ thích hợp cho quá trình tạo rễ, một số
nghiên cứu tạo rễ tóc trên sâm Ngọc Linh đã được chứng minh. Chất điều hòa sinh
trưởng IBA là chất kích thích tạo rễ thích hợp hơn cho nuôi cấy tạo rễ bất định ở sâm
Ngọc Linh. Chất điều hòa sinh trưởng này cũng đã được chứng minh là auxin hiệu quả
nhất cho sự hình thành rễ trên nhiều đối tượng khác (Nguyễn Thị Liễu và ctv, 2010).

Hình 4.1Phôi vô tính được soi dưới kính hiển vi 40X. A. Phôi hình
tim; B. Phôi hình cầu; C. Phôi hình thủy lôi; D. phôi hình bầu dục.

Sự sinh cơ quan phôi của một cây song tử diệp được xem là bắt đầu từ trạng
thái phôi hình cầu, với sự xuất hiện của các vùng mô phân sinh chồi và rễ. Biểu hiện
trạng thái đầu tiên từ trạng thái phôi hình cầu đến trạng thái phôi hình tim, đến trạng
thái phôi hình thủy lôi với sự xuất hiện của rễ mầm và tử diệp (Nguyễn Đức Lượng và
ctv, 2006).
15