Kỹ thuật lấy mẫu Bênh Phẩm chẩn đoán 1 số bệnh trên người

Kỹ thuật lấy bệnh phẩm
xét nghiệm chẩn đoán vi rút
Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài này, học viên có khả năng:
1. Nắm đợc các kỹ thuật lấy bệnh phẩm chẩn đoán vi rút
2. Thực hiện đợc kỹ thuật lấy bệnh phẩm đờng hô hấp để chẩn đoán sinh học
phân tử và phân lập vi rút.
3. Thực hiện đợc kỹ thuật lấy máu toàn phần và lấy máu tách huyết thanh
4. Thực hiện đợc kỹ thuật đóng gói và vận chuyển đúng cho từng loại bệnh phẩm.

1. Giới thiệu chung
Trong công tác xét nghiệm xác định tác nhân vi rút gây bệnh trong phòng thí
nghiệm thì công việc lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm
đúng qui định là vô cùng quan trọng. Công việc này thực hiện tốt thì thời gian xác
định đợc căn nguyên sẽ nhanh chóng và kết quả có độ tin cậy cao. Chúng tôi xin
giới thiệu các qui trình chi tiết trong công việc lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển
mẫu đến phòng thí nghiệm để cùng nhau thực hiện.
1.1. Trang bị bảo hộ cá nhân
Tuỳ từng loại bệnh phẩm và mức độ nguy hiểm, mức độ lây của bệnh mà có
các quy định bảo hộ cá nhân nh khẩu trang (khẩu trang phẫu thuật, N95, N/P/R 100), găng tay, quần, áo choàng, kính, tạp dề, mũ, ủng hoặc bao giày.
2.2. Các thông tin tối thiểu cần thiết của mẫu bệnh phẩm
Tất cả các tube đựng mẫu bệnh phẩm phải đợc ghi họ tên, tuổi, địa chỉ, loại
mẫu bệnh phẩm hoặc phải đợc mã hoá, ghi thông tin đầy đủ trên phiếu điều tra.
Phiếu điều tra đợc thiết kế tuỳ theo từng loại bệnh và tuỳ theo những thông tin cần
thu thập, nhng tối thiểu bao gồm các thông tin:
- Thông tin về hành chính: Họ tên, tuổi, địa chỉ
- Thông tin về bệnh, dịch tễ: Ngày khởi bệnh, ngày vào viện, một số thông tin
về tiền sử phơi nhiễm, một số triệu chứng hội chứng nếu cần thiết
- Thông tin về mẫu bệnh phẩm: Ngày thu thập mẫu, loại bệnh phẩm
Nếu dịch xảy ra đột ngột cha có phiếu điều tra chính thức thì cần phải nghi
thông tin tối thiểu nh họ và tên, tuổi, địa chỉ, ngày khởi bệnh, triệu chứng lâm
sàng, ngày lấy mẫu.

1


2. Lấy bệnh phẩm xét nghiệm
2.1. Dịch não tủy
* Lấy mẫu: Mẫu dịch não tuỷ do các bác sĩ lâm sàng có kinh nghiệm lấy mẫu,
hứng trực tiếp 1,5 - 2 ml dịch não tuỷ vào ống nghiệm. Chia dịch não tuỷ vào 3 tube
riêng biệt có nắp xoáy.
* Bảo quản và vận chuyển mẫu: Dịch não tuỷ đợc bảo quản 40C vận chuyển
ngay đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt trong vòng 24 giờ. Nếu không thể
vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm, phải bảo quản dịch não tuỷ ở nhiệt độ âm
sâu, tối thiểu - 20oC, dịch não tuỷ dùng cho phân lập vi rút bảo quản tốt nhất - 800C,
đá khô hoặc nitơ lỏng.
2.2. Mẫu bệnh phẩm đờng hô hấp
Tuỳ vào vị trí tổn thơng, mẫu bệnh phẩm đợc lấy ở vị trí đờng hô hấp trên
hoặc đờng hô hấp dới.
Bệnh phẩm đờng hô hấp trên: dịch mũi, dịch hầu họng, dịch súc họng, dịch
rửa mũi, dịch tỵ hầu, dịch mũi họng.
Bệnh phẩm đờng hô hấp dới: dịch phế quản, dịch phế nang.
2.2.1. Dụng cụ và môi trờng:
Môi truờng vận chuyển: có thể sử dụng một trong các môi trờng MEM,
DMEM, M199, các môi truờng này cho thêm kháng sinh Penicilline, streptomicine
và fungizone, môi trờng đợc chia 2 - 3 ml cho vào tube có nắp xoáy, bảo quản
40C trong vòng 4 tuần
Dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu:
- Lọ, tube đựng mẫu có sẵn môi trờng

- Đè lỡi
- Hộp bảo quản mẫu

vận chuyển
- Tăm ngoáy họng có đầu bằng

- Bình tích lạnh
- Quần áo bảo hộ

polyester
- Nớc muối

- Phiếu điều tra

- Bộ lấy dịch tỵ hầu bằng chân không

2


Lọ đựng mẫu

Dụng cụ lấy dịch tỵ hầu

Tăm ngoáy họng

Đè lỡi

Hình 1: Các loại dụng cụ để lấy và đựng bệnh phẩm
2.2.2. Cách lấy bệnh phẩm
Dịch mũi
- Đặt bệnh nhân ngồi thoải mái, hơi ngửa cổ ra sau.
- Đa tăm bông vào mũi theo một đờng song song
với vòm miệng

- Giữ tại đó vài giây
- Rút nhẹ nhàng xoáy tròn tăm bông trong quá
trình rút ra
- Sử dụng tăm bông khác để lấy mẫu mũi bên kia
- Cho cả 2 tăm bông vào lọ đựng mẫu đã có sẵn môi
trờng vận chuyển
- Bẻ đầu tăm bông thừa đạy chặt nắp
3


Dịch hầu họng
- Bệnh nhân há miệng

This image cannot currently be display ed.

- Dùng đè lỡi đè lỡi xuống
- Dùng tăm bông miết mạnh khu vực 2
amidan và vách phía sau vòm hầu họng
- Tránh chạm vào lỡi
- Cho tăm bông vào tube đựng mẫu có môi
trờng vận chuyển

Dịch tỵ hầu
- Nối dụng cụ lấy mẫu với hệ thống hút chân không (máy hút chân không
hoặc quả bóng)
- Bệnh nhân ngồi hơi ngửa đầu
- Đa catheter vào mũi theo hớng song song với vòm miệng, độ sâu bằng ẵ
đờng nối mũi, tai
- Bật máy hút chân không
- Từ từ đa catheter ra ngoài vừa đua ra vừa xoáy

- Tơng tự nh vậy với mũi bên kia, sử dụng chung một catheter
- Hút 3 ml dung dịch vận chuyển để rửa catheter, chia mẫu vào tube đựng mẫu
Bệnh phẩm đờng hô hấp dới:
* Dịch khí phế nang, phế quản
Chỉ những ngời có kinh nghiệm mới đợc lấy bệnh phẩm này, có thể lấy dịch
phế nang, phế quản qua ống nội khí quản hoặc ống mở khí quản trong trờng hợp
bệnh nhân thở máy
2.2.3. Bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm đờng hô hấp
Mẫu bệnh phẩm đờng hô hấp đợc bảo quản 40C chuyển về phòng thí
nghiệm càng sớm càng tốt. Trong trờng hợp mẫu bệnh phẩm nghi do các tác nhân
gây bệnh nguy hiểm nh SARS, cúm A H5N1... phải tuân thủ nghiêm ngặt quy
trình đóng gói, bảo quản và vận chuyển mẫu nghi ngờ chứa các tác nhân gây bệnh
nguy hiểm (mô tả ở phần đóng gói, bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm do tác
nhân nguy hiểm)
4


Trong trờng hợp không thể vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm thì phải
bảo quản mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ - 80oC, đá khô hoặc nitơ lỏng
2.3. Mẫu bệnh phẩm ở tổn thơng ngoài da
2.3.1. Dụng cụ lấy mẫu:
- Nớc muối sinh lý
- Tăm bông vô trùng và môi trờng vận chuyển
- Tube vô trùng có nắp xoáy
- Kim chích hoặc kim tiêm
2.3.2. Phơng pháp lấy và bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm
Bệnh phẩm là nốt phỏng hoặc vết loét: thờng dùng cho chẩn đoán các tác
nhân nh thuỷ đậu, Herpes, bệnh chân tay miệng
- Dùng kim vô trùng chích thủng nốt phỏng.
- Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch chảy ra từ nốt phỏng. Cố gắng lấy đợc

càng nhiều dịch càng tốt.
- Cho tăm bông trực tiếp vào môi trờng vận chuyển vi rút, bảo quản lạnh
4oC trong quá trình vận chuyển.
- Những tổn thơng đã bị vỡ hoặc các vết loét cần phải miết đủ mạnh ở vùng
gần bờ tổn thơng để đảm bảo lấy đợc cả các tế bào bị bong ra, Các tế bào này
chứa vi rút.
Sinh thiết da: dùng cho chẩn đoán bệnh dại
Kỹ thuật này thờng không áp dụng trong các vụ dịch. Khi cần thiết, kỹ
thuật này phải đợc tiến hành bởi những ngời có kinh nghiệm.
2.4. Mẫu máu/huyết thanh
Bệnh phẩm máu có thể sử dụng cho phân lập tác nhân gây bệnh, huyết thanh
có thể sử dụng làm các phản ứng phát hiện vật liệu di truyền (ví dụ phản ứng PCR),
phát hiện kháng thể, kháng nguyên .
Đối với các phản ứng huyết thanh học thì tốt nhất lên lấy mẫu máu kép, mẫu
máu trong giai đoạn cấp tính (máu 1) đợc thu thập trong những ngày đầu của
bệnh, mẫu máu 2 thu thập trong giai đoạn hồi phục, thờng sau bốn tuần.

5


2.4.1. Dụng cụ
- Garo
- Tube chân không hoặc tube vô trùng có sẵn EDTA
- Bông khô
- Kim lấy máu hoặc bơm kim tiêm trong trờng hợp
không có tube chân không
- Hộp huỷ kim
2.4.2. Lấy máu toàn phần: bắt buộc phải lấy máu tĩnh mạch
- Sử dụng bơm tiêm thông thờng: garo tĩnh mạch cần lấy, sát trùng cồn, dùng
bơm kim 5 - 10ml để lấy máu, ngời lớn lấy từ 2 đến 10ml máu, trẻ em lấy từ 2 đến

5ml máu, còn trẻ sơ sinh lấy từ 0,5 đến 2 ml máu. Cho máu vào ống nghiệm đã có
sẵn chất chống đông
- Dùng hệ thống hút chân không: Cắm kim lấy máu vào hệ thống nối với tube
chân không. Đa kim vào tĩnh mạch, khi kim đã hoàn toàn nằm trong lòng tĩnh
mạch nhanh chóng cắm hệ thống nối với tube chân không đã có sẵn EDTA, lấy từ 5
- 10 ml máu
- Trong trờng hợp máu dùng cho phân lập vi rút, bảo quản 40C chuyển mẫu
bệnh phẩm càng nhanh càng tốt về phòng thí nghiệm (trong vòng 24 giờ, nếu không
thì phải bảo quản nhiệt độ âm tốt nhất là - 800C
2.4.3. Lấy mấu và tách huyết thanh
* Lấy máu tĩnh mạch
Lấy 5 - 10 ml máu tĩnh mạch
Cho máu vào tube không có chất chống đông, để máu đông tự nhiên ở nhiệt
độ thờng khoảng 30 phút. Sau đó, chuyển mẫu vào tủ lạnh 4 - 8oC trong ít nhất 1 2 giờ để cục máu đông co lại (có thể giữ mẫu ở nhiệt độ này từ 48 - 72 giờ). Nếu
không có máy ly tâm, nên để mẫu ở nhiệt độ này từ 4- 6 tiếng cho cục máu đông co
lại hoàn toàn. Nếu có máy ly tâm, ly tâm mẫu máu ở tốc độ thấp 2.500 vòng/ phút/
10 phút chắt huyết thanh
* Lấy máu bằng ống mao dẫn
- Sát trùng cồn 700 vào đầu ngón tay, bóp nhẹ đầu ngón tay để cho máu dồn
xuống;
- Dùng kim chích đầu ngón tay;
6


- Dùng ống mao dẫn đã đánh dấu sẵn mã hoá bệnh nhân đặt ngang để cho
máu chảy dần vào ống mao dẫn;
- Để ống mao dẫn nằm ngang ở nhiệt độ phòng cho tạo cục máu đông, khi
máu đã đônng dùng đèn cồn hàn kín hai đầu của ống mao dẫ;
- Cho ống mao dẫn vào ống nghiệm, bảo quản 40C chuyển về phòng thí
nghiệm.

* Lấy máu bằng giấy thấm.
- Sát trùng cồn 700 vào đầu ngón tay, bóp nhẹ đầu ngón tay để cho máu dồn
xuống;
- Dùng kim chích đầu ngón tay;
- Dùng giấy thấm đã đánh dấu sẵn mã hoá bệnh nhân thấm máu sao cho máu
thấm đều 2 mặt của giấy thấm;
- Xếp giấy thấm theo phơng thẳng đứng, để khô ở nhiệt độ thờng, tránh để
sát các giấy thấm với nhau. Sau khi giấy thấm khô, cho giấy vào tube hoặc 1 túi
nilon riêng biệt, bảo quản 40C chuyển về phòng thí nghiệm.
2.5. Mẫu phân
Thu thập mẫu phân càng sớm càng tốt ngay sau khi xuất hiện bệnh. Nếu có
thể, thu thập mẫu phân hai đến ba lần trong các ngày khác nhau. Mẫu phân rất có
giá trị cho phân lập tác nhân gây bệnh nh vi rút đờng ruột, bệnh chân tay miệng,
vi rút Rota...
Đối với trẻ sơ sinh, có thể dùng tăm bông vô khuẩn hoặc ống thông trực
tràng đa vào trực tràng để lấy phân.
2.5.1. Dụng cụ
- Tube đựng mẫu sạch có nắp xoáy, khô và không thấm nớc;
- Để vận chuyển mẫu bệnh phẩm lấy bằng tăm bông trực tràng cần dùng môi
trờng vận chuyển;
2.5.2. Phơng pháp lấy mẫu
- Lấy khoảng 5 - 10ml phân lỏng (khoảng 1 thìa cà phê) hoặc 5 - 10 gam chất
rắn (bằng đầu ngón tay cái) cho vào tube đựng mẫu;
- Vặn chặt nắp;
* Cách lấy mẫu phân trực tràng bằng tăm bông ở trẻ sơ sinh:
- Tăm bông làm ẩm bằng nớc muối sinh lý;
- Đa tăm bông nhẹ nhàng qua cơ tròn vào đến trực tràng và xoay nhẹ;.
7

- Kéo nhẹ tăm bông ra, chú ý kiểm tra chắc chắn có mẫu phân thấm vào đầu
tăm bông;
- Cho tăm bông vào trong tube đựng bệnh phẩm có chứa môi trờng vận
chuyển thích hợp;
- Bẻ phần que thừa, đậy chặt nắp, chú ý không làm que thừa chạm vào miệng
tube đựng bệnh phẩm.
2.5.3. Bảo quản và vận chuyển
Mẫu phân bảo quản ở 4- 8oC trong quá trình vận chuyển tới phòng thí nghiệm.
Nên chuyển càng sớm càng tốt tới phòng thí nghiệm, nếu không thì bảo quản 200C. Khi mẫu phân tới phòng thí nghiệm thì phải đợc xử lý ngay theo thờng quy
xét nghiệm của mỗi loại tác nhân gây bệnh.
2.6. Mẫu nớc tiểu
2.6.1. Dụng cụ
- Cốc nhựa 50 ml tiệt trùng có nắp đậy;
- Tube đựng mẫu có nắp xoáy;
- Gạc hoặc giấy thấm;
- Xà phòng và nớc sạch (hoặc nớc muối).
2.6.2. Phơng pháp lấy mẫu
Để tránh nhiễm trùng, nên rửa bộ phận sinh dục ngoài trớc bằng xà phòng và
nớc sạch. Nếu không có xà phòng và nớc sạch, có thể dùng nớc muối thờng.
Lau khô bộ phận sinh dục bằng giấy thấm trớc khi lấy nớc tiểu.
Hớng dẫn bệnh nhân rõ ràng cách lấy nớc tiểu giữa dòng bằng cách bỏ một
ít nớc tiểu ban đầu, hứng bãi nớc tiểu ở giữa. Chú ý dặn bệnh nhân không đợc
chạm tay, chân và bộ phận sinh dục ngoài vào mặt trong cốc.
Sau khi lấy đợc nớc tiểu đậy chặt nắp, bệnh phẩm thu thập đợc phải dùng
pipét để chuyển mẫu nớc tiểu sang tube đựng mẫu càng sớm càng tốt, tránh nhiễm
trùng.
Đối với trẻ sơ sinh và trẻ nam có thể dùng túi đựng nớc tiểu để thu thập mẫu,
sử dụng pipét chuyển mẫu nớc tiểu thu thập đợc vào tube đựng mẫu
2.6.3. Bảo quản và vận chuyển
Vận chuyển mẫu nớc tiểu đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt. Không

đợc làm đông băng mẫu nớc tiểu, chỉ cần bảo quản ở 4 - 8oC.
Chú ý: Phải đảm bảo chắc chắn tube đựng mẫu bệnh phẩm không thấm nớc
và đậy chặt.
8


3. Đóng gói và vận chuyển mẫu bệnh phẩm
3.1. Nguyên tắc
- Mẫu bệnh phẩm phải đựng trong tube có nắp xoáy, không dễ vỡ và không
thấm nớc;
- Mẫu bệnh phẩm phải đợc đóng gói ba lớp;
- Lớp thứ nhất phải là lớp không thấm nớc;
- Sử dụng các chất liệu thấm nớc để bao bọc bên ngoài ở tất cả các lớp: Bông
thấm nớc.
- Mỗi hộp đựng mẫu để vận chuyển không quá 50 ml.
3.2. Phơng pháp đóng gói bệnh phẩm
* Lớp trong cùng:
- Tube chứa bệnh phẩm phải đợc xoáy chặt nắp, dùng giấy parafin hoặc băng
dính đợc làm bằng oxít kẽm quấn quanh nắp;
- Bọc ra ngoài tube bệnh phẩm bằng một lớp giấy thấm;
- Một vài tube bệnh phẩm có thể để chung vào lớp hộp thứ hai.
* Lớp thứ hai: Lớp thứ hai là một hộp chứa không thấm nớc, lót bên trong là
lớp giấy thấm có khả năng thấm hút dung dịch từ mẫu bệnh phẩm trong trờng hợp
tube đựng bệnh phẩm bị rò.
- Hộp này cũng phải đợc đậy nắp chặt và quấn kín nắp nh lớp trong cùng;
- Hộp thứ hai này cũng đợc bao ngoài bằng lớp giấy thấm;
- Có thể để một vài hộp lớp thứ hai chung vào hộp thứ ba;
* Lớp ngoài cùng: Lớp ngoài cùng có tác dụng bảo vệ lớp thứ hai khỏi các tác
nhân từ bên ngoài nh va chạm cơ học, nớc trong quá trình vận chuyển;
- Lót bên trong hộp bằng giấy thấm ngăn cách lớp thứ hai và lớp ngoài cùng;

- Vặn chặt nắp hộp, dán kín.
3.3. Bảo quản mẫu ở phòng thí nghiệm
Các mẫu cần đợc lu giữ trong điều kiện tốt và khoa học để thuận lợi cho
việc lấy mẫu kiểm tra - mẫu đợc để thứ tự trong các hộp đựng mẫu có số thứ tự
đợc ghi trên nắp hộp (có thể sử dụng hộp giấy hoặc hộp nhựa loại thiết kế cho 100
tube nhựa loại 1,5 ml hay 2 ml).
Cần có sổ theo dõi vị trí để mẫu (để ở tủ nào, ngăn nào...) để thuận tiện cho
khi tìm kiếm.
9


Câu hỏi lợng giá
1. Hãy nêu nguyên tắc cơ bản về an toàn sinh học khi tiếp xúc với các tác nhân gây
bệnh (bảo hộ cá nhân, nguyên tắc đóng gói, dán nhẫn và vận chuyển các mẫu bệnh
phẩm có nguy cơ gây nhiễm cao).
2. Trình bày các thông tin tối thiểu trong công tác thu thập bệnh phẩm xét nghiệm,
vai trò của các thông tin này?
3. Trình bày cách lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm đờng hô hấp
(dịch mũi, dịch hầu họng, dịch tỵ hầu).
4. Trình bày cách lấy mẫu phân, bảo quản và vận chuyển đến phòng thí nghiệm.
5. Trình bày cách lấy mẫu máu, huyết thanh, bảo quản và vận chuyển mẫu đến
phòng thí nghiệm dùng cho phân lập và chẩn đoán huyết thanh học.
Tài liệu tham khảo
1. David M. Knife, Peter M. Howley (2001), Field Virology, Diagnostic Virology,
pp 493 - 452
2. H. Lenneter, David A. Lenneter, Evelyne T. Lennetter (1995), Diagnostic
procedure for Viral, Rickettsial and Clamidial Infections, diagnosis by serologic
assay, pp 121 - 138
3. Lee Cheow Pheng, Zainudin Abdul Wahab, Rodani Jahis, Husnina Ibrahim
(2004) Syndromic notification and laboratory investigation manual 2nd edition,

collection and handling specific speciments, pp 20 - 30
4. Piere Payment, Michel Trudel (1989) Manuel de techniques Virologiques,
Isolement et Idenfication des vi rỳt, pp 21 - 22
5. WHO, (2006), Rapid Respose for Avial and Pandemic Influenza training of
trainers, Module 8- Specimens collection

10


Các Phơng pháp cơ bản
để phân lập và định danh vi rút
Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài này, học viên có khả năng:
1. Trình bày đợc các đờng lây truyền của một số vi rút gây bệnh ở ngời.
2. Trình bày đợc vì sao mỗi loại căn nguyên vi rút lại lấy mỗi loại bệnh phẩm
khác nhau.
3. Biết đợc các phơng pháp cơ bản để phân lập và định danh vi rút.
1. Đại cơng
Tuỳ từng loại vi rút mà đờng lây truyền của vi rút vào cơ thể có khác nhau.
Có loại vi rút lây nhiễm theo đờng phân- miệng (vi rút đờng ruột); Có loại vi rút
lây nhiễm theo đờng hô hấp nh vi rút Cúm, vi rút hợp bào đờng hô hấp, vi rút
Sởi, Rubella...; Có loại vi rút lây nhiễm theo đờng máu (vi rút viêm gan trừ vi rút
viêm gan A, vi rút HIV...), Có loại vi rút lây nhiễm theo đờng máu qua côn trùng
tiết túc (vi rút viêm não Nhật Bản, vi rút Dengue...)... Tuỳ vào từng loại vi rút, tuỳ
vào đờng lây truyền, tuỳ vào mục tiêu chẩn đoán và dựa vào cơ chế sinh bệnh mà
đa ra phơng pháp lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm
cũng nh lựa chọn phơng pháp xét nghiệm phù hợp nhất để xác định căn nguyên
nhanh nhất mà có độ tin cậy cao.
2. Lấy mẫu và bệnh phẩm xét nghiệm
2.1. Thông tin thu thập mẫu
Thông tin tối thiểu bao gồm họ tên bệnh nhân, tuổi, địa chỉ (thôn, xã, huyện,

tỉnh), ngày tiêm vacxin cuối cùng, ngày phát ban, ngày thu thập mẫu, loại mẫu,
ngày nhận mẫu tại phòng thí nghiệm.
2.2. Các loại mẫu dùng cho phân lập vi rút
- Dịch ngoáy họng: phân lập vi rút Cúm, vi rút Sởi, vi rút Rubella, vi rút hợp bào
đờng hô hấp, vi rút Rhino...
Đè lỡi và dùng tăm bông miết mạnh xung quanh thành họng. Cho tăm bông
vào tube đã có sẵn môi trờng vận chuyển vi rút.
- Phân : phân lập vi rút đờng ruột, vi rút Rota...
+ Phân cục: lấy khoảng 4 gam phân (cục phân bằng đầu ngón tay cái). Dùng
thìa gắn trên nắp nhựa, xúc cục phân và cho vào tube, vặn chặt nắp.
11


+ Phân lỏng: Dùng bơm tiêm hút khoảng 5-10 ml, cho vào tube sạch, đậy
chặt nắp.
+ Sông trực tràng: Dùng Sonde nelaton lấy khoảng 5ml phân từ hậu môn cho
vào tube sạch, đậy chặt nắp.
- Máu toàn phần: phân lập vi rút Dengue.
Dùng bơm tiêm lấy máu ven 5-10 ml, cho vào tube vô khuẩn, đậy chặt nắp.
Để máu đông tự nhiên để tránh vỡ hồng cầu.
- Dịch não tủy: phân lập vi rút VNNB và viêm não arbor.
Bác sĩ điều trị lấy: lấy khoảng 5-10 ml DNT, cho vào tube vô khuẩn.
- Dịch âm đạo, dịch mụn nớc: Phân lập vi rút Herpes, vi rút thủy đậu, vi rút
đờng ruột typ71, vi rút Coxsackie A16,...
+ Dịch âm đạo: Bác sĩ chuyên khoa lấy.
+ Dịch mụn nớc: Dùng bơm tiêm hút dịch. Nếu không hút đợc thì sau khi
chọc nhẹ mụn nớc, dùng tăm bông thấm dịch và cho vào tube đã có sẵn môi
trờng vận chuyển.
- Tổ chức bệnh lý nh não, nhu mô ruột: phân lập vi rút dại, vi rút VNNB,
2.3. Thời gian thu thập mẫu bệnh phẩm

Dựa vào cơ chế bệnh sinh của vi rút để xác định thời gian lấy mẫu bệnh
phẩm cho phân lập vi rút hay xác định kháng thể.
Thời gian thu thập mẫu để phân lập vi rút hoặc xác định ARN (ADN) của vi
rút: Tùy thuộc vào từng loại vi rút, tuy nhiên, hầu hết các vi rút đều dễ dàng phân
lập đợc nếu lấy mẫu ở giai đoạn sớm của bệnh sau ngày khởi phát. Vi rút Dengue
và viêm não <= 3 ngày sau ngày khởi bệnh, vi rút Sởi và Rubella <=7 ngày, vi rút
đờng ruột <=14 ngày, vi rút Cúm trong thời gian bệnh nhân viêm đờng hô hấp.
2.4. Bảo quản và vận chuyển mẫu xét nghiệm
Mỗi loại vi rút có nhiệt độ bảo quản khác nhau, tuỳ thuộc vào tính nhạy cảm
với nhiệt độ mà có điều kiện bảo quản thích hợp để phân lập vi rút (nh vi rút Cúm,
vi rút viêm não Nhật Bản...). Tuy nhiên, phần lớn các vi rút đợc bảo quản theo điều
kiện nhiệt độ sau.
- Bảo quản tại 40C: nếu mẫu đợc vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm
hoặc lâu nhất trong vòng 3 ngày
- Bảo quản tại - 200C (tốt nhất là -800C) nếu cha có điều kiện chuyển mẫu
ngay và phải vận chuyển đến PTN trong điều kiện còn đông đá.
12


3. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
3.1. Dụng cụ và thiét bị phòng thí nghiệm
- Dụng cụ, phơng tiện máy móc tối thiểu cần thiết để phân lập vi rút: Máy
ly tâm, tủ ấm, tủ sấy, tủ ATSH...
- Dụng cụ, phơng tiện máy móc cho sinh học phân tử: Tủ an toàn sinh học,
máy PCR, máy ly tâm cao tốc, máy chạy điện di, máy đọc gel...
3.2. Phân lập vi rút
3.2.1. Phân lập vi rút trên tế bào:
* Tế bào: Có 2 loại tế bào là tế bào tiên phát và tế bào thờng trực. Tùy theo
tính cảm nhiễm của tế bào với từng loại vi rút mà chọn dòng tế bào thích hợp
để phân lập vi rút.

+ Tế bào tiên phát: là tế bào trực tiếp từ sinh vật sống nh tế bào thận khỉ
tiên phát, là dòng tế bào nhạy cảm với tơng đối nhiều các loại vi rút khác nhau.
Tuy nhiên dòng tế bào này rất khó chủ động trong công việc, đắt tiền nên ít đợc sử
dụng
+ Tế bào thờng trực: là dòng tế bào đã đợc thuần hóa (cấy truyền nhiều
lần) và có khả năng giữ đợc trong phòng thí nghiệm trong thời gian dài. Có nhiều
các dòng tế bào thờng trực khác nhau, mỗi dòng có khả năng nhạy cảm với từng
nhóm vi rút. Tế bào thờng trực hiện nay đợc sử dụng phổ biến để phân lập vi rút.
* Phơng pháp thực hiện:
- Chuẩn bị tế bào một lớp: tế bào đợc trypssin hóa, pha loãng tế bào ở nồng
độ 105TB/1ml trong môi trờng thích hợp có 10% huyết thanh bào thai Bê. ủ chai tế
bào ở nhiệt độ thích hợp cho đến khi tạo đợc tế bào 1 lớp khoảng 75% (thông
thờng khoảng 3 ngày)
- Gây nhiễm bệnh phẩm: Bệnh phẩm đợc xử lý với kháng sinh P/S nồng độ
100U/ml
Thay môi trờng phát triển bằng môi trờng duy trì có 2% Serum
Cho bệnh phẩm vào chai tế bào
ủ chai tế bào đã gây nhiễm ở nhiệt độ thích hợp
Theo dõi hủy hoại tế bào hàng ngày (CPE)
Chai tế bào có CPE>50% đợc cất tại -200C để xác định typ huyết thanh
hoặc loại vi rút (Có loại vi rút không tạo CPE, cần xác định mù nh vi rút Rubella,
vi rút arbor, vi rút dại trên một số loại tế bào)
13


3.2.2. Phân lập vi rút trên chuột ổ: nhóm vi rút arbor
3.2.3. Phân lập vi rút trên muỗi: nhóm vi rút arbor
3.2.4. Phân lập vi rút trên tế bào sơ non (trứng ấp dở): vi rút Cúm
3.3. Phơng pháp định danh vi rút
3.3.1. Phơng pháp trung hoà vi lợng trên nuôi cấy tế bào: Xác định các typ vi

rút đờng ruột
Các bệnh phẩm dơng tính đợc pha loãng và trộn với 1 lợng đồng thể tích
hỗn hợp KHT vi rút bại liệt, hoặc KHT vi rút đờng ruột ủ ở 36oC trong 2 giờ cho
sự kết hợp KN-KT. Sau đó cho hỗn dịch tế bào nồng độ 1,2 x 105 tế bào/ml và theo
dõi thí nghiệm hàng ngày dới kính hiển vi lộn ngợc
VD: 0,05ml KHT chuẩn + 0,05 ml vi rút nồng độ 100TCD50+ 0,1ml tế bào
nồng độ 2X105TB/1ml. ủ ở nhiệt độ thích hợp.
Giải thích kết quả: xác định loại vi rút hay serotyp vi rút khi tế bào hoàn toàn
bình thờng do vi rút đã bị bất hoạt bởi kháng huyết thanh đặc hiệu vi rút, tế bào tự
do và phát triển bình thờng tạo nên một lớp tế bào khỏe mạnh.
3.3.2. Phơng pháp ức chế ngng kết hồng cầu (HI): xác định vi rút Cúm, vi
rút Dengue, vi rút VNNB...
3.3.3. Phơng pháp miễn dịch huỳnh quang: Xác định nhiều loại vi rút
3.3.4. Phơng pháp sinh học phân tử sử dụng cặp mồi đặc hiệu
3.4. Phơng pháp sinh học phân tử xác định vi rút
3.4.1. Phơng pháp RT-PCR, xác định các vi rút có vật liệu di truyền là
RNA từ các mẫu lâm sàng và mẫu phân lập
3.4.2. Phơng pháp snPCR/Seq. xác định các typ vi rút đờng ruột từ mẫu
lâm sàng
3.4.3. Phơng pháp PCR xác định các vi rút có vật liệu di truyền là ADN từ
các mẫu lâm sàng và mẫu phân lập: Vi rút viêm gan B, Herpes, Adeno...
3.4.4. Phơng pháp RT PCR ứng dụng xác định tác nhân vi rút
4. Phân tích và nhận định kết quả
Kết quả dơng tính khi:
Vi rút gây hủy hoại tế bào (một số ít vi rút không gây hủy hoại tế bào)
Typ vi rút hoặc loại vi rút đợc xác định bằng một trong các phơng pháp:
phơng pháp trung hòa trên nuôi cấy tế bào, phơng pháp ức chế ngng kết hồng
cầu, IFA, sinh học phân tử (RT-PCR, PCR, Seq.),...
14

Câu hỏi lợng giá
1. Vi rút nào lấy mẫu dịch ngoáy họng? Vi rút nào lấy mẫu phân, mẫu máu, mẫu
dịch não tủy?.
2. Các phơng pháp phân lập vi rút
3. Phơng pháp định danh vi rút
4. Phơng pháp nào thực hiện thuận lợi nhất
Tài liệu tham khảo
1. Manuel de techniques virologiques, presses de Luniversite du Quebec,
1989.
2. Manual for the laboratory diagnosis of measles and rubellavirus infection.
WHO, 2007
3. Poliovirus laboratory Manual . WHO, 2004

15


xét nghiệm huyết thanh
chẩn đoán vi rút

Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài này, học viên có khả năng:
1. Trình bày đợc nguyên lý các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học
2. Thực hành đợc các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học..
1. Giới thiệu chung
Phơng pháp chẩn đoán huyết thanh học là phơng pháp dùng kháng nguyên
mẫu (đã biết trớc) để xác định hoặc định lợng kháng thể có mặt trong huyết
thanh hoặc các dịch của cơ thể bệnh nhân. Phơng pháp huyết thanh học thờng
đợc ứng dụng trong các lĩnh vực sau đây:
Chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng
Xác định sự có mặt của kháng thể IgM và hoặc động lực kháng thể IgG đối

với một loại vi sinh vật nào đó trong huyết thanh hoặc chất dịch cơ thể.
Nghiên cứu dịch tễ học của các bệnh nhiễm trùng
Điều tra tình hình nhiễm một loại vi sinh vật nào đó qua việc điều tra kháng
thể trong huyết thanh của các mẫu nghiên cứu (ngời hoặc động vật truyền bệnh
hay ổ chứa).
Nghiên cứu sự đáp ứng của cơ thể đối với kháng nguyên vi sinh vật
Thờng dùng trong đánh giá hiệu lực đáp ứng miễn dịch của vắc xin.
2. Lấy mẫu để chẩn đoán huyết thanh học
Cỏc k thut xỏc nh IgM, ly mỏu trong giai on cp tớnh v cú th s dng
mt mu mỏu n nhng i vi cỏc k thut xột nghim xỏc nh IgG thỡ cn thit
phi ly mu mỏu kộp. Mỏu 1 trong giai on cp thng trong vũng tun th 1 2
ca bnh, mỏu 2 ly trong thi k lui bnh, thng 10 ngy 2 tun sau khi ly
mỏu 1.
2.1. Ly mỏu tnh mch
Dựng kim, xi lanh hoc kim v týp chõn khụng ly 5 ml mỏu tnh mch, cú
th ly tõm ngay tỏch t bo ly huyt thanh hoc trong trng hp khụng cú mỏy ly
tõm thỡ týp nghiờng nhit phũng thớ nghim 30 phỳt 1 gi cho co cc mỏu
ụng ri cht huyt thanh.
16


2.2. Ly mỏu u ngún tay
- Ly mỏu bng giy thm:
+ Dựng bỳt chỡ vit mó hoỏ (code) ca bnh nhõn lờn mt u giy thm;
+ Ly mỏu u ngún tay, dựng giy thm thm u 2 mt;
+ giy thm khụ ni thoỏng mỏt, trỏnh ỏnh sỏng mt tri v cụn trựng,
trỏnh xp chng lờn nhau;
+ Sau khi giy khụ cho vo tỳi nilon, dỏn kớn ming tỳi (1 mu cho vo 1 tỳi);
+ Bo qun 40C, chuyn v PTN;
+ Giy thm thng ch phỏt hin c IgG nờn phi ly mỏu 2 ln.

- Ly mỏu bng ng mao dn:
+ Ghi mó hoỏ ca bnh nhõn vo mt u ng mao dn;
+ Ly mỏu u ngún tay, ngiờng ng mao dn cho mỏu chy dn v u
bờn kia;
+ ng mao dn nm ngang nhit phũng 30 phỳt 1 gi cho co cc
mỏu ụng;
+ Dựng ốn cn hn kớn 2 u ng mao dn;
+ Bo qun 40C, chuyn v phũng thớ nghim;
+ Ly tõm 2.500 vũng/10 phỳt cht huyt thanh.
2.3. Dch nóo tu
+ Ghi code hoỏ bnh nhõn vo týp;
+ S dng týp vụ trựng ly khong 3 5 ml dch nóo tu;
+ Bo qun lnh 40C, chuyn v phũng thớ nghim.
Chỳ ý: Tt c cỏc mu bnh phm phi c mó hoỏ v ghi code trờn týp, cỏc
thụng tin mó hoỏ bao gm
- Cỏc thụng tin hnh chớnh: tờn, tui, gii, a ch;
- Cỏc thụng tin v bnh: ngy mc bnh, ngy khi phỏt, ngy vo vin;
- Cỏc thụng tin v mu: ngy ly mu, loi bnh phm;
- Cỏc thụng tin dch t liờn quan, tu tng bnh cú thụng tin chi tit;
3. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
3.1. Phản ứng ức chế ngng kết hồng cầu (HI-heamagglutination inhibition
test)
* Chuẩn bị dụng cụ
- Tấm nhựa đáy tròn 96 giếng;
17


- Tube thuỷ tinh 12, sấy khô để tách huyết thanh và xử lý huyết thanh;
- Giá đựng tube;
- Máy hút chân không trong trờng hợp xử lý huyết thanh bằng acetone, hoặc

máy ly tâm nếu xử lý huyết thanh bằng kaolin - hồng cầu;
- Pipét man các loại 0,25 - 1ml.
* Nguyên lý của phản ứng
Một số loại vi rút có khả năng ngng kết một số loại hồng cầu nh gà, chim,
ngỗngKhả năng này bị mất đi khi gặp kháng thể đặc hiệu, do kháng thể đã trung
hoà kháng nguyên ngng kết hồng cầu của vi rỳt.
* Các bớc tiến hành
+ Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên: Hiệu giá kháng nguyên đợc chuẩn độ
theo hiệu giá kháng nguyên ngng kết hồng cầu.
+ Chuẩn bị hồng cầu.
Tuỳ theo vi rút có khả năng gây ngng kết hồng cầu loài động vật nào (vi rút
viêm não Nhật bản, vi rút Dengue gây ngng kết hồng cầu ngỗng, vi rút sởi gây
ngng kết hồng cầu khỉ, vi rút cúm gây ngng kết hồng cầu gà...).
Lấy máu tĩnh mạch có chống đông, rửa hồng cầu bằng nớc muối sinh lý, bảo
quản hồng cầu trong dung dịch đệm phù hợp mà kháng nguyên vi rút có khả năng
gây ngng kết hồng cầu.
+ Xử lý huyết thanh.
Huyết thanh có chứa các chất ức chế hoặc ngng kết không đặc hiệu, do đó
cần phải xử lý để loại bỏ các yếu tố này. Tùy theo có thể dùng các phơng pháp xử
lý huyết thanh bằng tách chiết acetone, hấp phụ với kao lin hồng cầu, hoặc sử dụng
các dung dịch RDE (recepteor destroying enzyme), dung dịch natri citrate, dung
dịch trypsin.
+ Chuẩn độ kháng nguyên.
Kháng nguyên đợc pha loãng bậc 2 trong tấm nhựa đáy tròn 96 giếng bằng
dung dịch đệm thích hợp cho phản ứng ngng kết hồng cầu. Cho tiếp xúc với hồng
cầu đã xử lý, ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ. Hiệu giá kháng nguyên là nồng độ kháng
nguyên pha loãng nhất còn có khả năng ngng kết hồng cầu hoàn toàn.

18

Hình 1; Sơ đồ phản ứng ngng kết hồng cầu
Nhận định kết quả:
Dơng tính: có hiện tợng ngng kết hồng cầu
Hiệu giá kháng nguyên = 1/64; 1/4; âm tính và 1/1024
- Thực hiện phản ứng ức chế ngng kết hồng cầu.
Pha loãng chứng âm, chứng dơng và kháng thể cần xác định nồng độ, thờng
pha loãng bậc 2 trong dung dịch đệm phù hợp tạo điều kiện thích hợp cho phản ứng
ngng kết hồng cầu.
Cho tiếp xúc với kháng nguyên (thờng pha 4 hoặc 8 đơn vị, tuỳ theo từng vi
rỳt). ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
Chuẩn độ lại hiệu giá kháng nguyên bằng cách từ nồng độ kháng nguyên cho
vào phản ứng pha loãng tiếp bậc 2 để đợc 4 đơn vị, 2 đơn vị và 1 đơn vị kháng
nguyên. Cho hồng cầu. ủ 30 phút.
Nhận định kết quả:
Chứng dơng: hồng cầu lắng xuống đáy.
Chứng âm: có hiện tợng ngng kết hồng cầu.
Kháng nguyên: đủ 4 hoặc 8 đơn vị.
Hiệu giá kháng thể là nồng độ huyết thanh pha loãng nhất gây ức chế ngng
kết hồng cầu hoàn toàn. Trong chẩn đoán bệnh nhiễm vi rỳt khi động lực kháng thể
tăng gấp 4 lần có giá trị chẩn đoán dơng tính.
* ứng dụng
- Dùng trong chẩn đoán bệnh dựa vào việc xác định động lực kháng thể trong
mẫu máu kép.
19


- Trong điều tra dịch tễ huyết thanh học các bệnh nhiễm vi rỳt.
- Dùng trong xác định và hoặc định týp huyết thanh vi rỳt: ở trờng hợp này
đã biết trớc kháng thể đặc hiệu, xác định vi rỳt hoặc định týp huyết thanh của vi

rỳt phân lập đợc nhờ vào phản ứng ức chế ngng kết hồng cầu. (vi rỳt viêm não
Nhật Bản, Dengue, vi rỳt cúm, vi rỳt sởi)
3. 2. Kỹ thuật trung hoà
3.2.1. Chuẩn bị dụng cụ
Kỹ thuật trung hoà trên tế bào
- Tube vô trùng để trung hoà huyết thanh - vi rút;
- Chai nuôi cấy tế bào, tấm nhựa nuôi cấy tế bào;
- Bể nhiệt;
- Thiết bị cần thiết nuôi cấy tế bào nh tủ ấm CO2, hốt vô trùng, kính hiển vi
lộn ngợc;
- Môi trờng, hoá chất cần thiết cho nuôi cấy tế bà;
Kỹ thuật trung hoà trên động vật
- Tube vô trùng để trung hoà huyết thanh - vi rút;
- Bơm kim tiêm vô trùng để tiêm truyền động vật;
- Bể nhiệt;
- Động vật cảm thụ với từng loại vi rút: ví dụ chuột nhắt trắng đối với vi rút
viêm não nhật bản, vi rút dại...
* Nguyên lý
Một số vi rút gây hiện tợng huỷ hoại tế bào, hoặc gây bệnh trên động vật thí
nghiệm, tính chất này sẽ bị mất đi khi vi rút bị trung hoà bởi kháng thể đặc hiệu. Do
đó mà ngời ta có thể xác định, định týp vi rút dựa trên huyết thanh mẫu đã biết
trớc hoặc biết hiệu giá kháng thể trung hoà.
3.2.2. Các bớc tiến hành
- Pha loãng kháng thể bậc 2;
- Cho tiếp xúc với kháng nguyên với một lợng tơng đơng. ủ ở nhiệt độ 20 370C trong 30 - 60 phút. Hỗn dịch vi rút, kháng thể này có thể đem tiêm truyền trên
động vật thí nghiệm (thờng là chuột) hoặc gây nhiễm trên tế bào nhạy cảm với từng
loại vi rút.
- Sau vài ngày (tuỳ thuộc vào tính chất gây huỷ hoại tế bào của từng loại vi rút
hoặc thời gian gây bệnh) quan sát thấy các triệu chứng lâm sàng của động vật hoặc
hiện tợng huỷ hoại tế bào.

20


3.2.3. Nhận định kết quả
Dựa vào các dấu hiệu bệnh của động vật hoặc hiện tợng huỷ hoại tế bào mà
xác định, định týp vi rút hoặc biết hiệu giá kháng thể trung hoà.
3.3. Kỹ thuật trung hoà trên động vật
Dùng để xác định và định týp vi rút ví dụ nh vi rút viêm não Nhật Bản, vi rút
Dengue, dại.... Các vi rút này khi tiêm vào não chuột sẽ gây hiện tợng liệt chuột,
khi có kháng thể đặc hiệu (đã biết trớc) trung hoà vi rút thì chuột đợc tiêm hỗn
dịch kháng nguyên - kháng thể sẽ hoàn toàn khoẻ mạnh. Do vậy ta có thể xác định,
định týp đợc vi rút.
Một ứng dụng khá phổ biến của kỹ thuật này dùng để xác định hiệu giá kháng
thể, đặc biệt trong việc đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin. Ngời ta gây miễn
dịch cho chuột kháng nguyên pha loãng ở các nồng độ khác nhau (vaccine), đồng
thời tiêm kháng nguyên mẫu chuẩn đủ liều gây miễn dịch cơ bản (thờng là 2 liều),
sau khi tiêm miễn dịch cơ bản khoảng 2 tuần ngời ta tiêm cho chuột một lợng vi
rút cố định. Quan sát sự biểu hiện bệnh của động vật theo nồng độ pha loãng của
vaccine, so sánh với lô động vật tiêm kháng nguyên chuẩn mà có thể xác định đợc
công hiệu của vaccine.
3.4. Kỹ thuật trung hoà trên tế bào
* Định lợng hiệu giá kháng thể trung hoà trong huyết thanh;
- Pha loãng huyết thanh bậc 2 trong môi trờng duy trì trên tấm nhựa nuôi cấy
tế bào;
- Trung hoà với vi rút với một lợng vi rút cố định, thờng là 100 TCID/ 25 ul;
- Cho tế bào vào hỗn dịch vi rút - kháng thể. ủ tế bào ở điều kiện nuôi cấy
bình thờng, thời gian tuỳ thuộc vào từng loại vi rút;
- Cần chuẩn độ lại hiệu giá vi rút cho vào phản ứng.
* Đọc kết quả
- Đọc chứng dơng: không thấy có hiện tợng huỷ hoại tế bào;

- Chứng âm: Tế bào bị huỷ hoại hoàn toàn;
- Chuẩn độ vi rút: đủ 100 TCID/ 25ul;
- Hiệu giá kháng thể trung hoà là hiệu giá kháng thể pha loãng nhất không gây
hiện tuợng huỷ hoại tế bào;
- Xác định dơng tính khi động lực kháng thể gấp 4 lần trong mẫu máu kép.
21


TB bình thờng

tế bào huỷ hoại

Hình 2: Sơ đồ phản ứng trung hoà trên tế bào
* Xác định và định týp vi rút: Kỹ thuật này thờng dùng sau khi đã phân lập
đợc vi rút, trung hoà vi rút với kháng thể đã biết trớc, từ đó xác định và định týp
vi rút;
Kỹ thuật tơng tự nh kỹ thuật trung hoà xác định hiệu giá kháng thể, nhng ở
kỹ thuật này kháng thể mẫu đã biết trớc không cần pha loãng;
3.5. Kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử;
Kỹ thuật tơng tự nh trung hoà trên tế bào để xác định hiệu giá kháng thể,
nhng khác ở chỗ sau khi trung hoà vi rút - kháng thể, ngời ta gây nhiễm lên tế
bào nuôi cấy 1 lớp rồi phủ lên tế bào lớp thạch hoặc methyl cellulose, sau một vài
ngày tuỳ theo thời gian từng vi rút gây hoại tử tế bào, nhuộm tế bào với đỏ trung
tính hoặc tím tinh thể, đếm đám hoại tử tế bào, so sánh sự giảm đám hoại tử tính
đợc ở các nồng độ pha loãng huyết thanh khác nhau với chứng vi rút mà tính đợc
hiệu giá kháng thể trung hoà;
ứng dụng
- Trong chẩn đoán: xác định động lực kháng thể của cặp máu kép, hiệu giá
kháng thể máu 2 tăng 4 lần so với máu 1 có giá trị chẩn đoán;
- Trong nghiên cứu đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm phòng vắc xin (hiệu lực

bảo vệ vắc xin);
- Trong kiểm tra chất lợng vắc xin: kiểm định công hiệu của vắc xin.
3.6. Kỹ thuật ức chế tạo đám huỳnh quang:
Kỹ thuật tơng tự trung hoà giảm đám hoại tử, có một vài điểm khác nó đợc
ứng dụng cho các vi rút không gây hiện tợng huỷ hoại tế bào, do vậy hệ thống phát
hiện đám tế bào nhiễm vi rút (tơng tự nh đám hoại tử tế bào của các vi rút gây
huỷ hoại tế bào) thờng dùng là nhuộm với huỳnh quang hoặc nhuộm enzym peroxidase.
22


ứng dụng
- Sử dụng kỹ thuật này đối với các vi rút không gây huỷ hoại tế bào (ví dụ vi
rút rota, vi rút dại).
- Sử dụng trong chẩn đoán và đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin cũng nh
kiểm tra công hiệu của vắc xin trứoc khi xuất xuởng.
3.7. Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA)
Có rất nhiều kỹ thuật phát triển dựa trên nguyên lý của kỹ thuật gắn men
(ELISA) dùng kháng nguyên, kháng thể hoặc kháng kháng thể phủ bản để tóm bắt
kháng thể hoặc kháng nguyên, tiếp theo dùng hệ thống đánh dấu (cộng hợp là
kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym), hệ thống phát hiện cơ chất tạo mầu
Trong chẩn đoán bệnh ngời ta thờng sử dụng các kỹ thuật sau:
* ELISA gián tiếp
Chuẩn bị dụng cụ:
- Pipét nhiều kênh, pipét man các loại
- Đầu côn các loại
- Chai, lọ sử dụng để pha sinh phẩm
- Nớc cất
- Máy ủ
- Máy rửa và máy đọc ELISA
Nguyên lý:

Hình 3: Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật miễn dịch gằn enzyme
KN: Kháng nguyên phủ bản
KT: Kháng thể
KKT: Kháng kháng thể
Các bớc tiến hành
(1) Kháng nguyên đợc gắn vào bản nhựa
23


(2) Cho tiếp xúc với huyết thanh, kháng thể đặc hiệu có trong huyết thanh sẽ
gắn với kháng nguyên đã gắn bản, các kháng thể không đặc hiệu sẽ bị loại bỏ qua
bớc rửa
(3) Cho tiếp xúc với cộng hợp (kháng kháng thể gắn enzym), cộng hợp thừa
hoặc không gắn sẽ bị loại qua bớc rửa
(4) Cho cơ chất lên màu
(5) Dừng phản ứng: bằng H2SO4 hoặc HCL tuỳ theo cơ chất sử dụng
Đọc kết quả: đọc bằng máy đọc ELISA, tuỳ thuộc cơ chất sử dụng
mà đọc ở bớc sóng khác nhau. Đối với cơ chất OPD đọc ở bớc sóng 492nm; TMB
ở bớc sóng 405 nm.
Các nhà sản xuất sinh phẩm sẽ đa ra tiêu chí đọc kết quả, dựa trên nguyên tắc
đọc OD chứng dơng, chứng âm, ngỡng (cut off) để nhận định mẫu dơng tính,
mẫu âm tính (trong trờng hợp định tính) hoặc xác định hiệu giá kháng thể dựa vào
thang chuẩn (trong trờng hợp định lợng).
ứng dụng:
Định lợng kháng thể
Xác định mẫu huyết thanh dơng tính trong chẩn đoán bệnh
3.8. Kỹ thuật MAC - ELISA phát hiện kháng thể kháng IgM
* Chuẩn bị dụng cụ:
- Pipét nhiều kênh, pipét man các loại

- Đầu côn các loại
- Chai, lọ sử dụng để pha sinh phẩm
- Nớc cất
- Máy ủ
- Máy rửa và máy đọc ELISA
* Nguyên lý:

24


Hình 4: Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật miễn dịch gằn enzyme
* Các bớc tiến hành:
Phủ bản kháng IgM ngời đặc hiệu chuỗi à
(1)

Cho tiếp xúc với huyết thanh bệnh nhân, tóm bắt toàn bộ kháng thể IgM,

các thành phần khác trong huyết thanh bị loại qua bớc rửa
(2)

Tiếp xúc với kháng nguyên đặc hiệu đã biết trớc, kháng nguyên thừa

hoặc không gắn (không có kháng thể đặc hiệu IgM ) bị loại bỏ qua bớc rửa
(3) Tiếp xúc cộng hợp (kháng thể gắn Enzym). Rửa bản nhựa các cộng hợp
thừa hoặc không gắn do không có kháng nguyên gắn ở bớc trên sẽ bị loại
(4)

Cơ chất tạo mầu

(5)

Dừng phản ứng: bằng H2SO4 hoặc HCL tuỳ theo cơ chất sử dụng

* Đọc kết quả: Đọc bằng máy đọc ELISA, bớc sóng tuỳ thuộc vào từng loại
cơ chất OPD ở bớc sóng 492nm; TMB ở bớc sóng 405nm.
Các nhà sản xuất sinh phẩm sẽ đa ra tiêu chí đọc kết quả, dựa trên nguyên tắc
đọc OD chứng dơng, OD chứng âm, giá trị ngỡng (cut off) để nhận định mẫu
dơng tính, mẫu âm tính
* ứng dụng
Kỹ thuật MAC-ELISA là kỹ thuật khá phổ biến trong chẩn đoán nhanh các
bệnh nhiễm trùng ví dụ trong chẩn đoán vi rút Sởi, Rubella, Dengue, viêm não Nhật
Bản
* u điểm: Nhanh, nhạy, dễ thực hiện, có thể sử dụng một mẫu máu đơn để
chẩn đoán
* Nhợc điểm: Giá thành còn khá cao đối với một số bộ sinh phẩm
25