Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của aminoreductone với các chủng listeria monocytogenes phân lập từ thực phẩm

Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì được thể hiện trong Luận văn này bao gồm nội
dung nghiên cứu, kết quả nghiên cứu, số liệu thực hiện đều trung thực, được thực
hiện bởi chính bản thân tôi, và chưa từng được công bố dưới bất kỳ hình thức nào
trước đó. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét,
đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần
tài liệu tham khảo.

Hà Nội, ngày 22 tháng 9 năm 2016
Trương Thu Hằng

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
1

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ
LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Vũ Thu Trang, giảng
viên Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ
Thực Phẩm người đã tận tình hướng dẫn, góp ý động viên em trong suốt quá trình
thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Tiến Thành và Ths Lê Thị Lan

Chi đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em có thể thực hiện tốt quá trình làm
việc tại Trung Tâm Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học trong thời gian
qua.
Ngoài ra em cũng vô cùng biết ơn Ban lãnh đạo trung tâm nghiên cứu và
phát triển công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
Em cũng xin đồng cảm ơn các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và
Công Nghệ Thực phẩm – Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tạo điều kiện cho em được
tốt nghiệp.
Những lời cảm ơn sau cùng em xin dành cho bố mẹ, gia đình và bạn bè đã
hết lòng quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày 22 tháng 9 năm 2016
Trương Thu Hằng

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
2

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................2
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................6
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................7
DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................................9

ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................10
CHƯƠNG I: TỔNG QU AN ....................................................................................12
1. Tổng quan về phản ứng Maillard.......................................................................13
1.1 Lịch sử nghiên cứu về phản ứng Maillard....................................................13
1.1.1 Các giai đoạn phản ứng Maillard ...........................................................14
1.1.2 Các sản phẩm chủ yếu của phản ứng Maillard và ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm ...............................................................................................18
1.2 Aminoreductone ...........................................................................................19
1.2.1 Sự hình thành Aminoreductone .............................................................19
1.2.2 Ứng dụng sự tạo thành Aminoreductone để kiểm soát quá trình gia
nhiệt. ................................................................................................................22
1.2.3. Các đặc tính của Aminoreductone. .......................................................24
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
3

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

1.2.4 Các nghiên cứu về các đặc tính của sản phẩm của phản ứng Maillard và
hoạt tính kháng vi sinh vật của sản phẩm phản ứng Maillard. .......................25
1.3 Listeria monocytogenes ................................................................................28
1.3.1 Đặc điểm....................................................................................................28
1.3.2. Phân loại ...................................................................................................29
1.3.3. Lịch sử ......................................................................................................29
1.3.4. Nguồn lây nhiễm ......................................................................................29
1.3.5 Ảnh hưởng tới người và thực phẩm ..........................................................30

1.3.6 Quy định kiểm soát L. monocytogenes......................................................30
CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................33
2.1 Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................33
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................33
a. Aminoreductone (AR) .................................................................................33
b. Listeria monocytogenes ..............................................................................33
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................35
2.1.3. Thiết bị sử dụng ........................................................................................35
2.1.4 Dụng cụ và hóa chất ..................................................................................36

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
4

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

2.2 Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................37
2.2.1.Phương pháp tách chiết Aminoreductone .................................................37
2.2.2.Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch ....................................................40
2.2.3. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của Aminoreductone với
vi khuẩn. .............................................................................................................42
2.2.4. Xác định khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone bằng phương pháp
killing assay. .......................................................................................................45
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................48
3.1 Khảo sát khả năng ức chế L.monocytogenes của Aminoreductone (AR) .......48
3.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Aminoreductone (AR) đối với

L.monocytogenes....................................................................................................52
3.3 Khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone (AR) đối với L.monocytogenes ...54
3.4. So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với L.monocytogenes trong môi
trường nuôi cấy và môi trường thực phẩm ............................................................56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................67

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
5

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
 AR: Aminoreductone.
 Ak: Amikacin.
 CFU: Colony-forming unit. ( Đơn vị khuẩn lạc ).
 K2HPO4: Kali hydrophosphate.
 KH2PO4: Kali dihydrophosphate.
 MHB: Mueller-Hinton.
 MIC : Minimum Inhibitory Concentration ( Nồng độ ức chế tối thiểu ).
 MBC: Minimum Bactericidal. Concentration ( Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu)
 XTT : (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrezolium-5carboxanilide).

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
6

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ
DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
1

Bảng
Bảng 2.1

Tên Bảng

Trang

Danh sách 30 chủng L.monocytogenes nghiên

33

cứu được phân lập từ các sản phẩm thực phẩm
2

Bảng 2.2

Một số thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

35

3

Bảng 3.1

Kích thước đường kính kháng khuẩn của

48

Aminoreductone đối với các chủng
L.monocytogenes
4

Bảng 3.2

So sánh đường kính kháng khuẩn của

50

Aminoreductone và một số kháng sinh đối với
các chủng L.monocytogenes
5

Bảng 3.3

Nồng độc ức chế tối thiểu của Aminoreductone

52

đối với các chủng L.monocytogenes
6

Bảng 3.4

Khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone đối

54

với các 8 chủng L.monocytogenes
7

Bảng 3.5

So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với

56

chủng M10XC2.1 ở môi trường MHB và môi
trường sữa.
8

Bảng 3.6

So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với

57

chủng M10.2 ở môi trường MHB và môi trường
sữa.

9

Bảng 3.7

So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với

57

chủng MXC2.2 ở môi trường MHB và môi
trường sữa.
10

Bảng 3.8

So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với

58

chủng M50CP1.1 ở môi trường MHB và môi
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
7

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

trường sữa.

11

Bảng 3.9

So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với

58

chủng M50CP3.1 ở môi trường MHB và môi
trường sữa.
12

Bảng 3.10

So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với

59

chủng M50XCP1.2 ở môi trường MHB và môi
trường sữa.
13

Bảng 3.11

So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với

59

chủng M4TH2 ở môi trường MHB và môi
trường sữa.

14

Bảng 3.12

So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với

60

chủng M63.1 ở môi trường MHB và môi trường
sữa.
15

Bảng 3.13

So sánh khả năng diệt khuẩn của AR với 8

60

chủng thử nghiệm trong môi trường MHB và
môi trường sữa

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
8

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Hình

Tên Hình

Trang

1

1.1

Phản ứng ngưng tụ đường với acid amin

13

2

1.2

Phản ứng chuyển vị Amadori tạo ra 1-amin-1-dezoxy-2-

13

xetoza
3

1.3

Phản ứng tạo thành furfurol và ozon

14

4

14

Phản ứng tạo thành reduction có 6 cacbon

15

5

1.5

Phản ứng phân hủy các hợp chất amin

16

6

1.6

Các sản phẩm của phản ứng Maillard

17

7

1.7

Quá trình hình thành Aminoreductone theo

18

Pischetsrieder, 1994
8

1.8

Quá trình hình thành Aminoreductone theo Shimamura,

19

2000
9

1.9

Sơ đồ phản ứng của Lactose và hợp chất có chứa nhóm

20

amin
10

1.10

Sơ đồ phản ứng XTT

22

11

1.11

Hình ảnh minh họa Listeria monocytogenes

26

12

2.1

Sơ đồ chuẩn bị dung dịch đệm phosphat 1,28M (pH

36

7.0).
13

2.2

Sơ đồ chuẩn bị dung dịch phản ứng

37

14

2.3

Mối tương quan giữa Aminoreductone và XTT.

38

15

2.4

Sơ đồ phương pháp XTT.

38

16

2.5

Sơ đồ tách chiết Aminoreductone.

38

17

2.6

Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.

40

18

2.7

Các bước chuẩn bị môi trường chứa Aminoreductone.

41

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
9

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP
19

2.8

Luận Văn Thạc Sĩ

Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của

42

Aminoreductone với vi khuẩn
20

2.9

Hình ảnh minh họa kết quả xác định nồng độ ức chế tối

43

thiểu của Aminoreductone với vi khuẩn
21

2.10

Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của

45

Aminoreductone với L. monocytogenes

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
10

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

Phản ứng Maillard là phản ứng hóa học xảy ra giữa acid amin và đường khử,
có ảnh hưởng mạnh mẽ tới chất lượng sản phẩm. Nó tác động tới giá trị dinh dưỡng
cũng như giá trị cảm quan của thực phẩm bởi vì phản ứng này là một trong những

nguyên nhân chủ yếu làm thay đổi màu sắc, cấu trúc trong quá trình gia nhiệt, cũng
đồng thời tạo ra các mùi hương đặc trưng như trong quá trình rang café, nướng
bánh…….cùng lúc đó còn tạo một số sản phẩm không mong muốn. Ngoài ra hiện
nay trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu xác nhận về việc hình thành các hợp
chất có lợi khi xảy ra phản ứng Maillard như: hợp chất chống ung thư [26], hợp chất
chống oxi hóa [28], hợp chất kháng khuẩn [29], khả năng chống cao huyết áp…[25]
trong đó có những báo cáo về Aminoreductone tác dụng tương tự.
Aminoreductone (AR) là một trong những sản phẩm của phản ứng Maillard,
được hình thành sau một thời gian gia nhiệt ngắn, nên AR là chỉ số rất quan trọng
để xác định mức độ phản ứng Maillard cũng như mức độ xử lý nhiệt trong sản xuất
thực phẩm. AR được tách chiết dựa trên phương pháp của Shimamura [38]. Hợp
chất cũng được biết đến có hoạt tính chống oxi hóa [40], khả năng bảo vệ riboflavin
dưới tác dụng của ánh sáng [46]. Ngoài ra còn có những nghiên cứu cơ bản chứng
minh khả năng chống lại một số chủng vi khuẩn gây bệnh tồn tại trong thực phẩm
như : Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
Salmonella enterica, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis [44]. Qua các báo cáo
như trên có thể thấy được hiệu quả kháng khuẩn của AR từ đây có thể thử thêm hoạt
tính trên các chủng gây bệnh khác để làm rõ hơn khả năng diệt khuẩn của AR.
Listeria monocytogenes là một vi khuẩn gây bệnh, Gram +, tồn tại nhiều
trong thực phẩm, là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh Listeriosis (một bệnh nhiễm
trùng nghiêm trọng do ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes).
[4]

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
11

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

Dựa trên kết quả nghiên cứu từ trước được công bố về sản phẩm của phản
ứng Maillard gây ức chế gen gây độc đối với Listeria monocytogenes nhưng cũng
không rõ ràng là hợp chất nào [20] và tới hiện nay vẫn chưa thấy có báo cáo liên
quan tới khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes của AR. Với
mong muốn tìm hiểu sâu sắc hơn nữa tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu khả năng
kháng khuẩn của Aminoreductone với các chủng Listeria monocytogenes phân
lập từ thực phẩm.”. Trong phạm vi đề tài này, tôi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
của AR trên chủng vi khuẩn gây bệnh : Listeria monocytogenes được phân lập từ
các sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp xác định vòng kháng khuẩn, xác định
nồng độ ức chế tối thiểu, và khả năng diệt khuẩn với nội dung nghiên cứu sau :
1. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Listeria monocytogenes của AR
2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của AR với vi khuẩn Listeria monocytogenes
3. Xác định khả năng diệt Listeria monocytogenes của AR đối với vi khuẩn Listeria
monocytogenes
4. So sánh khả năng diệt Listeria monocytogenes của AR trong môi trường nuôi cấy
và môi trường thực phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QU AN
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
12

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

1. Tổng quan về phản ứng Maillard
1.1 Lịch sử nghiên cứu về phản ứng Maillard
Phản ứng Maillard xảy ra giữa acid amin và đường khử ( ví dụ như glucose,
fructose, lactose), đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong kỹ thuật sản xuất thực
phẩm. Phản ứng Maillard ảnh hưởng tới giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan của
sản phẩm, chủ yếu làm thay đổi màu sắc, cấu trúc trong quá trình gia nhiệt, đồng
thời tạo ra các mùi hương đặc trưng, ngài ra còn tạo ra một số sản phẩm phụ không
mong muốn. Vì vậy tùy thuộc vào yêu cầu tính chất, cảm quan của từng sản phẩm
mà người ta tăng cường hoặc kìm hãm các yếu tố liên quan để kiểm soát quá trình
xảy ra phản ứng [1].
Phản ứng Maillard được đặt tên theo nhà hóa học người Pháp Louis Camille Maillard (1878 – 1936), người đầu tiên phát hiện ra phản ứng. Năm 1912
trong lúc Maillard đang cố gắng tìm cách tổng hợp protein sinh học trong ống
nghiệm, thời điểm hợp chất hình thành mùi và màu sắc đã khiến ông liên tưởng tới
các phản ứng hóa học xảy ra trong thực phẩm. Cũng cùng năm đó, ông công bố
những dữ liệu ban đầu liên quan tới thành phần hóa học đồng thời dự đoán về khả
năng ứng dụng của hợp chất trong nhiều lĩnh vực như khoa học, sinh học thậm chí
liên quan tới bệnh lý của con người. Luận điểm này đã bị bác bỏ bởi cộng đồng
nghiên cứu khoa học cho tới tận năm 1941, cuối cùng vào năm 1948 phản ứng
Maillard được thừa nhận chắc chắn là nguyên nhân tạo màu nâu và làm giảm giá trị
dinh dưỡng trong sữa bột [17].Sau đó rất nhiều bài báo cáo đã đề cập tới những
phản ứng phức tạp xảy ra và bằng nhiều phương thức khác nhau để đánh giá sự ảnh
hưởng từ các thông số ( pH, nhiệt độ, thời gian, đường phản ứng, nồng độ các chất,
hoạt độ nước…) cùng với sự thay đổi chất lượng thực phẩm, dinh dưỡng, tổn thất

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
13

Đại Học Bách Khoa Hà Nội

Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

acid amin cần thiết, sự trao đổi chất trong sản phẩm phản ứng, tác dụng sinh lý khi
ăn các sản phẩm của phản ứng Maillard [28].
1.1.1 Các giai đoạn phản ứng Maillard
Dựa vào mức độ màu sắc của các sản phẩm có thể chia thành 3 giai đoạn kế
tiếp nhau như sau:
- Giai đoạn đầu: sản phẩm không màu và không hấp thụ ánh sáng tia cực tím.
- Giai đoạn trung gian: không màu hoặc có màu vàng, hấp thụ mạnh ánh sáng cực
tím.
- Giai đoạn cuối: màu đậm.
a. Giai đoạn đầu
- Phản ứng ngưng tụ cacbonylamin
Giai đoạn đầu tiên của phản ứng Maillard là sự ngưng tụ đường với acid
amin. Trong điều kiện nhiệt độ sinh lý thì tạo thành base Schiff (Hợp chất hữu cơ có
nhóm - HC=N -) hoặc glucozit.
Hình 1.1 Phản ứng ngưng tụ đường với acid amin

- Phản ứng chuyển vị Amadori.
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
14

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

Khi ở nhiệt độ cao phức đường amin bị đồng phân hóa hay còn gọi là chuyển
vị nội phân Amadori. Kết quả là giữa nguyên tử thứ nhất và thứ 2 sinh ra nối kép
tạo thành 1 – amin – 1 – dezoxy – 2 – xetoza.
Hình 1.2 Phản ứng chuyển vị Amadori tạo ra 1-amin-1-dezoxy-2-xetoza

Phẩm vật của sự chuyển vị Amadori là hợp chất có khả năng phản ứng và là
chất khởi đầu để tạo thành polymer có màu sẫm gọi là melanoidin.
b. Giai đoạn trung gian
Giai đoạn này xảy ra sự khử nước của 1 – amin – 1 – dezoxy – 2 – xetoza.
Tùy điều kiện môi trường và nhiệt độ mà tạo thành sản phẩm phân ly khác nhau.
- Tạo thành furfurol và ozon.
Hình 1.3 Phản ứng tạo thành furfurol và ozon

- Tạo thành reductone có 6 cacbon.
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
15

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

Các aminodezoxyxetoza được tạo thành khi chuyển vị Amadori có thể bị khử
đi 2 phân tử H20 để tạo thành reductone có 6 cacbon.
Reductone là những hợp chất hữu cơ có tính khử mạnh do có mặt nhóm
endiol, thường nhóm này được liên kết với gốc aldehyde hoặc gốc acid.

VD: Reductone đơn giản nhất là triozoreductone
Hình 1.4 Phản ứng tạo thành reduction có 6 cacbon

- Phân hủy các hợp chất amin
Base Schiff được tạo thành bị phân ly thủy phân thành aldehyde và hợp chất
amin, chất này cho các phẩm vật chứa nito và có màu nâu sau này:

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
16

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

Hình 1.5 Phản ứng phân hủy các hợp chất amin

c. Giai đoạn cuối
Giai đoạn cuối này bao gồm nhiều phản ứng phức tạp, có thể chia thành 2
kiểu phản ứng:
- Phản ứng ngưng tụ alldol với sự tạo thành polymer màu nâu không chứa nito.
- Phản ứng trùng hợp hóa aldehitamin với sự tạo thành các hợp chất nito dị vòng.
Giai đoạn cuối cùng của phản ứng melanoidin sẽ tạo nên đầu tiên là các
polymer không no hòa tan được trong nước, sau đến là các polymer không no và
không hòa tan được trong nước, nhưng đều có màu đậm và có cùng tên gọi chung là
melanoidin. Các melanoidin hấp thụ mạnh tia cực tím (λ<220nm) không khử được
dung dịch Feling, nhưng khử được iot và 2,6 – diclophenolindophenol. Khả năng
hòa tan của melanoidin phụ thuộc vào nhiệt độ mà phản ứng tiến hành.

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
17

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

1.1.2 Các sản phẩm chủ yếu của phản ứng Maillard và ứng dụng trong công
nghệ thực phẩm
Hình 1.6 Các sản phẩm của phản ứng Maillard

Như đã nêu ở trên phản ứng Maillard là phản ứng giữa acid amin và đường
khử xảy ra trong điều kiện rất dễ dàng do đó phản ứng này rất phổ biến trong sản
xuất và bảo quản các sản phẩm thực phẩm. Tùy thuộc và yêu cầu về tính chất cảm
quan của từng sản phẩm mà người ta hoặc tạo điều kiện để tăng cường phản ứng
đến tối đa hoặc kìm hãm phản ứng đến tối thiểu [1].
Do ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng sản phẩm, nghiên cứu về phản ứng
Maillard là mối quan tâm của các nhà khoa học và nhà công nghệ trên thế giới, rất
nhiều nghiên cứu với mong muốn làm sáng tỏ và khám phá các cơ chế hình thành
phản ứng Maillard cũng như ứng dụng và khả năng tác động của nó đã được thực
hiện, Aminoreductone là một trong số đó. Aminoreductone (AR) là một trong
những sản phẩm của phản ứng Maillard, hình thành trong giai đoạn đầu của quá
trình gia nhiệt, AR được sử dụng như một thông số quan trọng để phát hiện và kiểm
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
18

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

soát phản ứng Maillard trong thực phẩm, do đó đã có những nghiên cứu cơ bản liên
quan tới được thực hiện.
1.2 Aminoreductone
1.2.1 Sự hình thành Aminoreductone
AR được phát hiện lần đầu tiên bởi Monika Pischetsrieder [23] khi tác giả
nghiên cứu về sự hình thành của AR từ maltose. Ba cấu trúc chung của AR thu
được bắt nguồn từ hợp chất nguồn gốc Amadori maltose . 3-Hydroxy-5,6dihydropyridones cũng được hình thành trong phản ứng. Phản ứng của maltose với
amin dẫn đến sự hình thành của một chuỗi mở C6-aminoreducton và 3-hydroxy5,6-dihydropyridone [22].
Hình 1.7 Quá trình hình thành Aminoreductone theo Pischetsrieder, 1994
Maltoza + NH2R'

Ac
HC N R'
C OAc
C O
CH
CH
H2C OAc
2
a: R= H
b: R= glucoza

R

H

H2C NHR'
C O
HO CH
R
HC OR
HC OH
H2C OH

glucoza

1 a,b

HC NHR'
C OH
C O
CH2
HO
HC OH
H2C OH
3

O
OH
N
R'
4

R’ = e.g. propyl. butyl

Hình 1.3: Quá trình hình thành Aminoreducton theo Pischetsrieder, 1994

Năm 1998, sự hình thành AR tiếp tục được khảo sát bởi Pischetsrieder [24],
tác giả cho rằng AR được hình thành do phản ứng của Lactose với Naacetyllysinyllysine hoặc protein. Khi đun nóng lactoza với Nα acetyllysine trong một
thời gian ngắn, tạo thành một sản phẩm hấp thụ tối đa tia cực tím ở bước sóng 319
nm. Được xác định là AR có cấu trúc là: 1 - [Nε-(Nα-acetyllysinyl)] -1,2-dehydro-4deoxy-3-hexulose. Cấu trúc của AR tương tự như cấu trúc của sản phẩm thu được
từ phản ứng của butylamin và maltoza. Khi đun nóng lactoza với protein của sữa,
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
19

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

chẳng hạn như β-lactoglobulin, sản phẩm tạo thành là AR. Kể từ đó, AR được tạo
thành sau khi gia nhiệt trong một thời gian ngắn, tác giả cho rằng AR là sản phẩm
mới có thể có tầm quan trọng cho phản ứng Maillard trong quá trình chế biến sữa
[18].
Năm 2000 Tomoko Shiramura và Hiroyuki Ukeda đã khảo sát phản ứng tạo
AR giữa Lactose và Butylamin ở các dải nhiệt độ khác nhau, kết quả thu được phản
ứng xảy ra ở 1000 C tạo được sản phẩm hấp thụ tia cực tím cực đại đặc trưng ở λ =
320nm [38].
Hình 1.8 Quá trình hình thành Aminoreductone theo Shimamura, 2000.

H2C NHR

HC O
CO
HC OH
RNH
2
HO CH
HO CH
HC O gal
HC O gal
HC OH
HC OH
CH2OH
CH2OH
Lactoza

Galactoza

H2C NHR
CO
CO
CH2
HC OH
CH2OH

4 – deoxyosone

Sản phẩm Amadori

HC NHR
C OH

CO
CH2
HC OH
CH2OH
1-alkylamino-1,2
dehydro-4-deoxy-3hexuloza

Cũng theo hướng nghiên cứu đó, năm 2011 nhóm nghiên cứu của giáo sư
Shimamura đã tìm thấy sự tồn tại của AR khi xảy ra phản ứng Maillard trong sữa.
Hiện nay, sự hình thành của AR đã được chứng minh trong một mô hình mẫu bao
gồm một monosaccarit hay disaccarit và một hợp chất có chứa nhóm amino. Trong
nghiên cứu này, sự kết hợp của dinitrophenylhydrazine 2,4 (DNP) và Cu 2+ đã được
kiểm tra. Một cấu trúc được xác định qua quá trình phân tích quang phổ NMR cho
thấy dẫn xuất DNP của AR bị ôxi hóa bởi Cu2 +. Điểm nổi bật là việc kết hợp giữa
dinitrophenylhydrazine 2,4 và Cu2 + có hiệu quả giải phóng ra AR từ protein sữa
[39].
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
20

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

Các nhà khoa học đều rất quan tâm tới cơ chế hình thành Aminoreductone.
Vào năm 2010 tác giả Trang cùng cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu làm sáng tỏ
cơ chế hình thành của AR trong phản ứng Maillard của lactose . Mu ̣c đić h của
nghiên cứu này là để làm sáng tỏ cơ chế hin

̀ h thành của AR, mô ̣t chỉ số quan tro ̣ng
để ước tính mức đô ̣ phản ứng Maillard của các hơ ̣p chất lactoza và amin. Sử du ̣ng
mô hình mẫu lactoza và butylamin, các dung dich
̣ mẫu của lactoza và protein sữa,
và sữa. Nó đã chứng minh rằng D-galactoza đươ ̣c giải phóng cùng mô ̣t lúc như sự
tạo thành của AR. Người ta thấ y rằng mức đô ̣ của phản ứng Maillard và phân hủy
lactose trong quá trình gia nhiê ̣t phu ̣ thuô ̣c chă ̣t chẽ về tỷ lê ̣ nồ ng đô ̣ của nhóm amin
/ lactose trong các dung dich
̣ mẫu [45].
Pischetsrieder (1998) và Severin (1995), Shimamura (2002, 2004) cho rằ ng
D-galactoza (Gal) có thể được sinh ra trong suố t quá trin
̀ h hình thành AR. Gal là
một trong những sản phẩm chính của sự phân hủy lactoza trong thời gian gia nhiệt
[45].
Hình 1.9 Sơ đồ phản ứng của lactoza và hợp chất có chứa nhóm amin.

Vì có thể được phát hiện sau một thời gian gia nhiệt rất ngắn, AR trở thành
một chỉ số rất quan trọng để xác định mức độ của phản ứng Maillard cũng như mức
độ xử lý nhiệt trong sản xuất thực phẩm. Việc phát hiện ra sự tạo thành AR và kiểm
soát nồng độ AR trong sản phẩm chế biến đã mở ra một xu hướng tiếp cận mới cho
các nhà công nghệ trong việc kiểm soát chế độ gia nhiệt trong sản xuất thực phẩm

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
21

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

[37]. Chính vì thế đã có một số nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về vai trò của
AR và ứng dụng sự tạo thành AR để kiểm soát quá trình gia nhiệt.
1.2.2 Ứng dụng sự tạo thành Aminoreductone để kiểm soát quá trình gia
nhiệt.
Năm 1995 đến năm 1998,[9,10,11] nhóm nghiên cứu của giáo sư Ukeda
trường đại học Kochi Nhật Bản đã phát triển phương pháp kiểm soát phản ứng
Maillard trong quá trình gia nhiệt sữa bằng phương pháp mới – dùng thuốc thử XTT
(2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrezolium-5-carboxanilide).
Phương pháp này đã nhanh chóng được áp dụng trong các nhà máy chế biến sữa ở
Nhật Bản vì những đặc tính tối ưu của nó như là thời gian nhanh so với những
phương pháp truyền thống: phương pháp xác định hàm lượng hydromethylfufural,
lysin v.v. Năm 1998, nhóm nghiên cứu của ông đã làm sáng tỏ cơ chế của phương
pháp thử nghiệm XTT là dựa trên khả năng bị oxy hóa của XTT do sự hình thành
của AR trong quá trình gia nhiệt. Vì AR đóng vai trò quan trọng trong việc xác định
mức độ gia nhiệt của sản phẩm, nghiên cứu về các đặc tính chức năng đã trở thành
một đề tài quan trọng đối với các nhà sản xuất thực phẩm [8].
Năm 2000, Tomoko Shimamura cùng các cô ̣ng sự đã đề xuấ t mô ̣t phương
pháp để xác đinh
̣ khả năng xử lý sữa ở nhiê ̣t đô ̣ siêu cao (UHT) làm giảm 3’-[1[(phenylamino)carbonyl]-3,4-tetra-zolium]bis(4-methoxy-6-nitro)benzensulfonic
acid hydrate (XTT) như là mô ̣t phương pháp đánh giá mức đô ̣ của phản ứng
Maillard. So sánh với các phương pháp báo cáo trước đây chẳ ng ha ̣n như đinh
̣
lươ ̣ng lactuloza, hydroxymethylfurfural và furosin, phương pháp XTT là mô ̣t
phương pháp nhanh chóng và thuâ ̣n tiê ̣n đã đươ ̣c tim
̀ thấ y sẽ đươ ̣c áp du ̣ng để ước
tính không chỉ mức đô ̣ xử lý nhiê ̣t mà còn phu ̣ thuô ̣c điề u kiê ̣n bảo quản bởi vì khả
năng giảm tùy thuô ̣c vào thời gian và nhiê ̣t đô ̣ bảo quản. Hơn nữa, nghiên cứu này
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm

22

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

cũng chỉ ra rằ ng các phương pháp XTT có thể áp du ̣ng để ước tin
́ h mức đô ̣ xử lý
nhiê ̣t của các loa ̣i thực phẩ m khác . Tuy nhiên, tác nhân ảnh hưởng tới sự giảm XTT
chưa được xác định [38].
Hình 1.10 Sơ đồ phương pháp XTT.

Năm 2004 nhóm nghiên cứu của Tomoko Shimamura tiếp tục khảo sát về
mối quan hệ giữa tiń h khử của XTT và AR tạo thành trong phản ứng Maillard của
lactoza và đã phát hiện AR bởi phương pháp HPLC [37]. Căn cứ vào sự hình thành
hợp chất có khả năng hấp thụ tối đa ở bước sóng 320 nm khi gia nhiệt một dung
dịch phản ứng gồm lactoza và butylamin, tác giả cho rằng AR hình thành trong
phản ứng Maillard lactoza là nguyên nhân làm lượng XTT bị giảm đi. Trong nghiên
cứu này, mối quan hệ giữa sự khử XTT và sự tạo thành AR đã được khảo sát cụ thể
hơn bằng cách sử dụng thiết bị HPLC. Lactoza và butylamin được đun nóng ở
100 °C trong 15 phút, và sau đó được phân tích bởi sắc ký HPLC. Hợp chất chính
có khả năng hấp thụ tối đa ở bước sóng 324 nm là AR. AR có khả năng khử được
XTT. Sau khi bổ sung Cu2+, AR và khả năng làm giảm XTT của nó hoàn toàn biến
mất. Những phát hiện này mạnh mẽ cho rằng chất làm giảm XTT hình thành trong
phản ứng Maillard của lactoza là AR [7].

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm

23

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

Bởi AR được hình thành sau một thời gian gia nhiệt ngắn, nên AR là chỉ số
rất quan trọng để xác định mức độ phản ứng Maillard cũng như mức độ xử lý nhiệt
trong sản xuất thực phẩm, vì vậy việc nghiên cứu về đặc tính của hợp chất này rất
được mọi người quan tâm.
1.2.3. Các đặc tính của Aminoreductone.
Bằng những nỗ lực nghiên cứu chuyên sâu về phản ứng Maillard trong sản
xuất thực phẩm, đặc biệt là trong công nghệ chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa, cơ
chế tạo thành AR trong phản ứng Maillard cũng đã được làm sáng tỏ [37], đồng thời
cũng có những nghiên cứu đã chỉ ra các tác dụng có lợi gắn liền với sự tạo thành
của AR trong giai đoạn đầu của phản ứng Maillard.
Năm 2008 nhóm nghiên cứu của giáo sư Hiroyuki Ukeda đã công bố về tác
dụng bảo vệ của AR tới sự phân hủy của vitamin B2 [46]. . Các nghiên cứu trong
sữa chứng minh rằng quá trình xử lý nhiệt của sữa tăng cường khả năng bảo vệ,
chống sự phân hủy của vitamin B2 dưới tác dụng của ánh sáng nhờ sự có mặt của
AR tạo ra do phản ứng Maillard. Khi bổ sung thêm Cu2+ vào sữa tiệt trùng thì nồng
độ AR bị giảm đi, đồng thời khả năng bảo vệ cũng bị giảm. Như vậy, có thể kết
luận rằng AR là hợp chất chủ yếu ổn định vitamin B2 trong sữa tiệt trùng [46].
Nhiều nghiên cứu công bố đã chỉ ra các tác dụng có lợi gắn liền với sự tạo
thành sản phẩm Melanoidin trong giai đoạn cuối của phản ứng Maillard như là hoạt
tính chống oxi hóa, hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính chống cao huyết áp, chống đột
biến và đặc tính chống ung thư [27]. Cũng giống như Melanoidin, AR cũng thể hiện

các hoạt tính chức năng như là hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính chống cao huyết
áp [14], cũng như khả năng bảo vệ riboflavin dưới tác dụng của ánh sáng [46].
Chính vì lẽ đó, chúng tôi giả thiết rằng AR có thể có khả năng ảnh hưởng tới một số

Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
24

Đại Học Bách Khoa Hà Nội


Trương Thu Hằng_CNTP

Luận Văn Thạc Sĩ

vi khuẩn gây bệnh. Trong nỗ lực tìm kiếm các nguồn thay thế cho thuốc kháng sinh
và làm sáng tỏ các đặc tính chức năng của AR.
1.2.4 Các nghiên cứu về các đặc tính của sản phẩm của phản ứng Maillard và
hoạt tính kháng vi sinh vật của sản phẩm phản ứng Maillard.
AR là sản phẩm hình thành trước melanoidin, đóng vai trò quan trọng như là
chất chỉ thị của quá trình gia nhiệt. Tuy nhiên, trong nghiên cứu về các đặc tính
chức năng của sản phẩm phản ứng Maillard, nhiều nhà khoa học mới chỉ đề cập đến
các tác dụng của sản phẩm hình thành trong giai đoạn cuối của phản ứng Melanoidin. Nhóm nghiên cứu của Einarsson là nhóm đầu tiên công bố hoạt tính
kháng khuẩn của sản phẩm phản ứng Maillard [12].
Năm 2007 tác giả José A. Rufián-Henares chứng minh melanoidins hình
thành ở giai đoạn cuối cùng của phản ứng Maillard có một số đặc tính chức năng
như chất chống oxy hóa, các hoạt động kháng khuẩn và chống cao huyết áp. Tác giả
cho rằng màu sắc của melanoidins không ảnh hưởng đến những hoạt tính này [14].
Kế tiếp đó, năm 2008 nhóm nghiên cứu của José A. Rufián-Henares đã
chứng minh melanoidins có khả năng chống lại các vi khuẩn E.coli và S.aureus.
Khả năng kháng khuẩn chống lại E.coli và S.aureus được đánh giá là vùng nằm

dưới đường cong tăng trưởng so với mẫu kiểm chứng. Trong phương pháp này, một
lượng vi khuẩn khoảng 106 CFU/ml được bổ sung vào dung dịch melanoidin nồng
độ 2 mg/ml. Kết quả cho thấy melanodin đều kháng được 2 chủng vi khuẩn, nhưng
khả năng ức chế của melanoidin đối với chủng S. aureus (Gram +) cao hơn so với
E.coli (Gram -). Thí nghiệm này được sử dụng như một phương pháp sàng lọc hoạt
tính kháng khuẩn của melanoidin, và sau đó là sản phẩm phản ứng maillard, phân
lập ra các chất có hoạt tính sinh học có khả năng chống lại những chủng gây bệnh
[15].
Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm
25

Đại Học Bách Khoa Hà Nội