XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

PHẠM KHÁNH NGỌC

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN
KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

PHẠM KHÁNH NGỌC

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN
KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. NGUYỄN THỊ THU THỦY

CN. LA VĂN THÁI

2015


LỜI CẢM ƠN

Sau gần bốn năm học tập tại trường Đại học Cần Thơ, dưới sự dạy dỗ,
quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè, em đã hoàn
thành chương trình đào tạo với luận văn tốt nghiệp này. Để đạt được
thành quả như hôm nay, với sự biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành
gửi lời cảm ơn đến:
Cô Nguyễn Thị Thu Thủy – Bộ môn Sư Phạm Hóa Học – Khoa Sư Phạm
đã trực tiếp hướng dẫn, dành thời gian quý báu tận tình chỉ dạy, quan
tâm, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em thực hiện tốt luận văn tốt nghiệp.
Xin cảm ơn tất cả các quý Thầy Cô trường Đại học Cần Thơ nói chung,
bộ môn Hóa khoa Khoa Học Tự Nhiên nói riêng đã truyền dạy những
kiến thức, kỹ năng quý báu cũng như đã tạo điều kiện cho chúng em có
được môi trường học tập tốt nhất.
Đặc biệt cô Tôn Nữ Liên Hương, cô Lê Thị Bạch cố vấn lớp Hóa Dược 1
K38 đã dẫn dắt, định hướng, quan tâm và giúp đỡ chúng em tận tình
trong suốt những năm học qua.
Chân thành cảm ơn Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích và Giám Định
Vinacert Control Cần Thơ đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về trang
thiết bị, dụng cụ, hóa chất để em hoàn thành luận văn.
Anh La Văn Thái - trưởng phòng Trung Tâm Phân Tích – Giám Định
Vinacert Control Cần Thơ, chị Võ Thị Thúy An, anh Nguyễn Hoài
Thương và các anh chị trong trung tâm, đặc biệt là anh chị trong phòng
sắc ký đã nhiệt tình hướng dẫn, chia sẻ cho em những kinh nghiệm bổ
ích.

Cuối cùng, cảm ơn gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc, yêu thương,
tạo điều kiện cho con hoàn thành luận văn cũng như chương trình học
của mình. Cảm ơn tập thể Hóa dược 1 K38 đặc biệt là những người bạn
đã luôn bên cạnh ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ mình trong thời gian qua.
Xin chân thành cảm ơn!

i


Trường Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
------------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
2. Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ
(LC/MS/MS)
3. Sinh viên thực hiện: Phạm Khánh Ngọc MSSV: B1203477
Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ hướng dẫn

Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy

ii


Trường Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
------------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1
1. Cán bộ phản biện 1: Ths. Nguyễn Thị Diệp Chi

2. Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ
(LC/MS/MS)
3. Sinh viên thực hiện: Phạm Khánh Ngọc MSSV: B1203477
Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ phản biện 1

Ths. Nguyễn Thị Diệp Chi

iii

Trường Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
------------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 2
1. Cán bộ phản biện 2: Ths. Dương Thị Phương Liên
2. Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D3 TRONG SỮ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ
(LC/MS/MS)
3. Sinh viên thực hiện: Phạm Khánh Ngọc MSSV: B1203477
Lớp: Hóa Dược 1 – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................

..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ phản biện 2

Ths. Dương Thị Phương Liên

iv


TÓM TẮT
Vitamin D3 là một trong các loại vitamin thiết yếu, có vai trò đặc biệt
quan trọng đối với sức khỏe xương. Ngày nay, rất nhiều các sản phẩm dinh
dưỡng được bổ sung vitamin D3 để cung cấp đủ lượng cần thiết cho cơ thể con
người mà thông dụng nhất là các loại sữa. Tuy nhiên việc nghiên cứu phương
pháp xác định hàm lượng vitamin D3 trong các loại sữa này chưa được làm
nhiều. Do đó, đề tài tiến hành nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin D3
trong các loại sữa bột nhằm đánh giá đúng chất lượng của các sản phẩm này.
Sau khi tham khảo, thử nghiệm nhiều nghiên cứu, đề tài đã lựa chọn quy
trình sử dụng phương pháp xà phòng hóa, chiết lỏng-lỏng để trích ly mẫu và
phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ LC/MS/MS để phân tích định
lượng. Tiến hành đánh giá phương pháp thông qua một số các chỉ tiêu thẩm
định cơ bản, kết quả đều phù hợp các tiêu chuẩn phân tích. Đề tài phân tích
hàm lượng vitamin D3 trên 20 mẫu thực, kết quả cho thấy 100% các mẫu đều
có chứa vitamin D3, hàm lượng trung bình là 76,89 ppb, mặc dù vẫn có sự
chênh lệch giữa hàm lượng phân tích được với thông tin có trên bao bì sản
phẩm nhưng sự chênh lệch này là không quá lớn. Điều này chứng tỏ phương
pháp phân tích có độ chính xác tương đối, có thể được áp dụng vào trong

phân tích thực tiễn.
Từ Khóa: vitamin D3, sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ, LC/MS/MS,
sữa bột.

v


CAM ĐOAN
Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả
nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất
cứ luận văn cùng cấp nào khác.

Phạm Khánh Ngọc
Ngày: 01/12/2015

vi


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i
TÓM TẮT......................................................................................................... v
CAM ĐOAN .................................................................................................... vi
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................... x
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ xii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU .............................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................... 2

1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................... 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1 Tổng quan về vitamin ......................................................................... 3
2.1.1 Khái niệm ................................................................................ 3
2.1.2 Đặc điểm ................................................................................. 3
2.1.3 Phân loại .................................................................................. 3
2.1.4 Vai trò ...................................................................................... 4
2.2 Tổng quan về vitamin D ..................................................................... 5
2.2.1 Lịch sử phát hiện ..................................................................... 6
2.2.2 Phân loại .................................................................................. 6
2.3 Tổng quan về vitamin D3 .................................................................... 8
2.3.1 Đặc điểm ................................................................................. 8
2.3.2 Tính chất.................................................................................. 9
2.3.3 Hấp thu và chuyển hóa .......................................................... 10
2.3.4 Vai trò sinh lý ........................................................................ 12
vii


2.3.5 Nhu cầu ................................................................................. 14
2.3.6 Nguồn cung cấp..................................................................... 15
2.3.7 Ứng dụng ............................................................................... 16
2.4 Tổng quan về các phương pháp chuẩn bị mẫu ................................. 17
2.4.1 Phương pháp xà phòng hóa ................................................... 17
2.4.2 Phương pháp chiết lỏng-lỏng ................................................ 18
2.5 Phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS) ........ 19
2.5.1 Tổng quan về LC/MS/MS ..................................................... 19
2.5.2 Cấu tạo hệ thống LC/MS/MS ................................................ 20
2.5.3 Nguyên tắc hoạt động............................................................ 27
2.5.4 Một số kỹ thuật quét khối phổ MS/MS ................................. 27

2.5.5 Định tính, định lượng ............................................................ 28
2.5.6 Các thông số đánh giá phương pháp ..................................... 30
2.5.7 Ưu, nhược điểm..................................................................... 33
2.5.8 Ứng dụng ............................................................................... 33

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 35
3.1 Phương tiện nghiên cứu .................................................................... 35
3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................ 35
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ ................................................................ 35
3.1.3 Hóa chất ................................................................................ 35
3.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 36
3.2.1 Phương pháp thu mẫu ........................................................... 36
3.2.2 Phương pháp phân tích .......................................................... 37

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 45
4.1 Sắc ký đồ của chuẩn vitamin D3 ....................................................... 45
4.2 Khoảng tuyến tính ............................................................................. 45
4.2.1 Kết quả đo các điểm chuẩn khảo sát ..................................... 45
viii


4.2.2 Đồ thị các điểm chuẩn ........................................................... 46
4.2.3 Kết luận khoảng tuyến tính ................................................... 48
4.3 LOD và LOQ của phương pháp ........................................................ 48
4.4 Hiệu suất thu hồi ............................................................................... 49
4.5 Độ lặp lại ........................................................................................... 50
4.6 Đường chuẩn ..................................................................................... 51
4.6.1 Đường chuẩn ......................................................................... 51
4.6.2 Phương trình hồi quy tuyến tính ........................................... 51
4.7 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin D3 trên các mẫu sữa ............. 51

4.8 Độ chệch ........................................................................................... 53

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 55
5.1 Kết luận ............................................................................................. 55
5.2 Kiến nghị ........................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 57
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 59

ix


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Phân loại các vitamin theo khả năng hòa tan ..................................... 4
Bảng 2.2 Vai trò của một số vitamin................................................................. 5
Bảng 2.3 Nhu cầu vitamin D3 được khuyến nghị trong khẩu phần dinh dưỡng
hằng ngày do Viện Dinh Dưỡng đề nghị năm 2008. ....................................... 14
Bảng 2.4 Nguồn thực phẩm cung cấp vitamin D3 ........................................... 15
Bảng 3.1 Thông tin của các loại sữa bột được sử dụng trong đề tài ............... 37
Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ..... 43
Bảng 3.3 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
......................................................................................................................... 44
Bảng 4.1 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vitamin D3 46
Bảng 4.2 Hiệu suất thu hồi của Vitamin D3 .................................................... 50
Bảng 4.3 Độ lặp lại của phương pháp ............................................................. 50
Bảng 4.4 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin D3 trên các mẫu sữa ............ 52
Bảng 4.5 Độ chệch của phương pháp.............................................................. 53

x

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Bảng phân loại các dạng vitamin D ................................................... 7
Hình 2.2 Cấu trúc phân tử vitamin D2 và vitamin D3 ....................................... 7
Hình 2.4 Công thức cấu tạo của cholecalciferol (vitamin D3) .......................... 9
Hình 2.7 Các phản ứng chuyển hóa vitamin D3 trong cơ thể ......................... 11
Hình 2.8 Sự chuyển hóa – hấp thu của vitamin D3 trong cơ thể con người .... 12
Hình 2.9 Sự điều hòa calci bởi vitamin D3 trong cơ thể con người ................ 13
Hình 2.10 Các chế phẩm vitamin D3 trên thị trường ...................................... 16
Hình 2.12 Các loại thực phẩm được bổ sung vitamin D3 trên thị trường ....... 17
Hình 2.13 Hệ thống LC/MS/MS điển hình ..................................................... 19
Hình 2.14 Sơ đồ cấu tạo hệ thống LC/MS/MS ............................................... 20
Hình 2.15 Hệ thống LC/MS/MS AB Sciex QTRAP4500 .............................. 20
Hình 2.16 Sơ đồ phác họa một hệ thống HPLC cơ bản .................................. 21
Hình 2.17 Phác họa cấu tạo một bình chứa pha động thông thường .............. 21
Hình 2.18 Sơ đồ cấu tạo cơ bản của hệ thống đầu dò khối phổ ba tứ cực ...... 24
Hình 2.19 Phác họa phương pháp ion hóa phun điện ESI .............................. 25
Hình 2.20 Sơ đồ phác họa cấu tạo một tứ cực ................................................ 26
Hình 2.21 Đồ thị tương quan diện tích hoặc chiều cao peak với nồng độ. ..... 29
Hình 2.22 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc.......................................... 31
Hình 4.1 Sắc ký đồ của chuẩn vitamin D3 nồng độ 100 ppb trong methanol . 45
Hình 4.2 Đường chuẩn 20 ppb – 120 ppb ....................................................... 46
Hình 4.3 Đường chuẩn 20 ppb – 140 ppb ....................................................... 47
Hình 4.4 Đường chuẩn 20 ppb – 160 ppb ....................................................... 47
Hình 4.5 Đường chuẩn 20 ppb – 180 ppb ....................................................... 48

xi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

◦

C

Độ Celcius

µL

microliters

AAS

Atomic Emission Spectroscopy

AES

Atomic Absorption Spectroscopy

AOAC

Association Of Analytical Communities

DC

Direct Current

ESI

ElectroSpray Ionization

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

ICH

International Conference on Harmonisation

IU

International Unit

LC

Liquid Chromatography

mL

milliliters

MS

Mass spectrometry

NP

Normal Phase

ppb

parts per billion

ppm

parts per million

PTN

Phòng Thí Nghiệm

RP

Reversed Phase

SPE

Solid Phase Extraction

SPME

Solid Phase Micro Extraction

USFDA

United States Food and Drug Administration

USP

United States Pharmacopeia

xii


CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề [1-4]
Vitamin D là một nhóm các secosteroid tan được trong chất béo, có vai
trò rất quan trọng đối với sức khỏe con người. Vitamin D tồn tại ở một số dạng
khác nhau, trong đó quan trọng nhất là vitamin D3 (cholecalciferol). Chức
năng quan trọng nhất của vitamin D là duy trì nồng độ calci và phosphate ở
mức ổn định trong huyết tương. Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy,
vitamin D còn có vai trò trong sự điều hòa hoạt động tế bào và hệ miễn dịch.
Thiếu vitamin D thường gây nên hai tình trạng bệnh, đó là còi xương (ở trẻ
em) và loãng xương (ở người lớn tuổi).
Trước đây, còi xương được coi là bệnh phổ biến ở châu Âu, nhưng gần
đây nó là một vấn đề sức khỏe cộng đồng ở nhiều quốc gia, ngay cả ở nước
nhiệt đới có nhiều ánh sáng mặt trời như Việt Nam. Theo số liệu thống kê tại
Viện Dinh dưỡng năm 2007 thì bệnh còi xương của trẻ em chiếm tỷ lệ 45,5%,
năm 2010, tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi bị còi xương chiếm tới 29% nghĩa là trung bình
cứ 3 trẻ sẽ có 1 trẻ em bị mắc bệnh còi xương. Kết quả nghiên cứu cho thấy,
tại Việt Nam đang có tỷ lệ thiếu vitamin D ở trẻ từ 1-6 tháng tuổi tương đối
cao so với các nước khác trong khu vực. Tỷ lệ trẻ có lượng vitamin D thấp là
40%, và gần 24% trẻ thiếu vitamin D, trong đó số trẻ thiếu nặng là 9%.
Tình trạng bệnh thứ hai là loãng xương (còn được gọi là xốp xương), nó
là một vấn đề đang được thế giới rất quan tâm, vì có quy mô lớn và gây hệ quả
nghiêm trọng trong cộng đồng. Theo thống kê năm 2008 trên thế giới, ở nhóm
người trên 60 tuổi, tỷ lệ loãng xương ở phụ nữ vào khoảng 20% và nam giới là
10%. Tại Việt Nam một nghiên cứu dịch tễ ở Hà Nội vào năm 2008 cho thấy
tỷ lệ loãng xương ở nữ giới là 15,4%.
Nguyên nhân chính của những thực trạng này là do sự thiếu hụt vitamin

D mà chủ yếu là do cơ thể hấp thu thức ăn kém, do ít tiếp xúc với ánh nắng
mặt trời, do rối loạn chuyển hóa hay do nhu cầu cao ở phụ nữ có thai và cho
con bú…
Mặt khác, việc dùng vitamin D quá liều sẽ gây ngộ độc thuốc, làm tăng
calci trong máu, dẫn đến các biểu hiện: mệt mỏi, chán ăn, nôn, tiêu chảy, đau
nhức xương khớp… hơn nữa còn có thể gây tổn thương thận và tăng huyết áp.
Do đó, việc cung cấp cho cơ thể một lượng vitamin D vừa đủ và đều đặn mỗi
ngày là một việc làm rất cần thiết.
Vitamin D3 là dạng vitamin D chủ yếu mà cơ thể con người hấp thu và
chuyển hóa. Có hai nguồn tiếp nhận vitamin D3, đó là tổng hợp ở da dưới tác
dụng của bức xạ tia cực tím trong ánh sáng mặt trời và từ các loại thực phẩm
1


như dầu cá, gan động vật, lòng đỏ trứng gà, sữa… Tuy nhiên, thực phẩm hằng
ngày thường không cung cấp đủ lượng vitamin D3 cần thiết cho cơ thể, do đó
người ta sử dụng thêm các loại sản phẩm dinh dưỡng bổ sung mà chủ yếu là
các loại sữa.
Chính vì thế, việc tìm hiểu, nghiên cứu các phương pháp để xác định
hàm lượng vitamin D3 trong các loại sản phẩm dinh dưỡng bổ sung là hết sức
cần thiết. Trên thế giới, nhiều nhà phân tích hóa học đã có nhiều công trình
nghiên cứu về vấn đề trên. Các phương pháp khác nhau đã được áp dụng để
xác định hàm lượng vitamin D3 trong thực phẩm như LC, HPLC, LC/MS,
LC/MS/MS... Trong số các phương pháp nêu trên, LC/MS/MS được xem là
một trong những phương pháp đơn giản, có tính ưu việt, tính chọn lọc cũng
như có độ nhạy, độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp thích hợp để phân
tích vi lượng.
Trên thị trường Việt Nam hiện nay có rất nhiều loại sản phẩm sữa được
bổ sung thêm vitamin D3 với hàm lượng khác nhau nhưng việc nghiên cứu về
chúng chưa được tiến hành nhiều. Vì vậy, dựa vào tài liệu tham khảo kết hợp

với điều kiện thực tế của Trung Tâm Phân Tích và Giám Định Vinacert
Control Cần Thơ, đề tài “Xác định hàm lượng vitamin D3 trong sữa bằng
phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS)” được tiến
hành nghiên cứu, thực hiện trên một số loại sữa trên thị trường nhằm đánh giá
đúng chất lượng, giá trị dinh dưỡng thực của các sản phẩm này.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài “Xác định hàm lượng vitamin D3 trong sữa bằng phương pháp sắc
ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS)” mong muốn đạt được các mục
tiêu sau:
-

Chọn lựa quy trình phân tích hàm lượng vitamin D3 trong sữa bằng
phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS).

-

Xác định hàm lượng vitamin D3 trong 20 sản phẩm sữa bột trên thị
trường thành phố Cần Thơ.

1.3 Nội dung nghiên cứu
-

Tìm hiểu các quy trình phân tích hàm lượng vitamin D3 trong sữa
bằng LC/MS/MS, chọn lựa quy trình phân tích.

-

Điều chỉnh các điều kiện xử lý mẫu và điều kiện định lượng.

-

Đánh giá quy trình phân tích.

-

Định lượng vitamin D3 trong một số sản phẩm sữa bổ sung dạng bột
trên thị trường TP Cần thơ
2


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về vitamin [1-9]
2.1.1 Khái niệm
Vitamin là những hợp chất hữu cơ mà tế bào con người và động vật
không thể tự tổng hợp được (trừ vitamin D), có mặt trong thức ăn với hàm
lượng rất nhỏ, cấu trúc hoàn toàn khác với glucid, protid và lipid nhưng rất cần
thiết cho một số phản ứng chuyển hóa giúp duy trì sự phát triển và sự sống
bình thường, khi thiếu hụt sẽ gây nên các bệnh lý đặc hiệu.
2.1.2 Đặc điểm
Mặc dù có cấu trúc, vai trò và cơ chế hoạt động khác nhau nhưng tất cả
các vitamin đều có những đặc tính cơ bản như sau:
Vitamin không phải là những chất cung cấp năng lượng cũng như
thành phần cấu trúc của cơ thể mà chúng tham gia vào những hệ enzyme,
xúc tác cho các phản ứng sinh học, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
sản xuất và sử dụng năng lượng. Cơ thể chỉ có thể sử dụng hiệu quả
nguồn nguyên liệu cung cấp năng lượng (lipid, protid, hydrocarbon và
nước) nếu duy trì được nồng độ tối ưu của các chất xúc tác này.
Khác với enzyme và hormone, cơ thể con người và gia súc không
thể hoặc có rất ít khả năng tự tổng hợp được vitamin, vitamin hàng ngày

được đưa vào cơ thể theo thức ăn dưới dạng hoàn chỉnh (vitamin) hoặc
dạng gần hoàn chỉnh gọi là tiền vitamin (provitamin).
Một số loại vitamin (B6, B12, acid pantotenic, acid folic...) được hệ
vi khuẩn ở ruột tổng hợp hoặc tạo ra trong cơ thể (ví dụ acid nicotinic
được tổng hợp từ tryptophan), tuy vậy các phản ứng này không đủ cung
cấp cho nhu cầu của cơ thể.
Nhu cầu vitamin không lớn, chỉ cần với số lượng rất nhỏ cũng đủ
để duy trì sự hoạt động bình thường của cơ thể nhưng chúng không thể
thiếu được đối với sự sống. Lượng cần thiết hàng ngày thay đổi tuỳ theo
từng loại vitamin (ví dụ: D: 0,025 mg; C: 75 mg).
2.1.3 Phân loại
Có rất nhiều cách khác nhau để phân loại các vitamin. Dựa trên khả năng
hòa tan, các loại vitamin được phân chia thành 2 nhóm chính, đó là nhóm các
vitamin tan trong dầu và các vitamin tan trong nước.
3


Bảng 2.1 Phân loại các vitamin theo khả năng hòa tan
Vitamin tan trong dầu

Vitamin tan trong nước

Vitamin A

Vitamin B1
(Thiamine)

Vitamin B12
(Cyanocobalamin)

Vitamin B2
(Riboflavin)

Vitamin B15 (Pangamic
acid)

Vitamin B3
(Pantothenic acid)

Vitamin C (Ascorbic acid)

Vitamin D
Vitamin E
Vitamin K

Vitamin B5/ PP
(Niacinamide)

Vitamin H (paminobenzoic acid)
Vitamin I (inositol)

Vitamin B6
(Pyridoxine)

Vitamin P (Flavonoids)

Vitamin B7 (Biotin)

Vitamin U (S-methylmethionine)

Vitamin B10/BC
(Folic acid)

Acid lipoic

2.1.4 Vai trò
Vitamin đóng vai trò là chất xúc tác trong các phản ứng sinh hóa, từ quá
trình trao đổi chất, đến xây dựng hệ thống miễn dịch trong cơ thể. Vitamin có
vai trò đặc biệt quan trọng trong việc sản sinh năng lượng, duy trì các hoạt
động sống của cơ thể. Mỗi loại vi chất có những công dụng riêng và đều chứa
trong nguồn thực phẩm hàng ngày. Vitamin giúp chuyển hóa tối đa chất dinh
dưỡng thành năng lượng sống cho cơ thể, tăng cường sức đề kháng, bảo vệ cơ
thể. Vai trò của một số vitamin được tóm tắt trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2 Vai trò của một số vitamin
Vitamin

Chức năng chuyển hóa

A

Đồng phân hóa, điều tiết các con đường liên quan đến thị giác

D

Điều hòa chuyển hóa Calci và Phospho, đặc biệt ở xương

E

Kháng oxy hóa

K

Điều tiết sự biến đổi protein trong quá trình đông máu

B1

Chuyển aldehyde, loại carboxyl trong quá trình lên men rượu
và chu trình acid citric

B2

Phản ứng oxy hóa khử, đặc biệt trong chu trình acid citric và
4


vận chuyển điện tử
B5

Phản ứng oxy hóa khử ở nhiều con đường chuyển hóa

B6

Phản ứng chuyển nhóm amino, đặc biệt ở các acid amin

B7

Phản ứng carboxyl hóa trong chuyển hóa carbohydrate và lipid

Bc

Chuyển nhóm một carbon, đặc biệt ở các hợp chất chứa N

B3

Chuyển acyl ở nhiều con đường chuyển hóa

Acid lipoic Chuyển acyl, phản ứng oxy hóa khử
C

Hydroxyl hóa collagen

Khi cơ thể thiếu hoặc thừa một hay nhiều loại vitamin sẽ gây nên một số
bệnh lý đặc trưng. Một số bệnh lý điển hình khi thiếu các loại vitamin tương
ứng được tóm tắt trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3 Các bệnh lý điển hình khi thiếu các loại vitamin
Vitamin

Bệnh lý điển hình

A

Khô mắt, phù đại giác mạc, quáng gà, tăng sừng da

D

Còi xương, loãng xương, yếu cơ

E

Các rối loại về sinh sản, lão hóa

K

Các rối loạn về đông máu

B1

Bệnh tê phù, bệnh viêm thần kinh

B2

Viêm giác mạc, viêm da

B5

Triệu chứng Burning-Feet, viêm mũi – miệng

B6

Bệnh động kinh, viêm da, môi, lưỡi

Bc

Hồng cầu khổng lồ, thiếu máu

B3

Bệnh thiếu vitamin PP (pellagra)

B12

Thiếu máu ác tính

C

Bệnh thiếu vitamin C (scurvy)

Các vitamin tan trong dầu như vitamin A, D và E cần lưu ý không được
sử dụng quá liều. Khi sử dụng quá liều các vitamin này sẽ gây độc, đặc biệt là
vitamin A, do chúng tích tụ trong mô mỡ. Các vitamin tan trong nước không
gây độc khi sử dụng quá liều.
5


2.2 Tổng quan về vitamin D [1-11]
2.2.1 Lịch sử phát hiện
Các công trình nghiên cứu về vitamin D được bắt đầu từ năm 1916. Tới
năm 1931 người ta đã tổng hợp thành công vitamin D.
Francis Glisson (1596-1677) – giáo sư người Anh đã quan sát và kết luận
rằng: xương quá yếu có thể dẫn đến biến dạng bộ xương. Chính cuộc sống
không có mặt trời, thiếu nguồn sữa, thiếu chất dinh dưỡng là nguyên nhân gây
bệnh còi xương ở trẻ em.
Năm 1782, bác sĩ Dale Percval đã cho những đứa trẻ uống dầu cá và đã
chữa trị thành công bệnh còi xương.
Năm 1790, ngoài chức năng chữa bệnh bằng dầu cá, ông còn phát hiện
chức năng chữa lành bệnh khi cho tiếp xúc với ánh nắng mặt trời.
Năm 1865, bác sĩ Armand Trousseau đề nghị dùng liệu pháp chữa bệnh
bằng dầu cá và ánh sáng mặt trời.
Năm 1919, Maccollum và Mellanbourg phát hiện ra dầu cá chứa vitamin
A và vitamin D.

Năm 1928, Windaus – nhà hóa học người Đức nhận giải Nobel Hóa Học
vì đã phân lập được vitamin D từ nguồn thực vật và động vật là dầu cá ngừ.
2.2.2 Phân loại
Vitamin D tồn tại ở nhiều dạng (vitamer) khác nhau. Chúng bao gồm
vitamin D1, vitamin D2, vitamin D3, vitamin D4, vitamin D5… Trong đó hai
dạng chính là vitamin D2 (còn gọi là ergocalciferol) và vitamin D3
(cholecalciferol). Vitamin D được viết không kèm theo chỉ số được hiểu là D2
hoặc D3 hoặc cả hai, chúng được gọi chung là calciferol. Cấu trúc hóa học của
vitamin D2 được xác định lần đầu vào năm 1931. Vào năm 1935, cấu trúc hóa
học của vitamin D3 được xác định và chứng minh là nó được tạo thành từ quá
trình biến đổi của 7-dehydrocholesterol dưới tác động của tia cực tím.
Trong hóa học, các dạng khác nhau của vitamin D là những secosteroid –
steroid bị gãy một trong những liên kết trong các vòng steroid.

6


Hình 2.1 Bảng phân loại các dạng vitamin D
Sự khác biệt về cấu trúc của vitamin D2 và vitamin D3 nằm ở các chuỗi
bên của chúng. Chuỗi bên của vitamin D2 chứa một liên kết đôi giữa carbon
22 và 23 và một nhóm methyl trên carbon 24.

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử vitamin D2 và vitamin D3
Vitamin D2 là một dẫn xuất của ergosterol, một sterol có trong màng tế
bào của nấm cựa gà. Sterol này cũng có trong một số loài thực vật phù
du, động vật không xương sống, nấm men, và nấm lớn. Vitamin D2 được sản
7


xuất từ ergosterol trong cơ thể của các sinh vật này, dưới sự tác kích của tia

cực tím. Cũng giống như tất cả các loại vitamin D khác, không thể tạo ra
vitamin D2 nếu không có bức xạ cực tím. Các thực vật có diệp lục và động vật
có xương sống không thể tự sản xuất vitamin D2, vì cơ thể chúng không có
tiền chất ergosterol.

Hình 2.3 Phản ứng tổng hợp Vitamin D2
Vitamin D3 được tổng hợp từ tác động của bức xạ tia cực tím (UV) trên
tiền chất 7-dehydrocholesterol của nó. Da tạo ra vitamin D3 và cung cấp
khoảng 90% nhu cầu vitamin D cho cơ thể. Phân tử này tự xuất hiện trong da
động vật và trong sữa. Vitamin D3 có thể được tạo ra bằng cách cho da hoặc
phơi sữa (một phương thức thương mại) tiếp xúc trực tiếp với tia cực tím.
Vitamin D3 cũng được tìm thấy trong cá béo và dầu gan cá tuyết.
2.3 Tổng quan về vitamin D3 [1-11]
2.3.1 Đặc điểm
Vitamin D3 còn được gọi là cholecalciferol là một trong năm dạng
(vitamer) của vitamin D. Vitamin D3 cùng với vitamin D2 (ergocalciferol) là
hai dạng phổ biến nhất. Trong đó vitamin D3 dễ dàng được hấp thu và phát
huy tác dụng tốt hơn vì vitamin D2 phải trải qua một quá trình chuyển hoá nhất
định thì mới trở thành dạng có hoạt tính được.
Vitamin D3 là một secostreoid, cấu trúc là steroid có một vòng mở.
Vitamin D3 có ở các loại cá béo (cá hồi, cá thu…), dầu gan cá, sữa, lòng đỏ
trứng, bơ... với lượng rất thấp. Vitamin D3 là một vitamin D tự nhiên vì cơ thể
con người có thể tổng hợp được ở da từ 7-dehydro cholesterol dưới tác dụng
của tia tử ngoại trong ánh nắng mặt trời.
Vitamin D3 không có hoạt tính sinh học, nó được chuyển đổi thành dạng
có hoạt tính thông qua các quá trình chuyển hóa trong cơ thể.

8

Vitamin D3 được xem như một hormone vì nó được tổng hợp ở dưới da
đi vào máu đến cơ quan đích tạo nên tác dụng thông qua receptor đặc hiệu.
Hoạt tính enzyme hydroxylase xúc tác cho quá trình chuyển hóa vitamin D3
thành chất có hoạt tính được điều hòa theo cơ chế điều khiển ngược thông qua
nồng độ ion calci trong máu.
2.3.2 Tính chất
2.3.2.1 Tính chất vật lý
Vitamin D3 không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như
petrolium ether, alcohol, methanol, chloroform…
Là tinh thể hình kim, màu trắng. Không mùi.
Nhiệt độ nóng chảy ở 83 - 86◦C, nhiệt độ sôi 496,4◦C.
Vitamin D3 khá bền với nhiệt, môi trường acid (hữu cơ), kiềm và các tác
nhân khử.
Đơn vị: IU, 1 IU = 0,025 µg vitamin D3.
Bị hấp thụ cực đại (trong alcohol hay hexane) ở bước sóng 264,5 nm.
2.3.2.2 Tính chất hóa học
Tên IUPAC: (3β,5Z,7E)-9,10-secocholesta-5,7,10(19)-trien-3-ol.
Công thức phân tử: C27 H44 O
Công thức cấu tạo:

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của cholecalciferol (vitamin D3)
Khối lượng phân tử: 384,64 g/mol.
Được tổng hợp từ provitamin 7-dehydrocholesterol có sẵn trong da người
và động vật dưới tác dụng của tia cực tím có bước sóng từ: 270- 290 nm.
9


Hình 2.5 Phản ứng tổng hợp vitamin D3
Vitamin D3 rất nhạy cảm với ánh sáng, dưới tác dụng của bức xạ tia UV:
Cholecalciferol ↔ sura-sterols → ergosterol

Vitamin D3 dễ bị phân hủy khi có mặt các chất oxy hóa và các acid vô
cơ: sự phân hủy xảy ra ở nối đôi giữa C7 và C8 trong vòng B của phân tử.
Vitamin D3 dễ bị oxy hóa và bị bất hoạt khi tiếp xúc với oxy trong không
khí hay với các tác nhân oxy hóa khác: bị hydroxyl hóa tại carbon 25.

Hình 2.6 Phản ứng hydroxyl hóa vitamin D3
2.3.3 Hấp thu và chuyển hóa
Sự chuyển hóa vitamin D3 trong cơ thể gồm các quá trình chính như sau:
-

Phản ứng vòng hóa electron: 7-dehydrocholesterol có ở dưới da bị
quang phân bởi tác dụng của bức xạ UV trong ánh nắng mặt trời
10


chuyển thành provitamin D3.
-

Phản ứng chuyển vị sigma hydride: provitamin D3 tự đồng phân hóa
thành vitamin D3, quá trình này mất khoảng 10-12 ngày.

-

Sự hydroxyl hóa vitamin D3 lần lượt thành 25-hydroxyvitamin D3 và
1,25-dihydroxyvitamin D3 (calcitriol) nhờ các enzyme tại gan và
thận.

-

Bị biến đổi thành calcitroic acid có hoạt tính sinh học thông qua các

phản ứng dị hóa tại các mô đích.

Hình 2.7 Các phản ứng chuyển hóa vitamin D3 trong cơ thể
Vitamin D3 được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, mật rất cần thiết cho sự
hấp thụ ở ruột non.
Vì vitamin D3 tan trong lipid nên được tập trung trong vi thể dưỡng chấp
và được hấp thu theo hệ bạch huyết, trong máu chúng liên kết với alpha
glubomin đặc hiệu. Thời gian bán hủy trong huyết tương là 19-25 giờ nhưng
lại được lưu trữ lâu dài trong các mô mỡ.

11