THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ UVVIS
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.31 MB, 62 trang )
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------
TÔN PHÚ TÙNG
THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VỚI ĐẦU DÒ UV-VIS
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. NGUYỄN THỊ THU THỦY
2017
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------
TÔN PHÚ TÙNG
THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VỚI ĐẦU DÒ UV-VIS
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. NGUYỄN THỊ THU THỦY
2017
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Ts. Nguyễn
Thị Thu Thủy, giảng viên đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và tận
tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể
quý Thầy Cô của bộ môn Hóa học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, người đã trang bị
cho em kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt những năm học tại trường.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến anh Đỗ Điền Trung và chị
Trang Hiền Nhân cùng với các Anh Chị kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm –
Công ty TNHH Liên Nông Việt Nam (Đức Hòa, Long An) và Công ty Hóa sinh
Á Châu đã tạo điều kiện toàn diện cả về hóa chất lẫn máy móc, luôn quan tâm
chỉ dạy cho em những kinh nghiệm quý giá nhất để em hoàn thành luận văn của
mình.
Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Văn Đạt cố vấn lớp hóa học K39 luôn quan
tâm theo dõi, chỉ dạy cả về kiến thức chuyên môn lẫn kinh nghiệm xã hội cho
chúng em.
Em xin cảm ơn quý Thầy, Cô trong hộ đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Đại
học đã dành thời gian quý báu xem xét, góp ý và sửa chữa giúp em hoàn thiện
luận văn này một cách tốt nhất.
Sau cùng, em xin vô cùng cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè là chỗ dựa
tinh thần vững chắc, luôn giúp đỡ, quan tâm chia sẻ cùng em trong suốt thời gian
qua để em có thể hoàn thành luận văn cũng như chương trình Đại Học.
Chân thành cảm ơn!
TÔN PHÚ TÙNG
Luận văn Đại Học
iii
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
Trường Đại Học Cần Thơ
Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
Bộ Môn Hóa Học
------
------
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
2. Đề tài: “THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC
ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI
ĐẦU DÒ UV-VIS”
Sinh viên thực hiện: Tôn Phú Tùng MSSV: B1304130
Lớp: Hóa HọcKhóa: 39
3. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
................................................................................................................................
................................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2017
Cán bộ hướng dẫn
Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
Luận văn Đại Học
iv
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
Trường Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
Bộ Môn Hóa Học
------
------
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
1. Cán bộ phản biện:……………………………………………………………..
2. Đề tài: “THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC
ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI
ĐẦU DÒ UV-VIS”.
3. Sinh viên thực hiện: Tôn Phú Tùng MSSV: B1304130 Lớp: Hóa HọcKhóa: 39
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
................................................................................................................................
……........................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
................................................................................................................................
................................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2017
Cán bộ phản biện
Luận văn Đại Học
v
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
TÓM TẮT
Việc sử dụng các loại thuốc kích thích tăng trưởng nói chung và
Gibberellic acid nói riêng trên nông sản ngày càng phổ biến. Thị trường xuất
hiện ngày càng nhiều các loại nông dược có chứa Gibberellic acid nhưng chất
lượng và hàm lượng chưa thực sự được quan tâm. Do đó, việc xác định hàm
lượng của các sản phẩm nông dược này là cần thiết.
Các phương pháp định lượng Gibberellic acid rất đa dạng; trong đó,
phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV-VIS là
phổ biến nhất.
Tuy nhiên, quy trình phân tích này còn nhiều mặt hạn chế và chưa thống
nhất về nhiều mặt. Từ thực tế đó, việc thẩm định các tiêu chí như tính tuyến tính,
giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ đúng làm tăng độ tin cậy
và tính thống nhất của quy trình định lượng.
Kết quả thực hiện thẩm định cho quy trình đảm bảo độ tin cậy cao với tính
tuyến trong khoảng 25-200 mg/L. Độ đúng đạt trong khoảng 94-106%. Độ chính
xác với RSD < 2%. Giới hạn phát hiện là 0,000355 mg/L, giới hạn định lượng là
0.010764 mg/L.
Ứng dụng quy trình để thực hiện xác định hàm lượng Gibberellic acid có
trong 3 mẫu nông dược đang được lưu hành trên thị trường. Trong đó, có 2 mẫu
đạt yêu cầu và một mẫu không đạt yêu cầu so với hàm lượng trên nhãn.
Từ quy trình định lượng Gibberellic acid bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao với đầu dò UV-VIS có thể kiến nghị để ứng dụng để thực hiện xác
định dư lượng Gibberellic acid có trong nông sản, đảm bảo tính an toàn của
nông sản và sức khỏe người tiêu dùng.
Từ khóa: Gibberellic acid, quy trình định lượng, HPLC/UV-VIS, sắc ký
lỏng hiệu năng cao, quang phổ,…
Luận văn Đại Học
vi
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
LỜI CAM KẾT
Tôi tên Tôn Phú Tùng, tôi xin cam đoan những số liệu sử dụng trong luận
văn này hoàn toàn là nghiên cứu của riêng tôi và chưa từng được sử dụng trong
bất kỳ báo cáo cùng cấp nào.
Cần Thơ, ngày tháng
Cán bộ hướng dẫn
Sinh viên ký tên
Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
Luận văn Đại Học
năm
Tôn Phú Tùng
vii
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
MỤC LỤC
TÓM TẮT .......................................................................................................... vi
LỜI CAM KẾT ................................................................................................ vii
DANH SÁCH BẢNG ..........................................................................................x
DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................... xi
DANH SÁCH PHỤC LỤC .............................................................................. xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... xiii
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu đề tài .................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN............................................................................... 3
2.1 Tổng quan về quang phổ ................................................................................................... 3
2.1.1 Sơ lược về sự ra đời và lịch sử nghiên cứu quang phổ .............................................. 3
2.1.2 Định luật hấp thu ........................................................................................................ 5
2.1.3 Các yếu tố liên quan đến sự hấp thu .......................................................................... 5
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thu ........................................................................ 7
2.1.5 Cơ sở lý thuyết của một số phương pháp trắc quang ................................................. 8
2.1.6 Cấu tạo máy quang phổ UV-VIS ............................................................................. 10
2.2 Tổng quan về HPLC ....................................................................................................... 12
2.2.1 Nguyên tắc ............................................................................................................... 12
2.2.2 Các bộ phận cơ bản của máy HPLC ........................................................................ 13
2.2.3 Một số đại lượng đặc trưng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................... 15
2.3 Tổng quan về Gibberellic acid ........................................................................................ 19
2.3.1 Sơ lược về lịch sử phát hiện Gibberellic acid .......................................................... 19
2.3.2 Cấu tạo, danh pháp, tính chất ................................................................................... 19
2.3.3 Tính chất sinh lý của Gibberellic acid...................................................................... 20
2.3.4 Độc tính.................................................................................................................... 21
2.3.5 Tổng quan về định lượng Gibberellic acid............................................................... 22
2.4 Tổng quan về thẩm định quy trình định lượng Gibberallic acid bằng HPLC/UV-VIS .. 22
2.4.1 Định nghĩa ................................................................................................................ 22
2.4.2 Mục đích .................................................................................................................. 22
2.4.3 Các chỉ tiêu thẩm định quy trình phân tích .............................................................. 23
CHƯƠNG 3 . PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 29
Luận văn Đại Học
viii
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
2.5 Thời gian và địa điểm thực hiện ..................................................................................... 29
2.5.1 Thời gian thực hiện .................................................................................................. 29
2.5.2 Địa điểm thực hiện ................................................................................................... 29
2.6 Phương tiên thực hiện ..................................................................................................... 29
2.6.1 Hóa chất và dung môi .............................................................................................. 29
2.6.2 Thiết bị và dụng cụ................................................................................................... 29
2.7 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................... 30
2.7.1 Quy trình định lượng GA3 bằng HPLC/UV-VIS ..................................................... 30
2.7.2 Chất chuẩn đối chiếu ................................................................................................ 31
2.7.3 Mẫu Gibberrellic acid trên thị trường ...................................................................... 31
2.8 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................ 32
2.8.1 Lựa chọn phương pháp ............................................................................................ 32
2.8.2 Thẩm định quy trình................................................................................................. 32
2.8.3 ứng dụng phương pháp HPLC/UV-VIS để xác định hàm lượng trong các mẫu nông
dược thu được ................................................................................................................... 32
2.9 Phương pháp xử lý kết quả ............................................................................................. 33
CHƯƠNG 4 THỰC HIỆN VÀ KẾT QUẢ .................................................... 34
2.10 Xác định bước sóng hấp thu cực đại của Gibberellic acid ............................................ 34
2.10.1 Cách thực hiện ....................................................................................................... 34
2.10.2 Bước sóng hấp thu cực đại của Gibberellic acid .................................................... 34
2.10.3 Ý nghĩa của bước sóng hấp thu cực đại ................................................................. 34
2.11 Thẩm định quy trình định lượng Gibberellic acid bằng HPLC/UV-VIS ...................... 35
2.11.1 Tính tuyến tính ....................................................................................................... 35
2.11.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng............................................................. 36
2.11.3 Độ đúng.................................................................................................................. 37
2.11.4 Độ lặp lại ................................................................................................................ 38
2.12 Định lượng trên mẫu thật .............................................................................................. 41
2.12.1 Phân tích chuẩn Gibberellic acid............................................................................ 41
2.12.2 Phân tích các mẫu trên thị trường .......................................................................... 43
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 47
2.13 Kết luận ......................................................................................................................... 47
2.14 Kiến nghị....................................................................................................................... 47
Luận văn Đại Học
ix
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Tổ hợp màu và màu bổ sung .................................................................5
Bảng 2.2 Độ lặp lại tối đa chấp nhận được các nồng độ khác nhau (AOAC) ...24
Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận được ở các nồng độ khác nhau ........................25
Bảng 3.1 Hàm lượng đăng ký các mẫu thu gom trên thị trường ........................31
Bảng 4.1 Cách chuẩn bị dung dịch Gibberellic acid ..........................................35
Bảng 4.2 Kết quả hấp thu ABS của GA3 ở bước sóng 206 nm ..........................35
Bảng 4.3 Kết quả tính LOD và LOQ .................................................................36
Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi .................................................................................38
Luận văn Đại Học
x
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Thiết bị Spektralapparat thiết kế bởi G. R. Kirchoff và R. W. Bunsen
3
Hình 2.2 Các vùng trong bức xạ điện từ ..............................................................4
Hình 2.3 Các hiệu ứng và sự dịch chuyển ...........................................................7
Hình 2.4 Mô tả đường chuẩn của phương pháp đường chuẩn .............................9
Hình 2.5 Đồ thị củ phương pháp thêm chuẩn ....................................................10
Hình 2.6 Sơ đồ cấu tạo của một máy UV-VIS ...................................................11
Hình 2.7 Sơ đồ cấu tạo của một máy quang phổ một chùm tia .........................11
Hình 2.8 Sơ đồ cấu tạo của một máy quang phổ hai chùm tia...........................12
Hình 2.9 Sơ đồ cấu tạo của máy HPLC .............................................................12
Hình 2.10 Một số loại cột dùng trong HPLC .....................................................15
Hình 2.11 Hệ số kéo đuôi và hệ số đối xứng peak trong HPLC ........................18
Hình 2.12 Công thức cấu tạo của Gibberellic acid ............................................19
Hình 2.13 Gibberellic acid dạng tinh thể ...........................................................20
Hình 3.1 Máy sắc ký Shimazu LC-2030 Prominence-i .....................................29
Hình 3.2 Một số sản phẩm nông dược chứa GA3 .............................................32
Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện max của Gibberellic acid .........................................34
Hình 4.2 Đường chuẩn của Gibberellic acid tại 206 nm....................................36
Hình 4.3 Kết quả xác định độ đùng ...................................................................37
Hình 4.4 Kết quả kiểm tra độ lặp lại thực hiện bởi người thứ nhất ...................39
Hình 4.5 Kết quả kiểm tra độ lặp lại thực hiện bởi người thứ hai .....................40
Hình 4.6 Sơ đồ các bước pha dung dịch chuẩn ..................................................41
Hình 4.7 Kết quả phân tích chuẩn Gibberellic acid ...........................................42
Hình 4.8 Sơ đồ các bước pha dung dịch mẫu ....................................................43
Hình 4.9 Kết quả phân tích mẫu Gibber 4T (4%) ..............................................44
Hình 4.10 Kết quả phân tích mẫu Gibber 1T (1%) ............................................45
Hình 4.11 Kết quả phân tích mẫu Gibber 20T (20%) ........................................46
Luận văn Đại Học
xi
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
DANH SÁCH PHỤC LỤC
Bảng PHỤC LỤC A Mức độ sai lệch cho phép của hàm lượng hoạt chất .......52
Luận văn Đại Học
xii
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
UV-VIS
Ultralviolet – Visible
H2O
Nước
MeOH
Methanol
LOD
Limit of detection
LOQ
Limit of quantitation
GA3
Gibberellic acid
GC
Gas Chromatography
MS
Mass Spectrometry
Luận văn Đại Học
xiii
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, các loại nông dược có chứa thuốc kích thích sinh trưởng nói
chung và Gibberellic acid nói riêng được nhà nông sử dụng rộng rãi để tăng năng
suất nông sản. Gibberellic acid có tác dụng kích thích sinh trưởng mạnh ở cây
trồng, làm tăng ưu thế chồi, ảnh hưởng đến sự tạo thành hạt, sự nảy mầm của hạt.
Bên cạnh đó, việc sử dụng lâu dài các loại nông sản có chứa dư lượng lớn
Gibberellic acid sẽ gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người tiêu dùng.
Các loại thuốc chứa Gibberellic acid được cấp số đăng ký ngày càng nhiều.
Bên cạnh đó các loại thuốc kém chất lượng, với hàm lượng sai khác so với hàm
lượng in trên nhãn và chưa được đăng ký cấp phép vẫn được lưu hành rãi do giá
thành thấp và sự hiểu biết còn hạn chế của nông dân về nông dược. Các loại thuốc
giả, thuốc kém chất lượng không những gây nên thiệt thòi cho người nông dân
mà còn ảnh hưởng gián tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng. Vì thế, phương pháp
kiểm nghiệm định lượng các loại thuốc bảo vệ thực vật có chứa Gibberellic acid
là cần thiết đối với các nhà sản xuất, các nhà nghiên cứu và các cơ quan quản lý
chất lượng thuốc.
Trong những năm qua, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò
UV-VIS (HPLC/UV-VIS) của Cục Bảo vệ Thực vật (thuộc Bộ Nông nghiệp và
phát triển nông thôn) được các nhà sản xuất để kiểm nghiệm hàm lượng
Gibberellic acid trong nguồn nguyên liệu đầu vào cũng như hàm lượng của thành
phẩm. Phương pháp này cho kết quả khá chính xác vì có độ chọn lọc cao có giới
hạn phát hiện thấp. Tuy nhiên, quy trình nói trên sẽ có ý nghĩa hơn nếu được thầm
định thường xuyên. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài: THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ UV-VIS” được thực hiện với mong
muốn thẩm định lại qui trình định lượng Gibberrellic acid có trong một số loại
nông sản, bằng phương pháp HPLC với đầu dò UV-Vis góp phần giúp các nhà
chuyên môn có nhiều thông tin quý trong quy trình phân tích các chất kích thích
sinh trưởng thực vật đang được sử dụng, tìm ra giải pháp góp phần chuẩn hóa
chất lượng sản phẩm.
1.2 Mục tiêu đề tài
Đề tài “Thẩm định quy trình định lượng Gibberellic acid bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò uv-vis” được tiến hành với những
mục đích sau:
-
Xác định bước sóng hấp thu quang cực đại của Gibberellic acid.
Luận văn Đại Học
1
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
-
-
Thẩm định quy trình định lượng Gibberellic acid bằng phương pháp
HPLC/UV-VIS theo các tiêu chí khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện,
giới hạn định lượng, độ đúng và độ lặp lại.
Xác định hàm lượng Gibberellic acid có trong một số mẫu nông dược được
sử dụng trong giai đoạn hiện nay.
Luận văn Đại Học
2
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN
2.1 Tổng quan về quang phổ
2.1.1 Sơ lược về sự ra đời và lịch sử nghiên cứu quang phổ
Cách đây 200 năm, Joseh von Fraunhofer (1787-1826) lần đầu tiên sản xuất
loại máy đo quang phổ mà tính năng không có gì sánh kịp lúc bấy giờ. Ông có
thể xác định chính xác độ dài bước sóng của nhiều vạch. Tuy nhiên, trong thời
gian này ông ấy không hiểu được những cơ sở vật lý về những vấn đề mà ông ấy
đã khám phá ra.
Vào năm 1859 với sự cộng tác của nhiều nhà vật lý nổi tiếng như Gustav R.
Kirchhoff, Robert W Bunsen tại Heidelberg. Họ đã sử dụng thiết bị có tên là
“Spektralapparat”, họ đã ghi nhận được quá trình phát xạ rất đặc biệt của nhiều
nguyên tố khác nhau. Với phương pháp này họ đã tiếp tục khám phá ra hai nguyên
tố mới là casium và rubidium. Sự khám phá này là nền tảng cho sự khám phá tiếp
theo về sự hấp thu và phát xạ của hấp thu phân tử.
Hình 2.1 Thiết bị Spektralapparat thiết kế bởi G. R.Kirchhoff
và R. W. Bunsen
Năm 1879 Marie Alfred Cornu thấy rằng, những tia có bước sóng ngắn của
bức xạ mặt trời trên bề mặt trái đất bị hấp thụ bởi khí quyển. Một năm sau đó,
Walther Noel Hartley mô tả rất tỉ mỉ về sự hấp thụ UV của O 3 và nó trở nên rõ
ràng hơn khi họ phát hiện ra rằng O3 chứa đầy trong bầu khí quyển.
2.1.2 Định nghĩa bức xạ điện từ
Trong quang phổ học ánh sáng nhìn thấy, tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia
Rơnghen, sóng radio… đều được gọi chung một thuật ngữ là bức xạ.
Bức xạ điện từ hay còn gọi là ánh sáng, nó là một trạng thái của năng lượng
được truyền trong không gian với vận tốc lớn (c = 2,998.108 ms-1). Bức xạ điện
từ được miêu tả như một dạng sóng mà ở đó tính chất của nó phụ thuộc vào bước
Luận văn Đại Học
3
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
sóng, tần số, vận tốc và biên độ của nó. Mặt khác, bức xạ điện từ còn được xem
như là hạt, do đó có thể coi bức xạ điện từ như chùm năng lượng không khối
lượng và được gọi là lượng tử ánh sáng (photon). Theo thuyết lượng tử ánh sáng,
giữa năng lượng ε của photon với bước sóng ánh sáng có mối quan hệ
Trong đó h là hằng số Planck 6,624.10-34 Js
Bức xạ điện từ bao gồm một dãy các sóng điện từ có bước sóng thay đổi
trong khoảng rất rộng từ cỡ mét đến Å hoặc nhỏ hơn nữa. Toàn bộ dãy sóng đó
được chia thành nhiều vùng phổ với tên gọi khác nhau. Vùng mà mắt người cảm
nhận được có tên là ánh sáng khả kiến hay vùng nhìn thấy bao gồm bức xạ có
bước sóng từ 396-760 nm. Vùng ngay trước và sau vùng khả kiến được gọi là
vùng tử ngoại và vùng hồng ngoại. Tuy nhiên ranh giới của các vùng quang phổ
là không cứng ngắc mà có thể chồng chéo lên nhau.
Hình 2.2 Các vùng trong bức xạ điện từ
Vùng ánh sáng bao gồm tia cực tím và ánh sáng khả kiến được gọi tắt là
vùng UV-VIS. Vùng UV-VIS được chia thành 3 vùng nhỏ :
Vùng tử ngoại chân không (UV xa) λ = 50-200 nm, tuy nhiên ít được sử
dụng vì :
• Có năng lượng khá lớn, khi va chạm gây vỡ liên kết trong phân tử
• Bị hấp thu mạnh bởi hầu hết dung môi và oxy của không khí
• Bị hấp thu bởi thạch anh (dùng làm cốc đo)
Vùng tử ngoại gần (UV gần): từ λ = 200-375 nm
Vùng khả kiến (Vis): từ λ = 375-800 nm
Có thể nói trong công tác kiểm nghiệm nói chung và kiểm nghiệm thuốc
nói riêng, phép đo UV-Vis đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích định tính,
thử tinh khiết và định lượng. Bên cạnh đó, phương pháp UV-Vis còn có thể dùng
để xác định hằng số phân ly acid-base Ka, xác định số tiểu phân hấp thu dung
Luận văn Đại Học
4
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
dịch (xác định đẳng quang). Phương pháp này phổ biến hằng ngày ở các phòng
thí nghiệm.
2.1.3 Định luật hấp thu
Có hai định luật thực nghiệm được công thức hóa cho cường độ hấp thụ.
Định luật Lambert phát biểu rằng phần tia tới bị hấp thụ phụ thuộc vào cường độ
của nguồn. Định luật Beer phát biểu rằng sự hấp thụ tỉ lệ với số phân tử hấp thụ.
Từ các định luật này ta có phương trình sau của định luật Beer-Lambert:
Trong đó:
I0 và I là cường độ của tia tới và tia truyền qua tương ứng
l: chiều dày của lớp dung dịch hấp thụ tính bằng cm
C: nồng độ dung dịch tính bằng mol/L
ε: Độ hấp thụ phân tử gam (hay còn gọi là hệ số tắt phân tử gam, hệ số
hấp thu quang mol)
A: Độ hấp thụ quang hay mật độ quang
Định luật Beer-lambert là cơ sở của các phương pháp phân tích quang phổ.
Hệ số hấp thu quang mol là đại lượng không đổi, đặc trưng cho từng chất.
Định luật Beer-lambert tuân theo một cách nghiêm ngặt chỉ khi các dạng
đơn lẻ gây ra sự hấp thụ quan sát thấy. Tuy nhiên, định luật không tuân theo khi
các dạng khác nhau của phân tử đang hấp thụ nằm trong cân bằng, khi chất tan
và dung môi tạo thành phức qua một vài loại kết hợp, khi cân bằng nhiệt tồn tại
giữa trạng thái electron cơ bản và trạng thái kích thích ở mức thấp, hay khi các
hợp chất huỳnh quang và các hợp chất bị biến đổi bởi bức xạ có mặt trong dung
dịch.
2.1.4 Các yếu tố liên quan đến sự hấp thu
2.1.4.1 Màu sắc
Màu sắc có tầm quan trong riêng biệt cho một chất. Màu của một chất liên
quan với sự hấp thu và sự phản xạ của một chất. Mắt người nhìn thấy được màu
bổ trợ cho màu hấp thu.
Luận văn Đại Học
5
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
Bảng 2.1 Tổ hợp màu phổ và màu bổ sung
Thứ
tự
λ (nm)
Màu phổ
Màu bổ sung
1
400-430
Tím
Vàng lục
2
430-480
Chàm
Vàng
3
480-490
Chàm lục
Cam
4
490-500
Lục chàm
Đỏ
5
500-560
Lục
Đỏ tía
6
560-580
Vàng lục
Tím
7
580-595
Vàng
Chàm
8
595-650
Cam
Chàm lục
9
650-730
Đỏ
Lục vàng
10
730-760
Đỏ tía
Lục
2.1.4.2 Nhóm mang màu (Chromophore)
Nhóm mang màu là nhóm chưa no, liên kết đồng hóa trị π trong phân tử gây
ra sự hấp thu bức xạ trong vùng UV-Vis.
Trong một hệ liên hợp, tính bất đối xứng của các liên kết π càng tăng thì các
nhóm mang màu càng dễ hấp thu. Rất nhiều phân tử có thể có hai đến nhiều nhóm
mang màu.
2.1.4.3 Nhóm trợ màu (Auxochrome)
Nhóm trợ màu là những nhóm thế no gắn vào nhóm mang màu làm thay đổi
cả bước sóng lẫn cường độ của dải hấp thu cực đại, thường làm chuyển dịch λmax
về phía dài hơn.
Ví dụ: –OH, -NH2,-Cl,… làm tăng tính hấp thu, làm giảm năng lượng cần
hấp thu.
2.1.4.4 Các hiệu ứng và sự dịch chuyển
Sự dịch chuyển sang đỏ (red shift) λmax chuyển bước sóng dài hơn do các
nhóm trợ màu, dung môi, ion hóa chất tan.
Luận văn Đại Học
6
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
Sự dịch chuyển sang xanh (blue shift) λmax chuyển về bước sóng ngắn hơn.
Hiệu ứng tăng cường độ (hyperchromic effect): xảy ra khi có sự tăng tính
liên hợp π-π trong phân tử dẫn đến tăng ε, thường kèm theo sự chuyển dịch đỏ.
Hiệu ứng giảm cường độ (hypochromic effect): có sự phân ly phân tử dẫn
đến giảm ε thường kèm chuyển dịch xanh.
Hình 2.3 Các hiệu ứng và sự dịch chuyển
2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thu
2.1.5.1 Cấu trúc phân tử
Cấu trúc phân tử ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp thụ UV-Vis của phân tử.
Các yếu tố này có thể là hiệu ứng cảm ứng I, liên hợp và các hiệu ứng không gian
vị trí của các liên kết đôi ảnh hưởng nhiều đến sự hấp thu của phân tử, đặc biệt là
các hệ liên hợp có thể làm thay đổi vị trí các cực đại hấp thu.
2.1.5.2 Môi trường
a. Dung môi
Độ phân cực của dung môi có thể làm biến đổi môi trường điện tử của nhóm
hấp thu mang màu. Một cách tổng quát, độ lớn của sự chuyển dịch có thể liên
quan đến độ phân cực của dung môi.
Khi chọn dung môi cho dung dịch đo phổ UV-Vis ngoài việc dựa vào độ
tan của chất cần nghiên cứu còn phải tính đến khả năng hấp thụ của chính dung
môi này.
b. Nồng độ
Thường thì nồng độ chỉ ảnh hưởng đến cường độ của dải. Ở nồng độ cao,
tương tác phân tử có thể gây nên sự thay đổi về dạng và vị trí của dải hấp thu.
Luận văn Đại Học
7
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
Các thay đổi này làm khác đi tính tuyến tính của độ hấp thu theo nồng độ và dẫn
đến kết quả định lượng không chính xác.
c. pH
Ảnh hưởng của pH trên phổ hấp thu rất lớn và chủ yếu làm dịch chuyển sự
cân bằng giữa 2 dạng khác nhau.
d. Nhiệt độ
Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến việc đo quang phổ UV-Vis: sự trương nở đơn
giản của dung môi đủ làm thay đổi độ hấp thu biểu kiến và do đó cũng làm ảnh
hưởng đến độ đúng của kết quả.
2.1.6 Cơ sở lý thuyết của một số phương pháp trắc quang
2.1.6.1 Phương pháp so sánh
So sánh cường độ màu của dung dịch cần xác định với cường độ màu của
dung dịch chuẩn đã biết nồng độ, dung dịch chuẩn với dung dịch cần xác định
phải được đo trong cùng một điều kiện.
Ưu điểm: phương pháp đơn giản, nhanh chóng, không tốn thời gian dựng
đường chuẩn.
Nhược điểm: không thể tính chính xác nồng độ chất cần phân tích, cần phải
pha dung dịch chuẩn có nồng độ gần với nồng độ chất cần phân tích.
2.1.6.2 Phương pháp đường chuẩn
Lập các đường chuẩn riêng lẻ đối với từng cấu tử trong hỗn hợp bằng cách
đo những thể tích bằng nhau của một loạt dung dịch chất chuẩn có nồng độ khác
nhau. Như vậy ta thu được một loạt các độ hấp phụ ứng với từng nồng độ chất
chuẩn đã phân tích. Một đường chuẩn được dựng cho mỗi cấu tử với một trục
nồng độ và trục kia là độ hấp phụ tương ứng để kiểm tra sự tuyến tính của phương
pháp.
Đo cấu tử chất cần phân tích y như điều kiện đo mẫu chuẩn.
Từ các hệ số hấp phụ thu được của các cấu tử cần phân tích và đường
chuẩn vừa thiết lập suy ra được nồng độ của chúng.
Luận văn Đại Học
8
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
Hình 2.4 Mô tả đường chuẩn của phương pháp đường chuẩn
2.1.6.3 Phương pháp thêm chuẩn
Nguyên tắc của phương pháp này là người ta dùng ngay mẫu phân tích làm
nền để chuẩn bị một dãy mẫu đầu bằng cách lấy một lượng mẫu phân tích nhất
định và thêm vào đó những lượng chất nhất định của hoạt chất cần xác định theo
từng bậc (theo cấp số cộng). Ví dụ thêm vào là C1, C2,… như thế chúng ta sẽ
được dãy mẫu chuẩn là:
C0 = Cx
C1’= (Cx+C1)
C2’= (Cx+C2)
C3’= (Cx+C3)
C4’= (Cx+C4)
Trong đó Cx là hàm lượng của hoạt chất cần xác định trong mẫu phân tích.
Tiếp đó cũng chọn các điều kiện thí nghiệm phù hợp và hoạt chất cần phân
tích, tiến hành ghi lại diện tích peak theo nồng độ.
Luận văn Đại Học
9
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
Hình 2.5 Đồ thị của phương pháp thêm chuẩn
2.1.7 Cấu tạo máy quang phổ UV-VIS
Một máy quang phổ UV-Vis gồm có: nguồn sáng, bộ đơn sắc và detector.
Nguồn sáng thường là đèn deuteri, phát xạ bức xạ điện tử trong vùng UV
của phổ. Nguồn thứ 2 là đèn tungsten, được sử dụng cho bước sóng trong vùng
khả kiến Vis.
Bộ đơn sắc là một cách tử nhỏ, vai trò của nó là phân bố lại chùm ánh sáng
thành các bước sóng thành phần của nó. Một hệ thấu kính hội tụ bước sóng đòi
hỏi vào cuvet mẫu. Ánh sáng đi qua cuvet mẫu và đi tới detector. Detector ghi
nhận cường độ của ánh sáng đã truyền qua I.
Detector nói chung là một ống nhân quang, mặc dù trong các thiết bị hiện
đại các diot quang cũng được sử dụng.
Máy quang phổ tử ngoại và khả kiến UV-Vis gồm những bộ phận chủ yếu
sau:
(1)
Đèn nguồn (source): gồm đèn tungsten-halogen hay wolframe đo
vùng Vis, đèn Hydrogen hay Deuterium đo vùng UV
(2) Bộ tạo ánh sáng đơn sắc bằng lăng kính thạch anh hay bằng cách tử
(3) Hộp đựng mẫu (cuvet) bằng thủy tinh thạch anh để đo vùng UV-Vis,
thủy tinh thường để đo vùng Vis.
(4) Bộ phận tín hiệu (detector) là ống nhân quang điện đo từ 200-680 nm.
Trong trường hợp đo ở vùng có bước sóng lớn hơn 680 nm.
Luận văn Đại Học
10
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
(5) Bộ khuếch đại tín hiệu
(6) Bộ phận ghi nhận tín hiệu.
Hình 2.6 Sơ đồ cấu tạo của một máy UV-VIS
Phân loại :
Các máy quang phổ UV-Vis được phân loại theo cấu tạo:
Loại một chùm tia (single beam): loại này để đo điểm, tức là ta đo độ
hấp thu của từng bước sóng một. Muốn thu được toàn bộ phổ tự ta phải xây
dựng lấy.
Hình 2.7 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ một chùm tia
Loại hai chùm tia (giống nhau về cường độ và λ): thông thường có bộ
phận tự ghi kèm và máy tự ghi toàn bộ phổ mà ta cần khảo sát.
Luận văn Đại Học
11
TÔN PHÚ TÙNG
ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS
Hình 2.8 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ hai chùm tia
2.2 Tổng quan về HPLC
2.2.1 Nguyên tắc
Hỗn hợp chất cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp,
tiêm một thể tích chính xác vào bộ phận tiêm mẫu và được mang vào cột bởi một
một dung môi (pha động). Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có
diện tích bề mặt lớn (pha tĩnh). Với việc chọn pha động và pha tĩnh thích hợp,
các cấu tử trong mẫu sẽ di chuyển dọc trên cột với những tốc độ khác nhau. Khi
những cấu tử lần lượt thoát ra khỏi cột và đi vào detector thích hợp, ở đây tín hiệu
được ghi lại, xử lí và cho ra một sắc ký đồ, cho biết sự hiện diện của mỗi cấu tử
dưới dạng một peak. Khi đó lượng cấu tử có trong mẫu được tính toán dựa vào
chiều cao hoặc diện tích peak của nó.
Hình 2.9 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Luận văn Đại Học
12
TÔN PHÚ TÙNG
