ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Salmonella

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis
ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus,
Escherichia coli và Salmonella

Họ và tên sinh viên : ĐẶNG THỊ LÊ HÂN
Ngành : DƯỢC THÚ Y
Niên khóa : 2004-2009

i


Tháng 9/2009

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis
ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus,
Escherichia coli và Salmonella

ĐẶNG THỊ LÊ HÂN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng bác sĩ thú y chuyên ngành
Dược thú y

Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS NGUYỄN NGỌC HẢI

ii

Tháng 9/2009

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS TS Nguyễn Ngọc Hải vì đã
tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong quá trình
thực hiện đề tài này.

Tôi xin chân thành cám ơn cô Nguyễn Thị Thu Năm – giảng viên của bộ môn
Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y trường Đại học Nông Lâm vì đã giúp
đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài.

Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cha mẹ tôi, những người đã luôn động viên,
quan tâm, chăm sóc, tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và hoàn thành đề
tài này.

Chân thành cám ơn các bạn Lâm, Hải, Thảo, Nhân, Dung, Trâm, T Vân, K
Vân đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình làm đề tài.

Đặng Thị Lê Hân

iii


TÓM TẮT
Đề tài « ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis ĐỐI
VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus, Escherichia coli và
Salmonella » được thực hiện trong vòng 5 tháng (từ 2/2009 – 6/2009) nhằm mục
đích đánh giá khả năng đối kháng của Bacillus subtilis trên 3 loài vi khuẩn gây

bệnh là Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Salmonella.
Phương pháp nghiên cứu
1. Phân lập và định danh Bacillus subtilis
2. Kháng sinh đồ khuyếch tán trên thạch
Kết quả thu được
1. Bacillus subtilis đã được phân lập từ đất
2. Phần lớn các chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất đã thể hiện khả năng
đối kháng chống lại Staphylococcus aureus (21/24 chủng), một số ít hơn các
chủng phân lập có khả năng đối kháng với Escherichia coli (11/24 chủng) và
Salmonella (5/24 chủng)
3. Các chủng Bacillus subtilis được kiểm tra đã thể hiện khả năng đối kháng
mạnh nhất với Staphylococcus aureus và khả năng này yếu hơn đối với
Escherichia coli và Salmonella.
4. Tác động kháng khuẩn của Bacillus subtilis chịu sự ảnh hưởng của thời
gian nuôi cấy, tác động này là mạnh nhất khi Bacillus subtilis trải qua 24 giờ nuôi
cấy và giảm dần ở 36 giờ và 48 giờ nuôi cấy.
5. Sự hiện diện của các vi khuẩn khác có thể đóng vai trò như 1 yếu tố dẫn dụ
cho sự sản xuất các hợp chất kháng khuẩn của Bacillus subtilis.
iv


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN……...……………………………………………………..……….i
TÓM TẮT………………………………………………………………………...ii
MỤC LỤC…………………………………………………………………...…...iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………….vi
DANH MỤC BẢNG…………………………………………………………….vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ.......................................................................................ix
DANH MỤC SƠ ĐỒ……………………………………………………………...x
DANH MỤC HÌNH……………………………………………………………...xi

Chương 1. PHẦN MỞ ĐẦU……………………………………………………...1
1.1. Đặt vấn đề……………………………………………………………………..1
1.2. Nội dung của đề tài……………………………………………………………1
1.3. Mục tiêu của đề tài…………………………………………………………….2
Chương 2. TỔNG QUAN………………………………………………………...3
2.1. Sơ lược về Bacillus subtilis…………………………………………………...3
2.1.1. Lịch sử………………………………………………………………………3
2.1.2. Đặc điểm phân loại………………………………………………………….3
2.1.3. Đặc điểm phân bố…………………………………………………………...3
2.1.4. Đặc điểm hình thái…………………………………………………………..4
2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy…………………………………………………………..4
2.1.6. Kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp…………………………………...5
2.1.7. Tính đối kháng của Bacillus subtilis………………………………………...8

v


2.1.8. Ứng dụng của Bacillus subtilis……………………………………………...9
2.2. Sơ lược về Staphylococcus aureus…………………………………………..11
2.2.1. Đặc điểm hình thái…………………………………………………………11
2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy…………………………………………………………12
2.2.3. Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus và cơ chế tác động của
chúng……………………………………………………………………………...12
2.3. Sơ lược về Escherichia coli………………………………………………….13
2.3.1. Tổng quan………………………………………………………………….13
2.3.2. Đặc điểm hình thái…………………………………………………………13
2.3.3. Đặc điểm nuôi cấy…………………………………………………………13
2.3.4. Khả năng gây bệnh………………………………………………………...13
2.4. Sơ lược về Salmonella……………………………………………………….14
2.4.1. Đặc điểm hình thái…………………………………………………………14

2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy…………………………………………………………14
2.4.3. Khả năng gây bệnh của Salmonella……………………………………….15
Chương 3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ
NGHIỆM………………………………………………………………………...16
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện……………………………………………..16
3.2. Vật liệu thí nghiệm…………………………………………………………..16
3.2.1. Đối tượng khảo sát…………………………………………………………16
3.2.2. Dụng cụ - Thiết bị………………………………………………………….16
3.2.3. Môi trường nuôi cấy……………………………………………………….16
3.3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………17

vi


3.4. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………….17
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất………………………………….17
3.4.2. Đánh giá khả năng đối kháng của Bacillus subtilis đối với Staphylococcus
aureus, Escherichia coli và Salmonella…………………………………………..19
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………...26
4.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis……………………………………………26
4.2. Kết quả thí nghiệm 1…………………………………………………………28
4.3. Kết quả thí nghiệm 2…………………………………………………………33
4.4. Kết quả thí nghiệm 3…………………………………………………………38
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………40
5.1. Kết luận………………………………………………………………………40
5.2. Đề nghị……………………………………………………………………….41
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………42
PHỤ LỤC………………………………………………………………………..44

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CFU: Colony forming unit
TSST-1: Toxine Responsable du Choc toxique
CMH: Complexe Majeur d’Histocompatibilité
ETEC: Escherichia coli enterotoxinogene
EPEC: Escherichia coli enteropathogene
EIEC: Escherichia coli enteroinvasif
EHEC: Escherichia coli enterohemorragique
LT: Toxine thermolabile
ST: Toxine thermostable
TSA: Tryptone Soya Agar
TSB: Tryptone Soya Broth
NB: Nutrition Broth
d: Diamètre de zones d’inhibitrice
C: Concentration
t: Temps

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Phân loại Bacillus subtilis.
Bảng 3.1: Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis.
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát tính kháng vi khuẩn kiểm nghiệm của
dịch canh nuôi cấy chung giữa B. subtilis và vi khuẩn kiểm nghiệm
Bảng 4.1: Kết quả phân lập B. subtilis từ đất
Bảng 4.2: Kết quả của thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng trên thạch của
Bacillus subtilis chống lại Staphylococcus aureus

Bảng 4.3: Kết quả của thí nghiệm đánh giả khả năng đối kháng trên thạch của
Bacillus subtilis chống lại Escherichia coli
Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng trên thạch của
Bacillus subtilis chống lại Salmonella
Bảng 4.5: Tác động kháng khuẩn trên thạch của Bacillus subtilis đối với các
vi khuẩn kiểm nghiệm theo thời gian
Bảng 4.6: Tác động kháng khuẩn trên thạch của Bacillus subtilis đối với 3 vi
khuẩn kiểm nghiệm
Bảng 4.7: Đường kính các vòng vô khuẩn tạo ra theo thời gian bởi dịch canh
ly

tâm

Bacillus

subtilis

trên

thạch

được

phết

Staphylococcus aureus
Bảng 4.8: Đường kính các vòng vô khuẩn tạo ra theo thời gian bởi dịch canh
ly tâm Bacillus subtilis trên thạch được phết Escherichia coli
Bảng 4.9: Đường kính các vòng vô khuẩn tạo ra theo thời gian bởi dịch canh
ly tâm Bacillus subtilis trên thạch được phết Salmonella

ix


Bảng 4.10: Tác động kháng khuẩn của dịch canh khuẩn ly tâm Bacillus subtilis
trên 3 vi khuẩn kiểm nghiệm
Bảng 4.11: Tác động đối kháng Staphylococcus aureus của dịch canh khuẩn ly
tâm nuôi cấy chung giữa B. subtilis và Staphylococcus aureus
Bảng 4.12: Tác động đối kháng E. coli của dịch canh khuẩn ly tâm nuôi cấy
chung giữa B. subtilis và E. coli

x


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Tác động kháng khuẩn trên thạch của Bacillus subtilis đối với 3
vi khuẩn kiểm nghiệm.
Biểu đồ 4.2: Tác động kháng khuẩn của dịch canh ly tâm Bacillus subtilis đối
với các vi khuẩn kiểm theo thời gian ủ của dịch canh.
Biểu đồ 4.3: Tác động kháng khuẩn của dịch canh khuẩn Bacillus subtilis trên
3 loại vi khuẩn kiểm nghiệm.

xi


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Phân lập Bacillus subtilis từ đất
Sơ đồ 3.2: Định danh Bacillus subtilis
Sơ đồ 3.3: Thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của B. subtilis trên thạch
Sơ đồ 3.4: Đọc kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng trên thạch của

các chủng B. subtilis phân lập
Sơ đồ 3.5: Thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của dịch canh khuẩn
B. subtilis.
Sơ đồ 3.6: Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy chung
giữa B. subtilis và các vi khuẩn kiểm nghiệm.

xii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ở độ phóng đại 1000 lần
Hình 2.2: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus
Hình 2.3: Khuẩn lạc Salmonella trên thạch máu
Hình 4.1: Kết quả phân lập mẫu đất trên thạch TSA
Hình 4.2: Vòng vô khuẩn quan sát ở thời điểm 24giờ ủ tạo bởi các chủng
Bacillus subtilis trên thạch đã được phết vi khuẩn kiểm nghiệm
Hình 4.3: Kết quả đối kháng trên thạch giữa dịch canh B. subtilis ủ 24h và
S. aureus
Hình 4.4: Kết quả của tác động đối kháng tạo bởi 2 loại dịch canh khuẩn nuôi
cấy chung thu được bằng 2 cách – ly tâm và lọc

xiii


Chương 1
PHẦN MỞ ĐẦU
1.1.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong lĩnh vực chăn nuôi và thú y, việc sử dụng kháng sinh có thể gây ra nhiều
thiệt hại cho sức khỏe con người bởi sự tồn dư của nó trong các sản phẩm động vật và
do sự kháng đa kháng sinh của vi khuẩn. Vì vậy mà người ta hiện rất quan tâm đến các
nghiên cứu để tìm ra các giải pháp thay thế cho kháng sinh mà trong đó là việc sử
dụng các vi khuẩn probiotic như Bacillus subtilis.
Trong tự nhiên, các vi khuẩn chung sống với nhau hình thành nên các hệ vi sinh vật
khác nhau tùy thuộc vào môi trường sinh sống. Những vi khuẩn trong hệ vi sinh vật
phải cạnh tranh dữ dội để tồn tại bằng khả năng cạnh tranh dinh dưỡng cao và bằng sự
tiết ra những chất ức chế các vi khuẩn lân cận…và chúng ta có thể gọi hiện tượng này
là đối kháng vi sinh vật. Trong trường hợp của Bacillus subtilis, những vi khuẩn này
có khả năng sản xuất ra những hợp chất kháng khuẩn được gọi là Bacteriocins. Những
chất này có thể là protein hoặc polypeptide được tiết ra trong những giai đoạn và điều
kiện khác nhau, chúng cũng tạo nên những hiệu ứng kháng khuẩn khác nhau, tất cả đã
cho Bacillus subtilis 1 khả năng đối kháng với nhiều vi khuẩn và nấm khác nhau.
Được sự phân công của Khoa chăn nuôi thú y trường Đại học Nông Lâm thành phố
Hồ Chí Minh và Bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, dưới sự hướng dẫn của Phó giáo sư
tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải chúng tôi đã thực hiện đề tài « ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH –
Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Salmonella »

1.2 NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI
1. Phân lập B. subtilis từ sản phẩm đất.
2. Đánh giá đối kháng của B. subtilis với Staphylococcus aureus, E. coli và
Salmonella.
14


1.3 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Chọn ra chủng B. subtilis có khả năng đối kháng mạnh với vi sinh vật gây bệnh,
phục vụ cho việc ứng dụng cho sản xuất chế phẩm sinh học trong tương lai.

15


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 SƠ LƯỢC VỀ Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử
Bacillus subtilis đã được sử dụng rộng rãi trong vòng nhiều năm và được thương
mại hóa trên khắp nước Mỹ và châu Âu từ năm 1946 như 1 loại dược phẩm nhờ vào
tác động kích thích miễn dịch do hoạt hóa sự tiết các kháng thể đặc hiệu như IgM, IgG
và IgA.

2.1.2. Đặc điểm phân loại
Bảng 2.1: Phân loại Bacillus subtilis
Giới

Bactéria

Ngành

Firmicutes

Lớp

Bacilli

Bộ

Bacillales

Họ

Bacillacae

Giống

Bacillus

Loài

B.subtilis

(Bergey’s, 2004)
2.1.3. Đặc điểm phân bố
B. subtilis là vi khuẩn thường có mặt trong nước, đất, không khí, xác bã thực
vật thối rửa và cả trong đường tiêu hóa của người và động vật. B. subtilis hiện diện
trong đất với một số lượng phổ biến là 106 – 107 CFU/g. Vi khuẩn này có khả năng
sinh bào tử để có thể chịu đựng các điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt và những thay đổi
bất lợi của môi trường sống. Thông thường có khoảng 60% số lượng B. subtilis trong
đất tồn tại ở trạng thái này (Alexander, 1977).
16


2.1.4. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là các vi khuẩn gram dương hiếu khí. Dưới kính hiển vi với sự
nhuộm gram chúng xuất hiện với màu xanh tím và hình dạng trực thẳng hai đầu tròn
với kích thước 0,5-0,8 µm x 2,5-3 µm. Những vi khuẩn này nằm riêng lẽ hoặc sắp xếp
với nhau thành những chuỗi ngắn.
Bacillus subtilis có khả năng tạo bào tử dưới dạng hình ovale với kích thước

0,8-1,8 µm ở trung tâm tế bào vi khuẩn (Tô Minh Châu, 2000). Chúng có khả năng di
động như vào hệ thống các lông roi phủ trên bề mặt vi khuẩn (Kenethe Todar, 2008).

( />
Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ở độ phóng đại 1000 lần
Bacillus subtilis có khả năng tạo bào tử dưới dạng hình ovale với kích thước
0,8-1,8 µm ở trung tâm tế bào vi khuẩn (Tô Minh Châu, 2000). Chúng có khả năng di
động như vào hệ thống các lông roi phủ trên bề mặt vi khuẩn (Kenethe Todar, 2008).
Trên thạch dinh dưỡng: khuẩn lạc Bacillus subtilis trong mờ và gù lên. Những
khuẩn lạc nay có màu trắng kem, bề mặt sáng với viền nhăn nheo. Đường kính khuẩn
lạc từ 3-5 mm. Sau 1-4 ngày nuôi cấy, bề mặt khuẩn lạc trở nên nhăn nheo với màu
nâu nhạt (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).
Trong môi trường lỏng: Bacillus subtilis tạo những lớp màng mỏng trên bề mặt
sau thời gian nuôi cấy (Kenethe Todar, 2008).
2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy
Bacillus subtilis là loài vi khuẩn ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 3656oC và nồng độ NaCl có khả năng ức chế vi khuẩn là 10-1 (Lương Đức Phẩm, 2000).
17


Nhu cầu Oxy: Bacillus subtilis là loài hiếu khí và yếm khí tùy nghi
Bacillus subtilis có thể phát triển trong những môi trường phức tạp hoặc khá
đơn giản. Sự phân lập bước đầu có thể được thực hiện trên thạch dinh dưỡng (peptone
5 g/l, cao thịt 3 g/l, agar 15 g/l, pH 6,8) hoặc trên J-agar (tryptone 5 g/l, chiết nấm men
15 g/l, K2HPO4, glucose 2 g/l, agar 20 g/l, pH 7,4). (Kenethe Todar 2008).
2.1.6. Kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp
Tiềm năng sản xuất các kháng sinh của B. subtilis đã được nhận thấy khoảng 50
năm trước. Những kháng sinh có bản chất peptide chiếm ưu thế trong các kháng sinh
tổng hợp. Tuy nhiên, các nghiên cứu có hệ thống điều tra về phổ kháng khuẩn hoàn
chỉnh của các kháng sinh tổng hợp bởi các chủng B. subtilis khác nhau thì vẫn còn
hiếm ( Pinchuk et al, 2002)

Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 66 loại kháng sinh khác nhau như
subtilin, subtilosin, sublancin, surfactin, bacitracin,… ( Katz và Demain, 1997). Phần
lớn các kháng sinh có bản chất peptide tổng hợp bởi Bacillus subtilis có khả năng
chống lại các vi khuẩn gram dương (Ming và Epperson, 2002). Tuy nhiên, hỗn hợp
polymyxin, colistin và circulin thể hiện khả năng chống lại vi khuẩn gram âm hay
bacillomycin, mycobacillon và fungistatin có tác động mạnh trên nấm mốc và nấm
men (Katz và Demain, 1997)
Các kháng sinh peptide do B. Subtilis tổng hợp được chia thành 2 nhóm lớn. Đó là
các peptide kháng khuẩn tổng hợp dựa vào ribosome (RAMPs – Ribosomally
synthesized Antimicrobial peptides) và những peptide kháng khuẩn tổng hợp không
dựa vào ribosome (non-RAMPs) (Hancock và Chapple, 1999). Các RAMPs được tổng
hợp trong suốt pha phát triển chủa động của B. subtilis,trong khi đó các non-RAMPS
được tổng hợp sau pha phát triển của động của B. subtilis (Tamehiro et al, 2001).
™ Các peptide kháng khuẩn tổng hợp dựa vào ribosome (RAMPs)
Các RAMPs do B. subtilis tổng hợp ra bao gồm surfactin, nhóm inturin, fengycin
(Zuber, Nakano, et Marahiel, 1993), bacitracin, bacilysin (Ozcengiz, Alaeddingolu et
Demain, 1990)…

18


Surfactin: nó sở hữu khả năng kháng khuẩn, chống ung thư, tiêu máu, chống đông,
phân hủy fibrin. Giống với các biosurfactant mạnh nhất, surfactin có rất nhiều ứng
dụng trong ngành môi trường và công nghệ sinh học. Những khả năng khác của nó đã
được ghi nhận gồm có sự nhũ hóa và chống mycoplasma… (Al-Ajlani et al, 2007)
Nhóm Inturin: những kháng sinh thuộc nhóm này là các hợp chất peptidolipid mà
có tác động chống nấm rất mạnh. Chúng có 1 chuỗi β-aminoacide gắn vớimột nửa
peptid gồm D và L α-aminoacides. (Mhamedi et al, 1982).
Fengycin : bao gồm các enzyme (fengycin synthetase) – Fen C, Fen D, Fen A và
Fen B. Fengycin có khả năng kháng nấm rất mạnh.

™ Các peptide kháng khuẩn tổng hợp không dựa vào ribosome (non-RAMPs)
Những peptide kháng khuẩn tổng hợp không dựa vào ribosome bao gồm TasA
(Stover và Driks, 1999), subtilosin (Babasaki et al, 1985)
TasA: TasA có phổ kháng khuẩn rộng. Nó được tiết ra trong môi trường nuôi cấy
30 phút sau khi sự tạo bào tử bắt đầu. Nó định vị trong lớp peptidoglycan của bào tử.
TasA giúp Bacillus subtilis chiếm ưu thế trong sự hình thành (tài liệu tổng hợp bởi
Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).
Subtilosin: là 1 bacteriocin có khả năng kháng khuẩn mạnh chống lại Listeria
monocytogenes et Bacillus cereus (tài liệu tổng hợp bởi Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).
Sublancin: kháng sinh này không tác động lên các vi khuẩn gram âm nhưng nó có
khả năng đối kháng rất mạnh lên các vi khuẩn gram dương. Sublancin là 1 bacteriocin
bền, không mất hoạt tính sau 2 năm bảo quản trong những điều kiện bình thường (tài
liệu tổng hợp bởi Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)
Bacilysocine:

cấu

trúc

của

bacilysocin

là

1-(12-methyltetradecanoyl)-3-

phosphoglyceroglycerol. Bacilysocin thể hiện những khả năng kháng khuẩn nói chung
và khả năng kháng nấm nói riêng. Sự tổng hợp bacilysocin bắt đầu ngay lập tức sau

pha tăng sinh nhưng trước khi sự hình thành bào tử bắt đầu (Tamehiro et al, 2001)
™ Những yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp các kháng sinh của B. subtilis
19


• Các khoáng chất thiết yếu
Mặc dù phần lớn các kháng sinh không cần đến các ion kim loại cho các hoạt động
của nó nhưng vẫn có rất nhiều kháng sinh cần đến các ion kim loại để hoạt động ví dụ
như bacitracin (Jamil et al, 2006). Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc
duy trì cấu trúc và chức năng của các kháng sinh này. Những kháng sinh này được
(Epperson et Ming, 2000) gọi là « metaloanbiotics » theo tiếng anh.
Các ion kim loại có thể rất thiết yếu cho sự hình thanh bacitracin (Weimberg,
1958). Sự sản xuất bacitracin bị ức chết bởi EDTA. Tác động ức chế của EDTA bị đảo
ngược bởi sự thêm vào trong môi trường nuôi cấy lượng dư Mn2+, Co2+, Zn2+ (Haavik,
1974).

• Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Trong nghiên cứu « Phân lập B. subtilis MH4 từ đất và tiềm năng của nó trong việt
sản xuất các kháng sinh polypeptid » của (Jamil et al, 2007), sự ủ trong vòng 96 giờ đã
cho ra sự sản xuất kháng sinh tối ưu. Điều đó cũng đã được thảo luận trong nghiên cứu
của (Demain, 1972) mà trong đó ông đã kết luận rằng sự tổng hợp các kháng sinh
polypeptid được bắt đầu sau pha tăng trưởng của vi khuẩn.

• Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
pH tối ưu cho sự sản xuất kháng sinh của B. subtilis là 8. Tuy nhiên ở pH từ 6-9 sự
sản xuất kháng sinh cũng rất tốt (Jamil et al, 2007). Những sự thay đổi pH bên ngoài
ảnh hưởng rất nhiều đến các quy trình tế bào như sự điều hòa sinh tổng hợp các chất
biến dưỡng thứ cấp. Sự sản xuất bacitracin của B. subtilis phụ thuộc vào pH
(Montserrat et al, 2000).

• Ảnh hưởng của nguồn carbon
Người ta đã tìm ra rằng sự hình thành các kháng sinh đạt tối đa khi glycerol được
sử dụng như 1 nguồn carbon. Tuy nhiên, các hoạt động sản xuất kháng sinh sẽ tăng
đáng kể khi maltose, glucose, sorbitol và lactose được sử dụng như nguồn carbon
(Jamil et al, 2007)

• Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Sự tạo các kháng sinh đạt đến tối ưu khi acid L-glutamic được sử dụng làm nguồn
nitơ (Jamil et al, 2007). (Egorov et al, 1986) đã kết luận rằng sự thay thế glutamate bởi
20


tryptone có thể gây ra sự suy giảm đáng kể sự tăng sinh của vi khuẩn, sự tích tụ sinh
khối cũng như làm dừng quá trình tổng hợp kháng sinh.

• Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nghiên cứu của (Jamil et al, 2007) đã cho thấy rằng nhiệt độ tối ưu cho sự hình
thành các kháng sinh phụ thuộc vào các vi khuẩn kiểm nghiệm, nó là 30oC đối vời
Staphylococcus aureus, và là 37oC đối với Micrococcus luteus. Tuy nhiên, theo (Anker
et al, 1947) thì sự sản xuất kháng sinh này đạt đến tối đa ở 37oC.

2.1.7. Tính đối kháng của Bacillus subtilis
* Với vi sinh vật gây bệnh
Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh là
cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh.
Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hướng chủ
yếu sau:
¾ Làm ngừng tổng hợp thành (màng) tế bào hay làm tan màng tế bào vi khuẩn
và do đó phá hủy tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg++, Na+, Ca++ thoát ra
ngoài, tế bào chết.

¾ Ảnh hưởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Chất kháng sinh có thể
phong bế quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng hợp chuỗi
polypeptid hay đưa đến tổng protein bất thường.
¾ Ảnh hưởng đối với acid acetic cụ thể là phá hủy sự trao đổi của ADN và
ARN bằng cách ức chế men RNA polymerase hay gắn vào các base làm đứt đoạn
chuỗi xoắn kép ADN.
Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số
lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi
khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn
chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh
trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn
bởi Lý Kim Hữu).
21


* Với đồng loại:
Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra chất kháng
sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này nhằm tiêu
thụ chất dinh dưỡng giải phóng từ các tế bào này với mục đích kéo dài thời kỳ trước
khi tạo bào tử (Richard Losik, Jone Gonzales và cộng sự, 1993).
2.1.8. Ứng dụng của Bacillus subtilis
Các đặc tính có ích của Bacillus subtilis
-

Sản sinh enzyme amylase, pectinase, protease, lipase, trypsin, urease,
mannase,..

-

Sản sinh các acid hữu cơ: acid lactic, acid acetic làm giảm pH đường ruột.

-

Sản sinh vitamin nhóm B

-

Cạnh tranh vị trí bám dính với vi sinh vật gây bệnh.

-

Sản xuất các kháng sinh ức chế các vi sinh vật gây bệnh

-

Bacillus subtilis còn được xem là tác nhân kích thích miễn dịch trong điều trị
một số bệnh.

* Trong công nghiệp
Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất ra enzyme và một số
chất hóa học cho công nghiệp như amylase, protease, inosine, ribosides,
aminoacid,…Trong đó, protease được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất tẩy
rửa.
* Trong y học
Việc trao đổi gen giữa những chủng thuộc Bacillus subtilis khi chúng cùng phát
triển trong đất đã được biết đến khá lâu. Klier và cộng sự đã chứng minh khả năng
trao đổi plasmid giữa Bacillus subtilis và Bacillus thuringensis. Một số nghiên cứu chỉ
ra rằng Bacillus subtilis chuyển gen có khả năng kích ứng hay làm ức chế khả năng
biểu hiện độc tố hay 1 số thành phần độc tố trong các vi khuẩn trong các bệnh ho gà,
bạch hầu, viêm phổi,…điều này có ý nghĩa rất lớn đối với y học. Tuy nhiên, cũng còn

tồn tại 1 vấn đề là Bacillus subtilis hoàn toàn có thể nhận các gen quy định tính độc từ
22


các vi khuẩn độc có quan hệ tương đối gần về mặt di truyền và gây hại.
* Trong nông nghiệp
Bacillus subtilis ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia
solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae,… ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công
tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch.
Bacillus subtilis được ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm nhằm làm giảm tái
phát bệnh tiêu chảy gây ra trên heo so với đều trị bằng kháng sinh.

23


2.2 SƠ LƯỢC VỀ Staphylococcus aureus
Vào năm 1884, Rosenbach đã mô tả 2 dạng khuẩn lạc có màu của giống vi khuẩn
Staphylococcus và ông đã đề nghị tên cho 2 loài đó là Staphylococcus aureus (khuẩn
lạc vàng) và Staphylococcus albus (khuẩn lạc trắng) mà sau được đổi tên thành
Staphylococcus epidermidis. Mặc dụ hơn 20 loài của giống vi khuẩn Staphylococcus
đã được mô tả trong tác phẩm « Manuel de Bergey » (2001 ), chỉ duy nhất
Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis có những tác động quan trọng
trên con người (Kenethe Todar, 2008).
Staphylococcus aureus là loài gây bệnh mạnh nhất của giống Staphylococcus. Nó
gây ra ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng có mủ định vị và trong một số trường hợp gây
ra nhiễm trùng máu trên những chủ thể suy yếu.
2.2.1. Đặc điểm hình thái
Staphylococcus aureus là những cầu khuẩn gram dương. Dưới kính hiển vi ta thấy
vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ, đứng thành từng đôi hay là ở dạng chùm nho. Dạng
chùm nho là hình dạng đặc trừng cho giống vi khuẩn Staphylococus. Vi khuẩn này

không tạo bào tử, không di động, đường kính từ 0,5 đến 2,5 µm (trung bình 0,8 - 1
µm).
Staphylococcus aureus hình thành các khuẩn lạc lớn màu vàng cam trên các môi
trường giàu dinh dưỡng. S. aureus thường có khả năng dung huyết trên thạch máu
(Kenethe Todar, 2008).

( />us%20TopView.jpg)

Hình 2.2: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus

24


2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
S. aureus có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 đến 45oC và ở những nồng độ
NaCl khá cao đến 15% (Kenethe Todar, 2008).
S. aureus nhân lên dễ dàng trong môi trường hiếu khí hơn kị khí. Nó đòi hỏi các
acid amin và vitamin cho sự sinh trưởng. Nó là loài vi khuẩn chịu nhiệt trung bình và
nó bị ức chế khi có sự hiện diện của hệ vi sinh vật cạnh tranh quan trọng. Loài vi
khuẩn này nhạy cảm với sự acid hóa. Nó có thể tồn tại lâu dài trong những thực phẩm
khô hay đông lạnh (B. Peiffer, 1999).
Các nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho sự phát triển lần lượt là 6-8oC và 45oC. Vi
khuẩn có thể nhân lên dễ dàng trong các pH khác nhau từ 4-9,8 (B. Peiffer, 1999).
2.2.3. Các yếu tố độ lực của Staphylococcus aureus và cơ chế tác động của chúng
Người ta đã tìm ra ít nhất 7 enterotoxin tiết ra bởi Staphylococcus aureus là A, B,
C1, C2, C3, D, E1 et TSST-1.
™ Enterotoxin B
Có khả năng gây ra ngộ độc thực phẩm.
Độc tố này vẫn giữ nguyên độc tố sau khi đun sôi 30 phút và nó kháng lại các
enzyme ở dạ dày và ruột non.

Độc tố này tác động trực tiếp lên các thụ thể thần kinh của hệ dạ dày ruột dẫn đến
kích thích lên trung ương thần kinh gây ra nôn mữa và tiêu chảy.
Độc tố này tồn tại tốt trong các sản phẩm làm từ sữa.
™ α- toxin
Cette toxine cause la lyse des érythrocytes, des leukocytes et des plaquettes.
Độc tố này gây ra sự phân hủy hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu.
Nó tác động bằng cách dính vào lớp vỏ kép phosphoglycerolipid của màng tế bào,
hình thành những lổ thủng xuyên màng làm cho những thành phần sống của tế bào
chảy ra ngoài làm chết tế bào và chết mô.
™ TSST-1 (độc tố gây sock):
Độc tố này có tác động khá giống với α- toxin nhưng độc hơn

Gây giãn các mạch máu dẫn đến làm hạ áp lực máu trong các cơ quan
25