ĐẶC TÍNH KHÁNG nấm DIAPORTHE PHASEOLORUMVÀ LASIODIPLODIA THEOBROMAECỦA PHENOLIC CHIẾT XUẤT từ lá tía tô

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
---------------------------&---------------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐẶC TÍNH KHÁNG NẤM DIAPORTHE
PHASEOLORUMVÀ LASIODIPLODIA
THEOBROMAECỦA PHENOLIC CHIẾT XUẤT TỪ LÁ
TÍA TÔ
Người thực hiện: Đỗ Thị Thủy
Mã SV: 581185
Khóa

: 58

Ngành

: Công nghệ Sau thu hoạch

Người hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Thu Nga
Địa điểm thực tập: Khoa Công Nghệ Thực Phẩm - HVNNVN

Hà Nội - Năm 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
trung thực.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ trong khóa luận này đã được cảm ơn và
các thông tin được trích dẫn trong khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 16 tháng 12 năm 2016
Tác giả khóa luận

Đỗ Thị Thủy

1


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sau thu hoạch và
Bộ môn Quản lý Chất lượng và An toàn thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của ThS.Nguyễn Thị Thu Nga (Bộ môn
Công nghệ Sau thu hoạch, khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt
Nam).
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã
nhận được sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Nguyễn Thị Thu Nga đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Khoa Công
nghệ Thực phẩm đã dạy dỗ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè những
người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận
tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày 16 tháng 12năm 2016
Tác giả khóa luận

Đỗ Thị Thủy

2

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................... ii
MỤC LỤC.......................................................................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG.......................................................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH.......................................................................................................................................vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...............................................................................................................viii

I.ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................1

1.1. Tính cấp thiết của đề tài..........................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài...............................................................2
1.2.1. Mục đích..........................................................................................2
1.2.2.Yêu cầu.............................................................................................2
II. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU......................................3

2.1. Tổng quan về lá tía tô.............................................................................3
2.1.1. Giới thiệu chung về cây tía tô..........................................................3
2.1.2. Đặc điểm thực vật............................................................................4
2.1.3. Thành phần hóa học của tía tô.........................................................4
2.1.4. Phân bố và sinh thái của cây tía tô..................................................4
2.2. Giới thiệu về hợp chất phenolic..............................................................5
2.2.1. Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật..................................5
2.2.2. Phân loại các hợp chất phenolic......................................................6
2.2.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic...............................11
2.2.4. Các nghiên cứu liên quan..............................................................12
2.3.Tổng quan về nấm gây hại.....................................................................13
2.3.1. Diaporthe phaseolorum.................................................................13

2.3.2. Lasiodiplodia theobromae.............................................................13

3


III. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN
CỨU...........................................................................................................14

3.1. Đối tượng, vật liệu, phạm vi nghiên cứu..............................................14
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................14
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu........................................................................14
3.1.3. Phạm vi nghiên cứu.......................................................................14
3.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................14
3.3. Phương pháp nghiên cứu......................................................................15
3.3.1. Phương pháp vô trùng...................................................................15
3.3.2. Phương pháp điều chế môi trường nuôi cấy, giữ giống nấm.........15
3.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống nấm.....................................16
3.3.4. Phương pháp chiếtxuất phenolic từ lá tía tô..................................16
3.3.5. Bố trí thí nghiệm............................................................................16
3.3.5.1. Đánh giá khả năng kháng nấm Diaporthe phaseolorum và
Lasiodiplodia theobromae của hoạt chất phenolic chiết xuất từ lá tía tô
.............................................................................................................16
3.3.5.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết phenolic
chiết xuất từ lá tía tô đối với đối với nấm Diaporthe phaseolorum và
Lasiodiplodia theobromae trong điều kiện in vitro.............................17
3.3.6. Phương pháp phân tích..................................................................19
3.3.6.1. Phương pháp xác định hàm lượng chất khô bằng phương pháp
sấy đến khối lượng không đổi.............................................................19
3.3.6.2. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số..........19
3.3.6.3. Xác định hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp cấy chấm

điểm.....................................................................................................20
3.3.6.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng phương pháp pha
loãng thạch...........................................................................................21
3.4. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................21
IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................22

4


4.1. Đánh giá khả năng kháng nấm Diaporthe phaseolorum,Lasiodiplodia
theobromae của dịch chiết phenolic từ lá tía tô...........................................22
4.1.1. Khả năng kháng nấm Diaporthe phaseolorum..............................23
4.1.2. Khả năng kháng nấm Lasiodiplodia theobromae..........................24
4.2. Nồng độ ức chế tối thiểu nấm Diaporthe phaseolorum và
Lasiodiplodia theobromae của dịch chiết phenolic từ tía tô trong điều kiện
in vitro..........................................................................................................27
4.2.1. Nồng độ ức chế tối thiểu nấm Diaporthe phaseolorum của
phenolic từ lá tía tô..................................................................................27
4.2.2. Nồng độ ức chế tối thiểu nấm Lasiodiplodia theobromae của
phenolic từ lá tía tô..................................................................................29
V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................................................32

PHỤ LỤC.................................................................................................................... 35

5


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên......................................................6

Bảng 2.2. Hiệu quả kháng nấm của hợp chất phenolic....................................................12
Bảng 3.1.Bố trí thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng nấm của dịch chiết phenolic từ lá tía
tô...................................................................................................................................... 17
Bảng 3.2.Bố trí thí nghiệm xác định MICs của dịch chiết phenolic từ lá tía tô của dịch
chiết phenolic từ lá tía tô.................................................................................................18
Bảng 4.1. Hoạt tính kháng nấm D.phaseolorum của dịch chiết phenolic từ tía tô............24
Bảng 4.2.Hoạt tính kháng nấm L.theobromae của dịch chiết phenolic từ tía tô..............25
Bảng 4.3.Sự phát triển của nấm D. phaseolorum tại các nồng độ MICs của dịch chiết
phenolic từ tía tô.............................................................................................................. 28
Bảng 4.4.Sự phát triển của nấm L.theobromaetại các nồng độ MICs của dịch chiết
phenolic từ tía tô..............................................................................................................29

6


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc minh họa của stilben và lignan.............................................................8
Hình 1.2: Cấu trúc minh họa của flavonoid, axit phenolic và tannin..................................9
Hình 4.1.Đường chuẩn acid gallic.....................................................................................22
Hình 4.2. Khả năng kháng nấm D.phaseolorumcủa dịch chiết phenolic từ lá tía tô.........23
Hình 4.3.Khả năng kháng nấm L.theobromae của dịch chiết phenolic từ tía tô...............24
Hình 4.4.Sự phát triển của nấmD.phaseolorum tại các nồng độ MICs của dịch chiết
phenolic từ tía tô..............................................................................................................27
Hình 4.4.Sự phát triển của nấm L.theobromaetại các nồng độ MICs của dịch chiết
phenolic từ tía tô..............................................................................................................29

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt
ĐC
CT

L. theobromae
D. phaseolorum
MICs

Ý nghĩa
Đối chứng
Công thức
Lasiodiplodia theobromae
Diaporthe phaseolorum
Nồng độ ức chế tối thiểu

7


PGA

Potato Glucose Agar

8


I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Do đời sống của con người càng ngày càng được cải thiện, nhu cầu của con người
cũng theo đó ngày càng cao hơn từ đó đòi hỏi các mặt hàng nông sản, thực phẩm không
chỉ tăng về mặt số lượng mà còn phải đảm bảo về mặt chất lượng.Tuy nhiên, với điều
kiện khí hậu nước ta, nông sản sau khi thu hoạch rất dễ bị tổn thương. Sự tổn thương đó
là do các hoạt động sinh lý, hóa sinh của nông sản và do các hoạt động hết sức mạnh mẽ
của các vi sinh vật có hại.Trong đó, tổn thất do nấm mốc gây nên chiếm một phần đáng
kể. Nấm mốc phát triển trên nông sản làm cho sản phẩm nông nghiệp biến đổi màu sắc,

mùi vị, giảm chất lượngdinh dưỡng và tạo điều kiện cho nhiều loại vi sinh vật khác phát
triển gây hư hại [16]. Cho đến nay, khoa học đã phát hiện được khoảng 50 loài nấm mốc
và 100 loại độc tố do nấm mốc sinh ra, trong đó có khoảng 20 loài độc tố có thể gây nguy
hiểm cho người và động vật khi sử dụng nông sản bị nấm mốc gây hại [16].
Trong những năm gần đây, nhiều biện pháp vật lý, hóa học và sinh học đã được
nghiên cứu để phòng chống nấm mốc và độc tố của chúng. Trong đó, biện pháp xử lý
bằng hóa chất khá là phổ biến vì mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng nhưng nếu dùng
vượt mức quy định có thể gây ngộ độc, ung thư, và có thể dẫn đến tử vong cho người sử
dụng [17]. Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng các hoạt chất sinh học có khả năng kháng
nấm, thân thiện với môi trường, không ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng đang rất
được quan tâm. Một số công trình nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra một số hợp chất có
khả năng kháng nấm có nguồn gốc tự nhiên như phenolic, glycosides,isothiocyanates...
[18]. Hoạt chất phenolic ngoài khả năng kháng vi sinh vật còn mang lại rất nhiều lợi ích
cho sức khỏe con người như chống oxi hóa, kháng viêm, chống ung thư [10]. Phenolic đã
được sử dụng trong công nghệ thựcphẩm, mỹ phẩm, y học [27], tuy nhiên việc nghiên
cứu ứng dụng phenolic trong bảo quản nông sản khỏi sự gây hại của vi sinh vật lại chưa
được quan tâm.

1


Việt Nam có hệ thực vật phong phú, giàu hoạt chất phenolic như lá chè, lá vối, lá ổi,
tía tô,... [19]. Trong đó, tía tô không chỉ là một cây gia vị mà còn là một cây thuốc có
nhiều công dụng như giải độc, giải nhiệt, giảm ho, trừ đờm,... đặc biệt là tất cả bộ phận
của cây tía tô đều là thuốc. Nước cất và nước sắc của tía tô có phổ kháng khuẩn rộng, có
tác dụng ức chế với trực khuẩn ruột kết, trực khuẩn lỵ, tụ cầu khuẩn, một số nấm gây
bệnh ngoài da và virut ECHO11. Cành và lá tía tô có khả năng xúc tiến quá trình phân
tiết dịch tiêu hóa, tăng cường nhu động dạ dày, ruột, chống đột biến, dầu lá tía tô có khả
năng chống ung thư,... [20]. Tuy nhiên, chưa có các nghiên cứu công bố về khả năng
kháng nấm của loại thực vật này. Xuất phất từ nhu cầu thực tiễn, được sự đồng ý của

khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của
ThS. Nguyễn Thị Thu Nga đề tài “Đánh giá đặc tính kháng nấm Diaporthe
phaseolorum và Lasiodiplodia theobromaecủa phenolic chiết xuất từ lá tía tô” được
thực hiện.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
1.2.1. Mục đích
Đánh giá được khả năng kháng nấm Diaporthe phaseolorum và Lasiodiplodia
theobromae của hợp chất phenolic chiết xuất từ lá tía tô, đồng thời xác định nồng độ ức
chế tối thiểu của của hoạt chất trong điều kiện in vitro đối với nấm gây hại thử nghiệm, từ
đó tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng hoạt chất phenolic trong bảo quản nông sản Việt
Nam.
1.2.2.Yêu cầu
Xác định được hoạt tính kháng nấm Diaporthe phaseolorum và Lasiodiplodia
theobromae của hoạt chất phenolic chiết xuất từ lá tía tô.
Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết phenolic chiết xuất từ lá tía tô
đối với đối với nấmDiaporthe phaseolorum và Lasiodiplodia theobromaetrong điều
kiệnin vitro.

2


II. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về lá tía tô
2.1.1. Giới thiệu chung về cây tía tô
Tía tô có tên khoa học là Perilla frutescens (L.) Britton, giới Plantae, lớp
Magnoliopsida, bộ hoa môi(Lamiales), họ bạc hà (Lamiaceae), chi Perilla [22, 27]. Do
đặcđiểm hình thái rất đa dạng nên việc phân loại các giống tía tô vẫn còn được bàn luận
mà chưa đi đến thống nhất. Theo màu sắc lá, tía tô có 2 giống: lá xanh và lá tím. Dựa trên
mục đích sử dụng, tía tô được chia thành hai giống chính: Perilla frutescens var. crispa
và Perilla frutescens var. frutescens. Perilla frutescens var. crispathường trồng làm

thuốc, cất tinh dầu hoặc làm rau gia vị. Trong thành phần tinh dầu của giống này có chứa
hàm lượng lớn perilla andehyde (PA) – chất tạo hương thơm của cây. Giống này được
trồng rộng rãi ở Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam hay Mỹ... Mỗi quốc gia, vùng miền lại
có cách gọi khác nhau, trong tiếng Nhật giống này được gọi là “Shiso”, ở Mỹ gọi là
“beefsteak plant”. Perilla frutescens var. frutescens với đặc điểm là hạt lớn có hàm lượng
dầu cao, thường được trồng để sản xuất dầu hạt. Tinh dầu của giống này thường không
chứa PA. Lá có mùi hương gần giống lá vừng, thường được trồng và sử dụng phổ biến ở
Hàn Quốc. Ở Nhật, giống tía tô này được gọi là "egoma” [16].
Ở Việt Nam, cây tía tô còn được gọi là cây tử tô, tử tô tử hay tô ngạnh, hom tô
(tiếng Thái), phằn cưa (tiếng Tày). Theo nghiên cứu, tía tô được chia thành hai giống dựa
trên đặc điểm hình thái. Một giống tía tô có mép lá phẳng, mặt trên màu xanh, mặt dưới
màu tím đỏ, thân có sọc đỏ, hoa đỏ và có mùi thơm nhẹ. Giống thứ hai có mép lá quăn,
màu tím đậm hơn ở cả hai mặt lá và có mùi thơm mạnh hơn. Tía tô được ghi nhận lần đầu
tiên trong thư tịch cổ của Trung Quốc vào thế kỷ thứ V-VI, có nguồn gốc từ vùng núi Ấn
Độ và Trung Quốc. Loài thực vật này phân bố dọc theo dãy Hymalaya của Ấn Độ,
Bhutan, Pakistan và Nepal, phía bắc Đông Nam Á như Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt
Nam, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Đài Loan [27].

3


Từ thời cổ đại, tía tô được sử dụng như một loại rau ở Trung Quốc, làm gia vị hay
bày trên đĩa các món ăn của người Nhật Bản, còn người Hàn quốc lại ưa dùng tía tô trong
các món thịt quay, hạt làm gia vị cho các món súp. Theo nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ
ra rằng tía tô là loài cây có triển vọng vừa dùng làm thuốc, vừa làm gia vị, vừa làm cây
trang trí, nó làm tăng tính đa dạng và phong phú nguồn tài nguyên của loài [20, 27].
2.1.2. Đặc điểm thực vật
- Thân và lá: Tía tô là một loại cỏ mọc hàng năm, cao từ 0,5 – 1 m. Thân vuông, mọc
đứng, phân nhánh có màu tím nâu hoặc tím sẫm. Lá mọc đối hình trứng, đầu nhọn có
răng cưa ở mép lá, mặt trên xanh lục, mặt dưới có màu tía, nâu hay xanh lục. Các lá mọc

đối nhau, cuống lá dài. Khi vò ra có mùi thơm đặc biệt [27].
- Hoa: Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc ở đầu cành, dài 6 – 20 cm, hoa nhỏ màu trắng hay tím,
đài hình chuông [27].
- Quả và hạt: Mùa có quả là từ tháng 7- 10 và quả chín có màu hơi xám, chứa từ 1- 4 hạt
nhỏ. Hạt có hình trứng hoặc tựa hình trứng, có đường kính từ 0,6 - 2 mm, có màu hơi
xám đến màu nâu hơi đen. Vỏ hạt có các đường gân hình mạng lưới [27].
2.1.3. Thành phần hóa học của tía tô
Tía tô chứa 0,3-0,5% tinh dầu (theo trọng lượng khô), citral 20%. Thành phần tinh
dầu chủ yếu là perillaldehyd, L-perrilla alcohol, limonen, α-pinen, hydrocumin, còn có
elsholtziaceton, β-cargophylen, bergamoten và linalool perillaldehyd[27].
Hạt tía tô có thành phần hóa học bao gồm:nước 6,3%, protein 23,12%, dầu béo
45,07%, N 10,28%, tro 4,64%, acid nicotinic 3,98 mg/100 g. Thành phần dầu béo của hạt
gồm acid béo chưa no 3,5-7,6%, oleic 3,9-13,8%, linoleic 33,6-59,4%, acid linolenic 23,3
– 49% (một số mẫu dầu còn chứa trên 70% acid linolenic) [27].
2.1.4. Phân bố và sinh thái của cây tía tô
Chi Perilla L. có một loài ở châu Á. Nguồn gốc có thể từ vùng núi của Ấn Độ và
Trung Quốc, sau đó được nhân trồng khắp nơi ở châu lục. Cây cũng được trồng ở vùng
có khí hậu ôn hòa của Châu Âu. Ở Mỹ và Ukrain còn thấy cây mọc hoang dại [27].

4


Tía tô là cây ưa sáng và ưa ẩm, thích nghi với những vùng khí hậu ôn hòa, nhiệt
độ trung bình năm từ 18-230C. Ở những vùng có khí hậu nhiệt đới điển hình như các tỉnh
phía nam, cây chỉ trồng được vào mùa mưa. Tía tô ra hoa kết quả nhiều. Sau khi quả già,
cây tàn lụi, hạt giống phát tán ra xung quanh, đến mùa mưa ẩm năm sau mới nảy mầm. Ở
Việt Nam, người ta trồng tía tô ở khắp nơi và gần như quanh năm. Mỗi hecta cần 20-30
kg hạt giống và thời kỳ gieo hạt tốt nhất vào tháng 1-2 dương lịch. Thông thường mỗi cây
chỉ hái 2-3 lần lá. Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà có cách gieo trồng, thu hoạch khác
nhau [23]. Tuy nhiên, do nhu cầu sử dụng rau gia vị nhiều nên ở vùng ngoại thành Hà

Nội người ta có thể trồng tía tô quanh năm.
2.2. Giới thiệu về hợp chất phenolic
2.2.1. Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật
Phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm với một hoặc nhiềunhóm
hydroxy. Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật và là các sản phẩm trao
đổichất phong phú của thực vật. Hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã được tìm thấy, từ các
phân tử đơngiản như các axit phenolic đến các chất polyme như tannin.Các hợp chất
phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngăn chặncác tác nhân
gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt, cũng như làm tăng các màu sắccủa thực vật.
Chúng có ở khắp các bộ phận của cây và vì vậy, chúng cũng là một phần khôngthể thiếu
trong chế độ ăn uống của con người [10].
Phenolic là thành phần phổ biến trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật như trái
cây, rau, ngũ cốc, ô liu, các loại đậu, sô-cô-la,... hay như trà, cà phê, bia, rượu,..., và góp
phần tạo nên các đặc tính cảm quan chung của thực vật. Ví dụ, các hợp chất phenolic làm
tăng vị đắng, sự se của trái cây và nước trái cây, bởi vì sự tương tác giữa các hợp chất
phenolic, chủ yếu là các procyanidin và glycoprotein trong nước bọt. Các anthocyanin,
một trong sáu phân nhóm của phenolic, tạo màu da cam, đỏ, xanh và màu tím của nhiều
loại trái cây và rau quả như táo, quả, củ cải và hành tây. Các hợp chất phenolic được biết
đến như là những hợp chất quan trọng nhất ảnh hưởng đến hương vị và sự khác biệt

5


màu sắc giữa các loại rượu vang trắng, hồng và đỏ, các hợp chất này phản ứng với oxy và
có ảnh hưởng đến việc bảo quản, lên men và cất giữu rượu vang [10].
2.2.2. Phân loại các hợp chất phenolic
Các hợp chất phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể được chia thành 10 nhóm
chính. Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên được trình bày trong bảng 1.1 [10]:
Bảng 1.1. Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên

6


7


(Nguồn: Dai và Mumper, 2010)

Các hợp chất phenolic thực vật bao gồm các stilben, các lignan (Hình 1.1), các axit
phenolic, các flavonoid và các tannin (Hình 1.2) [10]:

Hình 1.1: Cấu trúc minh họa của stilben và lignan

8


Hình 1.2: Cấu trúc minh họa của flavonoid, axit phenolic và tannin
Các flavonoid là các polyphenol có nhiều nhất trong thức ăn của chúng ta. Một

9


cấu trúc flavonoid cơ bản là nhân flavan, chứa 15 nguyên tử cacbon được sắp xếp theo ba
vòng (C6-C3-C6), được kí hiệu là A, B và C. Các flavonoid được chia thành sáu phân
nhóm: flavon, flavonol, flavanol, falavanon, isoflavon và anthocyanin theo trạng thái oxy
hóa của vòng C trungtâm. Sự thay đổi cấu trúc của chúng trong mỗi nhóm một phần là do
mức độ và mô hình hydroxyl hóa, methoxyl hóa, prenyl hóa, hoặc glycosyl hóa [10,11].
Một số chất flavonoid phổ biến nhất bao gồm quercetin, một flavonol có rất nhiều
trong hành tây, bông cải xanh, táo; catechin, một flavonol được tìm thấy trong trà và một
số loại trái cây; naringenin, một flavonol có trong quả bưởi; các cyaniding glycoside,

anthocyanin có nhiều trong các loại trái cây mọng (nho đen, mâm xôi, blackberry, …) và
daidzein, genistein và glycitein, các isoflavon trong đậu tương [11].
Các axit phenolic có thể được chia thành hai nhóm: nhóm các dẫn xuất của axit
benzoic chẳng hạn như axit gallic và nhóm các dẫn xuất của axit cinnamic như axit
coumaric, axit caffeic và axit ferulic. Axit caffeic là một axit phenolic phổ biến nhất,
chứa trong nhiều loại trái cây và rau quả, thường được este hóa với axit quinic trong
axit chlorogenic, là một hợp chất phenolic chủ yếu trong cà phê. Một axit phenolic phổ
biến khác là axit ferulic, đây là chất có trong ngũ cốc và được este hóa tạo thành các
hemicelluose có trong thành tếbào [11].
Các tannin là một nhóm lớn các polyphenol có trong khẩu phần ăn của chúng ta
và thường được chia thành hai nhóm: nhóm các tannin thủy phân và nhóm các tannin
ngưng tụ. Các tannin thủy phân là các hợp chất có chứa nhân của glucose hoặc polyol
khác, được este hóa với axit galic tạo thành các gallotannin, hoặc với axit
hexahydroxydiphenic tạo thành các gellagitannin. Sự đa dạng trong cấu trúc của các
hợp chất này là do khả năng hình thành các liên kết oxy. Phản ứng oxy hóa giữa các
phân tử tạo thành nhiều hợp chất oligomeric có khối lượng phân tử khoảng 2.000 đến
5.000 dalton.Các tannin ngưng tụ là các oligome hoặc polymer của flavan-3-ol liên kết
với nhau bằng một liên kết cacbon giữa các flavan. Chúng cũng được coi là các
proanthocyanidin bởi vì chúng bị phân hủy thành các anthocyanidin thông qua phản
ứng oxy hóa, trong điều kiện xúc tác axit, nhiệt độ với các dung dịch rượu. Sự đa dạng
cấu trúc các tannin là một kết quả của sự biến đổi trong mô hình thủy phân, lập thể tại

10


ba trung tâm lập thể, vị trí và loại liên kết giữa các flavan, cũng như mức độ và mô
hình của sự glycosyl hóa, methoxyl hóa và galloylhóa [11].
2.2.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic
Do polyphenol có vai trò đối với sức khỏe của con người nên chếđộ ăn uống dinh
dưỡng có polyphenol được chú ý trong những năm gần đây. Theo các nghiên cứu dịch tễ

học, hấp thụ các hợp chất phenolic sẽ giảm được nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, ngăn
ngừa được bệnh ung thư. Hơn nữa các polyphenol còn có các tác dụng sinh lý học cụ thể
trong việc ngăn ngừa và điều trịbệnhnhư ung thư, chống viêm, chống lão hóa,... [10].
Các catechin được tìm thấy nhiều trong hạt nho, trà, ca cao, có tác dụng chống
oxy hóa và có hiệu quả ngăn ngừa ung thư [12].
Các tannin có nhiều trong rượu vang đỏ, trà và các loại hạt làm phát huy các tác
dụng sinh lý, chúng có thể làm giảm áp lực máu, thúc đẩy đông máu, giảm nồng độ lipit
trong huyết thanh, điều chỉnh sự đáp ứng miễn dịch và ngăn ngừa hoại tử gan [11,12].
Các isoflavon, genistein và daidzein (được tìm thấy trong đậu nành) có ảnh hưởng
tốt đến xương ở phụ nữ mãn kinh, cùng với một số tác dụng nội tiết tốt [12].
Các procyanidin có nồng độ cao trong rượu vang đỏ, nho và hạt nho, ca cao, việt
quất, táo, có tác dụng chống viêm và có ảnh hưởng rất tốt đến hệ thống mạch máu.Chất
này cũng được sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm để ngăn chặn quá trình oxy hóa của
các thành phần trong thực phẩm[12].
Stilben resveratrol là một polyphenol đặc biệt, có tiềm năng chống ung thư và
chống lão hóa [12].
Các quercetin (đại diện chính của lớp flavonol, chứa nhiều trong hành tây, táo,
rượu vang đỏ, bông cải xanh, trà) ức chế chất sinh ung thư và có tác dụng chống oxy
hóa của huyết tương trong cơ thể [12].

11


2.2.4. Các nghiên cứu liên quan
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm của hợp chất
phenolic trong thực vật. Các nhà khoa học ở Đại học Nam Kinh (Trung Quốc) đã nghiên
cứu tính kháng nấm của hợp chất phenolic được chiết từ lá artichoke Jerusalem và thực
hiện việc kháng các loại nấm: Botrytis cinema, Coletotrichum gloeosporioides,
Phytophthora capsici, Zhizoctonia cerealis với các nồng độ: 1,25; 2,5; 5; 10 gL -1 đã cho
hiệu quả kháng nấm từ 71,3 – 77,8% [13].

Các nhà khoa học Ấn Độ đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm từ một số chất của
hợp chất phenolic và kết quả được trình bày trong bảng 2.5[14]
Bảng 2.2. Hiệu quả kháng nấm của hợp chất phenolic
T

Nấm

Bệnh

Hợp chất tự

T
1 Candida albicans

Khả năng hoạt động

nhiên
Candidasis

Bisbibenzyl,

Ức chế sự biến đổi hình

Carvacrol

thái

Curcumin,
2 Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis

Thymol
Benzaldehyde

Kết hợp cùng với

Benzoic acid

nấm

diệt

Thymol, 2-5
3 Rhyzopus sp

Zygomycosis

dihydroxy
Thymol

Phá vỡ tính chất lưu
động bởi tương tác với

4 Aspegillus sp

Aspegillosis

Carvacrol,

một hợp chất kết tinh
Phá hủy trạng thái lỏng

Eugenol,

của màng tế bào và ức

Thymol

chế sự tăng trưởng của
các sợi nấm

Từ việc nghiên cứu các dẫn chứng về khả năng kháng nấm của các loại thực vật có
chứa các hợp chất phenolic kết hợp với các dẫn chứng về khả năng kháng nấm của bột
chiết phenolic cụ thể có thể nhận thấy các hợp chất phenolic đóng vao trò như một chất

12


diệt nấm, diệt trừ được rất nhiều loài nấm gây hại trên thực vật. Ta có thể nhận thấy rõ
được khả năng của các hợp chất phenolic trong việc phòng trừ nấm mốc trên nông sản
góp phần vào việc bảo quản nông sản tốt hơn.
2.3.Tổng quan về nấm gây hại
2.3.1. Diaporthe phaseolorum
Diaporthe phaseolorum thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớpSordariomycetes, lớp
phụ Sordariomycetidae, bộ Diaporthales, họ Diaporthaceae và chi Diaporthe [28].
Sợi nấm Diaporthe phaseolorum khi còn non có màu trắng trong, sau đó chuyển
dần sang màu đen, nấm mọc bông và phát triển mạnh. Sau hơn 15 ngày sinh trưởng, sợi
nấm lụi dần và làm đen toàn bộ môi trường thạch nuôi cấy.Sợi nấm phân nhánh, có vách
ngăn và không sinh bào tử [28].

Diaporthe phaseolorumgây hiện tượng thối nâu trên vải.Vết bệnh của vải bị thối nâu khi
loen rộng gây chảy dịch, gây nâu bên trong và bên ngoài vỏ vải, phần cùi vải có màu
trắng đục khô, có mùi chua [28].
2.3.2. Lasiodiplodia theobromae
Lasiodiplodiatheobromae

thuộc

giới

Fungi,

ngành

Ascomycota,

lớp

Dothideomycetes, lớp phụ Incertae sedis, bộ Botryosphaeriales, họ Botryosphaeriaceae
và chi Lasiodiplodia [26].
Lasiodiplodiatheobromae là một mầm bệnh với rất nhiều máy chủ nhiều. Nó gây
thối rữa và chết mầm nonở hầu hết các loài nó lây nhiễm.Lasiodiplodiatheobromae gây
nên bệnh thối cuống, một bệnh nấm sau thu hoạch chung của cam quýt. Nó là một trong
những nguyên nhân gây ra bệnh thối mục bot của nho và nó cũng gây bệnh trên tô mộc,
một loài cây có hoa còn được gọi là Sappanwood[26].

13


III. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng, vật liệu, phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
-Phenolic chiết xuất từ lá tía tô
- Nấm Diaporthe phaseolorum, Lasiodiplodia theobromaeđược cung cấp bởi
Trung tâm bệnh cây nhiệt đới
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- Hóa chất: glucose, agar, cồn 70o...
- Dụng cụ: đĩa petri, bình tam giác, bình định mức, đũa thủy tinh, pipet, buret, ống
fancol 50ml, que cấy, kéo, dao, băng dính, cuvet,...
- Thiết bị: tủ sấy, tủ cấy vô trùng, nồi thanh trùng, bếp điện, cân phân tích, máy đo
màu,..
- Môi trường vi sinh vật: môi trường nuôi cấy, giữ giống nấm Potato Glucose Agar
(PGA): khoai tây 200g, glucose 20g, agar 20g, nước cất 1000ml.
3.1.3. Phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm: Bộ môn Công nghệ sau thu hoạch, khoa Công nghệ thực phẩm, Học
Viện Nông Nghiệp Việt Nam
- Thời gian: tháng 9/2016 - tháng 12/2016
- Giới hạn nội dung nghiên cứu : Xác định đặc tính kháng nấm của hợp chất
phenolic chiết xuất từ lá tía tô trong phòng thí nghiệm.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng đối kháng của hợp chất phenolic chiết xuất từ lá tía tô với một
số loài nấm gây hại trên nông sản thực phẩm.
- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của hợp chất phenolic đối với từng loại nấm
trong điều kiện in vitro

14


3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp vô trùng

Môi trường dinh dưỡng, nước và các dụng cụ cần thiết được tiệt trùng bằng
cách đun nóng hơi nước dưới một áp lực trong nồi hấp. Nồi hấp được bịt kín bằng một vỏ
dày, có ống dẫn để thoát hơi nước, không khí và có áp lực kế để đo áp suất. Ngoài ra nồi
hấp còn có van bảo hiểm để điều hòa áp lực của hơi trong vỏ nồi. Khi hấp, đáy nồi đổ đầy
nước, sau đó xếp dụng cụ hấp vào, đậy kín nắp nồi lại rồi cắm điện. Lúc này, van thoát
hơi cần phải mở cho tới khi nước trong nồi chuyển thành hơi (nhiệt kế chỉ 100 oC). Sau
đó đóng van lại, tiếp tục đun cho tới khi nhiệt kế chỉ 121 oC, giữ nhiệt độ đó trong vòng
15 phút. Khi đã hấp đủ thời gian, ngắt nguồn điện, xả từ từ van thoát hơi, chờ tới khi
nhiệt độ nồi hấp giảm xuống còn khoảng 60oC thì mở nồi hấp và lấy dụng cụ bên trong
ra. Phơi dụng cụ vừa hấp trong buồng cấy vô trùng, bật tia UV.
Dụng cụ que cấy được khử trùng bằng cồn, đốt trên ngọn lửa đèn cồn cho tới khi
đầu que đỏ, để nguội trong bán kính 10cm quanh ngọn lửa đèn cồn sau đó mới sử dụng.
Giữ không gian làm việc luôn sạch sẽ, khử trùng bằng cồn 70%, công việc quan
trọng cần thực hiện trong buồng cấy đã khử trùng bằng tia UV và cồn 70%.
3.3.2. Phương pháp điều chế môi trường nuôi cấy, giữ giống nấm
Môi trường nuôi cấy, giữ giống nấm Potato Glucose Agar (PGA) gồm: khoai tây
200g, đường glucose 20g, agar 20g, nước cất 1000ml.
Cách nấu môi trường PGA: chuẩn bị và vệ sinh dụng cụ sạch sẽ, cân đủ các thành
phần rồi đổ đường và agar vào bình. Khoai tây rửa sạch không cần bỏ vỏ, thái nhỏ cho
vào nồi đun nhỏ lửa trong vòng 20 phút rồi dần dần cho sôi để khoai tây không bị vỡ ra.
Lọc lấy dịch khoai tây bằng vải mềm, rồi đổ vào bình, lắc để hòa tan dung dịch. Quay
trong lò vi sóng tới khi dung dịch đồng nhất. Hấp vô trùng môi trường bằng nồi hấp
chuyên dụng ở 121 oC trong 15 phút.

15


3.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống nấm
Sau khi tiếp nhận, các mẫu giống nấm được cấy truyền vào môi trường thạch
nghiêng và nuôi cấy ở tủ ấm 280C trong vòng 3 ngày rồi đem bảo quản lạnh để giữ giống.

Giống được cấy truyền hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống.
3.3.4. Phương pháp chiếtxuất phenolic từ lá tía tô
Nguyên liệu lá tía tô tươi được thu hái tại huyện Long Biên-Hà Nội. Nguyên liệu
được thái nhỏ rồi đem sấy ở điều kiện 35 0C đến khối lượng không đổi. Sau đó nguyên
liệu lá tía tô được nghiền nhỏ và rây để thu được lá tía tô khô có kích thước nguyên liệu
là 0,5-1 mm. Phenolic trong nguyên liệu tía tô khô được chiết xuất bằng dung môi
ethanol 70% với tỷ lệ nguyên liệu và dung môi 0,1 g/ml, ở nhiệt độ 36 oC trong thời gian
60 phút. Dung dịch chiết được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút ở nhiệt độ 4 oC trong
thời gian 10 phút. Dịch chiết thô phenolic được bảo quản ở nhiệt độ 4 oCtrong khi chờ tiến
hành thử nghiệm kháng nấm.
3.3.5. Bố trí thí nghiệm
3.3.5.1. Đánh giá khả năng kháng nấm Diaporthe phaseolorum và Lasiodiplodia
theobromae của hoạt chất phenolic chiết xuất từ lá tía tô
Hoạt tính kháng nấm được thực hiện dựa vào phương pháp cấy chấm điểm. Nấm
bệnh được cấy chấm điểm trên môi trường PGAcó chứa sẵn các chất thử nghiệm. Sau
một thời gian nhất định, quan sát đường kính tơ nấm mọc lan ra, xác định được hoạt tính
kháng nấm của các dịch chiết.
Tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch phenolic: Hòa tan phenolic chiết xuất từ lá tía tô với nước cất
đã được hấp khử trùngtheo các nồng độ khác nhau.
Chuẩn bị môi trường: Cân các thành phần của môi trường PGA, trộn đều với nhau,
đun sôi để tan hết agar, sau đó tiến hành hấp khử trùng ở 121 0Ctrong 15 phút.Để nhiệt độ
môi trường giảm xuống khoảng 45- 500C, hòa đều với dịch chiết phenolic chuẩn bị phía

16