Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (carica papaya linn) (tt)

1
ĐẶT VẤN ĐỀ

1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả được trồng ở các nước vùng
nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền
Nam. Lá đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh, có hoạt tính
kháng khuẩn tốt. Ngoài ra, lá đu đủ
còn có khả năng kháng viêm, giảm đau. Đã có
thông báo dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư
người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu. Ngoài ra, nước lá cây đu đủ còn
có tác dụng điều hòa miễn dịch. Tuy nhiên, những công bố đều chỉ sơ lược ở dạng dịch
chiết và chưa xác định được thành phần nào là hoạt chất. Vì v
ậy, việc chứng minh
được thành phần hoạt chất cụ thể của lá đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ
sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều
trị bệnh ung thư. Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của
một số hợp chấ
t chiết tách từ lá đu đủ (Carica papaya Linn”
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính sinh học và hợp chất mới
có trong lá đu đủ.
- Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập làm cơ sở khoa học chứng
minh cho việc người dân ở một số nước trên thế giới sử dụng lá đu đủ chữa tr
ị một số
loại bệnh trong đó có bệnh ung thư.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập một số hợp chất có trong lá đu đủ.
- Xác định cấu trúc của một số hợp chất phân lập được.
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết từ lá đu đủ.

- Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chấ
t phân lập được.
- Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine và
pseudocarpaine trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1.
- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ bằng các
phương pháp: loại bỏ gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), thử nghiệm
malonyl dialdehyd (MDA), chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan chuột phân lập.
- Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập từ lá đu
đủ.

2
- Đánh giá khả năng kích thích miễn dịch của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ.
4. Tính mới của đề tài
Phân lập và xác định cấu trúc của một hợp chất mới từ lá đu đủ (Carica papaya Linn)
được đặt tên là carpainone.
Đã xác định hoạt tính gây độc lên một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân
lập từ lá đu đủ, trong đó hợp chất carpaine và pseudocarpaine thể
hiện hoạt tính gây
độc tế bào ung thư rõ rệt.
Lần đầu tiên xác định được khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất
carpaine và pseudocarpaine trên tế bào ung thư phổi LU-1.
Đánh giá được khả năng chống oxy hóa, kháng vi khuẩn, kháng nấm và khả năng kích
thích miễn dịch của một số hợp chất phân lập từ lá đu đủ.
5. Bố cục của luận án
Luận án gồm 113 trang: Đặt vấn
đề (3 trang), chương 1: tổng quan (29 trang). Chương
2: vật liệu và phương pháp nghiên cứu (12 trang). Chương 3: kết quả và thảo luận (56
trang với 6 bảng và 54 hình). Kết luận và kiến nghị (2 trang). Danh mục các công trình
công bố (1 trang). Tài liệu tham khảo (10 trang gồm 20 tài liệu tiếng Việt, 86 tài liệu
tiếng Anh).

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây đu đủ
Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở các vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta có 1 chi và một loài. Một số giống đu đủ hiện nay đang
được trồng ở Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta, đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ
Trung Quốc, đu đủ Thái Lan, đu đủ
Đài Loan. Tại Hà Nội, chỉ có duy nhất giống đu
đủ Đài Loan được trồng ở các huyện: Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất,…
1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ
Trong lá đu đủ có các chất: tannin, alkaloid, saponin, glycosis, phytosterol, phenol,
flavonoid, steroid, terpenoid,…. Alkaloid có khung piperidin, chủ yếu là carpaine,
pseudocarpaine, dehydrocarpaine I, dehydrocarpaine II, choline, …. Ngoài ra còn có
vitamin C, E, nguyên tố khoáng Ca, K, Mg, Zn, Mn, Fe,
N
C
H
2
C
CH
2
C
C
HH
H
CH
3
(C H
2

)
7
O
C=O
N
C
C
CH
2
CH
2
C
HH
(C H
2
)
7
CH
3
H
H
C=O
O
N
C
H
2
C
CH
2

C
C
HCH
3
H
H(CH
2
)
7
O
C=O
N
C
C
CH
2
CH
2
C
HH
(C H
2
)
7
CH
3
H
H
C=O
O

Carpaine Pseudocarpaine
1.3. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ
Một số nhóm chất trong lá đu đủ có hoạt tính chống ung thư. Ví dụ: nhóm glucosise
bao gồm các chất benzyl glucosinolate, benzyl isothiocyanate có hoạt tính chống nhiều
dòng tế bào ung thư khác nhau. Nhóm các chất phenol bao gồm các chất: 5,7-
dimethoxy coumarin, axi protocatechui, axit ρ-coumaric, axit caffeic, kaempferol,
quercetin. Nhóm các chất này đã được chứng minh là có hoạt tính: ưc chế sự tăng sinh
tế bào, tăng cường chức năng miễn dịch, ức chế
enzyme ở pha I và II trong chu kỳ
phân bào, ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn, cảm ứng quá trình tự chết. Nhóm các
chất carotenoid các chất: β-carotene, lycopene, β-cryptoxanthin. Nhóm các chất này có
tác dụng phòng ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung
thư gan,…
Trong lá đu đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs). RIPs có khả năng gây độc tế
bào ung thư vú T47D với IC
50
= 2,8 μg/ml. Chất chiết bằng nước từ các phần khác
nhau của đu đủ có tác dụng ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc ức chế nhiều loại tế bào ung thư

4
như: dạ dày, phổi, tuyến tụy, gan, máu, lymphoma, bệnh bạch cầu, Dịch chiết lá đu đủ
bằng nước (nồng độ 0,625-20 µg/ml) có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư
khác nhau. Tác giả đã chứng minh dịch chiết từ lá đu đủ còn có tác dụng hỗ trợ hệ
miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản
phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-
γ và TNF-α, các cytokine
này có khả năng chống lại khối u. Sau đó tác giả sử dụng màng lọc để tách thành 2
phần có trọng lượng phân tử khác nhau. Các chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư và
điều hòa miễn dịch được xác định là nằm ở phần có trọng lượng phân tử nhỏ hơn

1000.
Chất chiết lá đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa. Các giống đu đủ khác nhau có tổng
hàm lượng phenol khác nhau và ho
ạt tính chống oxy hóa cũng khác nhau. Điều đó
chứng tỏ rằng các chất phenol gây ra hoạt tính chống oxy hoá. Các bộ phận khác nhau
của cây đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh →
quả chín → hạt. Tuy nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được
phân lập.
Dịch chiết lá đu đủ có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn và nấm. Cao lá
đu đủ có tác
dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T. rubrum và
Staphylococcus aureus. Ngoài ra, dịch chiết lá đu đủ còn có khả năng kháng viêm,
kháng virut sốt xuất huyết,….

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mẫu thực vật
Đu đủ Đài Loan (Carica papaya L.) được trồng tại Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội.
Thu hái lá trên cây đu đủ cái, dạng lá bánh tẻ, không bị sâu bệnh, không bị dập nát. Lá
thu hái vào tháng 10 năm 2012. Lá cây đu đủ Đài Loan thu hái về
được sấy ở nhiệt độ
40 – 50
0
C cho đến khô rồi nghiền thành bột.


5
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất: dùng phương pháp
chiết ngâm, chiết bằng sóng siêu âm để thu cặn chiết từ lá đu đủ. Sử dụng sắc ký cột,
sắc ký lớp mỏng để phân lập các chất tinh khiết. Sử dụng phổ hồng ngoại, phổ khối

lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chấ
t phân lập
được.
2.2.2. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.2.1. Phương pháp thử độ độc tế bào (cytotoxic assay): Phép thử tiến hành xác định
hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density)
đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B
(SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do
đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị
OD càng lớn. Phép
thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96
giếng để có nồng độ 100 g/ml; 20g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml.
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào, thêm lượng tế bào phù hợp và
để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.
- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư s
ẽ được sử
dụng làm đối chứng ngày 0.
- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO
2
, tế bào được cố định vào đáy giếng
bằng axit trichloracetic trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37
0
C.
- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám
và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng
máy ELISA Plate Reader để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua
phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm.
- Ellipticine luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương.
- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Chất th

ử nào có IC
50
< 20
g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC
50
 4 g/ml (với hoạt
chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự
phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.

6
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme caspase 3 / 7: Được thực hiện dựa
trên bộ kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay (Promega) theo đúng hướng
dẫn của nhà sản xuất.
2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng loại bỏ gốc tự do DPPH
Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để sàng
lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện
qua việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định bằng phép
đo độ hấp thụ ở
bước sóng 517 nm trên máy quang phổ.
2.2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm
malonyl dialdehyd (MDA test)
Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA
theo phương pháp của Stroev E A, Makarova V G (1989), Viện Dược liệu - Bộ Y Tế
(2006). Khi cho phản ứng với axit thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai
phân tử axit thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm.
Phả
n ứng thực hiện ở môi trường pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100
0
C trong vòng 10 - 15
phút. Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu.

2.2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro trên tế bào gan chuột
Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan. Tế bào gan sau
phân lập được nuôi ổn định 1-2 ngày. Thêm hoạt chất nghiên cứu hoặc cucurmin (đối
chứng dương). Thêm 100 µM H
2
O
2
vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ. Cho 50 µl/giếng
MTT nồng độ 1mg/ml, ủ trong 4 giờ. Loại bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi giếng 100 µl
DMSO 100%. Đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 492 nm.
2.2.2.6. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm
Hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa
nồng độ (Multimicrodilution assay).
2.2.2.7. Phương pháp thử hoạt tính kích thích miễn dịch
Động vật thí nghiệm: Thỏ
3 tháng tuổi khỏe mạnh, được nuôi tại chuồng nuôi
của viện Công nghệ sinh học.
Hoạt tính kích thích miễn dịch của các mẫu được xác định theo phương pháp
MTT (Mosmann (1983)).
Tế bào lympho được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2x10
6
tế
bào/ml. Bổ sung chất thử pha trong DMSO 10%. Concavalin A được sử dụng làm đối

7
chứng. Mẫu được ủ trong thời gian 48h ở 37
o
C, 5% CO
2
. Sau giai đoạn phát triển

trong tủ ấm CO
2
, thêm vào mỗi giếng 50µl MTT 1mg/ml. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37
o
C
trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO. Đĩa tế bào được
đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-
Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sóng 490nm.

8
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập cặn chiết phân đoạn CH
2
Cl
2

Từ 101,90 gam cặn chiết CH
2
Cl
2
, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi
CH
2
Cl
2
/MeOH gradient (bắt đầu từ 0% MeOH đến 50% MeOH). Cuối cùng dùng
dung môi MeOH 100% để dội cột nhằm rửa toàn bộ các chất còn bị giữ lại trên cột sắc
ký.
Sử dụng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra các phân đoạn, soi UV ở bước sóng 254
nm và 365 nm, hiện màu bản mỏng bằng thuốc thử Ce(SO

4
)
2
và vanilin. Kết quả, thu
được 13 phân đoạn chính như sau:
Bảng 3.1: Khối lượng các phân đoạn từ cặn chiết CH
2
Cl
2
của lá đu đủ (bảng 3.2 của
luận văn)
TT Kí hiệu phân đoạn Khối lượng (g)
1 F1 1,0530
2 F2 2,4254
3 F3 2,3174
4 F4 3,6284
5 F5 2,2090
6 F6 3,0837
7 F7 1,2896
8 F8 5,2600
9 F9 13,8602
10 F10 10,0700
11 F11 20,5137
12 F12 4,2901
13 F13 27,6800
3.2. Phân lập các hợp chất từ một số phân đoạn
Từ phân đoạn F5, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi CH
2
Cl
2

/MeOH
gradient, thu được 6 phân đoạn nhỏ kí hiệu F5.1-F5.6 Phân đoạn F5.2 được tinh chế
bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được chất sạch CP1 (139,6 mg).
Từ phân đoạn F8, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi Hx/EtOAc
gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ kí hiệu F8.1-F8.5 Phân đoạn F8.3 được tinh chế

9
bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel hệ dung môi Hx/EtOAc xuất
hiện tinh thể. Lọc rửa bằng Hx/CH
2
Cl
2
thu được chất sạch CP2 (6,7 mg).
Từ phân đoạn F9.I, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi CH
2
Cl
2
/EtOAc gradient
và HCOOH (1%) thu được 11 phân đoạn nhỏ kí hiệu F9.I.1-F9.I.11 Phân đoạn F9.I.3
được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi EtOH và cột silica gel với hệ dung môi
CH
2
Cl
2
/EtOAc gradient thu được chất sạch CP3 (6 mg). Phân đoạn F9.I.11 được tinh
chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel với hệ dung môi
CH
2
Cl
2

/axeton geadient thu được chất sạch CP4 (16,4 mg).
Từ phân đoạn F11.II, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi
CH
2
Cl
2
/EtOAc/NH
4
OH và CH
2
Cl
2
/MeOH/NH
4
OH thu được 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu
F11.II.1- F11.II.7. Kết tinh phân đoạn F11.II.4 bằng hệ dung môi Hx/CH
2
Cl
2
thu được
chất sạch CP5 (210,1 mg). Dịch cái tiếp tục được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với
hệ dung môi CH
2
Cl
2
/EtOAc/NH
4
OH và sắc ký cột sephadex với dung môi MeOH thu
được chất sạch CP6 (18,7 mg).
3.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã được phân lập

3.3.1. Hợp chất CP1
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 145 – 146
0
C
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 3,58 (1H, t, J = 4,5 Hz, OH), 3,94 (6H, s, 2 x
OCH
3
), 4,83 (2H, d, J = 4,5 Hz, CH
2
-2), 6,21 (1H, s, OH), 7,18 (1H, s, H-2’ + H-6’).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 56,5 (2 x OCH
3
), 64,9 (C-2), 105,0 (C-2’ + C-
6’), 124,8 (C-1’), 140,8 (C-4’), 147,1 (C3’ + C5’), 196,6 (C=O).
Phân tích chi tiết các phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR và DEPT và so sánh với tài liệu tham
khảo cho phép xác định chất CP1 là danielone. Hợp chất này lần đầu tiên được tách ra
từ lá đu đủ.

OCH
3

OH
OCH
3
HO
O
1
2
1'
2'
3'
4'
5'
6'

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất danielone (hình 3.3 của luận văn)
3.3.2. Hợp chất CP2
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 135 - 137
0
C. ESI-MS: m/z 274 [M+Na]
+
. HR-
ESI-MS (+) m/z: 274,1411.

10
1
H-NMR (500 MHz, CD
3
OD): δ (ppm): 1,37 (6H, m, CH
2
-4’+ CH

2
-5’+ CH
2
-6’); 1,06
(2H, quint, J= 7,5 Hz, CH
2
-7’); 1,69 (2H, quint, J= 7,5 Hz, CH
2
-3’); 2,28 (2H, t, J=
7,5 Hz, CH
2
-8’); 2,30 (3H, s, CH
3
); 2,71 (2H, t, J= 7,5 Hz, CH
2
-2’); 5,97 (1H, d, J=
3,5 Hz, H-4); 6,92 (1H, d, J= 3,5 Hz, H-5)
13
C-NMR (125 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 12,8 (CH
3
); 26,1 (C-7’); 27,1 (C-3’); 30,1 (C-
6’); 30,2 (C-5’); 30,3 (C-4’); 35,1 (C-8’); 38,4 (C-2’); 110,3 (C-4); 119,7 (C-5); 132,2
(C-2); 138,6 (C-3); 177,0 (C-9’); 192,1 (C-1’).
.

Hình 3.2: Phổ HR-ESI-MS (+) của hợp chất CP2 (hình 3.4 của luận văn)

Hình 3.3: Phổ

13
C-NMR của hợp chất CP2 (hình 3.6 của luận văn)



11

Hình 3.4: Phổ
1
H-NMR của hợp chất CP2 (hình 3.7 của luận văn)



Hình 3.5: Phổ COSY của hợp chất CP2 (hình 3.9 của luận văn)


12

Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất CP2 (hình 3.10 của luận văn)


Hình 3.7: Phổ HSQC của hợp chất CP2 (hình 3.11 của luận văn)

Phân tích dữ liệu phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR, COSY, HSQC, HMBC chúng tôi xác định
được chất CP2 là axit 9
’

-(3-methyl-pyrrol-2-yl)-9
’
-oxononanoic. Đây là một hợp
chất mới được đặt tên là carpainone. Trên thế giới và ở Việt Nam chưa có công bố
về hợp chất này trong lá đu đủ cũng như ở các loại thực vật khác.
N
H
COOH
O
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
2
3
5
4
9'

Hình 3.8: Cấu trúc hóa học của hợp chất carpainone (hình 3.12 của luận văn)


13
3.3.3. Hợp chất CP3
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 192 – 193
0

C. ESI-MS: m/z 167 [M-H]
-
.
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 3,91 (3H, s, OCH
3
), 6,83 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-
6), 7,55 (1H, dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-5), 7,58 (1H, dd, J = 1,5 Hz, H-3).
Sau khi so sánh các số liệu phổ của chất CP3 với tài liệu tham khảo chúng tôi đi đến
kết luận chất CP3 là axit pluchoic.

COOH
OCH
3
OH
1
2
4
5
6
3

Hình 3.9: Cấu trúc hóa học của hợp chất axit pluchoic (hình 3.15 của luận văn)

3.3.4. Hợp chất CP4
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 100 - 104
0
C

[α]
25
D
+288 (c=0,25 g/100ml trong MeOH)
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 0,97 (3H, s, CH
3
-12), 1,01 (3H, s, CH
3
-13), 1,26
(3H, d, J = 6,5 Hz, CH
3
-10), 2,10 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-2a), 2,38 (1H, d, J = 17,0 Hz,
H-2b), 2,56 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 4,11 (1H, dd, J = 1,5; 17,0 Hz, H-11a), 4,20 (1H,
dd, J = 1,5; 17,0 Hz, H-11b), 4,20 (1H, quint, J = 6,0 Hz, H-9), 5,57 (dd, J = 8,5; 15,5
Hz, H-7), 5,66 (1H, dd, J = 5,5; 15,5 Hz, H-8), 6,17 (1H, s, H-4).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 23,5 (CH
3
-10), 27,0 (CH
3
-12), 27,7 (CH
3
-13),
36,2 (C-1), 48,1 (C-2), 50,8 (C-6), 63,8 (C-11), 68,0 (C-9), 122,3 (C-4), 126,3 (C-8),
138,6 (C-7), 165,9 (C-5), 199,6 (C=O).

Phân tích chi tiết các phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR và DEPT COSY, HSQC, HMBC và so
sánh với tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định được chất CP4 là Apocynol A. Hợp
chất này lần đầu tiên được tách ra từ lá đu đủ.

OH
O
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Hình 3.10: Cấu trúc hóa học của hợp chất Apocynol A (hình 3.19 của luận văn)
3.3.5. Hợp chất CP5

14
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 118 – 120
0
C.
ESI-MS: m/z 479 [M+H]

+
, 240 [M/2+H]
+
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 1,05 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH
3
-2), 1,19 (1H, m,
H-5a), 1,32 (9H, m, CH
2
-8+ CH
2
-9 + CH
2
-10 + CH
2
-11 + H-7a), 1,47 (2H, m, H-7b +
H-5b), 1,65 (3H, m, CH
2
-12 + H-4a), 2,01 (1H, m, H-4b), 2,32 (1H, m, H-13a), 2,42
(1H, m, H-13b), 2,59 (1H, m, H-6), 2,87 (1H, dq, J=1,0, 7,0 Hz, H-2), 4,77 (1H, br, s,
H-3).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 18,6 (CH
3
-2), 25,4 (C-12), 25,4 (C-8), 26,2 (C-
5), 28,7 (C-11), 29,1 (C-4), 29,7 (C-9), 29,7 (C-10), 34,6 (C-13), 37,2 (C-7), 53,6 (C-

2), 50,6 (C-6), 70,3 (C-3), 173,5 (C=O).
Từ các dữ liệu phổ 1D, 2D-NMR, MS và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác
định đây là một alkaloid có cấu trúc đối xứng hai bên có tên carpaine.
N
H
H
(C H
2
)
7
C
O
O
N
H
H
3
C (CH
2
)
7
CH
3
H
O
C=O
2
3
4
5

6
2'
3'
4'
5'
6'

Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất carpaine (hình 3.24 của luận văn)
3.3.6. Hợp chất CP6
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 72 – 73
0
C
ESI-MS: m/z 479 [M+H]
+
, 240 [M/2+H]
+
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 1,02 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH
3
), 1,06 (3H, d, J =
6,5 Hz, CH
3
), 2,50 (2H, m, H-6 + H-6’), 2,69 (1H, m, H-2a), 2,86 (1H, dq, J=1,5, 6,5
Hz, H-2’), 4,33 (1H, m, H-3), 4,83 (1H, br s, H-3’),
13
C-NMR (125 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 18,5 (CH

3
), 19,1 (CH
3
), 24,7 (CH
2
), 24,9
(CH
2
), 25,1 (CH
2
), 25,4 (CH
2
), 26,7 (CH
2
), 27,8 (CH
2
), 28,0 (CH
2
), 28,1 (CH
2
), 28,4
(CH
2
), 28,5 (CH
2
), 28,8 (CH
2
), 29,1 (CH
2
), 29,5 (CH

2
), 30,6 (CH
2
), 30,9 (CH
2
), 34,5
(CH
2
), 34,8 (CH
2
), 35,4 (CH
2
), 37,3 (CH
2
), 53,8 (CH), 54,9 (CH), 55,7 (CH), 56,6
(CH), 70,1 (CH), 75,8 (CH), 173,3 (C=O), 173,7 (C=O).


15
Kết hợp các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất CP6
là đồng phân của chất CP5, chỉ khác nhóm CH
3
ở C-2 dưới dạng axial. Hợp chất này
có tên pseudocarpaine và đã được phân lập từ lá cây đu đủ.
N
CH
3
H
(CH
2

)
7
C
O
O
N
H
H
3
C (CH
2
)
7
H
H
O
C=O
2
3
4
5
6
2'
3'
4'
5'
6'

Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất pseudocarpaine (hình 3.28 của luận văn)

Kết luận: Từ cặn chiết CH
2
Cl
2
của lá đu đủ, chúng tôi đã tách chiết được 6 hợp chất.
Trong đó, hợp chất danielone (CP1) được tách ra từ phân đoạn F5 của cặn chiết. Hợp
chất carpainone (CP2) được tách ra từ phân đoạn F8 của cặn chiết, Hợp chất axit
pluchoic (CP3), apocynol A (CP4) được tách ra từ phân đoạn F9 của cặn chiết. Hợp
chất carpaine (CP5), pseudocarpaine (CP6) được tách ra từ các phân đoạn F11 của cặn
chiết.

3.4. Đánh giá tác d
ụng gây độc tế bào ung thư của các cặn chiết từ lá đu đủ
Cặn chiết các phân đoạn đem thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư: ung thư biểu mô
người KB, ung thư phổi người LU-1, ung thư vú người MCF-7. Kết quả thu được ở
hình 3.13:
Trong 5 phân đoạn cặn chiết thì 4 loại cặn chiết (Hx, EtOAc, BuOH và cặn nước còn
lại) không có hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB, LU-1, MCF-7 (với IC
50
>100
μg/ml). Chỉ có duy nhất cặn chiết CH
2
Cl
2
là có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 3 dòng
tế bào ung thư thử nghiệm: KB, LU-1, MCF-7 với giá trị IC
50
(μg/ml) lần lượt là:
18,44; 18,21; 19,16.

16

Hình 3.13: Tổng hợp kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cặn chiết từ
lá đu đủ (Hình 3.32 của luận văn)

3.5. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các phân đoạn
phân lập từ cặn chiết CH
2
Cl
2
từ lá đu đủ
Sau khi phân lập cặn CH
2
Cl
2
bằng sắc ký cột silica gel thu được 13 phân đoạn F1-
F13. Các phân đoạn F1- F13 được đem thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô
KB, kết quả như sau:


Hình 3.14: Kết quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB của các phân
đoạn cặn chiết CH
2
Cl
2
từ lá đu đủ (Hình 3.33 của luận văn)

Kết quả trên cho thấy: Các phân đoạn F8, F9, F10, F11 có thể hiện hoạt tính gây độc tế
bào ung thư biểu mô KB với IC

50
từ 15,41 đến 6,86 g/ml. Đặc biệt 2 phân đoạn F10,
F11 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB rất mạnh (IC
50
tương ứng là
7,17 và 6,86 g/ml).
Các phân đoạn còn lại không có hoặc có hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mô KB
yếu (IC
50
từ 23,93 đến >100 g/ml). Đối chứng dương là ellipticine hoạt động ổn định.


17
3.6. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ lá đu
đủ
Chúng tôi tiến hành xác định khả năng diệt hoặc kìm hãm sự phát triển tế bào ung thư
của các hợp chất phân lập được từ lá đu đủ trên bốn dòng tế bào ung thư khác nhau.
Ngoài ra, các mẫu nghiên cứu còn được thử nghiệm trên tế bào thường NH3T3 của
người và xem như là dòng tế bào đối chứng để kiể
m tra khả năng gây độc tế bào với tế
bào bình thường. Kết quả cụ thể như sau:



Hình 3.15: Tổng hợp kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập
từ lá đu đủ (hình 3.49 của luận văn)

Bốn hợp chất (danielone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A) không có hoạt tính
gây độc tế bào đối với 04 dòng tế bào ung thư và 1 dòng tế bào thường thử nghiệm.
Hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine thể hiện hoạt tính rất tốt trên cả 4 dòng tế bào

ung thư nghiên cứu (ung thư bi
ểu mô KB, ung thư máu LH-60, ung thư phổi LU-1,
ung thư vú MCF-7) với các giá trị IC
50
từ 1,13 đến 3,49 µg/ml.
3.7. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của một số hợp chất lên tế
bào ung thư phổi LU-1
Xác định khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của 2 hợp chất (carpaine và
pseudocarpaine) tách chiết được từ lá đu đủ trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1. Kết
quả cụ thể như sau:
3.7.1. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine lên tế
bào ung thư phổi LU-1
Hợp chấ
t carpaine tách chiết được từ lá đu đủ được đánh giá khả năng kích hoạt
enzyme caspase 3/7 trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1.

18


Hình 3.16: Kết quả kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine lên tế bào
ung thư phổi LU-1(hình 3.50 của luận văn)

Hợp chất carpaine thể hiện khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 ở nồng độ thử cao
nhất (20 µg/ml) là 386,5 RFU. Chất đối chứng dương tamoxifen hoạt động ổn định
trong thí nghiệm với hoạt tính caspase ở nồng độ 20 µg/ml là 3100 RFU.
Thông qua thí nghiệm xác định độ độc của hoạt ch
ất lên dòng tế bào nuôi cấy bằng
phương pháp nhuộm SRB, kết quả tỉ lệ tế bào sống sót so với đối chứng của hoạt chất
ở nồng độ thử nghiệm nằm trong khoảng 84,67 đến 90,44% cho thấy hợp chất
carpaine không gây chết tế bào trên diện rộng nhưng cũng đã có tác động nhất định lên

tế bào.
3.7.2. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất
psuedocarpaine lên tế bào ung th
ư phổi LU-1
Hợp chất pseudocarpaine tách chiết từ lá đu đủ được đánh giá khả năng kích hoạt
enzyme caspase 3/7 trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1.

Hình 3.17: Kết quả kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất pseudocarpaine lên tế
bào ung thư phổi LU-1(hình 3.51 của luận văn)
Kết quả trên cho thấy hợp chất pseudocarpaine thể hiện khả năng kích hoạt enzyme
caspase 3/7 ở nồng độ thử cao nhất (30µg/ml) là 778 RFU. Chất đối chứng dương

19
tamoxifen hoạt động ổn định trong thí nghiệm với hoạt tính caspase ở nồng độ 20
µg/ml là 3100 RFU.
Thông qua thí nghiệm xác định độ độc của hoạt chất lên dòng tế bào nuôi cấy bằng
phương pháp nhuộm SRB, kết quả tỉ lệ tế bào sống sót so với đối chứng của hoạt chất
ở nồng độ thử nghiệm nằm trong khoảng 89 đến 96 % cho thấy hợp chất
pseudocarpaine không gây chết tế bào trên diệ
n rộng nhưng cũng đã có tác động nhất
định lên tế bào.
3.8. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ
3.8.1. Kết quả chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp loại bỏ gốc tự do
DPPH của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ
Xác định khả năng chống oxy hóa của 6 hợp chất tách chiết được từ lá đu đủ bằ
ng
phương pháp thử DPPH.


Hình 3.18: Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH của các hợp chất chiết

tách từ lá đu đủ (hình 3.52 của luận văn)
Kết quả cho thấy: 6 hợp chất thử nghiệm đều có EC
50
> 128 µg/ml, lớn hơn nồng độ
cao nhất của phép thử. Chất tham khảo là resveratrol có EC
50
là 8,3 µg/ml. Kết quả
này chứng tỏ, cả 6 hợp chất tách chiết được từ lá đu đủ chưa thể hiện hoạt tính chống
oxy hóa ở nồng độ thử nghiệm.
3.8.2. Kết quả chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm MDA của các hợp chất phân
lập từ lá đu đủ
Xác định khả năng chống oxy hóa của 6 hợp chất tách chiết được từ lá đu đủ bằ
ng
phương pháp thử nghiệm MDA.

20


Hình 3.19: Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phép thử MDA của các hợp chất
chiết tách từ lá đu đủ (hình 3.53 của luận văn)
Bằng thử nghiệm MDA để kiểm tra khả năng chống oxy hóa in vitro của các hợp chất:
danilone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine chúng tôi
nhận thấy chỉ có duy nhất hợp chất pseudocarpaine ở nồng độ thử nghiệm cao nhất
100 µg/ml cũng chỉ có hoạt tính chống oxi hoá kho
ảng 33,59%, cho thấy có hoạt tính
yếu. Các hợp chất còn lại bao gồm: danilone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A và
carpaine đều không thể hiện hoạt tính chống oxi hóa trên thử nghiệm MDA ở các nồng
độ nghiên cứu.
3.8.3. Kết quả chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan chuột của các hợp chất phân
lập từ lá đu đủ

Xác định khả năng chống oxy hóa của 6 hợp chất tách chiết được từ lá đu đủ trên tế
bào gan chuột.


Hình 3.20: Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa trên tế bào gan chuột của các
hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (hình 3.54 của luận văn)


21
Qua quá trình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan phân lập của
6 hoạt chất cho thấy các chất đều không thể hiện hoạt tính ở nồng độ nghiên cứu.
Cucurmin hoạt động ổn định trong thí nghiệm.

3.9. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập được
Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân từ lá
đu đủ
(bảng 3.5 của luận văn)

Chất thử
Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi
khuẩn và nấm - IC
50
(g/ml)
Vi khuẩn gram
dương
Vi khuẩn gram âm
Nấ
m
1 2 3 4 5 6 7
Danielone >12

8
>12
8
>12
8
>12
8
>128 >12
8
>12
8
Carpainone >12
8
>12
8
>12
8
>12
8
>128 >12
8
>12
8
Axit
pluchoic
>12
8
>12
8
>12

8
>12
8
>128 >12
8
>12
8
Apocynol
A
>12
8
>12
8
>12
8
>12
8
>128 >12
8
>12
8
Carpaine >12
8
>12
8
>12
8
>12
8
>128 >12

8
>12
8
Pseudocarp
aine
80 >12
8
>12
8
>12
8
>128 >12
8
>12
8
Ampicilin 1,0 1,05 1,02 - 1,2 - -
Stretomyci
n
- - - 1,25 - 12 -
Amphoteri
cin B
- - - - - - 0,8
kí hiệu:

22
1: Staphylococcus aureus, 2: Bacillus subtilis, 3: Lactobacillus fermentum, 4:
Salmonella enterica, 5: Escherichia coli, 6: Pseudomonas aeruginosa, 7: Candida
albican,(-): không thử
Qua số liệu ở bảng 3.2 thấy rằng, có 5 trong tổng số 6 hợp chất thử nghiệm đều không
có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm ở nồng độ chất

thử cao nhất là 128 µg/ml.
Riêng hợp chất pseudocarpaine chỉ thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn gram dương
Staphylococcus aureus rất yếu với IC
50
là 80 µg/ml. Còn đối với các chủng vi khuẩn
và nấm còn lại đều có IC
50
> 128 µg/ml.
3.10. Đánh giá khả năng kích thích tế bào lympho của các hợp chất phân lập từ lá
đu đủ
Tiến hành đánh giá khả năng kích thích tế bào lympho của sáu hợp chất phân lập từ lá
đu đủ. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.3: Kết quả kích thích tế bào lympho của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ
(bảng 3.6 của luận văn)
Nồng độ
(µg/ml)
SI (chỉ số kích thích tế
bào lympho
phát triển so với đối chứng âm)
Chất thử 100 20 4 0,8
Danielone 1,15 1,04 1,05 1,01
Carpainone 0,95 0,93 0,93 0,92
Axit
pluchoic 0,98 1,00 1,03 1,00
Apocynol A 1,11 1,05 1,03 0,99
Carpaine 0,95 1,08 1,11 1,05
Pseudocarpai
ne
1,04
0,99 0,98 1,00

Concavalin
A
1,44
(1
µg/ml)
1,15
(0,5
µg/ml)
1,04
(0,25
µg/ml)
1,01
(0,125
µg/ml)


23
Kết quả trên cho thấy các hoạt chất nghiên cứu không thể hiện hoạt tính kích thích tế
bào lympho. Concavalin A có cho thấy khả năng kích thích tế bào lympho tăng sinh.
Do vậy, chúng tôi không xác định được giá trị SD
50
của tất cả các mẫu nghiên cứu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá đu đủ bằng các dung môi có độ phân cực
tăng dần (n-hexan, CH
2
Cl
2
, EtOAc, buthanol). Từ cặn chiết CH

2
Cl
2
phân lập được 6
hợp chất kí hiệu từ CP1 đến CP6 và xác định được cấu trúc như sau: danielone (CP1),
carpainone (CP2), axit pluchoic (CP3), apocynol A (CP4), carpaine (CP5),
pseudocarpaine (CP6). Trong đó carpainone là một hợp chất mới. Hai hợp chất
danielone và apocynol A lần đầu tiên được tách ra từ lá đu đủ.
2. Đã xác định được phân đoạn cặn chiết CH
2
Cl
2
của lá đu đủ có khả năng gây độc tế
bào ung thư biểu mô KB (IC
50
= 18,44 µg/ml), ung thư phổi LU-1 (IC
50
= 18,21
µg/ml) và ung thư vú MCF-7 (IC
50
= 19,16 µg/ml).
3. Hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ cặn CH
2
Cl
2
của lá đu đủ
lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào
ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư
vú MCF-7 (IC
50

từ 1,13 đến 3,49 µg/ml). Đồng thời hai hợp chất này cũng gây độc với
tế bào thường của người (tế bào NIH 3T3) (IC
50
từ 1,40 đến 1,88 µg/ml). Các hợp chất
còn lại (danielone, carpainone, axit pluchoic và apocynol A) đều không thể hiện khả
năng gây độc tế bào đối với 4 dòng tế bào ung thư và 1 dòng tế bào thường (IC
50
>100
µg/ml).
4. Hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine lần đầu tiên được chứng minh khả
năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 (tương ứng là 386,5 và 778 RFU) ở nồng độ thử
nghiệm cao nhất (tương ứng 20 và 30 µg/ml) nhưng không mạnh khi so với chất đối
chứng là tamoxifen (là 3100 RFU ở nồng độ thử 20 µg/ml).
5. Các hợp chất phân lập được từ lá đu đủ không thể hiện khả năng chống oxy hóa ở
các nồng độ nghiên cứ
u trong các thử nghiệm DPPH (EC
50
> 128 µg/ml), MDA (ED
50

> 100 µg/ml) và trên tế bào gan chuột phân lập (ED
50
> 100 µg/ml).
6. Hợp chất pseudocarpaine cho thấy khả năng kháng vi khuẩn gram dương
Staphylococcus aureus với IC
50
= 80 µg/ml, không thể hiện hoạt tính kháng các chủng
vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm khác ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/ml

24

(với IC
50
> 128 µg/ml). Các hợp chất còn lại (danielone, carpainone, axit pluchoic,
apocynol A và carpaine) đều không thể hiện khả năng kháng vi khuẩn và nấm tại nồng
độ thử nghiệm (với IC
50
> 128 µg/ml).
7. Các hợp chất phân lập được từ lá đu đủ chưa cho thấy khả năng kích thích tế bào
lympho tại các nồng độ thử nghiệm. Không xác định được giá trị SD
50
của các hợp
chất tại các nồng độ thử nghiệm từ 0,8 đến 100 µg/ml.
Kiến nghị
1. Tiếp tục nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của hợp chất carpaine và
pseudocarpaine như: khả năng hạn chế sự di căn của khối u, khả năng hạn chế sự hình
thành mạch máu trong khối u,…
2. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình để chiết tách carpaine và pseudocarpaine từ lá đu
đủ Carica papaya Linn.