Các phương pháp và công cụ trong công nghệ sinh học nano

Công nghệ sinh học nano là sự giao thoa của công nghệ nano và sinh học,
và là sự kết hợp của nhiều lĩnh vực nghiên cứu công nghệ cao. Nói một cách
khác, Công nghệ sinh học nano là công nghệ sinh học ở mức độ siêu nhỏ (mức
độ nm) liên quan đến phương pháp sử dụng vật liệu và thiết bị công nghệ nano
để nghiên cứu hệ sinh học. Ứng dụng của công nghệ sinh học nano gia tăng rất
nhanh, đặc biệt trong lĩnh vực y học. Một số thiết bị công nghệ sinh học nano đã
được chế tạo tại Việt Nam.
Để phục vụ cho nền công nghệ sinh học nano, hiện nay có một số công cụ
và phương pháp như:
1. Dynamics Light Scattering (DLS): Phương pháp tán xạ ánh sáng động
học
2. Automic Force Microscopy (AFM): Hiển vi lực nguyên tử
3. Transmision Electron Microscopy (TEM): Hiển vi điện tử truyền qua
4. Scanning Electron Microscopy (SEM): Hiển vi điện tử quét
5. Fluorescent microscopy: Hiển vi huỳnh quang
6. Confocat microscopy: Hiển vi đồng tiêu
7. Super-resolution microscopy STED: Hiển vi siêu phân giải STED
8. Bioassays: Các phép thử sinh học như ELISA, Western blotting.


1. Dynamics Light Scattering (DLS): Phương pháp tán xạ ánh sáng
động học

Phương pháp tán xạ ánh sáng động học là một kỹ thuật trong v ật lý có
thể được sử dụng để xác định cấu hình phân bố kích thước của các h ạt nhỏ
trong huyền phù hoặc polyme trong dung dịch.
+ Nguyên lý hoạt động
Kích thước hạt được đo bằng DLS: Các hạt lơ lửng trong một chất lỏng
liên tục trải qua chuyển động ngẫu nhiên, và kích thước của các hạt trực tiếp ảnh
hưởng đến tốc độ của chúng. Hạt nhỏ di chuyển nhanh hơn so với những hạt lớn
hơn. Trong DLS, ánh sáng đi qua mẫu, và ánh sáng tán xạ được phát hiện và ghi

nhận ở một góc độ nhất định. Sự phụ thuộc vào thời gian của cường độ tán xạ
cho thấy các hạt đang chuyển động nhanh như thế nào. Từ thông tin này, có thể
tính toán kích thước trung bình của hạt cũng như sự phân bố kích thước.
Đo điện thế Zeta bằng ELS: Trong ánh sáng tán xạ điện di (ELS) tốc độ
của các hạt được đo bằng sự hiện diện của một điện trường. Sự di chuyển các
hạt nhanh hơn, thì điện thế zeta của các hạt cao hơn. Nói chung, điện thế zeta
cường độ lớn có nghĩa là các hạt sẽ đẩy nhau mạnh hơn, tạo ra một dung dịch
huyền phù ổn định hơn.
+ Ứng dụng


DLS được sử dụng để mô tả kích thước của các hạt khác nhau bao gồm
protein, polyme, micelles, carbohydrate, hạt nano, tế bào sinh học và gel. Phép
đo này phụ thuộc vào kích thước của lõi hạt, kích thước của cấu trúc bề mặt,
nồng độ hạt và loại ion trong môi trường.
2. Automic Force Microscopy (AFM): Hiển vi lực nguyên tử
Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) là một thiết bị quan sát cấu trúc vi mô
bề mặt của vật rắn dựa trên nguyên tắc xác định lực tương tác nguyên tử giữa
một đầu mũi dò nhọn với bề mặt của mẫu, có thể quan sát ở độ phân giải
nanomet.

Cấu tạo của AFM gồm có 6 bộ phận chính
• Một mũi nhọn.
• Cần quét (cantilever).
• Nguồn Laser.
• Phản xạ gương (miroir ).
• Hai nửa tấm pin quang điện (photodiod)
• Bộ quét áp điện
Bộ phận chính của AFM là một mũi nhọn được gắn trên một thanh rung
(cantilever). Mũi nhọn thường được làm bằng Si hoặc SiN và kích thước của

đầu mũi nhọn là một nguyên tử. Khi mũi nhọn quét gần bề mặt mẫu vật, sẽ xuất
hiện lực Van der Waals giữa các nguyên tử tại bề mặt mẫu và nguyên tử tại đầu
mũi nhọn (lực nguyên tử) làm rung thanh cantilever. Lực này phụ thuộc vào
khoảng cách giữa đầu mũi dò và bề mặt của mẫu. Dao động của thanh rung do
lực tương tác được ghi lại nhờ một tia laser chiếu qua bề mặt của thanh rung,
dao động của thanh rung làm thay đổi góc lệch của tia lase và được detector ghi
lại. Việc ghi lại lực tương tác trong quá trình thanh rung quét trên bề mặt sẽ cho
hình ảnh cấu trúc bề mặt của mẫu vật.
Kính hiển vi lực nguyên tử ứng dụng chụp ảnh cắt lớp nhanh ; mô tả,
phân tích, xác định đặc điểm bề mặt ; đo cơ học đơn phân tử ; kiểm soát chất
lượng, kiểm tra khuyết tật vật liệu. Hơn thế nữa, AFM còn được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực như : công nghệ nano, công nghệ bán dẫn, dược phẩm, sinh học,
công nghệ vật liệu.,v…v….
3. Transmision Electron Microscopy (TEM): Hiển vi điện tư
truyền qua
Kính hiển vi điện tử truyền qua là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật
rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn
mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới
hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang
học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số.
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Là công cụ rất h ữu hi ệu cho
các nghiên cứu vật liệu và y học. Khi đo TEM ta có th ể xác định đ ược hình
dạng, kích thước trung bình của hạt và sự phân tán của h ạt trong môi
trường chất. Khi chùm điện tử chiếu tới mẫu v ới tốc đ ộ cao và trong
phạm vi rất hẹp, các điện tử bị tán xạ bởi thế tĩnh điện giữa hạt nhân
nguyên tử và lớp mây điện tử của vật liệu gây ra nhiễu xạ điện t ử. Chùm
điện tử nhiễu xạ từ vật liệu phụ thuộc vào bước sóng của chùm v ật li ệu
tới và khoảng cách mặt phẳng mạng trong tinh thể, tuân theo định luật

Bragg:


Kính hiển vi điện tử có độ phân giải giới hạn bởi bước sóng của sóng điện
tử, nhưng do sóng điện tử có bước sóng rất ngắn nên chúng có độ phân giải
vượt xa các kính hiển vi quang học truyền thống, và kính hiển vi điện tử
truyền qua hiện đang là loại kính hiển vi có độ phân giải tốt nhất tới cấp độ hạ
nguyên tử. Nhờ tương tác giữa chùm điện tử với mẫu vật, kính hiển vi điện tử
truyền qua còn cho phép quan sát các cấu trúc điện từ của vật rắn và đem lại
nhiều phép phân tích hóa học với chất lượng rất cao.
Ứng dụng chính của kính hiển vi điện tử truyền qua là cung cấp hình ảnh
phóng đại cao của cấu trúc bên trong của một mẫu.
Hiển vi điện tử truyền qua được dùng để nghiên cứu về vật liệu có kích
thước nano cho biết các thông tin về những đặc trưng hình thái, cấu trúc, kiểm
soát được chất lượng của vật liệu được chế tạo (như tính đồng nhất về cấu trúc
và kích thước, độ lặp lại, sự sai hỏng, khả năng phân tán…)
4. Scanning Electron Microscopy (SEM): Hiển vi điện tư quét
Là kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt
mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu. Khi
điện tử tương tác với bề mặt mẫu vật, sẽ có các bực xạ phát ra, sự tạo ảnh trong
SEM và các phép phân tích được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ
phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật.


Ứng dụng:
- Phép phân tích huỳnh quang catốt: Các ánh sáng phát ra do tương tác
của chùm điện tử với bề mặt mẫu. Phép phân tích này rất phổ biến và hữu ích
cho việc phân tích các tính chất quang, điện của vật liệu.
- Phân tích phổ tia X: Tương tác giữa điện tử với vật chất có thể sản sinh
phổ tia X đặc trưng, rất hữu ích cho phân tích thành phần hóa học của vật liệu.

- Một số hính hiển vi điện tử quét hoạt động ở chân không siêu cao có
thể phân tích phổ điện tử Auger, dùng để phân tích tinh tế bề mặt.
Mặc dù không có độ phân giải tốt như kính hiển vi điện tử truyền qua
nhưng kính hiển vị điện tử quét lại có điểm mạnh là phân tích mà không cần phá
hủy mẫu vật và có thể hoạt động ở chân không thấp.
5. Fluorescent microscopy: Hiển vi huỳnh quang
Kính hiển vi huỳnh quang là kính hiển vi quang học sử dụng huỳnh quang
và lân quang phản xạ và hấp thụ để nghiên cứu tính chất của các chất hữu cơ hoặc
chất vô cơ. Thuật ngữ kính hiển vi huỳnh quang đề cập đến bất kỳ kính hiển vi
nào sử dụng huỳnh quang để tạo ra hình ảnh.
Mẫu vật được chiếu sáng bằng ánh sáng của một bước sóng đặc biệt (hoặc
nhiều bước sóng) được hấp thụ bới các chất huỳnh quang, khiến chúng phát ra
ánh sáng có bước sóng dài hơn (ví dụ, màu sắc khác hơn so với ánh sáng hấp
thụ). Ánh sáng chiếu được tách ra từ huỳnh quang phát ra yếu hơn nhiều thông
qua việc sử dụng một bộ lọc quang phổ. Bộ phận quan trọng của kính hiển vi


huỳnh quang là nguồn ánh sáng( phổ biến là đèn hồ quang xenon hay đèn hơi
thủy ngân, hoặc cao cấp hơn là đèn năng lượng cao LED và laser), các bộ lọc kích
thích, các gương lưỡng sắc (hoặc bộ tách chùm lưỡng sắc), và bộ lọc phát xạ.

Cấu tạo kính hiển vi huỳnh quang
Các bộ lọc và gương lưỡng sắc đươhc lựa chọn để phù hợp với đặc điểm
quang phổ kích thích và phát xạ của chất huỳnh quang được sử dụng để đánh dấu
mẫu vật. Theo cách này, sự phân bố của một huỳnh quang duy nhất (màu sắc)
được chụp ảnh tại một thời điểm. Hình ảnh nhiều màu sắc của một số loại huỳnh
quang được tạo ra bằng cách kết hợp một số hình ảnh đơn màu.
Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất là kính hiển vi
Epiflourescence, trong đó sự kích thích của chất huỳnh quang và dò tìm ánh sáng
huỳnh quang được thực hiện thông qua cùng một đường truyền sáng (tức thông

qua vật kính). Loại kính huỳnh quang này được sử dụng rộng rãi trong sinh học
và là cơ sở cho nhiều mẫu thiết kế kính hiển vi tiên tiến.
Cách thức hoạt động
Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn thủy ngân hoặc đèn xenon để tạo ra
ánh sáng cực tím. Ánh sáng này đi vào kính hiển vi huỳnh quang chạm vào gương
lưỡng sắc – một tấm gương phản xạ một dải bước sóng này và cho phép một dải
bước sóng khác đi qua. Gương lưỡng sắc phản chiếu ánh snags cực tím đến mẫu
vật. Ánh sáng cực tím kích thích sự phát huỳnh quang từ các phân tử trong mẫu


vật. Vật kính thu nhận ánh sáng có bước sóng huỳnh quang được tạo ra. Ánh sáng
huỳnh quang này đi qua gương lưỡng sắc và một bộ lọc chắn (loại bỏ các bước
sóng không phải huỳnh quang), và cuối cùng vào thị kính để tạo thành hình ảnh.

Sơ đồ kính hiển vi huỳnh quang
Kỹ thuật kính hiển vi huỳnh quang rất hữu dụng để quan sát cấu trúc và đo
lường hoạt động sinh lý và sinh hóa trong tế bào sống. Các chỉ thị huỳnh quang
khác nhau luôn có sẵn để nghiên cứu nhiều hợp chất sinh lý quan trọng như DNA,
canxi, magie, natri, pH và các enzym.
6. Confocat microscopy: Hiển vi đồng tiêu
Kính hiển vi đồng tiêu sử dụng kỹ thuật kính hiển vi quang học/huỳnh
quang có khả năng tăng độ phân giải của hệ quan sát nhờ sử dụng lỗ hội tụ
(pinhole) và chùm sáng quét được hội tụ vào một điểm nhỏ trên mặt phẳng tiêu
(point illumination). Ánh sáng phản xạ sẽ tạo lại hình ảnh của vật, được ghi lại
bởi các CCD camera trong đa số kính hiển vi đồng tiêu hiện nay với độ phân giải
tới khoảng 100 nm ở độ phóng đại 1500 lần hoặc thấp hơn nữa, vượt xa các kính
quang học truyền thống vốn bị giới hạn bởi hiện tượng nhiễu xạ (200 nm). Gần


đây, kính hiển vi đồng tiêu đang được phát triển rộng rãi trong các ngành khoa

học vật liệu, nghiên cứu y sinh, khoa học tế bào, bán dẫn..

Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang
Kính hiển vi đồng tiêu về bản chất là một dạng tân tiến hơn của kính hiển
vi huỳnh quang. Điểm khác biệt là kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải lớn
hơn nhờ sử dụng các lỗ hội tụ để loại đi các ánh sáng không hội tụ hoàn toàn
(out-of- focus) và chùm tia được quét trên mẫu vật (do kích thước mũi chùm tia
được hội tụ rất nhỏ). Mẫu vật thường được nhuộm bởi các chất huỳnh quang
(fluorophores) như cyanine, DAPI hay các protein tổng hợp.
Chùm sáng sơ cấp được phát ra từ các đèn halogen, đèn thủy ngân hoặc
điốt quang năng lượng cao (high-power LED) với các kính hiển vi đồng tiêu
truyền thống (confocal microscopy) hay từ các đèn laser trong các kính đồng
tiêu quét laser (laser scanning confocal microscopy). Đôi lúc là ánh sáng trắng
được cho đi qua các tấm lọc màu (filter) để lựa chọn ánh sáng đơn sắc có màu
sắc cần thiết, thường từ 680 nm (đỏ và hồng ngoại), 550 nm (xanh lá cây),
480 nm (xanh dương) cho tới 280 - 400 nm (dải cực tím). Việc lựa chọn bước
sóng cho phép tạo ra sự huỳnh quang ở các loại fluorophores khác nhau. Ánh
sáng sơ cấp được cho đi qua một lỗ hội tụ sơ cấp để loại bỏ các tia bị cầu sai
(spherical aberration) hoặc kém hội tụ (out-of-focus).Sau đó, ánh sáng đi qua
một gương lọc/bán mạ (dichroic mirror) và được hội tụ tại một điểm rất nhỏ trên
mặt phẳng tiêu của mẫu vật, với độ sâu trường ảnh (depth-of-field) vào khoảng
vài trăm nanomet (do vậy tạo ra được ảnh ba chiều của mẫu vật). Ánh sáng


phản xạ hoặc ánh sáng huỳnh quang (ánh sáng thứ cấp) sẽ được phản chiếu tại
gương lọc (do có bước sóng dài hơn bước sóng cho phép của gương), đi qua
thêm một pinhole loại ánh sáng out-of-focus thứ hai trước khi đi vào bộ phận
ghi ảnh. Các kính hiển vi đồng tiêu có thị kính quan sát như kính quang học
truyền thống, nhưng có thể được trang bị các CCD camera hoặc CMOS để ghi
ảnh, đặc biệt cần thiết vì mắt người mẫn cảm và không quan sát được tia laser

hay tia cực tím.
Hình ảnh cuối của vật là ảnh ba chiều (khác với kính quang học truyền
qua truyền thống là ảnh hai chiều). Ở các phiên bản đặc biệt, các kính hiển vi
đồng tiêu được gắn thêm các máy đo thời gian cực nhanh để ghi ảnh bốn chiều
của vật (cỡ nano giây tới mili giây) cho các ứng dụng đo thời gian của các hoạt
động tế bào (time-lapse microscopy).
Kính hiển vi đồng tiêu là một dụng cụ quang học cho phép vượt xa khả
năng quan sát của các kính hiển vi truyền thống, do đó được áp dụng để quan
sát các chi tiết vốn quá nhỏ để quan sát bởi các kính hiển vi quang học thông
thường (dưới 200 nm). Các ứng dụng hiện nay bao gồm các ngành y sinh học
(nghiên cứu tế bào), bán dẫn (quan sát vật liệu ở dạng ảnh ba chiều)...
Kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải cao mà kết cấu và điều khiển
không quá phức tạp, giá thành rẻ hơn các kính hiển vi điện tử nhưng độ phân
giải tốt hơn nhiều so với kính hiển vi quang học thông thường, có thể xuống tới
dưới 10 nm ở các biến thể hoặc ở độ phóng đại trung bình (1500 lần, càng
phóng đại, độ phân giải càng giảm), đồng thời có độ sáng rất cao và phân biệt
tốt các chi tiết nhờ sử dụng các chất nhuộm màu. Khả năng ghi ảnh ba chiều và
đo thời gian của kính hiển vi đồng tiêu cũng là một lợi điểm, cho phép nghiên
cứu "chiều cao" của các chi tiết trong mạch bán dẫn hay thời gian hoạt động của
các tế bào sống (các hoạt động nội bào, phân chia hoặc phát triển), đồng thời
không yêu cầu phải phá hủy mẫu vật. Một ưu điểm nữa của kính hiển vi đồng
tiêu là tốc độ quét nhanh (cỡ mili giây) nếu so với các kỹ thuật quét khác như


kính hiển vi điện tử truyền qua quét (cỡ giây), kính hiển vi điện tử quét (cỡ vài
chục giây tới vài chục phút) và kính hiển vi quét đầu dò (cỡ vài chục phút)
Nhược điểm của kính hiển vi đồng tiêu là giá thành, mặc dù rẻ hơn so với
các loại biến thể hay kính hiển vi điện tử hay kính hiển vi quét đầu dò, nhưng
vẫn ở mức khá đắt (trên 5,000 đôla Mỹ tùy vào loại biến thể và các thiết bị phụ
trợ) tức khoảng 105 triệu VND so với kính hiển vi quang học thông dụng từ 16

đến dưới 80 triệu VND. Một điểm kém khác là yêu cầu các chất nhuộm màu
cho quá trình quan sát các phần tử không phát xạ huỳnh quang nguyên sinh như
nhân tế bào, DNA, RNA, vi khuẩn, virut... Điều này làm ảnh hưởng tương đối
lớn đến giá thành của thiết bị và hoạt động, đồng thời trong một số trường hợp
không thích hợp cho các mẫu vật sống (mặc dù đa số trường hợp đều có thể áp
dụng với tế bào sống). khả năng phân giải của kính hiển vi đồng tiêu, dù được
liệt vào loại tốt, vẫn còn thua xa các thiết bị quan sát hiện đại hơn như kính hiển
vi điện tử hay kính hiển vi quét đầu dò (có khả năng phân giải tới cấp đơn phân
tử, nguyên tử).
7. Super-resolution microscopy STED: Hiển vi siêu phân giải STED
Hiển vi siêu phân giải (Super-resolution microscopy) là một loại hiển vi
quang học. Các kĩ thuật siêu phân giải cho phép thu được ảnh với độ phân giải
không gian nhỏ hơn giới hạn nhiễu xạ này. Chúng có thể được chia thành hai
nhóm lớn: các kĩ thuật siêu phân giải "true" và "functional" ("true" super
resolution, "functional" super resolution). Các kĩ thuật "functional" dùng kĩ thuật
thí nghiệm thông minh kết hợp với việc hiểu các giới hạn của đối tượng hiện ảnh
để dự lại ảnh siêu phân giải.
Kĩ thuật siêu phân giải "true" gồm các phương pháp sử dụng siêu thấu kính
Pendry (Pendry superlens), hiển vi quang học quét trường gần (near field
scanning optical microscopy), hiển vi 4Pi và hiển vi chiếu sáng có cấu trúc
(structured illumination optical microscopy) như SIM và SMI. Tuy nhiên, các kĩ
thuật có nhiều ứng dụng trong sinh học thuộc về nhóm "functional".


Các kĩ thuật siêu phân giải "functional" có thể được chia làm hai loại:
1.

Tất định: sử dụng các hạt phát quang thường gặp trong kĩ thuật

hiển vi huỳnh quang được kích thích phi tuyến. Các phương pháp trong nhóm

này gồm STED, GSD, RESOLFT and SSIM.
2.

Ngẫu nhiên: sử dụng các phân tử quang hoạt (sự phát quang được

điều khiển bằng ánh sáng) được điều khiển phát quang một cách rời rạc. Các
phương pháp trong nhóm này gồm SOFI, SPDM, SPDMphymod, PALM,
FPALM, STORM và dSTORM.
8. Bioassays: Các phép thư sinh học như ELISA, Western blotting.
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), còn được gọi là enzyme
immunoassay (EIA), là một kỹ thuật sinh hóa sử dụng chủ yếu trong miễn dịch
học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một
mẫu. ELISA được sử dụng như một công cụ chẩn đoán trong y học và bệnh lý
học thực vật, cũng như kiểm tra kiểm soát chất lượng trong các ngành công
nghiệp khác nhau, chẳng hạn như ứng dụng ELISA trong ngành công nghiệp thực
phẩm. Theo thuật ngữ đơn giản, trong kỹ thuật ELISA, một lượng của kháng
nguyên được gắn liền với một bề mặt, và sau đó là một kháng thể đặc hiệu được
cho vào trên bề mặt để nó có thể liên kết với các kháng nguyên. Kháng thể này
sẽ liên kết với một loại enzyme, và cuối cùng thêm cơ chất để enzyme phân giải
cơ chất và phát ra những tín hiệu, phổ biến nhất là sự đổi màu một chất hóa học.
Để thực hiện một phản ứng ELISA bao gồm ít nhất một kháng thể bắt cặp
đặc hiệu với kháng nguyên cụ thể. Các mẫu có số lượng kháng nguyên chưa
biết được cố định trên một bề mặt vững chắc- giá thể rắn (thường là một tấm
polystyrene vi chuẩn) hoặc không đặc hiệu (thông qua hấp phụ lên bề mặt) hoặc


đặc hiệu (thông qua chụp bằng kháng thể khác đặc hiệu với kháng nguyên
tương tự trong thí nghiệm ELISA sandwich).
Sau khi kháng nguyên được cố định, các kháng thể phát hiện được thêm

vào, tạo thành một phức hợp với các kháng nguyên. Các kháng thể phát hiện có
thể liên kết với một loại enzyme, hay chính nó có thể được phát hiện bởi một
kháng thể thứ cấp liên kết với một loại enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị
giữa các phân tử sinh học. Các phần của kháng thể ELISA là tương tự với
phương pháp western blot. Giữa mỗi bước, các đĩa thường được rửa bằng dung
dịch tẩy nhẹ để loại bỏ các protein hoặc các kháng thể không gắn. Sau bước rửa
cuối cùng, cơ chất của enzyme được thêm vào để tạo ra tín hiệu có thể nhìn
thấy, giúp chỉ ra số lượng kháng nguyên trong mẫu.
Thiết bị cần thiết cho một phản ứng ELISA
- Đĩa ELISA pha rắn
- ELISA Pipet
- Hệ thống máy rửa
- Máy đọc kết quả ELISA
* Các loại ELISA
a) Direct ELISA ( ELISA trực tiếp)
Phương pháp ELISA trực tiếp được coi là loại đơn giản nhất trong
các phương pháp ELISA, kháng nguyên (Antigen- Ag) được hấp phụ lên một
tấm nhựa, sau đó một lượng lớn của một loại protein (thường là albumin huyết
thanh bò- BSA) được thêm vào để khóa tất cả các vị trí liên kết khác. Trong lúc
đó, một loại enzyme sẽ liên kết với một kháng thể trong một phản ứng riêng
biệt, phức hợp enzyme- kháng thể này được sử dụng để hấp phụ các kháng
nguyên. Sau khi phức enzyme- kháng thể dư thừa bị loại bỏ hết, phức hợp
enzyme- kháng thể nào gắn với kháng nguyên sẽ còn lại trên giếng. Bằng cách


thêm vào cơ chất của enzyme, tín hiệu phát ra đại diện cho lượng kháng nguyên
trong mẫu.

Tuy nhiên, so sánh ELISA trực tiếp với ELISA gián tiếp về mặt kỹ thuật
thì thấy, trong ELISA gián tiếp, các bước tiến hành cũng tương tự nhưng có

những khác biệt quan trọng và có thêm một bước bổ sung. Sau khi kháng
nguyên được hấp thụ vào các đĩa, và sau bước cho BSA, các kháng thể tiếp theo
sẽ được thêm vào là các kháng thể có thể nhận diện các kháng nguyên (kháng
thể này không gắn enzyme). Sau đó, một kháng thể gắn enzyme đã được chuẩn
bị và thêm vào đĩa nhằm phát hiện các kháng thể hấp phụ với kháng nguyên
(còn trong ELISA trực tiếp, phức hệ kháng thể- enzyme sẽ trực tiếp hấp thụ với
kháng nguyên).
b) ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
Phương pháp ELISA gián tiếp bao gồm hai bước ELISA liên quan đến
hai quá trình gắn của kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp được đánh dấu.
Kháng thể sơ cấp được ủ với kháng nguyên và sau đó là ủ với kháng thể thứ
cấp. Tuy nhiên, việc này có thể dẫn đến các tín hiệu không đặc hiệu bởi vì xảy
ra các phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp.


Các bước cơ bản trong ELISA gián tiếp:
1. Các đĩa giếng được ủ với kháng nguyên, rửa và khóa bằng BSA.
2. Thêm mẫu và kháng thể vào và rửa.
3. Enzyme gắn với kháng thể thứ cấp được thêm vào và rửa.
4. Thêm cơ chất, enzyme trên kháng thể tạo ra tín hiệu màu hoặc huỳnh
quang.
c) ELISA sandwich - Độ nhạy cao
ELISA sandwich là một loại ít phổ biến của kỹ thuật ELISA, nhưng rất
hiệu quả trong việc phát hiện kháng nguyên trong mẫu. Hơn nữa, nhiều bộ kit
thương mại ELISA được xây dựng dựa trên loại ELISA này.

ELISA sandwich định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng
thể bắt- capture và phát hiện- detection). Các kháng nguyên được định lượng
phải chứa ít nhất hai epitope kháng nguyên có khả năng liên kết với các kháng
thể, ít nhất là với hai kháng thể hoạt động trong kỹ thuật sandwich. Các kháng

thể đơn dòng hoặc đa dòng đều có thể được sử dụng như là các kháng thể bắt và
kháng thể phát hiện trong hệ thống ELISA sandwich. Kháng thể đơn dòng có
một epitope duy nhất cho phép phát hiện và định lượng tốt sự khác biệt nhỏ
trong kháng nguyên. Một kháng thể đa dòng thường được sử dụng như các
kháng thể bắt giữ càng nhiều kháng nguyên càng tốt. (Epitope- Quyết định
kháng nguyên, là vị trí trên kháng nguyên, nơi gắn với kháng thể).
Quy trình ELISA sandwich có thể khó khăn để tối ưu hóa và cần
phải kiểm tra các kháng thể bắt cặp sai. Điều này đảm bảo các kháng thể này
phát hiện được các epitope khác nhau trên một protein đích để chúng không cản
trở các kháng thể đang gắn.
Các bước thực hiện:
o Chuẩn bị bề mặt đã biết trước lượng kháng thể bắt được gắn.
o Khóa các vị trí bám không đặc hiệu trên bề mặt.
o Cho các mẫu có chứa kháng nguyên lên đĩa.
o Rửa đĩa, để loại bỏ các kháng nguyên không gắn.
o Thêm một kháng thể đặc hiệu vào, và gắn với kháng nguyên (do đó gọi
là "sandwich": kháng nguyên bị kẹp giữa hai kháng thể);
o Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme - đây là kháng thể phát hiện,
kháng thể này sẽ liên kết đặc hiệu với vùng Fc của kháng thể (không đặc hiệu).
o Rửa đĩa, để các liên kết enzyme- kháng thể không gắn bị loại bỏ.
o Thêm cơ chất của enzyme để tạo màu hoặc tín hiệu huỳnh quang hoặc
điện hóa.


o Đo độ hấp thụ hoặc huỳnh quang hoặc tín hiệu điện của các giếng để
xác định sự có mặt và số lượng kháng nguyên.


Phương pháp Western Blot

Western Blot là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhằm phát
hiện các protein chuyên biệt trên các mẫu mô hay dịch chiết xuất mô.
Phương pháp này sử dụng điện di trên gel để phân tách các protein còn
nguyên vẹn bằng cấu trúc 3D hay protein đã biến tính theo độ dài của mạch
polypeptide. Protein này sau đó sẽ được chuyển lên màng (thường sử dụng là
màng nitrocellulose hay màng PVDF), ở đó chúng được gắn bằng các kháng thể
đặc hiệu với protein mục tiêu. Điện di trên gel sẽ được đưa vào hệ thống phân
tích Western Blot nhằm giải quyết các vấn đề của các phản ứng chéo giữa các
kháng thể
Western Blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (Kháng nguyên –
Kháng thể). Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc
phát huỳnh quang
Các bước thực hiện:
Bước 1: Xử lý mẫu
Lấy mẫu từ toàn bộ mô hay môi trường nuôi cấy tế bào. Đầu tiên, xử lý
mô rắn bằng phương pháp cơ học sử dụng máy nghiền, sử dụng máy đồng hóa
hoặc siêu âm. Những mẫu virus hay mẫu lấy trừ trong môi trường nuôi cấy cũng
có thể là nguồn protein xác định được trong Western Blot. Thêm các loại chất
tẩy rửa, muối và dung dịch đệm để ly giải tế bào và hòa tan protein
Bước 2: Điện di trên gel
Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của
protein dựa trên điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, điện tích hoặc phối hợp
các yếu tố trên.


Phương pháp điện di phổ biến nhất là điện di trên gel polyacrylamide và
có bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS). Phương pháp SDS – PAGE (điện di
trên gel polyacrylamide và có bổ sung SDS) giữ các polypeptide ở trạng thái

biến tính sau khi chúng được xử lý với chất khử mạnh và mất đi cấu trúc bậc 2,
cấu trúc bậc 3.
Các mẫu được nạp vào trong các giếng của bản gel. Thường để lại một
giếng cho chỉ thị (marker) hoặc thang chuẩn ladder, là một sản phẩm thương
mại có chứa hỗn hợp các protein với khối lượng phân tử xác định được nhuộm
để có thể tạo ra band màu và nhìn thấy được. Khi điện thế được thiết lập trên
gel, protein bắt đầu di chuyển với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào khối lượng
phân tử của chúng. Vận tốc khác nhau của các protein (sự khác biệt về độ di
động điện di) sẽ tạo thành vạch khác nhau trên mỗi giếng.
Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai
Để các protein có thể phát hiện được kháng thể thì protein phải được
chuyển từ gel lên màng lai. Phương pháp chính để chuyển các protein được gọi
là phương pháp thẩm tách điện là sử dụng một dòng điện để kéo các protein từ
gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Các protein được chuyển lên
màng mà vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel. Kết quả là protein sẽ được
phơi ra trên lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định
Bước 4: Xử lý màng lai (Blocking)
Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên thường thực hiện các
bước để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác định
protein mục tiêu. Việc ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt
màng vào dung dịch protein loãng albumin huyết tương bò 3-5 % (BSA) hoặc
sữa bột không béo trong Tris – Buffered saline (TBS). Protein trong dung dịch
loãng sẽ gắn với màng ở tất cả các vị trí mà protein đích chưa gắn vào. Do đó
khi kháng thể được bổ sung vào, sẽ không còn chỗ bám trên màng ngoại trừ các


vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích. Điều này làm giảm nhiễu cơ bản trong
sản phẩm cuối cùng của Western Blot, cho kết quả rõ ràng và ngoại trừ hiện
tượng dương tính giả.
Bước 5: Quá trình lai và phát hiện vị trí lai

Để phát hiện các protein chuyên biệt, màng được dò protein quan tâm
bằng kháng thể đã biến đổi có khả năng liên kết với enzyme thông báo, enzyme
này khi kết hợp với một cơ chất tương ứng sẽ thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang
và tạo màu. Quá trình này diễn ra gồm 2 bước:
- Màng lai đã cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ
cấp là một kháng thể đặc hiệu được tao ra khi cho vật chủ hay môi trường nuôi
cấy tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein quan tâm.
- Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp
tục gắn kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) có gắn enzyme (thường sử dụng
horseradish peroxidase). Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc
hiệu với enzyme. Đặt 1 tấm phim ngạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện
các điểm sáng phát ra do enzyme.
Có thể sử dụng nhiều phương pháp để phát hiện kháng thể thứ cấp: sử
dụng bức xạ hồng ngoại gần liên kết với kháng thể gắn chất huỳnh quang, sử
dụng đánh dấu phóng xạ