NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS SELEN HỮU CƠ DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRONG ỐNG
NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS SELEN HỮU CƠ
DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

SVTH:

NGUYỄN THỊ DUNG

Ngành:

DƯỢC THÚ Y

Niên khóa: 2004-2009

Tháng 09/2009


NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRONG ỐNG
NGHIỆM CỦA TẢO SPIRULINA PLATENSIS CHỨA SELEN
HỮU CƠ DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

Tác giả

NGUYỄN THỊ DUNG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y-chuyên ngành

Dược ngành Dược thú y.

Giáo viên hướng dẫn
ThS. LÊ VĂN LĂNG
BSTY. ĐẶNG THỊ XUÂN THIỆP

Tháng 09 năm 2009
i


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Dung
Tên luận văn: “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của
nguyên liệu chứa Selen hữu cơ dùng trong chăn nuôi”. Đã hoàn thành luận văn theo
yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và ý kiến nhận xét, đóng góp của Hội Đồng chấm thi
tốt nghiệp Khóa ngày …./…./2009
Giáo viên hướng dẫn 1

Giáo viên hướng dẫn 2

ThS. Lê Văn Lăng

BSTY. Đặng Thị Xuân Thiệp

ii


LỜI CẢM ƠN
Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến
- Bậc sinh thành đã sinh ra, chăm sóc, dạy dỗ em để có một Nguyễn Thị Dung hôm

nay.
- ThS. Lê Văn Lăng – giảng viên Bộ môn Bào chế-Khoa Dược, Đại Học Y Dược
TP. Hồ Chí Minh, BSTY. Đặng Thị Xuân Thiệp - Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Đại Học
Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã hướng dẫn em tận tình trong mọi công việc và hỗ trợ
chu đáo tất cả mọi mặt để em hoàn thành tốt luận văn này.
- Bộ môn bào chế và phân tích - Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã
hỗ trợ trang thiết bị và môi trường làm việc chuyên môn cần thiết cho suốt quá trình
nghiên cứu của em.
- Ban giám hiệu của Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và Đại Học Y Dược TP.
Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em có một môi trường học tập đầy đủ.
- Các thầy, cô của Khoa Chăn Nuôi Thú Y nói riêng, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ
Chí Minh, đã dày công dạy dỗ, rèn luyện và truyền đạt cho em kiến thức, cho em một
hành trang để vững bước vào đời.
- Tất cả các bạn sinh viên trong lớp Dược Thú Y 30, Đại Học Nông Lâm TP. HCM
đã giúp đỡ và động viên em trong suốt 5 năm đại học, các bạn sinh viên của Đại Học
Y Dược TP. Hồ Chí Minh luôn nhiệt tình hỗ trợ em.
Một lần nữa em xin chân thành biết ơn và gửi lời chúc sức khỏe-thành công-hạnh
phúc đến tất cả mọi người.

NGUYỄN THỊ DUNG

iii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của nguyên liệu
chứa selen hữu cơ dùng trong chăn nuôi”, được tiến hành trong thời gian từ tháng
3/2009 đến 7/2009, tại Phòng nghiên cứu – Bộ môn Bào Chế - Khoa Dược – Đại Học
Y Dược TP.HCM. Đề tài là bước đầu nghiên cứu về các đặc tính cơ bản của nguyên
liệu chứa selen hữu cơ (Selen-sa). Chúng tôi đã nghiên cứu trên 4 nguyên liệu: (1) mẫu

chuẩn natri selenit (Na2SeO3), (3) tảo Spirulina platensis chứa Selen-sa có hàm lượng
Selen-sa khác nhau (0 mcg/ml - 0,2 mcg/g - 120 mcg/g. Các phương pháp đã sử dụng
trong đề tài gồm:
- Phương pháp chiết ướt để xử lý mẫu.
- Phương pháp so màu để định tính, sơ bộ định lượng selen vô cơ trong các mẫu
nguyên liệu tảo và định lượng selen hòa tan trong dịch chiết từ các mẫu tảo chứa
Selen-sa.
- Thử hoạt tính chống oxy hóa bằng hai phương pháp:
• Phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl).
• Ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp sắt II (Fe2+) Æ sắt
III (Fe2+).
Kết quả đã thu được như sau:
- Xác định nồng độ chất chiết được (cắn) trong dịch chiết các mẫu tảo.
- Định tính và sơ bộ định lượng selen vô cơ trong nguyên liệu (2,5 mcg/g tảo - <20
mcg/g tảo).Định lượng selen hòa tan trong dịch chiết các mẫu tảo có chứa hàm lượng
Selen-sa khác nhau (<50 mcg/ml dịch chiết).
- Chứng minh được natri selenit đã thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa qua 2
phương pháp thử nghiệm.
- Các mẫu tảo chứa Selen-sa và không chứa Selen-sa chưa thể hiện rõ hoạt tính
chống oxy hóa trên invitro so với mẫu chuẩn.
iv


MỤC LỤC
XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN........................................................... ii
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ iii
TÓM TẮT LUẬN VĂN................................................................................................ iv
MỤC LỤC .......................................................................................................................v
CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................................ viii
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................ ix

DANH MỤC CÁC HÌNH ...............................................................................................x
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ....................................................................................... xi
Chương 1: MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
U

1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu.................................................................................................2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu ..................................................................................................................2
Chương 2: TỔNG QUAN .............................................................................................3
2.1. Đại cương về Selenium ............................................................................................3
2.1.1. Nguyên tố Selen ....................................................................................................3
2.1.2. Tính chất hóa học ..................................................................................................3
2.1.3. Định tính và định lượng.........................................................................................4
2.1.3.1. Định tính .............................................................................................................4
2.1.3.2. Định lượng..........................................................................................................5
2.1.4. Phân bố và dạng sử dụng.......................................................................................6
2.1.4.1. Phân bố trong tự nhiên .......................................................................................6
2.1.4.2. Dạng sử dụng......................................................................................................7
2.1.5. Chức năng sinh học của Selen trong cơ thể động vật............................................7
2.2. Tổng quan về nguyên liệu chứa Selen-sa – tảo Spirulina platensis.........................8
2.2.1. Lịch sử ...................................................................................................................8
2.2.2. Phân loại ................................................................................................................9
2.2.3. Phân bố ..................................................................................................................9
2.2.4. Mô tả cấu tạo .........................................................................................................9
v


2.2.5. Đặc điểm dinh dưỡng của Spirulina platensis ......................................................9
2.2.7. Thành phần hóa học trong Spirulina platensis (S. platensis)..............................10

2.2.8. Quá trình trồng, thu hoạch và sản xuất nguyên liệu S. platensis ở Việt Nam.....11
2.2.9. Đặc điểm và vai trò của Selen-sa ........................................................................11
2.2.9.1. Đặc điểm...........................................................................................................11
2.2.9.2. Vai trò ...............................................................................................................12
2.2.10. Chỉ số xác định hoạt tính chống oxy hóa của selen-sa trên động vật thí nghiệm
(invivo) ..........................................................................................................................12
Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................14
U

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................14
3.2. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................14
3.2.1. Nguyên liệu .........................................................................................................14
3.2.2. Trang thiết bị .......................................................................................................14
3.2.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu .........................................................................15
3.3. Nội dung thực hiện .................................................................................................15
3.4. Phương pháp tiến hành ...........................................................................................16
3.4.1. Xử lý mẫu - xác định nồng độ cắn trong dịch chiết thu được của 3 nguyên liệu
mẫu thử tảo S. platensis và mẫu chuẩn natriselenit (Na2SeO3).....................................16
3.4.2. Định tính selen vô cơ trong nguyên liệu tảo S. platensis – định lượng Selen-sa
trong dịch chiết thu được...............................................................................................16
3.4.2.1. Lập phương trình đường chuẩn của natri selenit qua phản ứng màu ...............16
3.4.2.2. Phản ứng định tính của selen tự do trong nguyên liệu tảo ...............................17
3.4.2.3. Phản ứng định lượng của selen-sa trong dịch chiết của nguyên liệu tảo S.
platensis .........................................................................................................................17
3.4.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) của natri selenit và các dịch chiết thu
được từ tảo S. platensis..................................................................................................17
3.4.3.1. HTCO của natri selenit và các dịch chiết tảo S. platensis thu được qua phản
ứng đánh bắt gốc tự do DPPH (1,1-Diphenyl Picry Hydrazyl).....................................17
3.4.3.2. HTCO của natri selenit và các dịch chiết tảo S. platensis thu được qua phản
ứng ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp Fe2+ ..........................20

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................22
vi


4.1. Kết quả xử lý mẫu - xác định nồng độ cắn trong dịch chiết thu được của 3 mẫu
nguyên liệu tảo S. platensis và mẫu chuẩn natriselenit (Na2SeO3) ...............................22
4.1.1. Kết quả xử lý – xác định nồng độ của mẫu chuẩn natriselenit............................22
4.1.2. Kết quả xử lý – xác định nồng độ cắn trong dịch chiết của các mẫu thử S.
platensis ở những môi trường khác nhau ......................................................................22
4.2. Định tính selen vô cơ trong nguyên liệu tảo S. platensis – định lượng Selen-sa
trong dịch chiết thu được...............................................................................................24
4.2.1. Đường chuẩn màu của dung dịch chuẩn natri selenit..........................................24
4.2.2. Phản ứng định tính – sơ bộ định lượng selen vô cơ trong mẫu thử.....................25
4.2.3. Định lượng Selen-sa trong dịch chiết của tảo ở các môi trường khác nhau........26
4.3. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) của các dịch chiết nguyên liệu tảo S.
platensis .........................................................................................................................27
4.3.1. Kết quả HTCO của các dịch chiết tảo S. platensis thu được qua phản ứng đánh
bắt gốc tự do DPPH (1,1-Diphenyl Picry Hydrazyl).....................................................27
4.3.1.1. Kết quả HTCO của mẫu chứng natri selenit ....................................................27
4.3.1.2. Kết quả HTCO của các mẫu thử chiết bằng methanol ở pH = 1,2...................30
4.3.2. Kết quả HTCO của mẫu chuẩn và các mẫu thử qua phản ứng ngăn chặn hình
thành gốc tự do gián tiếp trong kim loại chuyển tiếp Fe2+ ............................................31
4.3.2.1. Phổ UV của Fe2+ (10 mcg/ml) với thuốc thử Ferren (2 mM/l).........................31
4.3.2.2. Đường chuẩn của Fe2+ bị oxy hóa trong không khí..........................................32
4.3.2.3. Kết quả sự ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp Fe2+ của
mẫu chuẩn và các mẫu thử tảo.......................................................................................34
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................37
5.1. Kết luận...................................................................................................................37
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................39

PHỤ LỤC ......................................................................................................................41

vii


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
C

: Mẫu tảo có Selen-sa cao

CCl4

: Tetra clorua cacbon

DPPH

: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

GSH

: Glutathion

GSSG

: Glutathione disulfid

HTCO

: Hoạt tính chống oxy hóa

Invitro

: Nghiên cứu ở phòng thí nghiệm

Invivo

: Nghiên cứu trên động vật thí nghiệm

K

: Mẫu tảo không chứa Selen-sa

MDA

: Malonyl dialdehyd

ODchứng

: Độ hấp thu của mẫu đối chứng

ODthử

: Độ hấp thu của mẫu thử

POL

: Peroxy hóa lipid

Selen-sa

: Selenium rich spirulina algae

T

: Mẫu tảo có Selen-sa thấp

viii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Nồng độ selen hữu cơ trong mẫu thử ..........................................................14
Bảng 3.2. Danh sách hóa chất dùng cho thí nghiệm....................................................15
Bảng 3.3. Hỗn hợp phản ứng DPPH ............................................................................19
Bảng 3.4. Hỗn hợp phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển
tiếp (Fe2+)......................................................................................................................21
Bảng 4.1. Nồng độ cắn của các mẫu thử sau khi xử lý bằng các dung môi khác nhau
......................................................................................................................................23
Bảng 4.2. Kết quả độ hấp thu màu của selenit với thuốc thử ......................................24
Bảng 4.3. Kết quả nồng độ Selen-sa suy ra từ phương trình y = 0,0058x + 0,3019....26
Bảng 4.4. Kết quả HTCO của selenit về khả năng bắt gốc tự do DPPH ở 3 pH = 1,2 –
7,0 – 6,8 ........................................................................................................................29
Bảng 4.5. Kết quả HTCO của các mẫu thử về khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH ...30
Bảng 4.6. Kết quả quét phổ UV của Fe2+ (10 mcg/ml) với thuốc thử Ferren (2 mM/l)
..................................................................................................................................... 32
Bảng 4.7. Kết quả sự oxy hóa của Fe2+ ngoài không khí theo thời gian......................33
Bảng 4.8. Kết quả ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp Fe2+ của
mẫu chuẩn và các mẫu thử ...........................................................................................34

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Tảo Spirulina platensis nhìn dưới kính hiển vi .............................................9
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình sản xuất nguyên liệu tảo Spirulina platensis ở Việt Nam..11
Hình 3.1. Máy đo quang UV-vis..................................................................................18
Hình 4.1. Dịch chiết các mẫu thử thu được ở các môi trường khác nhau ...................22
Hình 4.2. Phản ứng màu của dung dịch selenit từ trái qua phải : dd 1mcg/20 ml - dd 10
mcg/20 ml - 20 mcg/20 ml - dd 30 mcg/20 ml - dd 50 mcg/20 ml - dd 100 mcg/20 ml........24

Hình 4.3. Phản ứng màu định lượng sơ bộ selen trong mẫu nguyên liệu (K,T,C) ......25
Hình 4.4. Phản ứng màu định lượng Selen – sa trong dịch chiết các mẫu thử............26
Hình 4.5. Màu phản ứng oxy hóa Fe2+ ngoài không khí theo thời gian ......................32
Hình 4.6. Phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự do trong kim loại chuyển tiếp .......36

x


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng môi trường chiết lên nồng độ cắn thu được .........................23
Biểu đồ 4.2. Đồ thị đường chuẩn nồng độ của selenit ở dãy nồng độ tuyến tính........25
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng môi trường chiết lên nồng độ Selen-sa trong mẫu thử .........27
Biểu đồ 4.4. Phổ UV-vis của DPPH ............................................................................28
Biểu đồ 4.5. Đồ thị đường chuẩn của selenit trong phản ứng với DPPH ....................28
Biểu đồ 4.6. Phổ UV của Fe2+ (10 mcg/ml) với thuốc thử Ferren (2mM/l).................31
Biểu đồ 4.7. Đồ thị phương trình đường chuẩn nồng độ (%) của Fe2+ ........................33
Biểu đồ 4.8. Đồ thị HTCO của selenit trong phản ứng ngăn chặn hình thành gốc tự do
trong kim loại chuyển tiếp (Fe2+) .................................................................................35

xi

Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Từ lâu, trong chăn nuôi gia súc, gia cầm vai trò của các chất như kháng sinh,
hormon tăng trưởng…là rất quan trọng. Nó quyết định năng suất thịt và đưa đến hiệu
quả kinh tế rất lớn cho người chăn nuôi. Vì thế mà nhiều người đã lạm dụng chúng và
hậu quả dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh, hormon trong thực phẩm gây ngộ độc
cho người tiêu dùng và tình trạng đề kháng thuốc của vi khuẩn, virut trong chăn nuôi
và cả cho con người.
Do vậy, để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm xu hướng hiện nay cho nông dân là
sản suất thực phẩm sạch (thịt sạch, rau sạch,…). Có nhiều biện pháp để sản xuất thịt
sạch như kiểm soát chặt việc sử dụng thuốc trong chăn nuôi, tăng sức đề kháng cho
thú nuôi (vaccin, thức ăn dinh dưỡng,…), sử dụng cây thuốc trong chăn nuôi,….
Trong đó, giải pháp đề xuất trong Hội thảo chuyên đề khu vực châu Á – Thái Bình
Dương về vấn đề: “Chăn nuôi không cần kháng sinh” do tập đoàn Alltech
Biotechnology tổ chức là rất đáng quan tâm. Tại hội thảo, tập đoàn này đã đưa ra nhiều
sản phẩm thức ăn cho gia súc, gia cầm, thủy sản,… để tăng năng suất vật nuôi, tăng
tính an toàn cho thực phẩm và trong sạch môi trường. Trong những sản phẩm đó có
một sản phẩm sử dụng selen hữu cơ nhằm tăng sức đề kháng, tăng chất lượng thịt, hạn
chế một số bệnh xảy ra trên động vật do thiếu selen gây ra.
Hiện nay, selen hữu cơ đã được sản xuất thực nghiệm trong nước như selen trong
men bia, selen trong Linh chi, selen trong tảo,…. Nhóm nghiên cứu của trường Đại
học Y Dược TP.Hồ Chí Minh do ThS. Lê Văn Lăng làm chủ trì đã sản xuất thành công
selen hữu cơ ở qui mô nhỏ (pilot) và sắp tới đây sẽ đưa vào sản xuất công nghiệp phục
vụ cho con người và cả cho chăn nuôi. Nguyên liệu đã và đang được thử nghiệm trên
động vật và trên người. Nhóm nghiêm cứu đã và đang có nhiều thử nghiệm selen hữu
1

cơ trên động vật và trên người nhưng chưa có một thử nghiệm nào chứng minh hiệu
quả chống oxy hóa của selenium và selen hữu cơ trong ống nghiệm. Vì thế, được sự
đồng ý của Bộ môn Bào Chế - Khoa Dược, Trường Đai học Y Dược TP. Hồ Chí
Minh, dưới sự hướng dẫn của của ThS. Lê Văn Lăng và sự giúp đỡ tận tình của BSTY.
Đặng Thị Xuân Thiệp Bô môn Nội Dược - Khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Trường Đại học
Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh; chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính
chống oxy hóa trong ống nghiệm của nguyên liệu chứa selen hữu cơ dùng trong
chăn nuôi”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu bước đầu về những đặc tính cơ bản của selen hữu cơ trong ống nghiệm
của sinh khối tảo Spirulina platensis chứa Selen-sa được dùng làm thuốc cho người và
thức ăn dinh dưỡng cho động vật.
1.2.2. Yêu cầu
Xử lý các mẫu nguyên liệu bằng phương pháp chiết ướt qua những dung môi khác
nhau.
Định tính và sơ bộ định lượng selen vô cơ trong nguyên liệu tảo chứa Selen-sa
bằng phản ứng màu.
Định lượng Selen-sa trong dịch chiết nguyên liệu tảo Spirulina platensis chứa
Selen-sa dựa vào phương trình đường mẫu chuẩn.
Đánh giá khả năng chống oxy hóa trong ống nghiệm của Spirulina platensis chứa
Selen-sa.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1. Đại cương về Selenium

2.1.1. Nguyên tố Selen
Nguyên tố Selen, tên quốc tế là Selenium, được Berzelius (1779-1848) nhà hóa học
người Thụy Điển phát hiện năm 1817, như một chất thừa trong quá trình oxy hóa SO2
từ quặng đồng pyrit của quá trình sản xuất acid sulfuric (H2SO4). Trong bảng tuần
hoàn các nguyên tố, selen ở nhóm VIA, cùng với oxy, lưu huỳnh,.… Công thức
electron lớp ngoài cùng: 4s24p4.
2.1.2. Tính chất hóa học
Selen rất giống lưu huỳnh. Trong hóa học vô cơ, cả lưu huỳnh và slelen đều thể
hiện mức oxy hóa -2, +4, +6 tương ứng với các hợp chất: sulfid-selenid, sulfit-selenit,
sulfat-selenat. Với nhiều hợp chất hữu cơ của lưu huỳnh. Selen có thể thay thế vị trí
của lưu huỳnh trong các hợp chất đó, cho những hợp chất tương tự của selen như:
cystein và selenocystein, methionin và selenomethionin, các enzym chứa nhóm –SeH
tương tự như các enzym chứa nhóm –SH, …
Ở mức oxy hóa +4, selen tồn tại dạng selen dioxyd (SeO2), acid seleno (H2SeO3) và
muối selenit (SeO32-). Selen nguyên tố cháy trong không khí thành dạng SeO2. Ở mức
oxy hóa +6, selen tồn tại dạng acid selenic (H2SeO4) hoặc muối selenat (SeO42-).
H2SeO4 là dạng acid mạnh hình thành do quá trình oxy hóa selen hoặc H2SeO3 dưới
xúc tác của các tác nhân oxy hóa mạnh như: NaBrO3/NaHCO3 hoặc Br2, Cl2,
H2O2/H2O.
Khi ở dạng oxy hóa -2, Selen tồn tại dưới dạng Selenid (Se2-). Hydro Selenid
(H2Se) là một acid khá mạnh. Ở thể khí, nó không màu và độc tính khá cao. H2Se được
hình thành do sự thủy phân của hợp chất selenid kim loại hoặc do selen nguyên tố bị

3


phân hủy trong không khí ở điều kiện 400oC. H2Se không bền trong không khí, nó dễ
dàng phân hủy thành selen và nước.
Các hợp chất selen đáng chú ý trong dinh dưỡng và sức khỏe là các dạng methyl
hóa của selen như: (CH3)2Se, (CH3)2Se+, các dạng selen hữu cơ là các selenoacid amin

như: selenocystin, selenocystein, selenomethionin,…

2.1.3. Định tính và định lượng
2.1.3.1. Định tính
( Phương pháp khử Selen (IV,VI) về Selen nguyên tố: khử các hợp chất của selen
(IV) hoặc selen (VI) về trạng thái Se0. Nếu hàm lượng selen trong mẫu cao sẽ xuất
hiện kết tủa đỏ. Nếu hàm lượng selen trong mẫu thấp thì sẽ tạo thành dung dịch keo có
màu từ đỏ - đỏ cam - vàng cam - vàng.
Thí dụ: Phản ứng với SO2 trong môi trường acid mạnh: tạo dung dịch đỏ cam, thêm
acid nitric (HNO3) dung dịch sẽ mất màu và trở nên trong suốt. Dung dịch keo nói trên
sẽ ổn định trong vài tuần - phản ứng với thioure trong môi trường acid mạnh: tạo kết
tủa đỏ và tan trong thioure thừa và phản ứng với iodid trong môi trường trung tính: cho
kết tủa đỏ, khi thêm thioure thì màu đỏ vẫn không mất.
( Phương pháp tạo phức
Với anonimolypdat: selen (IV) và selen (VI) tạo thành phức xanh lơ.
Với các O-diamino thơm: Phản ứng nhạy và chọn lọc, nhất là sự tạo phức giữa
selen (IV) với 3-3’ diaminobenzidin.
( Phương pháp động học xúc tác
Selen xúc tác cho phản ứng khử xanh methylen bằng natri sulfid (Na2S), xanh
methylen sẽ mất màu nhanh nếu mẫu thử có chứa vết selen (so với mẫu đối chứng).
4


2.1.3.2. Định lượng
( Phương pháp phân tích khối lượng
Nguyên tắc: chuyển những hợp chất selenat (SeO42-), selenit (SeO32-) trong các
mẫu thử về selen nguyên tố kết tủa đỏ nhờ thuốc thử khác nhau như: SO2+, muối Fe2+,
Cu2+, thioure,….
Cách khác, có thể dùng thuốc thử O-diamino thơm tạo phức dipiazoselennol kết
tủa, lại rửa tủa đó, sấy, cân tính kết quả.

( Phương pháp đo quang
Đo quang dung dịch keo selen hoặc đo quang nhờ phản ứng tạo phức giữa selen
(IV) với các thuốc thử O-diamino thơm.
Nguyên tắc của phản ứng tạo phức: selen phản ứng rất nhạy và rất chọn lọc với
các O-diamino thơm, tạo phức piazoselenol. Trong các dung môi hữu cơ, phức này có
cực đại hấp thu rất đặc trưng, do đó có thể đo quang để xác định hàm lượng Selen
trong các mẫu thử. Trong số các thuốc thử thì 3,3’-diaminobenzidin là được dùng phổ
biến nhất. Ngoài ra cũng có thể dùng 2,3-diaminonaphtalen (Dược điển Mỹ 24).
Tiến hành: selen (IV) trong môi trường vô cơ hóa được chuyển sang môi trường
HCl 6N. Điều chỉnh độ pH của dung dịch đến 2-3 bằng NH4OH (1:1). Thêm
complexon (III) và HCOOH 2,5M. Thêm dung dịch thuốc thử 3-3’-diaminobenzidin
0,5% vừa pha, để chỗ tối khoảng 1 giờ. Nâng pH lên 8 và chiết bằng toluen. Đo quang
ở bước sóng 420 nm để định lượng Selen.
( Phương pháp huỳnh quang
Nguyên tắc: Phức piazoselenol tạo thành giữa selen (IV) và các O-diamino thơm
phát huỳnh quang ở bước sóng thích hợp. Do đó, có thể đo cường độ huỳnh quang để
định lượng Selen.
Với 3-3’-diaminobenzidin: selen (IV) sẽ tạo phức monopiazoselenol. Trong dung
môi hữu cơ, phức này phát huỳnh quang ở bước sóng 580 nm, với bước sóng kích
thích là 436 nm.

5


Với 2,3-diaminonaphtalen: Mẫu thử được nghiền nhỏ, vô cơ hóa trong bình
Keldan bằng hỗn hợp HNO3 + HClO4, pha loãng dịch vô cơ hóa bằng nước cất. Thêm
vào đó dung dịch Trilon B 0,2M và dung dịch NH4OH 10%, đưa pH đến 2. Thêm
dung dịch hydroxylamin 1%. Sau đó thêm dung dịch thuốc thử 2,3-diaminonaphtalen.
Đậy dung dịch và giữ ở 800C trong 30 phút. Chiết bằng n-hexan. Phức piazoselenol
phát huỳnh quang ở bước sóng 520 nm, với bước sóng kích thích là 380 nm.

( Phương pháp cực phổ
Nguyên tắc: đưa selen trong mẫu về dạng selen (IV) rồi đem đo trên thiết bị cực
phổ giọt thủy ngân với dung dịch điện ly nền là acid. Dưới điện thế một chiều biến
thiên từ 0 đến 1000 mV, selen bị khử ở catod cho 2 thế bán sóng. Đem đo cường độ
dòng khuếch tán giới hạn tại thế bán sóng thứ 2 sẽ xác định được nồng độ selen trong
dung dịch đo, từ đó tính được hàm lượng selen trong mẫu thử.
2.1.4. Phân bố và dạng sử dụng
2.1.4.1. Phân bố trong tự nhiên
Selen phân bố rộng rải trên quả đất với hàm lượng trung bình 0,09 ppm. Ta thường
gặp selen trong các loại đất đá, khoáng sản, trong nguyên liệu hóa thạch, nước và trong
cây. Hàm lượng selen trong đất thay đổi từ 0,1 - 2,0 ppm tùy thuộc vào lượng
Hydroxyd sắt (Fe(OH)3). Ngoài ra còn phụ thuộc vào đất mùn hay đất chứa nhiều
cacbonat. Đặc biệt như ở Hawai hàm lượng selen có trong đất 6-15 ppm do đất ở vùng
này có nhiều Fe(OH)3. Se6+ là dạng selen hòa tan chính trong đất.
Theo tổ chức y tế thế giới qui định hàm lượng selen trong nước không được quá 10
μg/l. Thực tế trong tự nhiên hàm lượng selen trong nước rất thấp, nhất là trong nước
biển và đại dương chỉ khoảng 0,09 μg/l. Điều này có thể giải thích là do sự lắng đọng
giữa các muối selenit (SeO32-) với các oxyt kim loại.
Ngoài ra selen còn phân bố trong thực vật (cây Astragalus species, cây trinh nữ Mimosa pudica L, keo đậu – Leucaena glauca Benth), tảo (Spirulina), nấm
(Saccharomyces cerivisiae) với hàm lượng thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố.

6


2.1.4.2. Dạng sử dụng
Hiện nay, do tính an toàn, ít độc và dễ sử dụng mà người ta đang dần thay thế selen
vô cơ bằng những hợp chất selen hữu cơ. Dạng selen hữu cơ thường dùng là:
selenomethionine, selenocystein, nấm men, tảo Spirulina platensis, nấm linh chi, …bổ
sung cho những vùng có nguy cơ thiếu selen trong tự nhiên và đáp ứng nhu cầu sinh lý
cho cơ thể vật nuôi.

2.1.5. Chức năng sinh học của Selen trong cơ thể động vật
Selen cần thiết cho sự sinh trưởng và sự thụ tinh. Nhiều tác giả ghi nhận trường
hợp bệnh lý trên động vật thí nghiệm được nuôi bằng khẩu phần ăn thiếu selen như:
hoại tử gan trên chuột, thoái hóa cơ và gan trên heo cũng như bệnh cơ trắng trên bò.
Các triệu chứng này được phòng ngừa và điều trị bằng các hợp chất chứa selen.
Selen là thành phần quan trọng của enzym Glutathione peroxidase. Enzym này
được tinh khiết hóa từ hồng cầu cừu, phân tử là một tứ hợp và mỗi đơn vị protein có
chứa 0,34% selen. Phản ứng sinh hóa học với sự xúc tác của Glutathione peroxidase
và cơ chất là Peroxide hydro xảy ra như sau:
2G-SH + H2O2

G-S-S-G + 2 H2O

2G-SH + ROOH

G-S-S-G + ROH + H2O

Với cơ chế phản ứng hóa học này Glutathione ở dạng khử bảo vệ được màng Lipid
và các thành phần khác của tế bào như: bảo vệ Hemoglobin khỏi bị tác động hủy hoại
của Peroxide hydro. Glutathione ở dạng oxy hóa được phục hồi trở lại dạng khử như
sau:

Ngoài ra, selen còn tham gia vào quá trình sinh hóa khác như cơ chế miễn dịch,
sinh tổng hợp Ubiquinone và sinh tổng hợp ATP trong ty thể của tế bào động vật.
Selen có mối tương quan với vitamin E: nếu Vitamin E có tác dụng ngăn ngừa sự
thành lập peroxide hydro từ các acid béo và tham gia vào quá trình biến dưỡng của các
7


acid amin chứa lưu huỳnh (như cystein tiền chất của glutathione) thì Selen có tác dụng

phá hủy peroxide hydro trong mô bào động vật. Điều này có ý nghĩa hết sức quan
trọng trong việc bảo vệ màng tế bào tránh khỏi sự tấn công của các gốc tự do (FR),
còn gọi là Peroxid, đây cũng là tác nhân gây ung thư.
Selenium tham gia vào cấu tạo enzym glutathione peroxydase để phá hủy các
peroxid sinh ra trong cơ thể, vì vậy selen bảo vệ được tổ chức tế bào thành mạch, tránh
sự oxy hóa trực tiếp gây hư hại. Cũng vì thế selen có mối quan hệ tương tác cùng với
vitamin E trong việc chống oxy hóa. Vì thế khi thiếu selen thì triệu chứng thiếu
vitamin E trở nên trầm trọng hơn. Tuy nhiên, selen và vitanim E không thể thay thế
cho nhau trong các chức năng sinh học.
Sự hấp thu selen nói riêng và các khoáng vi lượng nói chung phải nhờ vào một
phức hợp protein gọi là Chelate. Nhờ sự gắn kết này mà các ion kim loại không bị kết
tủa. Selen hữu cơ (selenomethionine, selenocystein) được tổng hợp nhờ gắn vào cơ
chất như: nấm men, nấm Linh chi, tảo Spirulina platensis,…. Chúng được đưa đến các
tổ chức mô bào để thực hiện chức năng sinh học một phần, một phần đi vào tổng hợp
protein bắp cơ, protein mô, một phần khác tham gia cấu tạo nên enzym Glutathionperoxydase.
2.2. Tổng quan về nguyên liệu chứa Selen-sa – tảo Spirulina platensis
2.2.1. Lịch sử
Thời cổ xưa, 2 bộ tộc (Aztec – Mexico - Châu Mỹ; Kanembu - Châu Phi), thu rong
từ tự nhiên cho vào nuôi trong hồ và dùng làm thức ăn dinh dưỡng.
Sự phát triển tảo này ra khắp thế giới cũng vào năm 1492, năm mà Christophe
Colomb tìm ra Châu Mỹ.
Tảo S. platensis được phát hiện và sản xuất công nghiệp từ năm 1960 ở Mexico,
Mỹ và nhiều nước khác trên thế giới.
Đến năm 1972 Viện Khoa học Việt Nam đã bắt đầu nhập Spirulina về nghiên cứu.
Cho đến nay, trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng thì Spirulina đã rất phổ
biến trên người và đang có khuynh hướng chuyển sang thú y để sản xuất thịt sạch.

8

2.2.2. Phân loại
Spirulina là tên gọi được đặt bởi nhà tảo học người Đức Deurben, năm 1927 dựa
vào hình thái sợi xoắn. Nó là một loài vi tảo xanh, có tên khoa học là Arthrospira
platensis
Phân loại theo tên khoa
học
Ngành:

Cyanophyta

(ngành tảo lam)
Lớp: Oscillatoriales
Họ: Oscillatoriaceae
Chi: Spirulina (tảo xoắn)
Loài: Platensis
Hình 2.1. Tảo Spirulina platensis nhìn dưới kính hiển vi
2.2.3. Phân bố
Spirulina sống trong tự nhiên ở những vùng nước kiềm pH 8 - 11, trong hồ, suối
khoáng, ấm áp. Loài tảo Spirulina platensis được tìm thấy ở nhiều nước. Tảo này
thường được phân tán nhờ Hồng Hạc cư trú theo mùa.
2.2.4. Mô tả cấu tạo
Theo Fremy (1930), cơ thể hiển vi có dạng xoắn lò xo với 5 - 7 vòng xoắn đều
nhau, không phân nhánh, không có bao, không có vách ngăn tế bào. Trong tế bào có
những hạt nhỏ phân bố sát màng tế bào, không có không bào khí. Sợi nấm dài 1,5 mm,
chiều rộng 5,5 - 6,5 micron, đầu sợi hơi thun lại.
2.2.5. Đặc điểm dinh dưỡng của Spirulina platensis
Tảo Spirulina là sinh vật tự dưỡng bắt buộc, không thể sống hoàn toàn trong tối,
quang hợp nhờ ánh sáng mặt trời và có khả năng cố định đạm rất cao và sinh sản bằng
cách phân chia - cắt đôi (Keeton, 1967).

9


Môi trường dinh dưỡng của Spirulina platensis:
- Các dưỡng chất: Carbon, nitơ, các khoáng đa lượng và vi lượng,… cũng nhạy
với một số chất ức chế và kích thích tăng trưởng.
- Các điều kiện lý hóa thích hợp: pH, áp suất thẩm thấu, ánh sáng, nhiệt độ, điều
kiện khuấy trộn,…
- Các quy trình sản xuất sinh khối có thể là nhân tạo hoặc bán nhân tạo, bổ sung
nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng khoan,…
2.2.7. Thành phần hóa học trong Spirulina platensis (S. platensis)
Theo Lê Văn Lăng (1999), Spirulina platensis chứa hơn 60% chất đạm (protein) là
nguồn cung cấp chất tạo hình cao hơn thịt bò (18%), gia cầm (19%), sữa tươi (3,7%)
và trứng (14%). Đặc biệt, đạm trong tảo Spirulina là tổng hợp của hơn 18 loại acid
amin, trong đó có 8 loại là thiết yếu và tất cả đều dễ tiêu hóa (đến 95%) do bản chất
làm đạm thực vật.
S. platensis còn là nguồn bổ sung nhiều loại vitamin như: Vitamin A, vitamin E,
vitamin B complex (B1, B2, B6, B12),… với hàm lượng B12 gấp đôi gan bò, lượng
beta - carotene cao hơn 20 lần trong cà rốt, lượng vitamin E thì gấp đôi mầm lúa mì. S.
platensis giàu khoáng chất cần thiết cho cơ thể và xương khớp như kali, canxi, magiê,
sắt, kẽm,… và giàu axit béo thiết yếu và chất xơ.
Ngoài ra, S. platensis còn chứa nhiều chất chống lão hóa (để bảo vệ tế bào) quan
trọng như: Phycocianin, chlorophyl và carotenoid,… đã góp phần làm cho S. platensis
hoàn toàn khác biệt và độc nhất so với các loại thực phẩm thiên nhiên khác.

10


2.2.8. Quá trình trồng, thu hoạch và sản xuất nguyên liệu S. platensis ở Việt Nam
Sơ đồ quy trình:

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình sản xuất nguyên liệu S. platensis ở Việt Nam
Để tảo S. platensis có chứa selen thì môi trường nuôi phải bổ sung hợp chất selenit
vào bể hóa chất với nồng độ phù hợp và theo dõi pH, nhiệt độ, chất dinh dưỡng, tốc độ
khuấy trộn, ... theo dõi sự phát triển, thu sinh khối tảo.
2.2.9. Đặc điểm và vai trò của Selen-sa
2.2.9.1. Đặc điểm
Selen-sa là một hình thức selen hữu cơ được sản xuất nhờ vào tảo S. platensis sử
dụng selenium vô cơ chuyển hóa thành. Selen-sa là những selenoamino và dạng liên
kết với các axit amin giúp selen dễ dàng được hấp thu và dự trữ, đặc biệt ít gây độc
tính ở liều cao.
S. platensis sử dụng Se vô cơ dạng Na2SeO3, gắn selen lên các đoạn pepid khác
nhau và tổng hợp nên những selenium pepid có tác dụng chống oxy hóa (antioxidant)
và nhiều tác dụng khác.
11


2.2.9.2. Vai trò
Theo Karl Dawson () - Giám đốc nghiên cứu toàn cầu
của Alltech – tập đoàn đứng đầu về sản phẩm selen hữu cơ cho thấy những vài trò của
Selen-sa như :
Là nguồn Selenium hữu cơ rất an toàn.
Tăng độ hữu dụng sinh học của Selenium.
Giúp tăng năng suất sinh sản ở heo nái (25 con/năm đến 30 con/năm).
Giúp tăng trưởng tốt cho heo.
Cải thiện chất lượng quầy thịt.
Cải thiện nguồn gen sinh sản
Cải thiện tốc độ mọc lông ở gà trống.
Selen-sa là một yếu tố trong hệ thống enzym chống oxy hóa (Surai,2006)
2.2.10. Chỉ số xác định hoạt tính chống oxy hóa của selen-sa trên động vật thí

nghiệm (invivo)
Để xác định hoạt tính chống oxy hóa có rất nhiều phương pháp như:
Trên ống nghiệm (invitro)
Khả năng bắt gốc tự do DPPH
Mô hình beta caroten
Ngăn chặn hình thành gốc tự do,...
Trên invivo, người ta có thể dựa vào 2 chỉ số sau :
Malonyl dialdehyl (MDA)
Để đánh giá khả năng ức chế quá trình peroxyd hóa lipid (POL), chúng tôi đo hoạt
tính chống oxy hóa (HTCO) invivo ở gan theo phương pháp của UI.A.Vladimirob và
A.I.Archakob (1972).
Nguyên tắc: Các gốc tự do hay các dạng oxy hóa hoạt động tăng lên rất mạnh do
CCl4 chuyển hóa trong gan. Đó là nguyên nhân làm cho quá trình POL tăng mạnh, gây
12


tổn thương màng và viêm hoại tử gan. Sản phẩm cuối cùng của quá trình POL là
MDA. Chất này có thể xác định bằng cách cho tạo phức với acid thiobarbituric cho
màu hồng bền vững. Đo cường độ màu có thể xác định hàm lượng MDA trong mẫu.
Lượng MDA trong mẫu thử giảm đi so với mẫu chứng cho biết khả năng ức chế quá
trình POL của chất thử được gọi là HTCO.
Glutathion (GSH)
GSH là một tripeptid – một chuỗi 3 amino acid : Cystein, glycin và glutamic acid,
được tìm thấy trong hàng loạt các mô, tế bào động vật. GSH là yếu tố chống oxy hóa
chủ yếu của cơ thể.
GSH tồn tại dưới dạng khử và giữ cân bằng dưới dạng oxy hóa (GSSG) – một
disulfid. Hàm lượng GSH trong mẫu đo được xác định bằng thuốc thử 2,2’-dinitro5,5’-dithio-dibenzoic acid với phép đo cường độ màu của sản phẩm hình thành ở λmax =
412 nm, theo phương pháp của G.A.Hazenton và C.A.Lang (1980).

13