Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất lignan và stilbene

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THANH TÂM

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG
OXI HÓA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA
MỘT SỐ HỢP CHẤT LIGNAN VÀ
STILBENE

Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH
Mã số: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. NGUYỄN THỊ THANH MAI
2. GS. OLE VANG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010
I



Lời Cảm Ơn



Trước tiên, tôi xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Thanh Mai,
người đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt

quá trình thực hiện luận văn này.
Xin cảm ơn tất cả các thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu
trong suốt quá trình học tập nghiên cứu chương trình sau đại học
Xin cảm ơn các thầy cô thuộc dự án DANIDA đã tạo điều kiện cho tôi được
thực hiện luận văn tại trường Đại Học Roskilde – Đan Mạch
Xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Nhân, người đã cung cấp mẫu thử và cung
cấp nhiều lời khuyên quý báu trong quá trình thực hiện đề tài
Và cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đặc biệt các bạn trong lớp cao
học phân tích K16, những người luôn bên tôi động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn
thành tốt luận văn thạc sĩ này.

Thành phố Hồ Chí Minh tháng 1, 2010.


II

MỤC LỤC

Trang phụ bìa
Lời Cảm Ơn I
MỤC LỤC II
DANH MỤC CÁC BẢNG VII
DANH MỤC CÁC HÌNH VIII
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ IX
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ X
1. Giới thiệu đề tài 1
2. Giới thiệu một số phƣơng pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 3
2.1 Khái niệm về gốc tự do 3
2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể 3
2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể 4

2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 6
2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 6
2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 7
2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA 9
2.4.4 Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating
activity) 10
2.4.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 10
2.4.5.1 Giới thiệu 10
2.4.5.2 Cấu tạo 10
2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO 10
2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 11
3. Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 12
III

3.1 Nuôi cấy tế bào 12
3.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 13
3.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào 13
3.2.2 Phƣơng pháp SRB 13
4. Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene 14
4.1 Lignan 14
4.1.1 Isotaxiresinol (ITR) 15
4.1.2 Secoisolariciresinol

(SSR) 15
4.2 Stilbene 16
4.2.1 Resveratrol (RES) 17
4.2.2 Pterostilbene (PTS) 18
4.2.3 Piceatannol (PI) 19
5. Kết quả và thảo luận 21
5.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa 21

5.1.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 21
5.1.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 25
5.1.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO 27
5.1.4 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa 28
5.2 Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào 31
5.2.1 Isotaxiresinol 31
5.2.2 Secoisolariciresinol 34
5.2.3 Resveratrol, Pterostilbene và Piceatannol 37
5.2.4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào 42
6. Thực nghiệm 45
6.1 Hóa chất và dụng cụ 45
6.1.1 Hóa chất 45
IV

6.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 46
6.1.3 Chuẩn bị mẫu 47
6.1.4 IC
50
và cách xác định 48
6.1.4.1 Định nghĩa 48
6.1.4.2 Cách xác định IC
50
48
6.2 Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa 49
6.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 49
6.2.1.1 Nguyên tắc 49
6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH 49
6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất 50
6.2.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 51
6.2.2.1 Nguyên tắc 51

6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất 52
6.2.2.3 Sơ đồ biểu diễn quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 52
6.2.3 Phƣơng pháp ức chế enzyme XO 54
6.2.3.1 Nguyên tắc 54
6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất 54
6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 54
6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào 56
6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào 56
6.3.2 Phƣơng pháp SRB 57
7. Tài Liệu Tham Khảo 63

V

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ITR
Isotaxiresinol
SSR
Secoisolariciresinol
RES
Resveratrol
PTS
Pterostilbene
PI
Piceatannol
Da
Dalton
ROS
Reactive oxygen species
DNA
Deoxyribonucleic acid

RNA
Ribonucleic acid
DPPH
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
NO
Nitric oxide
SOD
Superoxyde dimustase
CAT
Catalase
FDA
Flavin adenin dinucleotide
Fe
Iron
Mo
Molybdenum
NED
N-1-naptyletilendiamin dihydroclorur
MDA
Malonyl dialdehyde
XO
Xanthine oxidase
SRB
Sulforhodamine B
VI

IC
50

Half maximal inhibitory concentration

DMSO
Dimethylsulfoxide
NaCl
Sodium chloride
PBS
Phosphate buffer saline
FBS
Fetal bovin serum
TCA
Trichloroacetic acid
COX-1
Cyclooxygenase - 1
COX-2
Cyclooxygenase - 1
HPLC
High performance liquid chromatography
GC
Gas chromatography
NMR
Nuclear magnetic resonance

VII

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của PI, RES và PTS 21
Bảng 2. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 21
Bảng 3. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 25
Bảng 4. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO 27
Bảng 5. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc enzyme XO của Allopurinol ở
nồng độ từ 0.2 đến 5 uM 27

Bảng 6. Tóm tắt kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, gốc tự do NO và
enzyme XO của các chất 30
Bảng 7. Kết quả ảnh hƣởng của ITR 300µM lên hình dạng tế bào 33
Bảng 8. Kết quả ảnh hƣởng của ITR lên dạng hình học của tế bào 33
Bảng 9. Kết quả ảnh hƣởng của SSR lên dạng hình học của tế bào 35
Bảng 10. Ảnh hƣởng của RES lên dạng hình học của dòng tế bào DLD-1 40
Bảng 11. Ảnh hƣởng của PTS lên dạng hình học của dòng tế bào DLD-1 41
Bảng 12. Ảnh hƣởng của PI lên dạng hình học của dòng tế bào DLD-1 42
Bảng 13. Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào theo phƣơng pháp CC và
SRB 44
Bảng 14.Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 10 đến 100 μM 50
Bảng 15. Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 1 đến 10 μM 51
Bảng 16.Cách pha dung dịch thử hoạt tính NO có nồng độ từ 10 đến 100 μM 53
Bảng 17. Cách pha dung dịch thử hoạt tính ức chế enzyme XO có nồng độ từ 10
đến 100 μM 56

VIII

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Phản ứng trung hòa gốc DPPH 7
Hình 2. Cơ chế phản ứng lên màu nitrit bằng thuốc thử Greiss 8
Hình 3. Cơ chế phản ứng lên màu của MDA và Acid thiobarbituric 9
Hình 4. Cơ chế xúc tác của XO cho phản ứng biến đổi xanthine thành acid uric 11
Hình 5. Phản ứng tạo acid uric 12
Hình 6. Khung sƣờn cấu trúc Lignan 14
Hình 7. Công thức cấu tạo của Isotaxiresinol 15
Hình 8. Công thức cấu tạo của Secoisolariciresinol 16
Hình 9. Khung sƣờn trans-stilbene 17
Hình 10. Khung sƣờn cis-stilbene 17
Hình 11. Công thức cấu tạo của Resveratrol 17

Hình 12. Công thức cấu tạo của Pterostilbene 18
Hình 13. Công thức cấu tạo của Piceatannol 19
Hình 14. Công thức cấu tạo của Quercetin 51

IX

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 50
Sơ đồ 2. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 53
Sơ đồ 3. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 55

X

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 1. Biễu diễn % ức chế gốc tự do DPPH• theo nồng độ các chất 22
Đồ thị 2. Biễu diễn % ức chế gốc tự do NO theo nồng độ các chất 26
Đồ thị 3. Biễu diễn % ức chế enzyme XO theo nồng độ các chất 28
Đồ thị 4. Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm ITR trên số tế bào. 31
Đồ thị 5. Sự phụ thuộc nồng độ ITR trên sự phát triển tế bào theo SRB. 32
Đồ thị 6. Biễu diễn ảnh hƣởng của ITR lên đƣờng kính tế bào DLD-1 34
Đồ thị 7. Sự phụ thuộc thời gian phơi nhiễm SSR trên số tế bào theo CC 34
Đồ thị 8. Sự phụ thuộc nồng độ SSR trên số tế bào theo SRB 35
Đồ thị 9. Ảnh hƣởng của SSR lên đƣờng kính của dòng tế bào DLD-1 36
Đồ thị 10. Sự phụ thuộc thời gian vào số tế bào phát triển dƣới sự phơi nhiễm các
chất RES, PTS, PI tƣơng ứng với hình (A), (B), (C) theo phƣơng pháp CC 38
Đồ thị 11. Sự phụ thuộc nồng độ của các chất phơi nhiễm RES, PTS và PI vào số tế
bào tƣơng ứng ở các hình (A), (B), (C) theo phƣơng pháp SRB 39
Đồ thị 12. Ảnh hƣởng của RES trên đƣờng kính của dòng tế bào DLD-1 40
Đồ thị 13. Ảnh hƣởng của PTS lên đƣờng kính của dòng tế bào DLD-1 41
Đồ thị 14. Ảnh hƣởng của PI lên đƣờng kính của dòng tế bào DLD-1 42

1

1. Giới thiệu đề tài
Mặc dù việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học nhƣ
là các loại thuốc thảo dƣợc có từ cách đây vài trăm năm và thậm chí vài ngàn
năm, tuy nhiên việc cô lập và mô tả các hợp chất đóng góp vào sự phát triển và
khám phá các loại dƣợc phẩm hiện đại chỉ mới bắt đầu từ thế kỷ 19, mở đầu cho
kỷ nguyên hóa học trị liệu của các hợp chất thiên nhiên.

Hóa dƣợc ngày nay phát triển dựa trên nền tảng của sự phát triển của hóa
học các hợp chất có hoạt tính sinh học, là cầu nối của nhiều lĩnh vực khác nhau,
bao gồm sự cô lập và mô tả đặc tính của các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn
gốc thiên nhiên, sự thay đổi cấu trúc để có sự tối ƣu hóa hoạt tính và các tính chất
vật lý khác, sự tổng hợp hoàn toàn hoặc bán tổng hợp cho quá trình nghiên cứu
sâu mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc của các chất. Thêm vào đó, quá trình
tổng hợp các sản phẩm tự nhiên cũng đóng vai trò thiết yếu trong việc giải quyết
vấn đề cung cấp và quảng bá dƣợc phẩm.
Từ những năm 1980, sự tiến bộ vƣợt bậc trong sinh học phân tử, hóa học
tính toán, hóa học tổ hợp, và các kỹ thuật khảo sát lâm sàng nhanh đã định hình
lại ngành công nghiệp dƣợc phẩm và thay đổi cái nhìn của chúng ta vào các sản
phẩm tự nhiên. Một khi con ngƣời đã nghĩ rằng sự khám phá các sản phẩm tự
nhiên ít có giá trị vì quá trình đòi hỏi rất nhiều thời gian và do đó là không kinh
tế. Tuy nhiên, các sản phẩm tự nhiên đã vẫn tiếp tục tồn tại nhƣ là kết quả của
quá trình nghiên cứu không thành công của hóa học tổ hợp và khảo sát lâm sàng.
Từ đó, một lần nữa con ngƣời đã bắt đầu hiểu rõ giá trị của các sản phẩm tự
nhiên và làm sống lại nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên bằng cách kết hợp các
kỹ thuật tách và xác định nhanh, tổng hợp song song, tính toán và có lẽ thêm
nhiều kỹ thuật mới vào trong hóa dƣợc của các hợp chất thiên nhiên

29
.
Các hợp chất phenolic đại diện cho một nhóm lớn của các phân tử với các
nhóm chức khác nhau bao gồm nhiều loại nhƣ: các phenolic đơn giản (C
6
),
phenolic acid và các dẫn xuất (C
6
-C
1
), acetophenone và phenylacetic acid, (C
6
-
C
2
), cinnamic acid, cinnamyl aldehyde, cinnamyl alcohol, coumarin, isocoumarin
và chromone (C
6
-C
3
), chalcone, aurone, dihydrochalcone, flavan, flavone,
anthocyanidin, anthocyanin (C
15
), biflavonyl (C
30
), benzophenon, xanthone,
2

stilbene (C
6

-C
1
-C
6
, C
6
-C
2
-C
6
), quinone (C
6
, C
10
, C
14
), betacyanin (C
18
), dimer
hoặc oligomer (lignan và neolignan), polymer (lignin), oligomer hoặc polymer
(tannin), polymer (phlobaphene)
55
.
Trong những thành phần thuộc họ phenolic đã đƣợc liệt kê ở trên, có lẽ
trans-resveratrol (RES), một hợp chất stilbene có nhiều trong quả nho, đậu
phộng, đậu nành,… đã đƣợc nghiên cứu nhiều về hoạt tính sinh học. Các công bố
khoa học cho thấy RES có các hoạt tính nhƣ kháng viêm, chống oxy hóa, ức chế
sinh trƣởng tế bào và các thuộc tính ngăn ngừa và bảo vệ tim mạch, Ngoài ra,
RES cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn
4,13,16,20,26,30,36,37,39,46,47,48,49,58

.
Các hợp chất stilbene khác, cụ thể là trans-piceatannol (PIC) và trans-
pterostilbene (TPS), cũng đƣợc báo cáo là thể hiện các hoạt tính ngăn ngừa bệnh,
kháng viêm và chống oxi hóa. Các nghiên cứu sự ức chế sinh trƣởng hay chu
trình chết apoptosis đƣợc thực hiện trên các dòng tế bào lymphocyte, tế bào
melanocyte, các tế bào dạng biểu bì
13,27,36,37,46,50
.
Trong khi đó, các hợp chất lignan đƣợc biết đến nhƣ là những estrogen
thực vật, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Ngoài ra, các lignan nhƣ
secoisolariciresinol (SSR) và isotaxiresinol (ITR) đƣợc công bố có hoạt tính ức
chế chu trình chết của khối u gan
11,12,16,17,24,25
.
Từ các kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào
của RES nên hiện nay hợp chất này đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các loại dƣợc
phẩm hiện có trên thị trƣờng. Trong khi đó, các hợp chất khác thuộc họ phenolic
cũng đƣợc tìm thấy có nhiều hoạt tính sinh học nhƣng ít đƣợc sử dụng. Do đó
mục tiêu của đề tài này là xác định và so sánh hoạt tính chống oxy hóa và độc
tính tế bào trên dòng tế bào DLD-1 của các hoạt chất RES, PTS, PI thuộc họ
stilbene và SSR, ITR thuộc họ lignan. Từ đó đề ra các hƣớng ứng dụng mới cho
hợp chất tiềm năng và có thể thay thế RES.
3

2. Giới thiệu một số phƣơng pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa
2.1 Khái niệm về gốc tự do
Oxy đƣợc xem nhƣ một nguyên tố quan trọng giúp con ngƣời duy trì sự
sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lƣợng cung
cấp cho mọi hoạt động sống của con ngƣời.
Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng

oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy
tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn
gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và đƣợc gọi chung là các gốc dạng
oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species)
1,2
.
Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O
2
•–
), đây là gốc
tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde (O
2
•–
) nhiều gốc tự do và các
phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao đƣợc tạo ra nhƣ hydroxyl
(HO
●
), hydroperoxyl (HOO
●
), peroxyl (ROO
●
), alkoxyl (RO
●
), lipoperoxyde
(LOO
•
), H
2
O
2

2,10,18
.
Các dạng oxy hoạt động này do có năng lƣợng cao, kém bền nên dễ dàng
phản ứng với những đại phân tử nhƣ protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá
trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn
công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với
những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thƣờng gọi là phản ứng dây
chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể
2,10
.
Gốc tự do đƣợc tạo ra bằng nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những
căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trƣờng, thuốc lá,
dƣợc phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nƣớc có
nhiều chlorine và ngay cả oxy
9,10
.
2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể
Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu đƣợc kiểm
soát, nó là nguồn cung cấp năng lƣợng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần
cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm
4

trùng, tăng cƣờng miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co
bóp cơ thịt
2
.
2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con ngƣời
mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày.
Nếu không đƣợc kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa nhƣ:

ung thƣ, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm
trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở ngƣời cao niên, phá rách màng tế
bào khiến chất dinh dƣỡng thất thoát, tế bào không tăng trƣởng, tu bổ, rồi chết.
Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dƣới da khiến ta có những vết đồi mồi trên
mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp
các phân tử protein, đƣờng bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở
DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn
nheo, cơ khớp cứng nhắc
2,38
.
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau
đây: Trƣớc hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất
bã và tiếp nhận thực phẩm, dƣỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá
vỡ nguồn cung cấp năng lƣợng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy
yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trƣởng đƣợc
2,38
.
Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ
gây tử vong. Hóa già đƣợc coi nhƣ một tích tụ những đổi thay trong mô và tế
bào. Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân
gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên
ty lạp thể, gây tổn thƣơng các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu
trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lƣợng
1,2
.
Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60
bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thƣ, Alzheimer,
Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đƣờng, cao huyết áp không nguyên nhân,
xơ gan
2

.
5

Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS)
sẽ đƣợc loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể nhƣ
enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px),
enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các
dạng chống oxy hóa trong cơ thể con ngƣời. Đó là một trạng thái cơ bản của cân
bằng nội mô (homeostasis). Do ảnh hƣởng của nhiều yếu tố tác động từ bên
ngoài hay bên trong cơ thể, làm cân bằng này di chuyển theo hƣớng gia tăng các
dạng oxy hoạt động. Trạng thái sinh lý này gọi là stress oxy hóa (oxidative
stress). Hay nói cách khác, stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất
chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hƣớng tạo ra nhiều các chất oxy hóa
5,38
.
Ngày nay, do ảnh hƣởng của điều kiện sống nhƣ: ô nhiễm môi trƣờng,
tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa
đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng
oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi,
tổn thƣơng cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có
những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại
những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con ngƣời. Bên cạnh đó, chúng ta
cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ƣu và dễ
thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu. Dƣới đây chúng tôi xin giới thiệu một
số phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa đơn giản, ổn định và đã đƣợc
sử dụng rộng rãi trong thực tế.
6

2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có
màu tím đậm, hầu nhƣ không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản
ứng với oxy đó chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). DPPH
•

là một gốc tự do có màu tím giống nhƣ màu của dung dịch KMnO
4
, không tan
trong nƣớc, tan trong dung môi hữu cơ. Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại
bƣớc sóng 517nm, và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine
(DPPH-H) thì có màu vàng cam
3,5,8,19,23,36,51
.
Ngày nay DPPH đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do.
Phƣơng pháp này rất hữu hiệu đƣợc dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và
dễ ổn định.
Nguyên tắc
Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách
cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch
phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa đƣợc minh họa
bằng phản ứng đƣợc mô tả bên dƣới:

7





Hình 1. Phản ứng trung hòa gốc DPPH

2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO

Trong hệ thống thần kinh trung ƣơng và ngoại biên, vai trò của NO rất quan
trọng: Đóng vai trò dẫn truyền thần kinh, mang tín hiệu đến bất cứ nơi nào trong cơ
thể, điều khiển cân bằng nội mô mạch não, điều hòa cảm nhận đau, điều khiển quá
trình tƣ duy và trí nhớ
2,33,39
.
NO đƣợc sinh ra từ NOS tổ chức (nNOS và eNOS) sẽ ảnh hƣởng lên
trƣơng lực cơ bản của mạch não và góp phần điều hòa vận mạch khi bị kích
thích. Vì vậy, sự rối loạn NO sẽ dẫn đến một số bệnh về não nhƣ bệnh: Alzeimer,
thiếu máu não, đột quỵ
22
.
NO có một vai trò vô cùng quan trọng đối với cơ thể là tác nhân góp phần
điều hòa huyết áp, ngoài ra NO còn là yếu tố gây giãn mạch nội sinh. Nếu quá
nhiều NO đƣợc sinh ra thì sự dãn mạch máu sẽ dẫn đến sự giảm huyết áp, và
ngƣợc lại, nếu lƣợng NO sinh ra ít sẽ dẫn đến hiện tƣợng tăng huyết áp
18
.
Sự rối loạn con đƣờng chuyển hóa L-arginin – NO làm thay đổi nồng độ
NO tạo ra. Những sự rối loạn này thƣờng dẫn đến một số bệnh nhƣ: chứng tăng
huyết áp, tiểu đƣờng, béo phì, suy tim, xơ vữa động mạch, lão hóa, tổn thƣơng
mạch máu. Ngoài ra, khi lƣợng NO sản xuất quá nhiều thì chính nó sẽ trở thành
N
N
NO
2
O
2

N
NO
2
+
N
NH
NO
2
O
2
N
NO
2
+
AAH
DPPH
Chất kháng oxy hóa
hhoa
DPPHH
8

chất nội độc tố và khi đó NO còn phản ứng với các ROS gây hại cho cơ thể, ví dụ
gốc tự do ONOO
-
, là gốc nitrite gây hại cho cơ thể
2,7,9,18
.
NO
•
+

•
O
2-
↔ ONOO
-

4NO
•
+ O
2
+ H
2
O ↔ NO
2
-
+ H
+
Nguyên tắc
NO phản ứng với oxi tạo ra sản phẩm bền vững là nitrite và nitrate, hoạt
chất ức chế NO sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả là làm giảm sản phẩm
nitrit tạo thành trong dung dịch nƣớc và nồng độ nitrite trong dung dịch nƣớc
đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trắc quang sử dụng thuốc thử Greiss. Trong đó,
nitrite phản ứng với thuốc thử Greiss tạo thành hợp chất màu diazo bền vững và
có bƣớc sóng hấp thu cực đại ở 540 nm. Dựa trên sự giảm nồng độ nitrite tạo
thành, ta tính đƣợc khả năng ngăn chặn gốc tự do NO của hoạt chất (tính trên %
ức chế)
5,8,33,39
.

Hình 2. Cơ chế phản ứng lên màu nitrite bằng thuốc thử Greiss

Thuốc thử Greiss là hỗn hợp của hai dung dịch: N-1-napthylethylene
diamine dihydrochloride (NED) và sulfanilamide trong môi trƣờng H
3
PO
4
. Cơ
chế của phản ứng tạo sản phẩm màu diazo hóa nhƣ trên.

N
H
2
H
2
N
O
2
S
N
2
+
H
2
N
O
2
S
N
O
2
-

H
2
O
NED

N
H
C
H
2
C
H
2
N
H
2

=540 nm

H
2
N
O
2
S
N
N
H
C
H

2
C
H
2
N
H
2
N




9

2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA
MDA (Malonyl dialdehyde) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy
hóa lipid màng tế bào nên đƣợc áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá
trình peroxy hóa lipid của màng tế bào.
Nguyên tắc
MDA đƣợc sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho
phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử
acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 532 nm, phản
ứng đƣợc thực hiện ở môi trƣờng pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100
o
C trong thời
gian từ 10 đến 15 phút. Dựa trên sự giảm cƣờng độ hấp thu của phức ta tính đƣợc
khả năng kháng oxy hóa của chất cần nghiên cứu
3,5
.
Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric đƣợc biểu diễn nhƣ

sau:

Hình 3. Cơ chế phản ứng lên màu của MDA và Acid thiobarbituric



Malonyl dialdehyd
Acid thiobarbituric
Phức
Trimethin
HN
N
O
S
H
O
HN
N
O
S O
H
N
O
SNO
H
CH
2
CHO
HOC
2

+
-2 H
2

t
o
10

2.4.4 Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating
activity)
Nguyên tắc:
Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Khi
cho ion Fe
2+
tác dụng với thuốc thử Ferrozin sẽ sinh ra phức màu có cực đại hấp
thu tại bƣớc sóng  = 562nm
5,7,28
.
Mẫu thử sẽ khóa các kim loại vào dạng phức, không cho kim loại tồn tại ở
dạng tự do nên làm mất khả năng xúc tác của kim loại.
Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử sẽ đƣợc thể hiện qua việc ngăn chặn
tạo thành phức chất có màu giữa ion Fe
2+
với thuốc thử Ferrozin.
2.4.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO)
2.4.5.1 Giới thiệu
Xanthine oxidase (XO) là một loại enzyme giữ vai trò quan trọng trong
quá trình thoái hóa của purine, nó đóng vai trò là chất xúc tác cho phản ứng oxy
hóa hypoxanthine thành xanthine và sau đó tiếp tục xúc tác cho phản ứng oxy
hóa xanthine thành acid uric

5,7,38,51
.
2.4.5.2 Cấu tạo
Enzyme XO là một protein dimer đồng nhất (homodimeric protein) có
phân tử lƣợng là 300000 Da, trong đó mỗi monomer của protein tổ chức gồm 3
phần (domain) chính: một phần chứa 2 tâm Fe
2
S
2
, một phần chứa tâm
molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi là molybdopterin, một phần là flavin
adenine dinucleotide (FAD). Trong đó phần chứa Mo là phần lớn nhất và là trung
tâm hoạt tính xúc tác của enzyme, tâm Fe
2
S
2
và FAD đóng vai trò là những chất
vận chuyển điện tử trong quá trình oxy hóa đƣợc xúc tác bởi enzyme
21
.
2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO
Enzyme XO là một trong ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác là
molybdenum (XO, DMSO reductase, sulfite oxidase). Enzyme XO xúc tác cho
sự hydroxyl hóa các chất nền khác nhau theo phản ứng tổng quát:
11

RH + H
2
O ROH + 2H
+

+ 2e
─

Phản ứng xảy ra tại tâm Mo, Mo bị khử từ Mo (VI) xuống Mo (IV), và
trong quá trình phản ứng, các electron tạo thành đƣợc chuyển tới các tâm nhận
electron trong enzyme
21
.
Với chất nền là xanthine, cơ chế phản ứng hydroxygen hóa dƣới sự hiện
diện của XO đƣợc các nhà khoa học đề nghị nhƣ sau
21
:

Hình 4. Cơ chế xúc tác của XO cho phản ứng biến đổi xanthine thành acid uric.

2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO
Xanthine oxidase là một enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy
hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O
2
●
. Acid uric
có bƣớc sóng cực đại hấp thu tại 290 nm. Nếu mẫu thử có khả năng kháng
O
S
N
N
N
N
O
O

H
H
H
H
O
O
glu
126
MoS
S
O
O
SH
N
N
N
N
O
O
H
H
H
H
, e
MoS
S
O
O
S
N

N
N
N
O
O
H
H
H
HO
, H
e
Mo
OH
S
O
S
S
+
HN
NH
NH
N
O
O
OH
HN
NH
NH
NH
O

O
O
Xanthine
Acid uric
VI
IV
V
VI
MoS
S
O
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9

12

enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm
giá trị mật độ quang.

Hình 5. Phản ứng tạo acid uric
Các phƣơng pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng đƣợc sử
dụng nhiều nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng nhƣ
kháng các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này đƣợc gọi là các chất kháng
oxy hóa. Chúng có thể đƣợc sinh ra từ cơ thể nhƣ hệ thống kháng oxy hóa có
bản chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò
thiết yếu nhằm chống lại các gốc tự do độc hại sản sinh liên tục trong cơ thể, và
những chất kháng oxy hóa có phân tử lƣợng thấp nhƣ glutathinon, vitamin E,
vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất có trong thực phẩm, rau quả nhƣ
các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin
3,9
.

3. Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào
3.1 Nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào ung thƣ ruột kết ngƣời DLD-1 đƣợc thu từ bộ sƣu tập tế bào
American Type và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng McCoy’5A có bổ sung các
thành phần dinh dƣỡng FBS 10%, gentamicin 0.1%, và ủ trong môi trƣờng CO
2

5% tại 37
o
C. Tế bào phục vụ cho thí nghiệm đƣợc rửa bằng PBS và tách khỏi
chai nuôi cấy tế bào bằng dung dịch trypsin 2% .


Xanthine
Acid uric

HN
O NH
O
NH
N
+
H
2
O
+
O
2
2
XO
HN
O NH
NH
NH
O
O
+
O
2
+
H
2 2
12

enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm
giá trị mật độ quang.

Hình 5. Phản ứng tạo acid uric
Các phƣơng pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng đƣợc sử
dụng nhiều nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng nhƣ
kháng các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này đƣợc gọi là các chất kháng
oxy hóa. Chúng có thể đƣợc sinh ra từ cơ thể nhƣ hệ thống kháng oxy hóa có
bản chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò
thiết yếu nhằm chống lại các gốc tự do độc hại sản sinh liên tục trong cơ thể, và
những chất kháng oxy hóa có phân tử lƣợng thấp nhƣ glutathinon, vitamin E,
vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất có trong thực phẩm, rau quả nhƣ
các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin
3,9
.

3. Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào
3.1 Nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào ung thƣ ruột kết ngƣời DLD-1 đƣợc thu từ bộ sƣu tập tế bào
American Type và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng McCoy’5A có bổ sung các
thành phần dinh dƣỡng FBS 10%, gentamicin 0.1%, và ủ trong môi trƣờng CO
2

5% tại 37
o
C. Tế bào phục vụ cho thí nghiệm đƣợc rửa bằng PBS và tách khỏi
chai nuôi cấy tế bào bằng dung dịch trypsin 2% .

Xanthine
Acid uric
HN
O NH
O
NH
N
+
H
2
O
+
O
2
2
XO
HN
O NH
NH
NH
O
O
+
O
2
+
H
2 2

13

3.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào
3.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào
Nghiên cứu sự phát triển của tế bào dựa trên phƣơng pháp đếm tế bào sinh
ra hoặc tế bào phát triển theo thời gian. Phƣơng pháp đếm tế bào và xác định kích
thƣớc dựa trên sự phát hiện và sự đo lƣờng sự thay đổi điện trở đƣợc sinh ra bởi
các hạt hoặc tế bào hiện diện lơ lửng trong dung dịch dẫn điện (nƣớc muối 0.9%)
chạy vào lỗ có kích thƣớc nhỏ theo phƣơng ngang
37
.
Tế bào đƣợc pha loãng vào dung dịch dẫn điện, chúng đóng vai trò nhƣ
các hạt cách điện riêng lẻ. Khi dung dịch pha loãng của tế bào đƣợc hút thông
qua một lỗ nhỏ hình trụ, mỗi một hạt hoặc một tế bào riêng lẽ vƣợt qua lỗ ngay
lập tức điều biến dòng điện giữa hai điện cực đặt chìm trong dung dịch ở mỗi bên
của lỗ nhỏ. Trong khi đó, số xung hiển thị số hạt hoặc số tế bào đi qua lỗ, và biên
độ của xung điện phụ thuộc vào thể tích của hạt hoặc tế bào. Điện trở có hiệu quả
giữa hai điện cực là do trở kháng của dung dịch dẫn điện (nƣớc muối) trong
khoảng ranh giới của lỗ nhỏ. Sự hiện diện các hạt hoặc tế bào bên trong ranh giới
của lỗ nhỏ làm tăng trở kháng của đƣờng dẫn và độ lớn của trở kháng phụ thuộc
vào thể tích của hạt hoặc tế bào
44
.
Phân tích lý thuyết và thực tế về khả năng đáp ứng khác nhau của các hạt
bên trong lỗ nhỏ cho thấy độ cao của xung điện là đặc trƣng chủ yếu tỷ lệ với thể
tích của tế bào, phƣơng pháp này cho phép lựa chọn đếm các hạt hoặc tế bào
trong khoảng phân bố kích thƣớc rất hẹp bằng cách lựa chọn xung điện tử
44
.

3.2.2 Phƣơng pháp SRB
Phƣơng pháp phân tích Sulforhodamine B (SRB) đầu tiên đƣợc Skehan và
các cộng sự phát triển để nghiên cứu khám phá các loại thuốc chống ung thƣ với
tỷ lệ lớn của Viện ung thƣ quốc gia vào năm 1985. Phƣơng pháp SRB dựa trên
khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dƣ lƣợng amino acid
của các protein
22,40
.
Dƣới các điều kiện môi trƣờng axit nhẹ, SRB liên kết với các dƣ lƣợng
amino acid trên các protein của các tế bào đã đƣợc cố định bằng trichloroacetic