SINH học PHÂN tử và tế bào

CHUYÊN ĐỀ:

SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ TẾ BÀO

1


MỞ ĐẦU
Mọi cơ thể sinh vật, vật chất sống được cấu tạo từ các đại phân tử sinh
học, trong đó quan trọng nhất là acid nucleic và protein. Vì vậy việc tìm hiểu,
phân tích các đại phân tử là rất cần thiết. Chúng ta có thể kết hợp phân tích cấu
trúc, đặc điểm của các đại phân tử với sự phát triển các kỹ thuật và các công
nghệ hiện đại để tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất các hợp chất thứ cấp
dùng trong y học, sản xuất các chất kháng sinh.
Di truyền học thực sự trở thành một bộ môn khoa học độc lập kể từ những
năm 1900 - 35 năm sau ngày Mendel công bố công trình “Các thí nghiệm lai ở
thực vật”. Từ đó đến nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các nghành khoa
học khác như vật lý, tốn học, hóa học, di truyền học đã và đang khám phá rất
nhiều quy luật về sự tồn tại và lưu truyền sự sống và trở thành một mũi nhọn
trong nghiên cứu sinh học.
Những thành tựu rực rỡ của di truyền học đã đem lại những nhận thức
mới về cấu tạo và sự vận hành bộ máy di truyền của cơ thể sống. Cùng với sự
phát triển mạnh mẽ của di truyền học, một lĩnh vực nghiên cứu mới của di
truyền học ra đời, đó là kỹ thuật di truyền. Có thể nói, kỹ thuật di truyền là một
tập hợp của nhiều kỹ thuật như hóa học, sinh học phân tử, vi sinh vật học,... mà
trong đó, vai trị hàng đầu thuộc về các tư duy và phương pháp của di truyền.
Có rất nhiều kĩ thuật được ứng dụng trong công nghệ sinh học để nghiên
cứu vật chất sống, như điện di, PCR, giải trình tự gen, phương pháp tạo thể đột
biến nhân tạo.....
Trong đó, điện di là một kỹ thuật rất hữu ích nhằm phân tích, xác định và
tinh sạch các đoạn DNA, RNA, protein dựa vào sự dịch chuyển của chúng trong

môi trường điện trường. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử
nhằm nhân bản (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ống nghiệm mô
phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống. Kỹ thuật này được sử dụng
2


rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác
nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA, chuẩn đốn
những bệnh nhiễm trùng, tách dịng gene, và xác định huyết thống. Trong thuật
ngữ di truyền học, xác định trình tự DNA là quá trình xác định trật tự nucleotide
của một đoạn DNA. Hiện nay, hầu hết mọi xác định trình tự DNA đều được thực
thi dùng phương pháp phân tách trình tự (chain termination method). Kĩ thuật
này dùng phân tách trình tự cụ thể (sequence-specific termination) của một phản
ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm (in vitro) dùng chất nền nucleotide đã
được chỉnh sửa.

3


NỘI DUNG

A. PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI
I. Khái niệm và nguyên tắc chung:
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động
của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA,
RNA, protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực
của chúng.
Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch
chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích
thực hoặc dương hoặc âm, cịn các nucleic acid có một điện tích âm khơng đổi

nhờ khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.

Hình 1: Nguyên tắc chung của điện di
Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khn
đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc
polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá thể rắn (agarose hoặc
polyacrylamide) được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này sử dụng một dung
dịch đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel để phân tách các phân
tử và các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi
điện di. Trong đó, polyacrylamide gel được dùng để phân tách các phân tử

4


protein và các phân tử DNA có chiều dài <1kb, còn agarose gel phân tách hiệu
quả các phân tử DNA và RNA có kích thước từ 20bp đến 20 kb.
II. Các phương pháp điện di:
1. Điện di lòng dịch và điện di giấy:
Điện di trong lòng dịch: đã được Tiselius mô tả đầu tiên để phân chia
protein huyết thanh vào năm 1939. Hiện nay, nó khơng cịn được dùng nữa,
nhưng vẫn còn được xem như một quy chiếu để đo độ di động điện di thực, vì
khơng có dịng thuỷ động gây nhiễu và khơng có sự can thiệp của giá thể.
Điện di giấy: Điện di trên giấy là phương pháp điện di thường được sử
dụng để phân tích và phân giải các phân tử cỡ nhỏ. Phương pháp này không
được sử dụng để phân giải các đại phân tử (ví dụ protein…) bởi vì sự hấp thụ và
sức căng bề mặt liên kết với giấy điện di thường làm thay đổi hoặc biến tính các
đại phân tử tạo ra độ phân giải kém.
2. Điện di trên màng cellulose acetat:
Màng cellulose acetat là chất nền quen thuộc để phân chia protein huyết
thanh trong xét nghiệm ngày nay. Chấm một lượng nhỏ huyết thanh trên màng

cellulose acetat dới dạng một vạch nhỏ bằng bộ chấm mẫu chuyên dụng. Sau khi
chạy điện di (khoảng 30 phút ở 230V) và nhuộm các protein, màng được làm
trong bằng sấy khô, rồi đọc kết quả trên máy đo mật độ (densitometor).

Hình 2: Kết quả phân chia protein trên màng và định lượng bằng
densitometor (bên trái là bản đồ điện di protein huyết thanh, bên phải là kết
quả định lượng bằng densitometor)
5


3. Điện di mao quản:
Đây là một phương pháp mới cho sự phân tích điện di và có ứng dụng
ngày càng nhiều trong nghiên cứu sinh hóa. Tên của phương pháp đã giúp ta
phần nào đoán được nguyên lý hoạt động của nó, trong đó vật chất được phân
tích và môi trường điện di được đặt trong một ống mao dẫn mịn, dài (thông
thường dài từ 50 đến 100cm và đường kính trong từ 15 đến 100 μm). Một lượng
mẫu rất nhỏ (cỡ nano lít) được đặt tại một đầu của ống mao dẫn và chịu sự điện
di dưới trường tạo bởi điện áp từ 20 đến 30kV.
Ưu điểm của điện di mao dẫn là nó cho độ phân giải cực cao, tốc độ và độ
nhạy cao đối với việc phân tích các mẫu rất nhỏ nhưng rõ ràng nó khơng thực sự
hữu ích trong phương pháp chuẩn bị vật liệu (preparative). Nó thường sử dụng
trong việc phân tách các phân tử DNA có kích thước khác nhau chỉ một
nucleotit đơn lẻ. Bởi vì phương pháp điện di mao dẫn có độ phân giải rất cao,
nên nó là cơ sở để phân tách các polynucleotide trong trình tự DNA kiểu mới.
Phương pháp điện di mao dẫn cũng phù hợp với sự phân tách các phân tử khơng
tích điện bằng cách thêm các vi hạt tích điện vào trong mơi trường dung dịch
điện di. Nếu hỗn hợp dung dịch hòa tan được ngăn cách giữa môi trường nước
và phần kỵ nước bên trong của vi hạt được đưa vào trong hệ thống này thì chúng
có thể được phân tách bằng phương pháp điện di. Điện di mao dẫn là một
phương pháp có tính linh động cao, phạm vi ứng dụng và phương pháp tối ưu

hóa cho nó vẫn đang được nghiên cứu.
4. Điện di trên gel:
Đối với phương pháp điện di trên gel, phân tử được phân tách trong hệ
đệm lỏng được hỗ trợ trong một chất nền polimer. Hệ thống điện di trên gel có
một số ưu điểm rõ rệt. Đầu tiên, chúng có thể thích hợp trên những mẫu lớn hơn
so với hầu hết các hệ thống điện di giấy, và cũng có thể sử dụng cho việc chuẩn
bị tỷ lệ xích (preparative scale) cho các đại phân tử. Thứ hai là tính chất của chất
nền gel có thể thay đổi theo ý muốn để phù hợp với những ứng dụng cụ thể, bởi
6


vì gel làm tăng độ ma sát và điều chỉnh sự linh động điện di. Rất nhiều tác nhân
dạng gel đã được sử dụng trong hệ thống điện di, trong đó gel agarose (polymer
polygalactose) được sử dụng khá phổ biến, đặc biệt là trong ứng dụng với những
đa phân tử như acid nucleic, lipoprotein v.v. Gel polyacrylamide là một trong
những tác nhân hữu ích và linh hoạt nhất sử dụng trong phân tách điện di bởi vì
nó dễ dàng giải quyết một loạt các protein và acid nucleic.
4.1. Điện di trên gel agarose:
Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành
phần chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng
30%. Agarose là một polymer mạch thẳng khơng bị sulphate hóa chứa hai gốc
xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose. Cấu trúc của agarose
khơng đồng nhất: vừa tích điện vừa trung hịa. Các chuỗi polymer liên kết chéo
với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy
thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hố.

Hình 3: Cấu trúc của agarose gel

4.1.1. Nguyên lí điện di agarose gel
Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách

ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hê ̣điện di trong một điện trường
có điện thế và cường độ ̣thích hợp. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel
phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường... Điện
di agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định
và tinh sạch các đoạn DNA Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp:

7


các băng DNA trong gel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh
quang ethidium bromide (EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
4.1.2. Chuẩn bị
Thiết bị điện di agarose gel gồm 3 bộ phận cơ bản: nắp, khay vận hành và
buồng điện di.

Hình 4: Cấu trúc thiết bị điện di agarose gel
Đệm pH:
Một số đệm điện di DNA thích hợp là Tris - acetate - EDTA (TAE),
Trisborate -EDTA (TBE) và Tris – phosphate - EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng
50 mM và pH 7,5-7,8. Trong đó, TAE sử dụng nhiều nhất , nhưng khả năng đệm
lại bị thấp. Đệm TBE và TPE đều có khả năng hòa tan tốt các đoạn DNA và khả
năng đệm cao hơn. Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ khác nhau
trong ba loại đệm trên. Đệm giúp thiết lập một giá trị pH cung cấp các ion để hỗ
trợ cho độ dẫn.
4.1.3. Quy trình điện di trên gel agarose
4.1.3.1. Chuẩn bị agarose gel
Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di , loại agarose
dùng tốt nhất trong thí nghiệm là type -II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low8

endoosmotic). Nó dễ dàng chảy ra và taọ thành một dung dịch trong suốt, kết
quả là gel đàn hồi thậm chí là ở nồng độ thấp. Tuy nhiên , type-II-agarose dễ bị
bẩn bởi sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa Sp còn ức chế các enzyme như
ligase , polymerase và RE . Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế
phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu
hoặc cơ chất cho các enzyme này.
Cách tiến hành: Cho 1% type-II-agarose vào 100 ml đệm 0,5 TAE vào
nồi khử trùng hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hồn tồn. Nếu q trình
đun mất nước quá nhiều thì phải them nước cho đủ 100ml. Để nguội khoảng 60
0

C và đổ vào buồng điện di có cài sẵn lược. Chiều dày gel khoảng 5mm là thích

hợp. Sau 30 – 40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra.
4.1.3.2. Đặt mẫu DNA vào giếng
Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ
DNA cao hoặc thấp. Chẳng hạn theo tỉ lệ sau:
DNA (1 Lµg/1 µL ) : 1 µL
Đệm màu bromophenol (x10 loading dye) : 1µL
Nước cất 2 lần: 9 µL
Tổng số : 11µL
Dùng micropipette hút 1µL dung dịch trên cho vào giếng.
Thường đặt mẫu sau khi đã đổ dung dịch đệm 0,5 x TAE vào buồng điện
di cho ngập gel, ít khi đặt mẫu trước rồi đổ đệm sau. Thường dùng micropipette
loại 20 – 200 µL và đặt vào buồng điện di trên bàn có nền đen. Khi tăng điện thế
của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với
các đoạn nhỏ. DNA dịch chuyển từ cực âm đén cực dương. Quan sát sự dịch
chuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di.
4.1.3.3. Nhuộm DNA bằng EtBr
Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng

thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr. Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra
khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5µg/µL, trong thời gian 30 –
9


45 phút, tốt nhất trên một máy lắc nhẹ độ (10 vịng/ phút). Đổ dịch nhuộm EtBr
vào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai
lần, mỗi lần 15-20 phút. EtBr thường pha sẵn ở dạng đậm đặc 5 mg/mL và giữ ở
4 0C trong tối. EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn . Tuy
nhiên, ái lực (affinity) của thuốc nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối
thấp và có hiệu suất huỳnh quang không cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào
giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel.
Thường EtBr ( 0,5 µg/ mL) được đưa vào trong agarose gel để phản ứng
nhuộm xảy ra trong suốt q trình điện di. Mặc dù tính linh động điện di của
DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng
khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt q trình điện di
hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt. Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di gel
khơng có ETBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong. Gel được
ngâm trong đệm điện di hoặc H 2O chứa EtBr ( 0,5µg/ mL) trong 45 phút ở nhiệt
độ phịng.
Vị trí gắn lược

Dung dịch agarose gel

Lược
Giếng

Băng dính

a. Khn đổ gel

b. Gắn lược và đổ
agarose gel vào khuôn

10

c. Lấy lược ra khỏi
khuôn gel


Nguồn điện di
Micropipette

Cable

Đệm điện di

Buồng điện di

d. Nạp mẫu DNA vào giếng

e. Chạy điện di
Nắp

Hình 5: Sơ đồ các bước trong quá trình điện di agarose gel
4.1.3.4. Quan sát và chụp ảnh
Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (λ = 302
nm)
Dùng thiết bị chuyên dụng để lưu trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation
System).

a

b

Hình 6: Quan sát DNA dưới ánh sáng tử ngoại (a) và hình ảnh điện di
DNA trên agarose gel (b)
11


4.1.4. Một số phương pháp thu hồi DNA từ agarose gel
- Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp:
Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm
được cắt ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến
nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70 0C để hịa tan hồn tồn trong đệm.
Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/ chloroform và kết tủa. Lưu ý
DNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương
thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tố ức chế trong agarose.
-

Ly tâm:

Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm
chiết, làm nóng để hịa tan hồn tồn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp
bơng thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 ml. Cột này
được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000
- 15.000 rpm trong 10 - 15 phút. DNA sẽ liên kết với màng cịn dung dịch đệm
sẽ đi qua lớp bơng thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột
vài lần bằng cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA
vào cột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch

DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu
gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA.
- Điện di vào bẫy:
* Cách 1: Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của
băng DNA quan tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di
nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (q trình điện
di có thể được kiểm sốt bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết
bằng pipette.
* Cách 2: sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước
băng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA - 45. Gel sau đó
được điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy.
12


Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng
mẫu giấy tới 70 0C. DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa.
- Dùng hạt thủy tinh
Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI ở nồng độ khoảng
4 M. Sau đó, các hạt thủy tinh được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả
với các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và
các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo, tiến hành rửa
và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm
muối thấp. Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có
phạm vi tối ưu hẹp. Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả
lắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và
các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa.
4.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng
-

Kích thước của phân tử:

Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ
dịch chuyển càng chậm. Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở
các tốc đô ̣tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng.
-

Nồng độ agarose:

Đoạn DNA mang kích thước khác nhau dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau
qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.
-

Cấu hình của DNA:

Các DNA dạng vịng đóng, vịng đứt và mạch thẳng có cùng một khối lượng
phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau. DNA của các
plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng
có dạng mạch thẳng.
-

Thành phần base và nhiệt độ

Điện di của DNA trong agarose gel không bị ảnh hưởng rõ bởi thành phần
base của DNA hoặc nhiệt độ. Trong agarose gel, tính linh động điện di tương đối

13


của các đoạn DNA có kích thước khác nhau khơng thay đổi trong khoảng 4 – 30
0

C. Nói chung, agarose gel thường được chạy ở nhiệt độ phòng.
4.2. Điện di trên gel acrylamid
Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau:

Gel polyacrylamide được hình thành từ q trình polymer hóa acryamide
(đơn phân tử) và N,N&-methylene-bis-acrylamide. Khi có mặt các gốc tự do,
được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn định bởi TEMED (N, N, N' , N'
-tetramethylathylene-diamine), phản ứng chuỗi bắt đầu khi các acrylamide
monomer

được

polymer

hoá

thành

một

chuỗi

dài.

Khi bisacrylamide (N, N'-methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản
ứng polymer hoá, các chuỗi sẽ liên kết chéo để tạo thành dạng gel. Độ xốp của
gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Mức độ liên
kết chéo sẽ xác định kích thước lỗ, từ đó phân tách các phân tử protein với kích
thước khác nhau. Kích thước trung bình của các lỗ gel được điều chỉnh bằng

cách thay đổi tỷ lệ acrylamide và bisacrylamide.
4.2.1. Nguyên lí điện di trên gel acrylamid
Điện di trên gel acrylamid dùng để phân tách các phân tử protein, các
đoạn DNA , kể cả RNA và DNA/RNA. Gel phải được rót vào giữa hai tấm kính
và được ngăn cách bởi các miếng đệm (gel spacers) để ngăn khơng cho
polyacrylamide tiếp xúc với khơng khí. Gel có thể dài từ 10-100cm tùy thuộc
vào yêu cầu phân tích và chúng thường được chạy trong phương thẳng đứng. Có
thể đúc bản gel ở các nồng độ khác nhau của polyacrylamide từ 3,5% - 20% tùy
14


thuộc vào kích thước của phân tử protein hhoặc đoạn DNA quan tâm . Nồng độ
thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử
lớn hơn Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được
điều chỉnh để kiểm sốt mức độ xốp của khn gel. Điều này cho phép tối ưu
hóa một khn gel để phân tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân
tử protein.
Điện di polyacrylamide gel được dùng để phân tích và thu hồi các đoạn
DNA có chiều dài từ 5 - 2.000 bp. Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụng
trong khoảng từ 3,5 - 20% tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA quan tâm.
Hai loại polyacrylamide gel thường được sử dụng là:
- Polyacrylamide gel khơng biến tính dùng để phân tách và tinh sạch các
đoạn DNA sợi đơi.
- Polyacrylamide gel biến tính dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA
sợi đơn (kết hợp với urea và formamide) và phân tách và tinh sạch protein (kết
hợp polyacrylamide với natri dodecyl-sulfat SDS) .
Trong đó, polyacrylamide gel khơng biến tính là loại gel hay được sử dụng
nhất. Hiệu quả của sự phân tách DNA trong loại gel này phụ thuộc vào nồng độ
của acrylamide, kích thước và điện tích của DNA
4.2.2. Chuẩn bị

Thiết bị:

Hình 7: Cấu trúc thiết bị điện di polyacrylamide gel
15


4.2.3. Phương pháp điện di polyacrylamide gel khơng biến tính
4.2.3.1. Chuẩn bị polyacrylamide gel khơng biến tính
Kích thước phổ biến của tấm kính đổ gel thường là 20cm x 40cm. Miếng
đệm dày khoảng 0,5 mm - 2,0 mm. Các gel dày hơn thường nóng lên trong q
trình điện di nên sẽ làm nhịe các băng DNA , vì thế người ta thường sử dụng
các gel mỏng . Tuy nhiên , khi khi chạy một lượng lớn DNA (> 1µg/băng) thì
cần chuẩn bi ̣gel dày.
4.2.3.2. Các bước tiến hành:
a. Chuẩn bị dung dịch: 30% acrylamide (gồm bis-acrylamide), 1 x TBE, 10%
ammonium persulphate.
b. Lau sạch tấm kính dùng làm khn gel và miếng đệm bằng KOH/methanol
hoặc ethanol. Xử lý bề mặt của hai tấm kính bằng dung dịch silicon để ngăn gel
dính chặt vào hai tấm kính gây rách gel lúc lấy nó ra khỏi khn sau khi điện di
xong.
c. Tính tốn thể tích của các dung dịch dùng để tạo polyacrylamide gel trên
cơ sở kích thước tấm kính, độ dày miếng đệm.
d. Bổ sung 35 µL TEMED vào mỗi 100mL dung dịch tạo polyacrylamide
gel, trộn hỗ hợp bằng cách vortex. Rót dung dịch tạo gel vào giữa hai tấm kính,
gắn nhanh lược vào, tránh bọt khí ở răng lược (giếng). Đỉnh của răng lược phải
hơi cao hơn mép gel. Nếu cần bổ sung một ít dung dịch tạo gel để làm đầy mép
gel.
e. Cho phép acrylamide polymer hóa trong khoảng 60 phút ở nhiệt độ phòng,
bổ sung thêm dung dịch tạo gel nếu thấy gel co vào nhiều.
f. Sau khi polymer hóa hồn tồn, rút lược cẩn thận, tháo băng dính khỏi đáy

khn gel. Gắn khn gel vào buồng điện di và làm đầy buồng điện di bằng đệm
1 x TBE, dùng Pasteur pipette để phá các bọt khí ra khỏi đáy gel và các giếng
bằng đệm 1 x TBE.

16


g. Trộn các mẫu DNA với một lượng thích hợp của đệm 6 x gel loading Dye. Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette hoặc Hamilton syringe .
h. Nối buồng điện di với bộ nguồn. Polyacrylamide gel khơng biến tính
thường chạy điện di trong khoảng 1 V/cm đến 8 V/cm. Chạy gel cho đến khi
thuốc nhuộm chỉ thi ̣ dịch chuyển đến vi ̣ trí mong muốn . Tắt nguồn, lấy khuôn
gel ra và đặt lên bàn. Tháo tấm kính nhỏ ở mặt trước ra , tấm kính lớn ở phía sau
được dùng làm giá đỡ và chuẩn bị nhuộm gel.

Hình 8: Các bước chuẩn bị điện di
4.2.3. Phát hiện DNA trong polyacrylamide gel
4.2.3.1. Nhuộm bằng ethidium bromide
Ngâm nhe ̣ gel trong dung dịch nhuộm (0,5µg/mL EtBr trong 1 x TBE). Sau
30 – 40 phút , lấy gel và tấm kính đỡ ra, cẩn thận thấm khơ bề mặt gel bằng giấy
thấm Kimwipe. Phủ lên bề mặt gel bằng giấy nylon (Saran wrap ), tránh tạo ra
bọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap. Quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử
ngoại Polyacrylamide có thể làm mất huỳnh quang của EtBr , do đó khơng thể
17


phát hiện các băng DNA bằng phương pháp này nếu hàm lượng của nó thấp hơn
10ng.
4.2.3.2. Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc:
Thuốc nhuộm bạc sử dụng hiệu quả để phát hiện cho phép phát hiện một
lượng protein ở dạng vết trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleic

acid (pg), nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr.
Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là:
- Dùng các dung dịch diamine silver hay ammoniacal silver cho thấm vào
gel và pha loãng các dung dịch acid của formaldehyde.
- Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và dùng
formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiện
kiềm. Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với các
gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel
mỏng.
Quá trình nhuộm bao gồm các bước sau:
- Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút để ngăn cản sự
khuếch tán của các phân tử nucleic acid đã được phân tách trong gel, loại bỏ và
trung hịa các hóa chất khơng mong muốn (urea và đệm).
- Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút để loại bỏ acetic acid, các chất
bẩn dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định.
- Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde để cải
thiện độ nhạy và độ tương phản. Thời gian nhuộm tối ưu khoảng 20 phút. Tuy
nhiên, đối với loại gel có tấm đỡ polyester (8×10 cm) chỉ cần 10 phút để có chất
lượng hình ảnh cao mà khơng làm giảm độ nhạy.
- Rửa gel sau khi nhuộm bạc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết
tủa màu nâu trong quá trình phát triển màu.
- Phát triển màu của gel bằng hỗn hợp dung dịch sodium carbonate (4g/L),
sodium thiosulfate (4µM) và formaldehyde để giảm các background khơng đặc
hiệu một cách hiệu quả. Nhiệt độ rửa thích hợp từ 8-10 oC, thời gian rửa thay
18


đổi tùy vào thành phần của dung dịch phát triển màu trong khoảng từ vài giây
đến vài phút.
- Dừng phản ứng phát triển màu khi thu được hình ảnh tối ưu càng nhanh

càng tốt bằng cách dùng acetic acid lạnh 7,5%.
4.2.3.3. Phóng xạ tự ghi:
DNA có thể được phát hiện bằng đồng vị phóng xạ 32P. Cố định nucleic acid
trong acetic acid 7,5%. Sau đó, tiến hành rửa gel trong nước khử ion . Dùng giấy
thấm Kimwipe để thấm khô bề mặt gel . Tiếp theo, đánh dấu phóng xạ và sấy
gel ở 80 0C trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ. Ủ phim phóng xạ khoảng 24
giờ.
4.2.4. Phân lập các đoạn DNA từ polyacrylamide gel
Phương pháp tốt nhất để phân lâp ̣ DNA từ polyacrylamide gel là kỹ thuật
của Maxam và Gilbert (1977).
- Ưu điểm của phương pháp:
+ DNA thu được có độ tinh sạch cao
+ Phân lập cả hia loại DNA sợi đôi và sợi đơn từ các polyacrylamide gel
khơng biến tính và biến tính.
Phương thức sau đây được cải tiến từ kỹ thuật của Maxam và Gilbert (1977):
- Chạy điện di polyacrylamide gel. Xác định vị trí của DNA quan tâm bằng
phóng xạ tự ghi hoặc bằng EtBr quan sát dưới ánh sáng UV.
- Dùng dao cắt mảnh gel chứa băng DNA quan tâm. Không loại bỏ Saran
wrap khỏi gel trước khi cắt, cắt cả gel lẫn Saran wrap, sau đó bóc mảnh gel nhỏ
có chứa DNA quan tâm ra khỏi Saran wrap.
- Chuyển gel vào trong E - tube (eppendorf tube), dùng tip của micropipette
để ép mảnh gel theo thành của tube.
- Tính tốn thể tích thích hợp của mảnh gel và bổ sung 1 - 2 thể tích của đêm
chiết vào E - tube.
- Đóng tube và ủ ở 37 0C kèm theo lắc vòng nhe ̣. Đoạn DNA nhỏ (<500bp)
được dung ly trong khoảng 3-4 giờ, đoạn lớn hơn mất khoảng 12-16 giờ.
19


- Ly tâm 12.000 vòng trong 1 phút ở 4 0C. Chuyển thể nổi vào E-tube sạch.

- Bổ sung thêm 0,5 thể tích đệm chiết vào E - tube cũ có mảnh
polyacrylamide gel, vortex nhanh và ly tâm. Trộn hai thể nổi lạivới nhau.
- Bổ sung hai thể tích ethanol ở 4 0C, bảo quản dung dịch trên đá tuyết 30
phút. Thu hồi DNA bằng cách ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút ở 4 0C.
- Hòa tan trở lại DNA trong 200µL đệm TE (pH = 7,6) và bổ sung thêm 25
µL của 3M sodium acetate và kết tủa DNA.
- Rửa cẩn thận tiểu thể với ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đệm TE
(pH 7,6) tới thể tích cuối cùng là 10µL.
- Kiểm tra số lượng và chất lượng của đoạn DNA bằng điện di
polyacrylamide gel. Lấy một thể tích nhỏ tối thiểu trộn với 10µL TE (pH 7,6),
bổ sung thêm 2 µL gel-loading dye. Nạp mẫu và chạy điện di polyacrylamide
gel ở nồng độ thích hợp.
4.2.5. Phương pháp điện di polyacrylamide gel biến tính
Làm biến tính các protein bằng cách đun nóng trong dung dịch chứa các chất
khử (ᵦ-mercapto-ẹthanol) để cắt các cầu disulfua và một chất tẩy, natri dodecylsulfat (SDS).
SDS gắn với bề mặt protein làm cho chúng tích điện âm. Sự di chuyển của
protein trong gel acrylamid thực tế chỉ phụ thuộc duy nhất vào trọng lượng phân
tử của chúng. Phương pháp này đơn giản, nhanh, chính xác và thực tế được
dùng thay cho phần lớn các phương pháp lý học (siêu ly tâm phân tích, khếch
tán ánh sáng…) trong xác định trọng lượng protein. Gần đây, cetyl-triammonbromua (CTAB) đã được đề nghị sử dụng thay cho SDS, vì nó tương đối giữ được hoạt tính sinh học sau khi điện di, cịn SDS thì khơng.

20


Hình 9: Sơ đồ tóm tắt điện di SDS‒PAGE
Trong q trình điện di, hệ đệm điện di có vai trị là mơi trường để duy trì
dịng điện ổn định chạy trong gel. Loại đệm điện di được sử dụng phổ biến nhất
trong SDS – PAGE là hệ đệm không liên tục Laemmli. “Không liên tục” nghĩa
là loại đệm được sử dụng trong gel và trong bể điện di khác nhau. Hệ đệm
khơng liên tục Laemmli gồm lớp gel cơ có pH = 6.8, lớp gel tách có pH = 8.8 và

đệm điện di ở pH = 8.3, trong đó lớp gel cơ có nồng độ acrylamide thấp hơn so
với lớp gel tách.

21


Hình 10: Hệ đệm khơng liên tục Laemmli
III. Ứng dụng của phương pháp điện di:
1. Trong y tế:
• Điện di protein huyết thanh:
Là một cách để theo dõi, phát hiện bất thường trên xét nghiệm, chẳng hạn
như mức độ protein tổng số/ albumin máu bất thường, protein nước tiểu mức độ
cao, nồng độ canxi cao, hoặc số lượng tế bào máu trắng hoặc đỏ máu thấp.
Khi các triệu chứng cho thấy một tình trạng viêm, bệnh tự miễn dịch, một
bệnh nhiễm trùng cấp tính hoặc mãn tính, rối loạn thận hoặc gan, hoặc nguyên
nhân

mất protein.
Khi một bác sĩ đang điều tra các triệu chứng cho thấy đau tủy, chẳng hạn

như đau xương, thiếu máu, mệt mỏi, gãy xương không giải thích được, hoặc
nhiễm khuẩn tái phát, để tìm sự hiện diện của một dải protein đặc trưng
(globulin miễn dịch đơn dòng) trong vùng beta hay gama, nếu một dải sắc
nét được nhìn thấy, bản chất của một globulin miễn dịch đơn dịng sẽ được xác
nhận bởi điện di immunofixation.
• Điện di thuốc trị liệu
Tác dụng: chữa bệnh bằng cách đưa các ion vào cơ thể hoặc lấy các ion
thuốc có hại ra khỏi cơ thể.
Ví dụ: Muốn lấy một ion có hại (Ca++) ra khỏi cơ thể thì ta đặt điện cực
trái dấu vào vùng da nhiễm ion, điện cực đó sẽ hút các ion này ra khỏi cơ thể về

phía nó.
Tác dụng của dịng điện một chiều:
+ Tác dụng giãn mạch: Làm tăng cường tuần hoàn và dinh dưỡng, tăng
chuyển hóa chống viêm.
+ Tác dụng lên hệ thần kinh: Tại cực dương có tác dụng giảm đau, giảm
co thắt, giảm trương lực cơ. Tại cực âm có tác dụng kích thích làm tăng trương
lực cơ.
22


+ Tác dụng của ion thuốc: Không gây tổn thương da, không gây lây
truyền các bệnh đường máu như khi tiêm.
2. Trong nơng nghiệp:
Giúp phát hiện nhanh những tính chất nổi bật của lúa như mùi thơm,
protein, amylose,…
Giúp các nhà chọn giống thực hiện công tác chọn lọc, tạo giống lúa thuần,
giống lúa mới một cách nhanh nhất, rẻ tiền và hiệu quả cao.
Chọn ra được dòng Nếp Bè 1-2 có chiều dài hạt dài hơn giống đối chứng,
năng suất cao hơn 15% và hàm lượng protein trên 10%
3. Trong cơng nghệ sinh học:
• Điện di agarose gel có nhiều ứng dụng như:
Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng
cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dịng…).
Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử
hoặc in dấu di truyền…).
Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern,
hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern.
• Điện di được ứng dụng để kiểm tra độ tinh sạch và định lượng protein
Do tính đơn giản của phương pháp, điện di được áp dụng phổ biến để
đánh giá độ tinh sạch và định lượng protein. Ví dụ, điện di được áp dụng phổ

biến để theo dõi protein sạch hay không mà phép thử nghiệm enzyme không làm
được. Ngay cả khi có một trắc nghiệm enzyme tốt đi nữa, ta cũng nên kiểm tra
các mẫu protein bằng điện di trong quá trình tinh sạch protein bởi vì phương
pháp điện di cho phép chúng ta quan sát được các tạp chất có thể có.
Dựa vào tính linh động khác nhau của hầu hết các protein mà điện di
thường được dùng để ước lượng khối lượng phân tử của các chuỗi polypeptide.
Để chuẩn độ thí nghiệm điện di, một số polypeptide có khối lượng phân tử đã
được biết trước được đem chạy điện di đồng thời với các chuỗi polypeptide chưa
biết, và tính linh động tương đối Rf của mỗi lồi được xác định. Tính linh động
23


tương đối được tính bằng cách chia khoảng cách protein di chuyển cho khoảng
cách của chất nhuộm di chuyển. Chất nhuộm là một phân tử nhỏ mang điện tích
và có màu nên di chuyển nhanh hơn nhiều so với các protein. Do chất nhuộm có
màu nên cho phép ta thấy được dấu vết của nó đi trước và từ đó ta tính được giá
trị Rf ngay cả khi vệt dấu chạy khơng chính xác như nhau. Đối với phân tích
này điều quan trọng là không để vệt dấu ăn màu đi ra khỏi gel, nếu khơng ta
khơng thể tính được giá trị Rf. Với protein chuẩn nên có ít nhất năm loại protein
biết khối lượng phân tử khác nhau để chúng tạo phân bố khắp trong gel để ta có
thể ước lượng khối lượng protein chưa biết của mẫu.
• Phương pháp điện di mao quản nói chung và phương pháp điện di mao
quản điện động học mixen nói riêng góp phần phân tích nhiều loại chỉ tiêu trong
thực phẩm như đường, các aminoaxit, các peptide, chất béo, vitamin, các chất
phụ gia, các chất độc vi lượng cả vô cơ và hữu cơ.

24


B. PHƯƠNG PHÁP PCR

I. Khái niệm:
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch
đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà khơng qua tạo dịng. Phương pháp
này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương
pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn
ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh,
xác định giới tính của phơi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến
định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,….
II. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp
DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân
số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của
enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một
mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer
này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa
trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được
khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm
bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích
khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA
xác định, cần phải có những thơng tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là
trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt
(trích dẫn bởi Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003).
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước như sau :
Bước 1: (Biến tính tách đơi sợi DNA, denaturation)
25