Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm trichoderma có hoạt tính kháng nấm từ đất trồng cây hoa màu tại tỉnh thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐÀM THỊ THU GIANG
Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM
TRICHODERMA CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ ĐẤT
TRỒNG CÂY HOA MÀU TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy
Ngành

: CNSH

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2013 – 2017

Thái Nguyên – năm 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐÀM THỊ THU GIANG
Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM
TRICHODERMA CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ ĐẤT
TRỒNG CÂY HOA MÀU TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành

: CNSH

Lớp

: K45 - Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2013 – 2017

Ngƣời hƣớng dẫn

: ThS. Bùi Đình Lãm

Thái Nguyên – năm 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Được sự đ ồng ý của Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông lâm
Thái Nguyên. Em được thực tập tại phòng thí nghiệm của Khoa CNSHCNTP, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên với đề tài : “Phân lập và
tuyển chọn một số chủng nấm Trichoderma có hoạt tính kháng nấm từ đất
trồng cây hoa màu tại tỉnh Thái Nguyên”. Để hoàn thành khóa luận này
ngoài sự nỗ lực của bản thân em còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của Ban
giám hiệu trường, Ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP, cùng các thầy cô giáo
đã tận tình giảng dạy em suốt 4 năm Đại học.
Trước hết em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiê ̣u nhà trường

, Ban

chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP cùng các thầ y cô giáo trong Khoa đã ta ̣o điề u
kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính t rọng, lòng biế t ơn sâu sắ c tới ThS .
Bùi Đình Lãm giảng viên khoa CNSH-CNTP. Người đã tâ ̣n tiǹ h chỉ bảo , giúp
đỡ và hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiê ̣n đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới gia điǹ h, bạn bè, người thân đã quan tâm ủng
hộ và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập , cảm ơn
bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ em trong suố t thời gian qua.
Do điều kiện và thời gian có ha ̣n , trình độ và kỹ năng bản thân còn
nhiề u ha ̣n chế nên đề tài khó tránh khỏi những thi ếu sót. Kính mong thầy cô

giáo và các bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài của em được
hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 04 tháng 06 năm 2017
Sinh viên
Đàm Thị Thu Giang


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Thành phần môi trường PGA ......................................................... 24
Bảng 3.2: Thành phần môi trường nhân sinh khối Trichoderma [5] .............. 25
Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu............................................ 25
Bảng 3.4: Các trang thiết bị máy móc dùng trong thí nghiệm ........................ 26
Bảng 3.5. Trình tự mồi ITS4 và ITS5 ............................................................. 31
Bảng 3.6. Thành phần phản ứng PCR và liều lượng dùng cho một phản ứng .. 31
Bảng 3.7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................. 32
Bảng 4.1. Kết quả phân lập các mẫu đất ......................................................... 36
Bảng 4.2. Đặc điểm hình thái của 2 chủng phân lập được ............................. 39
Bảng 4.3. Hoạt tính đối kháng của Trichoderma và Fusarium trên môi
trường PGA ..................................................................................... 41
Bảng 4.4. Hoạt tính đối kháng của Trichoderma và Phytophthora trên môi
trường PGA ..................................................................................... 44


iii

DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 2.1. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma .............................................. 5
Hình 2.2. Bào tử nấm Trichoderma .................................................................. 6
Hình 3.1: Các bước tạo chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma .................... 35
Hình 4.1. Nấm mốc phân lập trên môi trường PGA của chủng C1 và chủng C2 37
Hình 4.2. Hình thái của nấm Trichoderma trên môi trường PGA .................. 38
Hình 4.3. Hình ảnh cấy trải của chủng C1, chủng C2 và chủng C3 .............. 39
Hình 4.4. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B), (C) chủng C1 ...... 39
Hình 4.5. Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào (B) chủng C2 ............. 40
Hình 4.6. Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với
Fusarium và đối chứng (D) Fusarium sau 3 ngày cấy ................... 42
Hình 4.7. Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với
Fusarium và đối chứng (D) Fusarium sau 6 ngày cấy ................... 42
Hình 4.8. Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A) với Fusarium và đối chứng
(B) Fusarium sau 9 ngày cấy ......................................................... 43
Hình 4.9. Đối kháng Trichoderma chủng C1 với Phytophthroza (a) và đối
chứng Phytophthroza (b) ................................................................ 45
Hình 4.10. Kết quả tách chiết DNA tổng số ................................................... 46
Hình 4.11. Kết quả điện di trên gel agarose .................................................... 47
Hình 4.12. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .................................................. 47
Hình 4.13. Kết quả so sánh trình tự gen sản phẩm PCR trên BLAST với mồi
với mồi ITS4-ITS5 từ mẫu đất (từ Xã Quyết Thắng TP Thái
Nguyên, Tỉnh Thái Nguyên) ........................................................... 48
Hình 4.14. Hình ảnh chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma......................... 50


iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

STT

Ký hiệu

1

µg

Microgram

2

µl

Microlit

3

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

4

DNA

Deoxyribonucleotide acid

5

EDTA

Ethylene diamin tetracetic acid

6

PCR

7

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

8

RNA

Ribonucleic acid

9

Taq

Thermus aquaticus

10

TAE

Tris-Acetate- EDTA

11

TE

Tris- EDTA

12

ĐC

Đối chứng

Polymerase chain reaction


v

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... iv
MỤC LỤC ........................................................................................................ v
PHẦN I. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục đích của đề tài .................................................................................... 3

1.3.Yêu cầu của đề tài ....................................................................................... 3
1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
1.4.1. Ý nghĩa trong khoa học ........................................................................... 3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
2.1. Đại cương về Trichoderma ........................................................................ 4
2.2. Đặc điểm cấu tạo, hình thái tế bào nấm ..................................................... 4
2.2.1. Cấu tạo..................................................................................................... 4
2.2.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 5
2.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa nấm Trichoderma ........................................ 7
2.3. Phân loại nấm Trichoderma ....................................................................... 9
2.4. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma ........................................ 9
2.4.1. Tương tác với nấm bệnh ......................................................................... 9
2.4.2. Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh ....................................... 11
2.5. Nấm Trichoderma với khả năng tạo chế phẩm đối kháng ...................... 11
2.5.1. Đất kháng nấm ...................................................................................... 12
2.5.2. Thiết lập quần thể và hiện tượng này mầm trong đất ........................... 12


vi

2.5.3. Thiết lập quần thể tại vùng rễ cây ........................................................ 12
2.6. Cơ chế hoạt động của Trichoderma ........................................................ 13
2.6.1. Khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma đối với các loài nấm gây
bệnh cây trồng ................................................................................................. 14
2.6.2. Hiện tượng giao thoa ............................................................................. 15
2.6.3. Hoạt động tiết enzyme ......................................................................... 15
2.6.3.1. Hệ enzyme thủy phân chitin............................................................... 15
2.6.3.2. Hệ enzyme thủy phân celluose........................................................... 16
2.7. Các dạng thuốc của chế phẩm Trichoderma trừ nấm bệnh .................... 17

2.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Trichoderma .................................... 18
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.. 24
3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu .............................................. 24
3.1.1. Đối tượng .............................................................................................. 24
3.1.2. Vật liệu và hóa chất, thiết bị dụng cụ nghiên cứu ................................. 24
3.1.2.1. Môi trường cần thiết trong quá trình nghiên cứu ............................... 24
3.1.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ hóa chất dùng trong phòng thí nghiệm . 25
3.1.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 26
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 26
3.2.1. Địa điểm thu thập và phân tích mẫu ..................................................... 26
3.2.2. Thời gian ............................................................................................... 26
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 26
3.4. Các phương pháp tiến hành thí nghiệm ................................................... 27
3.4.1. Phương pháp thu thập mẫu đất.............................................................. 27
3.4.2. Phương pháp phân lập nấm Trichoderma ............................................. 27
3.4.3. Phương pháp xác định hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc ................ 28
3.4.4. Phương pháp thử hoạt tính đối kháng của Trichoderma ...................... 28
3.4.5. Phương pháp định danh nấm Trichoderma bằng sinh học phân tử ...... 29


vii

3.4.5.1. Nhân và thu sinh khối Trichoderma .................................................. 29
3.4.5.2. Tách chiết DNA tổng số Trichoderma............................................... 30
3.4.5.3. Phản ứng PCR .................................................................................... 31
3.4.5.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR ......................................................... 32
3.4.5.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR .............................................. 33
3.6. Phương pháp tạo chế phẩm nấm đối kháng ............................................. 34
PHẦN 4. KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 36
4.1. Kết quả phân lập các chủng nấm Trichoderma ....................................... 36

4.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các nấm
Trichoderma .................................................................................................... 37
4.3. Kết quả thử hoạt tính đối kháng của nấm Trichoderma .......................... 41
4.3.1. Kết quả khả năng ký sinh của nấm Trichoderma và nấm Fusarium gây
bệnh vàng lá thối rễ ở cây ............................................................................... 41
4.3.2. Kết quả khả năng ký sinh của nấm Trichoderma và nấm Phytophthora
gấy bệnh thối gốc ở cây................................................................................... 44
4.4. Kết quả Định danh ................................................................................... 45
4.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số Trichoderma ..................................... 45
4.4.2. Kết quả PCR .......................................................................................... 46
4.4.3. Kết quả giải trình tự gen........................................................................ 47
4.5. Bước đầu sản xuất chế phẩm nấm đối kháng........................................... 49
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 51
5.1. Kết luận .................................................................................................... 51
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52


1

PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây hoa màu như: rau, lạc, đậu, lúa… là các loại cây trồng có giá trị
kinh tế cao đang được phát triển ở quy mô lớn ở nhiều nơi trên thế giới trong
đó có Việt Nam. Là nguồn nguyên liệu rất cần thiết cho các ngành sản xuất
lương thực, thực phẩm , đồng thời tăng cường bảo vệ môi trường sinh thái, cải
thiện kinh tế xã hội, tạo công ăn việc làm ổn định cho người dân trên cả nước,
đặc biệt là vùng miền núi.
Với lợi thế về đất đai và khí hậu, Thái Nguyên là vùng có thể phát triển

nhiều loại cây hoa màu. Tuy nhiên các loại cây này lại rất mẫn cảm với bệnh
do nấm. Ở đây, người dân tập trung đầu tư, thâm canh cao, lượng phân bón,
hóa chất bảo vệ thực vật hàng năm sử dụng nhiều. Trong khi đó việc áp dụng
các kỹ thuật tiến bộ về công nghệ sinh học cũng như công nghệ vi sinh trong
trồng trọt tại đây rất hạn chế.
Trong những năm gần đây Việt Nam đã có các công trình nghiên cứu
trong sử dụng nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ bệnh hại cây
trồng. Tuy nhiên các loài nấm Trichoderma chỉ phát huy được hiểu quả trong
một số môi trường nhất định. Thái Nguyên chủ yếu là đất đồi, chứa các loài
nấm Trichoderma bản địa có khả năng đối kháng cao với các loài nấm gây
bệnh, dễ phân lập.
Nấm Trichoderma hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong
một số môi trường sống khác. Chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng
nhất, hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số
giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên
rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài
nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe


2

mạnh, vì Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công các loài nấm
gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển của
cây. Rất nhiều giống Trichoderma có khả năng kiểm soát tất cả các loài nấm
gây bệnh khác. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma giết
nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium.
Tricoderma tiết ra một enzym làm tan vách tế bào của các loài nấm khác. Sau
đó nó có thể tấn công vào bên trong loài nấm gây hại đó và tiêu thụ
chúng. Cho phép nó bảo vệ vùng rễ của cây trồng chống lại các loại nấm gây
thối rễ trên đồng ruộng [8].

Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số giống có khả năng
hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những giống này cũng có khả
năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm.
Từ đó, Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản xuất và sử dụng
như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả. Hình thức sử dụng
dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón
cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng
bệnh của cây.
Các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng sử dụng chế phẩm nấm
Trichoderma giữ được quần thể sâu hại phát triển ở mức thấp nhất và không
thể phát triển được thành dịch, bảo vệ được các loài nấm và các vi sinh vật có
ích khác , góp phần nâng cao năng suất và chất lượng ra, bảo vệ môi trường
sống và sức khỏe cộng đồng. Các chế phẩm nấm sinh học được nghiên cứu từ
nấm Trichoderma được ứng dụng ngày càng phổ biến. Việc tìm ra các chủng
nấm Trichoderma mới thực sự có giá trị, ý nghĩa và tiềm năng ứng dụng to
lớn là cơ sở để bảo tồn nguồn gen quý và tạo ra các chế phẩm sinh học phục
vụ trong nông nghiệp. Ngày nay chủng Trichoderma chưa được bảo tồn, bị
biến đổi, mất cân bằng sinh học, theo đó chúng tôi tiến hành đề tài "Phân lập


3

và tuyển chọn một số chủng nấm Trichoderma có hoạt tính kháng nấm từ
đất trồng cây hoa màu tại tỉnh Thái Nguyên”.
1.2. Mục đích của đề tài
- Mục đích của đề tài:
+ Phân lập các chủng nấm Trichoderma từ các mẫu đất trên địa bàn tỉnh
Thái Nguyên
+ Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có hoạt lực kháng nấm cao
+ Định danh một số chủng Trichoderma có hoạt lực kháng nấm cao

+ Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm nấm đối kháng.
1.3.Yêu cầu của đề tài
+ Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả năng kháng nấm của
Trichoderma.
+ Tuyển chọn được 1-2 chủng Trichoderma có hoạt lực diệt nấm cao
nhất từ các chủng nấm được phân lập.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa trong khoa học
- Đánh giá mức độ đa dạng của nấm Trichoderma được phân lập từ
các mẫu đát khác nhau tại địa bàn tỉnh Thái Nguyên.
- Phân loại các chủng nấm Trichoderma có hoạt lực kháng nấm cao
- Bước đầu sản xuất các loại chế phẩm nấm đối kháng.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Dựa trên những gì thu được trong quá trình nghiên cứu góp phần xác
định được một số đặc điểm về hình thái tế bào và khuẩn lạc của nấm
Trichoderma.
- Giúp sinh viên tiếp cận với công tác khoa học, nâng cao trình độ
chuyên môn và đồng thời tạo cho bản thân sinh viên tác phong làm việc.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đại cƣơng về Trichoderma
Trichoderma: là nấm đối kháng dễ dàng phát triển trên tất cả các loại
đất tự nhiên, đất nông nghiệp, và trong một số môi trường khác. Chúng hiện
diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rể của cây, một số giống có
khả năng phát triển ngay trên rễ.
Nấm Trichoderma là một loại nấm mốc có phổ đối kháng rộng đối với

các loại nấm gây bệnh hại cây trồng và có khả năng kích thích sự phát triển
của bộ rễ cây.
Năm 1801, Person ex Gray đã xác định Trichoderma thuộc giới fungi, ngành
Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Hypocreaceae, giống Trichoderma [14].
Chúng tiêu diệt nấm bệnh bằng phản ứng lectin trung gian và phân hủy
thành tế bào nấm mục tiêu (nấm gây bệnh). Quá trình này đã kìm hãm sự tăng
trưởng và hoạt động của các loại nấm gây bệnh. Ngoài ra chúng sản xuất các
enzyme thành tế bào, trong đó cho phép Trichoderma đâm xuyên vào trong
nấm khác và trích xuất các chất dinh dưỡng cho sự phát triển của mình. Điều
này đã vô tình gây mất sự sống trực tiếp của các vi nấm gây bệnh.
2.2. Đặc điểm cấu tạo, hình thái tế bào nấm
2.2.1. Cấu tạo
Nấm mốc nói chung (trong đó có Trichoderma) có thành tế bào cấu tạo
chủ yếu là chitin (là polymer của n- acetylglucosamine) và chitosan (chitin bị
deacetyl hóa) và các thành phần khác gồm beta- glucan, alpha- glucan,
mannoprotein[20], chất màu, lipid (8-33%)[3]. Màng tế bào dày khoảng 7µm
thành phần chủ yếu là lipit (40%) và protein (38%). Nhân phân hóa thường
hình tròn, đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2-3µm. Ty thể hình elip, luôn
di động để tham gia vào quá trình hô hấp của tế bào[3]. Những hiểu biết cơ


5

bản về cấu tạo tế bào Trichoderma chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn và cải
tiến các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp.
2.2.2. Đặc điểm hình thái
- Trichoderma là loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng bào tử từ khuẩn
ty. Bào tử nấm có dạng hình trứng, màu xanh lục đính trên các sợi nấm.
- Khuẩn ty (sợi nấm) của vi nấm không màu, có tốc độ phát triển rất
nhanh, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều ở cuối nhánh phát triển thành một

khối tròn mang các bào tử trần, không có vách ngăn, không màu, liên kết
nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhày. Bào tử hình cầu, hình elip,
hoặc hình khuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng
xanh, lục xỉn đến lục đậm.
- Trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì
chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số loài còn có khả
năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trường PGA hóa vàng [12].

Hình 2.1. Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma


6

Thường quan sát thấy nấm Trichoderma tồn tại trong đất ở dạng sợi
nấm hoăc bào tử. Bào tử có rất nhiều trong đất ẩm.
Trên cùng một môi trường nuôi cấy, mỗi loài Trichoderma có hình
dạng khuẩn lạc khác nhau. Đây là một trong những đặc điểm để nhận dạng và
phân biệt. Khuẩn lạc Trichoderma phát triển rất nhanh và thành thục trong
vòng 5 - 7 ngày. Trên môi trường PGA khi ủ ở nhiệt độ ở 250C, khuẩn lạc
nấm Trichoderma ban đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc
xanh vàng khi có bào tử xuất hiện. Ở một số loài Trichoderma còn có khả
năng tiết ra sắc tố có màu vàng trên môi trường PGA [12].

Hình 2.2. Bào tử nấm Trichoderma
(Nguồn: vuonsinhthaitrungviet.com)
Ở một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Cuống
bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau. Một số loài khác có cuống bào tử
mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực
tỏa ra của khuẩn lạc, có kích thước từ 1-7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc
dạng như bông không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng

khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động như chồi mầm.
Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của
cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không


7

có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc
điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có
màu trắng (như T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc
hình oval (với tỉ lệ dài rộng từ 1-1,1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài rộng là
hơn 1,4 µm), đa số các bào tử trơn láng. Kích thước không quá 5µm.
Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà
T.haianum có thể tồn tại 110-130 ngày dù không được cung cấp chất dinh
dưỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống
sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng
nên Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học.
2.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa nấm Trichoderma
Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2.59.5. Phát triển tốt ở pH 4.5-6.5. Nhiệt độ phát triển tối ưu thường là 25-30ºC.
Một vài dòng phát triển ở 35ºC. Một số ít phát triển đưc ở 40ºC [16]. Hình thái
khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau.
Ở 35ºC chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ
và ở mép bất thường, ở 37ºC không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy [18].
Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt
đường kính khuẩn lạc từ 2-4cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20ºC.
Trong thời gian nhân nuôi, nấm Trichoderma cần có điều kiện thoáng
khí vì vậy sau khi vô trùng cần làm cho môi trường nhân nuôi xốp bằng cách
lắc để chúng không kết lại thành mảng. Nếu bị kết mảng bào tử hình thành rất
ít thậm chí sợi nấm không lan vào được.
- Môi trường sống: Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ở đất tự

nhiên, đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng muối và đất xa mạc. Trichoderma rất ít
tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội ký sinh ở thực vật [15]. Chúng


8

có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực bắc đến các vùng núi
cao cũng như vùng nhiệt đới. Tuy nhiên, có một sự tương quan giữa sự phân
bố các loài và các điều kiện môi trường.
- Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau từ
cacbonhydrat, amino axit đến amonia.
- Trichoderma là vi nấm ưa độ ẩm chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở
những nơi ẩm ướt. Tuy nhiên lại không chịu được độ ẩm thấp và điều này
được cho là một yếu tố góp phần làm cho số lượng Trichoderma giảm rõ rệt
trong những nơi có độ ẩm thấp, song các loài Trichoderma khác nhau yêu cầu
về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau.
- Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh: Trichoderma sản xuất nhiều
loại kháng sinh và enzyme như: Chitinolytic (enzyme phân giải chitin),
Cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2 enzyme chính phân giải
thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với
Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác dụng làm tăng tỉ lệ nảy mầm.
Tuy nhiên cơ chế tác động này chưa được biết [16].
Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện
tượng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân
chia tế bào và tác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn
tới sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một
loài Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện
sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dòng rất có ý nghĩa trong
nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh
thực vật [15].

Ngoài ra chúng cũng sinh ra nhiều hợp chất ức chế dễ bay hơi có thể
trợ giúp cho sự hình thành khuẩn lạc của chúng trong đất.


9

2.3. Phân loại nấm Trichoderma
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho
việc định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh,
phân loại vẫn chưa biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường
dựa vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử và quá trình sinh
sản bào tử vô tính.
- Phân loại Trichoderma:
+ Dựa trên sự khác biệt về hình thái, chủ yếu là hình thái bào tử đơn tính
+ Dựa trên tính đối kháng của Trichoderma
- Hiện nay có khoảng 50 loài Trichoderma được tìm thấy, được phân
thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasim và
Hypocreanum. Trong đó có 11 loài có khả năng đối kháng cao: T.harzianum,
T.aureoviride,

T.atroviride,

T.koningii,

T.longibrachiatum,

T.viride,

T.pseudokoningii, T.longipilis, T.minutisporum, T.hamatum, T.seesei.
2.4. Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma

2.4.1. Tương tác với nấm bệnh
- Sự tương tác đối kháng giữa Trichoderma và các loài nấm khác được
phân loại như sau:
+ Tiết ra các chất kháng nấm bệnh
+ Kí sinh trên cơ thể của nấm bệnh
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh.
Các cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối kháng có thể bao
gồm một tương tác hoặc nhiều hơn. Ví dụ, sự kiểm soát Botritis trên nho bởi
Trichoderma bao gồm cả sự cạnh tranh dinh dưỡng và kí sinh trên hạch nấm,
cả 2 tương tác đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh.
- Cơ chế tiết ra các chất kháng nấm bệnh: Các chủng Trichoderma sản
xuất đa dạng các chất chuyển hóa dễ bay hơi và không bay hơi, một vài chất


10

loại này ức chế vi sinh vật khác mà không có sự tương tác vật lý. Chất ức chế
được gọi là chất kháng sinh. Các chủng Trichoderma sản xuất nhiều loại
kháng sinh khác nhau, môi trường cũng tác động vào sự hình thành chất
kháng sinh cả về số lượng và chất lượng. Hơn nữa các kháng sinh đặc hiệu tác
động vào các tác nhân gây bệnh khác nhau thì khác nhau.
- Cơ chế ký sinh trên cơ thể nấm bệnh: Tức giết chết các loài gây bệnh
bằng cách xâm nhập vào bên trong loài nấm gây hại và tiết ra những chất
(enzyme) để phân hủy chúng. Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ
có tính hướng hóa chất, nó ký sinh phân nhánh hướng về những nấm đã được
định trước (do những nấm này tiết ra các hóa chất). Ngoài ra, vật ký sinh và
vật đối kháng được Trichoderma nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này
có thể do tự nhiên hay hóa học (qua trung gian là lectin trên bề mặt tế bào của
mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời, Trichoderma kí sinh vào và cuộn
quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng móc hay dạng giác

bám, tiết enzyme chitinase, glucanase, protease, những enzyme này có khả
năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi
nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công trực tiếp của Trichoderma. Khi kí sinh
vào cây T. asperellum tiết cellulase, cho phép nó tấn công những nấm như
Phytophthora spp., Và Pythium spp., khi chúng bám vào cây trồng.
- Theo Chet (1990) Cơ chế đối kháng ký sinh gồm 4 giai đoạn:
+ Sự tăng trưởng có tính chất hướng hóa trong giai đoạn này các tác
nhân kích thích hóa học hấp dẫn nấm đối kháng.
+ Sự nhận dạng đặc hiệu bởi lectin trên bề mặt tế bào của tác nhân gây
bệnh và nấm đối kháng.
+ Sự tấn công và xoắn vòng của sợi nấm Trichoderma xung quanh vật chủ.
+ Sự bài tiết các enzyme phân giải thành tế bào. Hệ enzyme phân
giải thành tế bào gồm: Endochitinase và Glucanase1,3-beta-glucosidase
và protease.


11

2.4.2. Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh
Trichoderma sử dụng cùng một nguồn tài nguyên (dinh dưỡng, không
gian sống) với các sinh vật gây bệnh và Trichoderma “xâm chiếm” môi
trường trước khi tác nhân không mong muốn đến.
Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm bệnh cây trồng, làm suy kiệt
chúng bằng cách hút hết dưỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng
những bào tử chống chịu (chlamydospores).
+ Sự cạnh tranh cho mô hoại sinh: Botrytis và Sclerotinia là mầm bệnh
tấn công vào mô thực vật lão hóa hoặc chết và coi đó như nguồn dinh dưỡng,
từ đây tiếp tục tấn công vào những mô khỏe mạnh. Khi đã xử lí Trichoderma,
chúng làm suy yếu, làm chậm quá trình hình thành khuẩn lạc của Botrytis vào
mô thực vật. Sau đó làm giảm mức độ bệnh trên cây. Trichoderma đã được

ứng dụng thành công trong kiểm soát Botrytis và Sclerotinia trên những loại
rau cải, trái cây khác nhau: dâu, dưa chuột.
+ Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt: Bệnh chết nhát gây bởi
Pythium ultimum.
Ở một số loại ngũ cốc và rau quả được xuất phát từ sự đáp ứng nhanh
chóng của mầm bệnh với dịch rỉ từ hạt. Túi bào tử của Pythium được nảy
mầm và xâm nhiễm vào hạt giống, trong vòng vài giờ đã lan tràn trong đất.
Xử lý bằng Trichoderma làm giảm sút sự nảy mầm của túi bào tử Pythium,
hiện tượng đó gọi là sự cạnh tranh kích thích nảy mầm.
+ Sự cạnh tranh trên vị trí vết thương: sử dụng T. viride để kiểm soát
mầm bệnh gây bạc lá.
2.5. Nấm Trichoderma với khả năng tạo chế phẩm đối kháng
Nấm đối kháng: là các loài VSV sống hội sinh trong đất mà trong quá
trình sống nó sản sinh ra chất kháng sinh có tác dụng ức chế, kìm hãm cạnh
tranh và tiêu diệt nấm gây bệnh.


12

2.5.1. Đất kháng nấm
- Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng này sẽ mất dần.
Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của
Trichoderma. Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao
và liên quan đến hiện tượng giảm khả năng kháng nấm trong đất.
- Độ nhạy của đất kháng nấm được công bố trên đất trung tính, đất
kiềm chua và đất acid.
- Các bào tử phân sinh kháng nấm nhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít
kháng nấm hơn bào tử phân sinh.
2.5.2. Thiết lập quần thể và hiện tượng này mầm trong đất
VSV trong đất không và hoạt động phụ thuộc vào nhiều loại chất nền

trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau. Trong nhiều trường hợp
cho thấy vấn đề này không thích hợp với Trichoderma và tăng lên nhiều trong
nhiều loại đất khác nhau. Khi cấy sợi nấm non (chưa có bào tử) vào đất đều
liên quan mật thiết với tình trạng thành phần môi trường đất. Bào tử sinh sôi
nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ cân bằng trong đất từ
9-36 tuần sau khi cấy nấm vào đất). Điều này phụ thuộc vào tuổi nấm và như
vậy có liên quan đến thành phần thức ăn, và việc hình thành quần thể sợi nấm
Trichoderma từ thành phần nuôi trồng không liên quan đến loại đất. Viên
Alginate chứa bào tử phân sinh được sản xuất bằng phương pháp lên men tạo
quần thể bào tử ít hơn so với phương pháp nhân sinh khối bằng đất (chủ yếu
là hậu mô bào tử). Thêm vào đó, việc lên men đất được thêm vào đất chất
Pyrax khô giúp làm tăng quần thể từ 5.103 lên 6-7.106 bào tử /gram đất.
2.5.3. Thiết lập quần thể tại vùng rễ cây
Trichoderma đã được phân lập từ rễ cây và có khả năng dùng vào việc
phòng trừ sinh học tại vùng rễ cây bị bệnh.
Hiệu quả của Trichoderma không chỉ xử lý mà còn tiếp tục thiết lập
quần thể dưới vùng rễ cây sau khi xử lý hạt.


13

Trichoderma xử lý hạt phát triển nhanh xung quanh hệ rễ tạo các bào tử
ngăn cản bệnh xâm nhiễm cây trồng.
Nấm Trichoderma được cấy vào đất với tác dụng chống bệnh cho cây
bắt buộc phải cấy dọc theo bề mặt rễ nhưng cách xa lá mầm. Trichoderma có
khả năng diệt trừ bệnh thối rễ, hạt và bệnh chết cây con.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy T.hazzianum không thiết lập quần
thể xung quanh hệ rễ cây họ đậu và cây đậu Hà lan con. Quan sát bào tử trên
vùng rễ cây gồm rễ, vỏ, hạt bị thối và lá mầm, số lượng bào tử trên mỗi gram
đất xung quanh hệ rễ luôn luôn ít. Bào tử của Trichoderma ít thiết lập quần

thể hay ít di chuyển vào vùng rễ cây. Với T. hazzianum vài bào tử được tìm
thấy cách xung quanh hệ rễ cây 10cm, trên cây dược xử lý hạt.
Ngược lại, số lượng bào tử tìm thấy nhiều trên là mầm đậu bị thối và vỏ
hạt giống kể cả mẫu bệnh xung quanh rễ. Có nhiều giải thích về việc số lượng
bào tử Trichoderma tăng hoặc giảm trong đất và Trichoderma không có khả
năng thiết lập quần thể ở vùng rễ cây, do có nhiều lý do bao gồm: Thiếu dinh
dưỡng, hiện diện chất độc trong rễ cây hay hiện diện của chất kháng sinh hoặc
sự hiện diện của vi sinh vật đối lập với Trichoderma tại vùng rễ cây hay mức
độ rễ của cây. Ví dụ: Pseudomonas đối lập với tác nhân phòng trừ sinh học
nhưng khi có hiện diện của chất sắt trong vùng rễ của cây hay Pseudomonas
sản xuất chất độc chuyển đổi gây ảnh hưởng đến bào tử của Trichoderma.
2.6. Cơ chế hoạt động của Trichoderma
Nấm đối kháng là những thành viên phổ biến của hệ vsv đất. Chúng
thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc nấm
kháng cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh. Sự phân biệt của chúng
phụ thuộc vào vùng địa lý, loại đất, điều kiện khí hậu, và thảm thực vật ở từng
khu vực. Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm
gây bệnh, giúp cây phục hồi, sinh trưởng và phát triển, một số loài nấm đối


14

kháng đã được tìm thấy: Penicillium, P. frequetans, P. Vermiculata,… là đối
kháng của nấm Pythium spp, phizocotia solani. Nấm Aspergillus niger đối
kháng với nấm Fusarium sokeni.
Đối với nấm Trichoderma, cũng là một trong những giống nấm có khả
năng ức chế một số nấm gây bệnh như: fusarium, Phytophthroza,.. gây bệnh
trên nhiều loại cây hoa màu.
2.6.1. Khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma đối với các loài nấm
gây bệnh cây trồng

Năm 1952, Wood thông báo về tính đối kháng của nấm Trichoderma
viride đối với nấm bệnh trên rau diếp là Botrytis cinerea. Ngày nay, người ta
còn biết sử dụng nấm Trichoderma để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh nấm ở
rễ (như Pythium, Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthora,...) và cả các bệnh ở
các phần trên mặt đất (như Botrytis cinerea).
Bliss (1959); Ohr và cô ̣ng sự (1973), cung cấ p bằ ng chứng thuyế t phu ̣c
nhấ t, quầ n thể Trichoderma trong đấ t có khả năng phòng trừ nấ m Armillaria
mellea trên đấ t đã đươ ̣c xử lý xông hơi bằ ng methyl bromide.
Well và cá c cô ̣ng sự (1962) lầ n đầ u tiên công bố sử du ̣ng mô ̣t số lươ ̣ng
lớn Trichoderma được nuôi trồ ng trên môi trường rắ n ra thử nghiê ̣m ngoài
đồ ng ruô ̣ng để kiể m soát nấ m

Sclerotium rolfsii trên cà chua . Barkman và

Rodriguez Kabano (1975) nuôi trồ ng T.harzianum bằ ng phương pháp thương
mại, các giá thể chứa nấm được rải xuống đất dọc theo các hàng đậu vớ

i

lươ ̣ng 112-140 kg/ha sau 70-100 ngày sau khi gieo đậu. Với lươ ̣ng 140 kg/ha,
T.harzianum có tác dụng phòng chống S.rolfsii và tăng năng suất lên trong
khoảng 3 năm.
Nấ m Trichodema hamatum có rất nhiều trong đất hữu cơ tại vườn ươm
ở Colombia có khả năng ngăn chặn nấm

R.solani và phân lập từ đất tại

Mexico có khả năng ngăn chă ̣n nhiề u loại nấm đ ất. Nhiê ̣t đô ̣ và tia phóng xa ̣

15

gamma không thể diê ̣t nấ m

R.solani nhưng trong môi trường T.harzianum

diê ̣t đươc̣ nấ m này , đây là vai trò chính của Trichoderma trong viê ̣c phòng trừ
sinh ho ̣c.
2.6.2. Hiện tượng giao thoa
Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Vào năm
1932 Weinding đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh
và đặt tên cho hiện tượng đó là “Giao thoa sợi nấm”
Hiện tượng gia thoa gồm 3 giai đoạn như sau:
(1) Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh
(2) Sau sự vây quanh, sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm
gây bệnh cây
(3) Cuối cùng là sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng lớp tế bào
của nấm gây bệnh, làm cho chất nguyên sinh trong nấm gây bệnh bị phân hủy
và dẫn đến nấm bệnh bị chết.
Sau này quan sát dưới kính hiển vi, hiện tượng ký sinh của nấm
Trichoderma được mô tả như sau: Tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc
với nấm gây bệnh đã làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết.
Ngược lại ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma
với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất
kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh.
2.6.3. Hoạt động tiết enzyme
2.6.3.1. Hệ enzyme thủy phân chitin
Chitin là 1 trong những polymer phong phú nhất trong sinh học,
enzyme phân giải chitin được tìm thấy ở tất cả mọi giới: nguyên sinh, vi
khuẩn, nấm, thực vật, động vật có xương sống và không xương sống kể cả

con người. Sự thủy phân chitin bằng enzyme có liên quan đến rất nhiều quá
trình sinh học như: sự tự phân giải, sự tạo hình, dinh dưỡng. Thêm vào đó,


16

sự vi kí sinh đóng vai trò quan trọng trong mối quan hệ giữa nấm và các
sinh vật khác.
Người ta đã tinh chế được rất nhiều enzyme chitinase, trong đó phổ
biến nhất là endochitinase.
Hoạt động kháng nấm của chitinase được tăng cường bởi sự trợ lực của
kháng sinh. Enzyme chitinase của Trichoderma được xem là enzyme có hoạt
tính kháng khuẩn mạnh nhất. Hoạt động của chitinase phối hợp mạnh mẽ với
các enzyme chitinase và các hợp chất có liên quan đến việc kiểm soát sinh
học như kháng sinh. Sự phối hợp với các enzyme phân giải chitin và glucan
khác đã dấn đến sự tăng cường kỳ lạ của hoạt động thủy phân và ức chế ngay
cả trong các trường hợp các enzyme này có hoạt tính thấp hay không có hoạt
tính khi chúng được sử dụng riêng lẻ, tuy nhiên quan trọng hơn nữa là khả
năng chitinase làm tăng hiệu quả kháng nấm của các hợp chất không có bản
chất enzyme hay các vi sinh vật khác. Chẳng hạn Lorito và các cộng sự đã
cho thấy sự phối hợp hoạt động giữa các enzyme thủy phân chitin với các hợp
chất tự nhiên cũng như tổng hợp có ảnh hưởng lên màng tế bào.
2.6.3.2. Hệ enzyme thủy phân celluose
Cellulose là chất trùng hợp của β-1,4-glucan được sử dụng như 1
nguồn năng lượng bởi rất nhiều vsv tiết ra cellulase. Hệ thủy phân cellulose
của Trichoderma bao gồm 3 lớp enzyme:
 Enzyme thủy giải 1,4- β-D-glucan, cát các sợi cellulose thành các
đơn vị cellobiose
 Endo-1,4-D-glucanase, cắt các nối glucoside
 1,4-β-D-glucoside phân cát các cello-oligosaccharide để tạo glucose

Bên cạnh sự tác động qua lại trong quần thể giữa nấm đối kháng và
nấm bênh, nấm Trichoderma. Còn có tác động trực tiếp lên sự phát triển của
cây trồng, do trong hoạt động, nấm này sản sinh ra các men phân hủy glucose,