Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng urease của vi khuẩn Helicobacter pylori (Luận án tiến sĩ)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm đã gây nhiễm hơn nửa dân số
trên thế giới và đã được chứng minh có liên quan đến cơ chế gây bệnh viêm
dạ dày mạn tính, loét dạ dày tá tràng, ung thư dạ dày và u lympho ở dạ dày
(gastric MALT lymphoma) [1], [2], [3], [4], [5]. Tần suất nhiễm H. pylori có
liên quan rất lớn đến điều kiện kinh tế xã hội, trên 80% ở các nước đang phát
triển trong khi chỉ có khoảng 20 – 50% ở các nước phát triển [6], [7], [8], [9],
[10] và có sự khác biệt theo từng vùng địa lý giữa các nước dao động từ 13%
ở Nga đến Myanmar (48%), Nhật (71%), Trung Quốc (58%), Trung Mỹ
(62%), Việt Nam (>70%), Đông Âu (82%) và các nước châu Phi (>80%) [10],
[11], [12], [13], [14]. Mặc dù mỗi chủng H. pylori đều có sự khác biệt về khả
năng gây bệnh nhưng nhìn chung H. pylori đã nhiễm ở 90% bệnh nhân viêm
dạ dày, trên 90% loét tá tràng, 70% loét dạ dày và 90% ung thư dạ dày [11],
[15], [16], [17]. Riêng ở Việt Nam, nhiễm H. pylori khá phổ biến và có mối
liên quan mật thiết với bệnh lý dạ dày tá tràng. H. pylori được tìm thấy trong
viêm dạ dày mạn (100%), viêm dạ dày thể hoạt động (83,1%), viêm teo niêm
mạc dạ dày (85,3%), chuyển sản ruột (14,7%) tạo nguy cơ dẫn đến ung thư
biểu mô tuyến dạ dày và loét dạ dày tá tràng (21%) [18], [19], [20].
Việc điều trị viêm loét dạ dày - tá tràng do nhiễm H. pylori rất phức tạp
vì phải sử dụng phác đồ phối hợp các thuốc kháng sinh với các thuốc giảm
toan, giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian và đúng quy cách. Tuy nhiên, khả
năng thất bại cũng rất lớn do tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh. Hội nghị
Đồng thuận Maastricht III (2005) khuyến cáo nên sử dụng phác đồ điều trị
chuẩn ban đầu với bộ ba điều trị PPI (thuốc ức chế sự bài tiết acid của dạ dày
- proton pump inhibitor) – clarithromycin – amoxicillin hoặc metronidazole.
Tuy nhiên, tỉ lệ đề kháng thuốc với phác đồ bộ ba ngày càng tăng. Để hỗ trợ

1

2

cho phác đồ điều trị chuẩn ban đầu, Hội nghị cũng nhắc đến phác đồ thứ hai
và phác đồ thứ ba, đồng thời tiếp tục bàn luận về sự đề kháng thuốc và nhận
thấy khả năng đề kháng thuốc đạt tới 20% [21]. Năm 2010, tại Hội nghị
Maastricht IV ở Florence (Ý) đã ghi nhận tỉ lệ kháng thuốc trong điều trị tiệt
trừ H. pylori tăng trên toàn cầu và cũng thống nhất những phác đồ thích hợp
dựa trên tình trạng kháng thuốc [22], trong đó phương pháp miễn dịch trị liệu
thụ động sử dụng các kháng thể kháng trực tiếp H. pylori hoặc kháng urease
của H. pylori là một hướng nghiên cứu được quan tâm đặc biệt.
Globulin miễn dịch từ trứng gà (egg york immunoglobulin - IgY) là
kháng thể được chuyển từ máu gà mái sang lòng đỏ trứng để thực hiện chức
năng sinh lý là bảo vệ phôi và gà con. Các kháng thể IgY đặc hiệu trong trứng
gà có các đặc tính bảo vệ giống như các kháng thể có trong máu gà mẹ. Các
tác giả Nhật Bản và Hàn Quốc đã sử dụng IgY kháng urease của H. pylori bổ
sung vào sữa chua làm thực phẩm chức năng dự phòng nhiễm H. pylori bước
đầu cho thấy có hiệu quả dự phòng trên người tình nguyện [23]. Nhằm tạo ra
nguyên liệu chế tạo các chế phẩm dự phòng nhiễm H. pylori tại Việt Nam
theo phương pháp miễn dịch thụ động, đề tài “Nghiên cứu chế tạo globulin
miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng urease của vi khuẩn Helicobacter
pylori” được thực hiện với những mục tiêu sau:
1. Tách chiết urease của vi khuẩn Helicobacter pylori phân lập từ bệnh

nhân viêm loét dạ dày - tá tràng.
2. Chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng urease của vi

khuẩn Helicobacter pylori.
3. Đánh giá khả năng dự phòng nhiễm Helicobacter pylori trên động vật

thực nghiệm của IgY kháng urease.

2


3

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
1.1. VI KHUẨN Helicobacter pylori
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Vào năm 1981, Robin Warren, nhà Giải phẫu bệnh người Úc, đã phát
hiện được một loại vi khuẩn ở niêm mạc dạ dày của bệnh nhân bị viêm hoặc
loét dạ dày và hình dạng của chúng giống vi khuẩn thuộc giống
Campylobacter cho nên tên gọi đầu tiên của chúng là Campylobacter pylori.
Đến năm 1983, Barry Marshall, người Úc, đã thành công trong việc nuôi cấy,
phân lập vi khuẩn này từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân bị viêm dạ
dày mạn, loét dạ dày, loét tá tràng và ghi nhận đặc tính tăng trưởng khác nhau
giữa chúng với Campylobacter pylori. Cho đến năm 1989, dưới kính hiển vi
điện tử, vi khuẩn này không giống Campylobacter vì có cấu trúc lông khác
hẳn, bên cạnh đó, còn có những khác biệt lớn trong tính chất sinh hoá và cấu
trúc chuỗi 16S rRNA cho nên cuối cùng loài vi khuẩn này được xếp vào một
giống mới, giống Helicobacter, thuộc họ Helicobacteraceae và được đổi tên
là Helicobacter pylori [24], [25].
1.1.2. Dịch tễ học
Một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất ở người mà
các tác giả trong và ngoài nước thường hay nhắc đến đó chính là nhiễm H.
pylori. Qua nhiều nghiên cứu nhận thấy tuổi, tình trạng kinh tế, xã hội và
chủng tộc đã ảnh hưởng rất lớn đến tần suất nhiễm H. pylori. Đã có khoảng

hơn nửa dân số thế giới bị nhiễm H. pylori và tần suất nhiễm có sự khác biệt
rất lớn giữa các nước phát triển và các nước đang phát triển. Ở các nước đang
phát triển như Ấn Độ, Saudi Arabia, Việt Nam và châu Phi có tỉ lệ nhiễm H.
pylori khá cao chiếm khoảng 80% ở lứa tuổi trên 20 tuổi. Trong khi đó, ở các
3


4

nước phát triển như Anh, Úc và Pháp, tỉ lệ nhiễm thấp hơn 10 – 20% và tăng
khoảng 1% mỗi năm [11], [26], [27]. Nguyên nhân của sự khác biệt này chủ
yếu là do vệ sinh môi trường, cụ thể như sự phát triển của hệ thống hiện đại
trong việc xử lý nước và chất thảy ở các nước phát triển [28], [29], [30].
Riêng về tuổi, trẻ em phần lớn bị nhiễm ở độ tuổi từ 2 – 8, trong đó các
nước phát triển tỉ lệ nhiễm cũng thấp hơn như tần suất nhiễm ở trẻ em Nhật
Bản dưới 10 tuổi rất thấp chỉ có 5% và cũng tăng dần theo tuổi [27]. Thêm
vào đó, ở các nước phát triển, người lớn có độ tuổi bị nhiễm thường trên 50
tuổi và tần suất này tăng thêm 10% mỗi năm, trong khi các nước đang phát
triển có độ tuổi nhiễm sớm hơn thường trên 20 tuổi. Ở Việt Nam, Nguyễn Sào
Trung (2005) đã ghi nhận tần suất nhiễm H. pylori cao ở độ tuổi từ 31 - 50
tuổi [31].
Đường lây nhiễm chủ yếu là đường ăn uống (phân - miệng) hoặc lây
trực tiếp (miệng - miệng) qua nước bọt. Ở những nơi có điều kiện vệ sinh
kém, nước và thức ăn bị nhiễm là nguồn lây quan trọng ban đầu. Đó cũng
chính là lý do giải thích tại sao ở các nước đang phát triển tần suất nhiễm H.
pylori cao hơn rất nhiều [11], [28], [32], [33].
1.1.3. Đặc điểm sinh học của H. pylori
1.1.3.1. Hình thể và dinh dưỡng

Hình 1.1. Vi khuẩn Helicobacter pylori

* Nguồn: McColl K.E.L. (2010) [34]

Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm, hình cong, xoắn nhẹ, dài 1,5
- 5µm, đường kính 0,3 - 1µm. Bề mặt vi khuẩn nhẵn, vỏ mỏng, có 4 - 6 lông,

4


5

đầu mút hình củ hành, nhờ đó H. pylori di chuyển được trong lớp nhầy của
niêm mạc dạ dày bởi chuyển động xoắn (Hình 1.1) [24], [34], [35], [36].
Helicobacter pylori thuộc loại vi khuẩn vi hiếu khí, mọc chậm nên phải
nuôi cấy từ 4 - 7 ngày. Vi khuẩn mọc trên các môi trường chuyên biệt như
Pylori agar, Skirrow cải tiến hoặc trên các môi trường Columbia, Brucella,
BHI agar có thêm 7 – 10% máu ngựa hoặc máu cừu tươi, để ở 37 oC trong
điều kiện có 5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao. Môi trường chọn lọc
thường có thêm các thuốc kháng sinh như vancomycin, trimethoprim và
amphotericin B để ức chế tạp nhiễm. Helicobacter pylori có thể tăng trưởng
được ở nhiệt độ từ 30 – 40 oC, chịu được môi trường pH từ 5,5 - 8,5 và sống
nhiều tháng ở âm 70oC trong môi trường thích hợp [24]. Kết quả có thể đọc
sau 3 - 5 ngày nuôi cấy (hoặc có thể để đến 14 ngày) với các khuẩn lạc tròn,
bóng, màu xám trong, đường kính từ 0,5 – 1mm, không tan máu hoặc tan máu
alpha. Đặc biệt, tiêu chuẩn xác định H. pylori sau nuôi cấy là khuẩn lạc phải
cho kết quả dương tính với các thử nghiệm oxidase, catalase và urease, trong
đó thử nghiệm urease cho dương tính nhanh và mạnh.
* Thử nghiệm oxydase
Lấy 1mm khuẩn lạc trong suốt đặt lên giấy thấm. Nhỏ thuốc thử TMPD
0,1% (TMPD: N,N,N’,N’-Tetramethyl-p-phenylenediamine).
Cytochrom C khử + H+ + O2

Cytochrom oxy hóa + TMPD khử

Cytochrom oxy hóa + H2O
TMPD oxy hóa (màu xanh)

Đọc kết quả ngay sau 30 giây: phản ứng (+) tính thì sinh khối chuyển
màu xanh và phản ứng (-) tính sinh khối vẫn còn màu trắng (Hình 1.2).

5


6

Hình 1.2. Thử nghiệm oxydase của Helicobacter pylori
* Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35]

* Thử nghiệm catalase
Lấy 1mm khuẩn lạc trong suốt đặt lên lame kính sạch. Nhỏ H 2O2 30%
(hydrogen peroxide).
H2O2

H2O + O2 (bọt khí)
Catalase

Đọc kết quả ngay sau 1 - 2 giây: phản ứng (+) tính thì có bọt khí xuất
hiện và phản ứng (-) tính không có bọt khí (Hình 1.3).

Hình 1.3. Thử nghiệm catalase của Helicobacter pylori
* Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35]

* Thử nghiệm urease
Thử nghiệm urease nhằm phát hiện gián tiếp sự có mặt của H. pylori
thông qua urease của chúng. Do H. pylori sản xuất urease có hoạt tính rất cao,
vì vậy, chỉ cần đưa mảnh sinh thiết có chứa H. pylori hoặc khuẩn lạc của H.
pylori vào một lượng nhỏ dung dịch urea có chỉ thị màu. Lúc này hoạt tính
urease của vi khuẩn sẽ nhanh chóng phân hủy urea thành ammonia, làm môi
trường trở thành kiềm hóa và chỉ thị màu sẽ thay đổi từ màu vàng thành màu
hồng cánh sen. Kết quả đọc trong vòng 20 phút với độ đặc hiệu gần như
100% (Hình 1.4) [24].

6


7

Hình 1.4. Thử nghiệm urease của Helicobacter pylori
* Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35]

Đồng thời trên tiêu bản nhuộm Gram, hình thể vi khuẩn H. pylori đa số
là hình cong, mức độ xoắn không điển hình như trên tiêu bản trực tiếp từ
mảnh sinh thiết, có thể có cả hình trực khuẩn (Hình 1.5) và nếu để sau 10
ngày nuôi cấy, có thể xuất hiện các thể hình cầu [24], [36], [37].

Hình 1.5. Hình ảnh nhuộm Gram của Helicobacter pylori
* Nguồn: O'Rourke J.L., et al. (2001) [36]

1.1.3.2. Tính chất hóa sinh và kháng nguyên urease của H. pylori
Urease là một trong những enzyme chủ yếu trong sinh bệnh học của H.
pylori. Trọng lượng phân tử của urease khoảng 550 kDa. Enzyme này mang
tính quan trọng sống còn đối với H. pylori trong môi trường dạ dày.

Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase, là enzyme xúc
tác cho quá trình thủy phân urea thành ammonia và acid carbonic:
urease

(NH2)2CO + H2O
NH2COOH + H2O
7

NH3 + NH2COOH
NH3 + H2CO3


8

NH3 vừa được tạo ra nhanh chóng hợp nước để tạo thành NH4+ và OH-.
H2CO3
2NH3 + 2H2O

H+ + HCO32NH4+ + 2OH-

Gốc OH- này kết hợp với gốc H + của acid HCl trong dịch nhày ở niêm
mạc dạ dày, từ đó làm tăng dần pH ở bề mặt niêm mạc dạ dày từ thấp đến
trung tính và tạo nên một lớp đệm pH trung tính bao quanh H. pylori. Cơ chế
tác động này của urease đã giúp H. pylori không bị tác động của môi trường
acid mạnh (pH < 4) ở dạ dày (Hình 1.6 và 1.7) [38]. Bên cạnh đó, urease còn
là tác nhân kích thích mạnh mẽ hoạt động thực bào đơn nhân và sản sinh ra
các cytokine gây viêm. Đồng thời, NH3 còn gây độc trực tiếp lên tế bào và
phá vỡ liên kết giữa các tế bào làm tổn thương niêm mạc dạ dày. Như vậy,
urease biểu hiện cả hai chức năng: vừa là tác nhân xâm lấn và cũng vừa là tác
nhân gây độc. Urease là một trong những mục tiêu quan trọng nhất trong việc

phát triển thuốc để kiểm soát nhiễm H. pylori ở dạ dày [39], [40], [41], [42],
[43].

Hình 1.6. Vai trò của H. pylori urease trong nhiễm H. pylori
* Nguồn: Follmer C. (2010) [44]

Hình 1.7. Cơ chế xâm lấn của H. pylori vào dịch nhày dạ dày
* Nguồn: Bansil R., et al. (2013) [39]

8


9

Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số
EC 3.5.1.5 trong đó 3 (nhóm chính là nhóm hydrolase), 5 (nhóm phụ enzyme
tác dụng lên liên kết C-N), 1 (phân nhóm phụ cắt các amid thẳng) và 5 (số thứ
tự của urease trong phân nhóm phụ).
Vào năm 1926, urease lần đầu tiên được Summer tách chiết từ đậu rựa
(jack bean). Urease là các tinh thể có 8 cạnh, không màu, trong suốt, quan sát
được dưới kính hiển vi và có đường kính d = 4 – 30µm tùy theo phương pháp
tách chiết. Khối lượng phân tử của urease được Polacco và Havir xác định
bằng phương pháp lọc gel trên cột agarose A-15m đối với urease đậu rựa và
đậu nành Brazil. Urease đậu nành có 2 phân tử lượng khác nhau 540 kDa và
420 kDa, còn urease đậu rựa chỉ có một phân tử lượng là 480 kDa. Như vậy,
urease từ những nguồn khác nhau có phân tử lượng khác nhau và ngay cả
trong cùng một nguồn đậu nành đã có tới 2 loại urease. Hai loại urease này
khác nhau ở thành phần apoenzyme nhưng bản chất của coenzyme vẫn không
thay đổi. Các apoenzyme là những chuỗi polypeptide được hình thành từ
nhiều acid amine, mà thành phần của các acid amine này thì không giống

nhau ở những nguồn khác nhau, điều này lý giải sự khác nhau về khối lượng
phân tử giữa chúng [45], [46].
Urease dễ dàng hòa tan trong dung dịch ammonia loãng và dung dịch
kiềm loãng, có thể hòa tan hoặc đông tụ trong dung dịch muối loãng và acid
hữu cơ tùy thuộc nồng độ acid. Điểm đẳng điện của urease nằm trong khoảng
pH = 5,0 – 5,1 và tại điểm đẳng điện độ hòa tan của urease cực nhỏ.
Urease cũng mang những đặc tính của protein như tan trong nước và
dung dịch muối loãng; không đi qua được màng thẩm tích vì có kích thước
phân tử lớn; tan khi có lớp áo nước và tích điện; tủa khi mất lớp áo nước và
trung tính; bị biến tính dưới tác dụng của acid, kiềm đặc, các ion kim loại
nặng và nhiệt độ cao; dễ bị tủa thuận nghịch trong các dung môi hữu cơ
9


10

(ethanol, acetone...) hoặc muối ammonium sulfate, sodium chloride; tính chất
hóa lý có thể thay đổi khi kết hợp với cơ chất, coenzyme, ion kim loại hoặc
một số chất hữu cơ đặc hiệu khác; và phân tử enzyme có thể tồn tại ở các
trạng thái ion như anion, cation hoặc trung hòa tùy theo pH của môi trường.
Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm các acid amine có nhóm hóa
học hoạt động mạnh và các ion kim loại. Các nhóm hóa học hoạt động mạnh
này có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất. Các
ion kim loại có vai trò xúc tác rất lớn, có tác dụng liên kết giữa enzyme và cơ
chất hoặc apoenzyme và coenzyme hoặc tham gia vào quá trình vận chuyển
điện tử. Đồng thời, urease là enzyme không có bất cứ cofactor hữu cơ nào và
cũng không có sắt, manganese hay phosphorus. Bên cạnh đó, trung tâm hoạt
động của urease còn có chứa hai nguyên tử nitrogen. Hai nguyên tử nitrogen
này đóng vai trò rất quan trọng trong việc xúc tác phản ứng của urease hay
còn gọi là Nikel dependent enzyme. Cơ chất của urease khá quan trọng trong

việc mô tả vai trò của trung tâm hoạt động nitrogen trong quá trình xúc tác.
Một số cơ chất của urease là urea, semicarbazide, formamide, acetamide, N –
Methylurea, N – Hydroxyurea, dihydroxyurea… Urea là cơ chất đặc hiệu của
urease với năng lượng hoạt hóa là 8.700 hoặc 11.700 calories/gmol ở 25 oC,
còn đối với các cơ chất như hydroxyurea hoặc dihydroxyurea thì vận tốc nhỏ
hơn 120 lần. Phân tử urea rất bền và sự phân hủy urea không enzyme trong
dung dịch không phụ thuộc vào độ pH. Tuy nhiên, khi gặp enzyme, chính
enzyme đã chống lại sự phân hủy và tạo điều kiện cho urea bị nước hay OH tấn công để tạo ra carbamate [7], [42], [47].
Urease được phát hiện ở nhiều loài vi sinh vật, thực vật và một số ít
động vật. Các vi khuẩn có chứa urease tham gia vào quá trình đồng hóa urea
thành muối amon, tên gọi chung là Ureabacterium và phần lớn thuộc hai họ

10


11

Cocoaceae và Bacilaceae. Một số vi khuẩn sinh tổng hợp urease là H. pylori,
Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis…
Helicobacter pylori phân lập được từ các mô sinh thiết dạ dày đều sản
xuất một lượng lớn urease. Trọng lượng phân tử của urease sinh ra từ H.
pylori khoảng 540 kDa và là một phân tử hexameric chứa nickel gồm có 2
tiểu đơn vị (UreA [30 kDa] và UreB [62 kDa]) theo tỉ lệ phân tử 1:1. Nhìn
chung, hoạt tính của urease được đòi hỏi là phải tạo ra vi môi trường trung
tính trong dạ dày cho H. pylori. Urease được biểu lộ như một protein lớp bề
mặt ngoài của H. pylori và hình thành một lượng lớn protein bao quanh H.
pylori. Cùng với việc urease sau tiết liên kết với màng ngoài của H. pylori thì
hoạt tính của urease cũng còn biểu hiện trong bào tương của H. pylori với vai
trò tiêu hóa nitrogen hữu cơ. Sự tương quan giữa urease và bề mặt vi khuẩn
có vẻ ổn định nhờ vào các ion dương hóa trị 2 như Ca2+ và Mg2+ mặc dù

những ion dương khác có thể ức chế hoạt tính urease [7], [40], [42], [48].
Bên cạnh urease, những sản phẩm chuyển hóa đặc biệt khác của H.
pylori là catalase, superoxid dismutase và alkylhydroperoxid reductase.
Superoxid dismutase phân hủy superoxid của các tế bào bạch cầu đa nhân và
đại thực bào, do đó H. pylori sẽ không bị bạch cầu đa nhân và đại thực bào
tiêu diệt. Catalase bảo vệ H. pylori tránh khỏi sự tiêu diệt từ các hydro
peroxid (H2O2) của các tế bào thực bào. Các protein màng ngoài,
phospholipid, glucolipid và các điểm bám dính của H. pylori đã giúp cho vi
khuẩn này bám vào lớp mucin và tế bào niêm mạc của dạ dày. Các điểm bám
dính này bám vào các thụ thể đặc hiệu có ở trên tế bào chủ [7], [24], [49].
Ngoài ra, H. pylori còn sản xuất các độc tố khác như yếu tố độc tế bào
tạo không bào A (Vacuolating cytotoxin A – VacA), yếu tố độc tế bào liên
quan gen A (Cytotoxin associated gen A – CagA), lipopolysaccharid (LPS)
của H. pylori [24]. Vai trò của CagA và VacA sau tiết từ H. pylori được minh
11


12

họa trong Hình 1.8 và 1.9. Trong đó, VacA ảnh hưởng đến quy trình hoạt động
tế bào bằng những đường khác nhau nhằm tạo thuận cho bệnh viêm dạ dày
mạn tính bởi H. pylori:
(1) VacA bề mặt vi khuẩn bám trực tiếp vào màng,
(2) VacA tiết bám lên thụ thể màng tế bào và khởi đầu đáp ứng tiền
viêm,
(3) xuyên trực tiếp qua màng tế bào và vào mitochondria gây ra sự chết
tế bào,
(4) vào pinocytosis tạo ra sự ẩm bào,
(5) tạo kênh qua màng tế bào dẫn đến sự dò rỉ chất dinh dưỡng ra ngoài
qua màng,

(6) xuyên qua kẽ hở màng tế bào và ức chế sự hoạt hóa và tăng sinh của
tế bào T [8], [50].

Thay đổi hình tháiTăng sinh tế bào

Đáp ứng
tiền viêm

Hình 1.8. Những vai trò khác nhau của hệ thống tiết loại IV của Cag trong
điều chỉnh về miễn dịch, tăng sinh tế bào và thay đổi hình thái
* Nguồn: Kusters J.G., et al. (2006) [8]

12


13

Kênh màng tế bào
Con đường tín hiệu tiền viêm

Sự chết tế bào

Sự tạo không bào

Ức chế hoạt hóa và tăng sinh
tế bào T

Hình 1.9. VacA ảnh hưởng đến quy trình hoạt động tế bào bằng những
đường khác nhau nhằm tạo thuận cho viêm dạ dày mạn tính bởi H. pylori
* Nguồn: Kusters J.G., et al. (2006) [8]

1.1.4. Nhiễm H. pylori và bệnh viêm loét dạ dày tá tràng
Cơ chế bệnh sinh của viêm loét dạ dày tá tràng liên quan đến H. pylori
được thể hiện rõ nét qua phản ứng của cơ thể đối với H. pylori. Urease của vi
khuẩn trung hòa pH của dạ dày đưa pH dạ dày trở về trung tính, từ đó đã tạo
thuận lợi cho sự tồn tại của vi khuẩn, sự tấn công của chúng vào tế bào biểu
mô dạ dày và sự di chuyển của chúng trên bề mặt nhày của niêm mạc dạ dày
[51]. Sự dính bám của vi khuẩn vào lớp biểu mô của dạ dày nhờ vào hai yếu
tố dính bám là BabA (blood group antigen - binding adhesion) và SabA (sialic
acid - binding adhesion), ngay sau khi dính bám, vi khuẩn giải phóng hai yếu
tố CagA và VacA vào lớp tế bào này. Chính CagA và VacA là những nguyên
nhân tạo ra một đáp ứng của hệ thống miễn dịch rất mạnh và gây viêm niêm
mạc dạ dày [52].

13


14

Hình 1.10. Cơ chế bệnh sinh của nhiễm H. pylori và đáp ứng miễn dịch
của cơ thể người bệnh
* Nguồn: Cadamuro A.C.T., et al. (2014) [52]

Lipopolysaccharide (LPS) của H. pylori được nhận biết chủ yếu bởi hai
thụ thể TLR4 và TLR2 (Toll-like receptor - TLR) trong đó TLR4 là thụ thể
nhận biết chính LPS của H. pylori, tuy nhiên do sự thay đổi của cấu trúc LPS
đã làm thay đổi sự nhận biết này và làm giảm kích thích đáp ứng miễn dịch
của cơ thể, điều này tạo thuận cho sự tấn công của vi khuẩn và gây ra bệnh.
Hai thụ thể này phụ thuộc vào sự hiện diện của MyD88 (myeloid
differentiation primary-response gene 88) để truyền tín hiệu. Phức hợp

MyD88 được kết hợp với IRAK1 (interleukin-1-receptor-associated kinase-1)
và IRAK4. IRAK1 được phosphoryl hóa và kế đó phân ly từ MyD88. Cũng
bằng sự phosphoryl hóa, phức hợp MyD88 phân tách cho ra NF-κB (nuclear
facter κB). NF-κB được di chuyển vào nhân để kích hoạt biểu lộ các gen liên
quan đến tiến trình hình thành viêm niêm mạc dạ dày [52].

14


15

CagA tạo ra đáp ứng viêm là do chúng gây ra sự tăng sản xuất một vài
cytokines như IL-1β (interleukin - 1β) và IL-8 và đồng thời hoạt hóa NF-κB,
thủ phạm tạo ra sự phát sinh nhanh các kiểu hình của vi khuẩn, quan trọng
trong quá trình hình thành cơ chế bệnh sinh của ung thư như kích hoạt các yếu
tố tăng trưởng và ức chế sự chết tế bào. Như vậy, CagA đã hủy bỏ con đường
truyền tín hiệu trong tế bào và thay vào sự phát triển những tế bào ung thư,
một điểm quan trọng trong bệnh sinh của H. pylori [52], [53].
VacA kích hoạt đáp ứng tiền viêm và hoạt hóa những tế bào viêm tham
gia trong đáp ứng viêm mạn tính ở niêm mạc dạ dày bởi sự tấn công của vi
khuẩn H. pylori. VacA còn kích hoạt sản sinh ra TNF-α, IL-1β, nitric oxide,
phản ứng đặc hiệu oxy và hoạt hóa NF-κB có thể liên quan đến những
cytokine tiền viêm và sự chết tế bào. VacA cũng tác động đến hệ thống miễn
dịch nhằm giúp cho H. pylori né tránh được đáp ứng miễn dịch thu được của
cơ thể để tạo ra nhiễm trùng dai dẳng, từ đó cản trở sự thực bào, sự trình diện
kháng nguyên và cũng ức chế sự biệt hóa tế bào lympho T [52].
Song song đó, đáp ứng miễn dịch cũng được hoạt hóa với sự tăng sinh
những tế bào viêm tại ổ nhiễm ở dạ dày dẫn đến sự phóng thích nhiều hóa
chất trung gian tiền viêm và kháng viêm khác nhau. Bên cạnh đó, sau khi hoạt
hóa NF-κB (nuclear factor - NF), đã tạo ra một lượng lớn các cytokine và

chemokine tiền viêm như yếu tố hoại tử u alpha (TNF-α) và nhiều interleukin,
và đồng thời đã hoạt hóa những con đường phát bệnh ung thư có thể gây ra
ung thư dạ dày. Thêm vào đó, sự giải phóng các hóa chất trung gian trong đáp
ứng miễn dịch học được điều tiết bởi miRNAs và những hóa chất trung gian
trong viêm do nhiễm H. pylori có thể làm thay đổi sự phóng thích miRNAs.
Mặt khác, sau hoạt hóa NF-κB và sản sinh các cytokine, nhiễm H. pylori tạo
ra hóa hướng động các đại thực bào và tẩm nhuận các bạch cầu đa nhân (bạch
cầu đa nhân trung tính) và các tế bào lympho (Hình 1.10) [52].
15


16

1.1.5. Các phương pháp phát hiện H. pylori
Có hai nhóm phương pháp phát hiện H. pylori: các phương pháp xâm
phạm (invasive methods) và không xâm phạm (non-invasive methods) [24],
[54], [55], [56]. Các phương pháp xâm phạm bao gồm phương pháp tế bào
học, phương pháp mô bệnh học, thử nghiệm urease, nuôi cấy và phản ứng
chuỗi polymerase (PCR - Polymerase chain reaction). Để thực hiện một trong
những phương pháp này, bệnh nhân phải được nội soi dạ dày – tá tràng để lấy
mảnh sinh thiết ở vị trí tổn thương dạ dày hoặc tá tràng. Bên cạnh đó, các
phương pháp không xâm phạm bao gồm test thở với urea gắn 14C hoặc 13C,
các xét nghiệm huyết thanh học tìm kháng thể và xét nghiệm phân tìm kháng
nguyên H. pylori.
1.1.6. Khả năng kháng kháng sinh của H. pylori
Helicobacter pylori có khả năng đề kháng rất mạnh với những thuốc
kháng sinh đưa vào điều trị cả trên in vitro và in vivo. Đối với bệnh lý viêm
loét dạ dày và tá tràng do nhiễm H. pylori, Hội nghị Đồng thuận Maastricht
III (2005) bàn luận về phác đồ điều trị chuẩn ban đầu trong điều trị tiệt trừ H.
pylori với thời gian điều trị từ 7 – 14 ngày. Với phác đồ bộ ba này, tỉ lệ đề

kháng thuốc ngày càng tăng [57]. Ví dụ như tỉ lệ đề kháng clarithromycin ở
Nhật là 16%, châu Âu lớn hơn 20% và Bắc Mỹ 25% [58]; và hiệu quả tiệt trừ
H. pylori của phác đồ điều trị chuẩn ban đầu trong năm 2007 chỉ đạt được
72% [59]. Riêng ở Việt Nam, sự thất bại của phác đồ chuẩn điều trị tiệt trừ H.
pylori được ghi nhận trong Hình 1.11 [60], [61], [62], [63]. Đồng thời, Hội
nghị cũng bàn luận đến phác đồ thứ hai hoặc là bổ sung bismuth 10 – 14 ngày
điều trị trong phác đồ bộ bốn (bismuth - PPI – clarithromycin – amoxicillin
hoặc metronidazole) hoặc lựa chọn sự kết hợp khác thay clarithromycin và
amoxicillin bằng tetracycline (PPI – tetracycline – metronidazole), tuy nhiên
khả năng điều trị tiệt trừ H. pylori trên toàn cầu chỉ đạt được 64% đối với
16


17

phác đồ bộ bốn và 91% đối với phác đồ có tetracycline và phác đồ thứ ba có
thêm hai kháng sinh levofloxacin (fluoroquinolone) và rifabutin (rifamycin)
cũng với ghi nhận sự đề kháng thuốc tăng nhanh (Bảng 1.1) [21], [22], [64],
[65].

Hình 1.11. Hiệu quả tiệt trừ H. pylori của phác đồ chuẩn tại Việt Nam
* Nguồn: Nguyễn Thúy Vinh (2003) [62], Trần Ngọc Bảo (2004) [63],
Đào Hữu Ngôi (2010) [61] và Bùi Hữu Hoàng (2011) [60]

Bảng 1.1. Tình hình đề kháng kháng sinh của H. pylori trên thế giới
theo Hội nghị Đồng thuận Maastricht III và IV
Loại kháng sinh

Tỉ lệ kháng thuốc

Clarithromycin

15 – 20%

Metronidazole

≥ 80%

Levofloxacin

20%

Rifabutin

20%

* Nguồn: Malfertheiner P. (2007 và 2012) [21], [22]

17


18

Riêng ở Việt Nam, vào những năm gần đây, tình hình đề kháng với các
loại thuốc kháng sinh trong điều trị tiệt trừ H. pylori như Clarithromycin,
Amoxicillin, Metronidazole và Tetracycline trong bệnh viêm dạ dày mạn tính,
loét dạ dày - tá tràng và ung thư dạ dày ngày càng tăng: metronidazole (94,6 –
95,5%), amoxicillin (33,9 – 35,5%), tetracycline (17,78 - 21,4%) và
clarithromycin (21,4 – 26,6%) (Hình 1.12) [66], [67], [68], [69], [70].
Tóm lại, về vấn đề đề kháng thuốc kháng sinh trong điều trị tiệt trừ H.

pylori trên toàn cầu, Hội nghị khuyến cáo nên dựa chủ yếu vào kháng sinh đồ
trước khi tiến hành điều trị cho bệnh nhân [21]. Tiếp đến Hội nghị Maastricht
IV ở Florence (2010) đã ghi nhận tỉ lệ kháng thuốc trong điều trị tiệt trừ H.
pylori tăng trên toàn cầu và thống nhất những phác đồ thích hợp dựa theo tình
trạng kháng thuốc [22].

Hình 1.12. Tình hình đề kháng kháng sinh của H. pylori tại Việt Nam
* Nguồn: Phan Quốc Hoàn (2000) [69], Lê Đình Minh Nhân (2006) [66],
Nguyễn Văn Thịnh (2009) [68] và Nguyễn Thị Nguyệt (2010) [67]

18


19

1.2. HỆ THỐNG MIỄN DỊCH CỦA GÀ VÀ KHÁNG THỂ IgY
1.2.1. Hệ thống miễn dịch của gà
Hệ thống miễn dịch của gà cũng tương tự như hệ thống miễn dịch đã
tìm thấy ở động vật có vú, bao gồm 2 phần: miễn dịch tự nhiên (innate
immunity) là hàng rào bảo vệ đầu tiên chống lại sự viêm nhiễm và miễn dịch
thích ứng (adaptive immunity) là loại đề kháng của cơ thể khi có sự xâm nhập
của vật lạ vào cơ thể và hình thành các tế bào nhớ miễn dịch có khả năng
nhận diện khi có sự tái xâm nhập lại của vật lạ [71], [72], [73].
1.2.2. Các kháng thể của gà
Năm 1893, Klemperer lần đầu tiên đã mô tả khả năng miễn dịch thụ
động thu được ở chim. Ông đã chứng minh về sự di truyền các yếu tố miễn
dịch chống lại độc tố uốn ván từ gà mái sang gà con. Sự miễn dịch này có
được là nhờ có sự vận chuyển của kháng thể từ gà mẹ sang gà con [74], [75].
Gà có 3 lớp kháng thể là IgA, IgM và IgY. Trọng lượng phân tử, đặc
điểm hình thái học và tính linh động của IgA và IgM ở gà thì tương tự như

các lớp này ở động vật có vú, trong khi đó, IgY có trọng lượng phân tử thấp,
có trong máu gà và được chuyển qua chứa trong lòng đỏ trứng (egg york –
nên có tên gọi là IgY) nhằm cung cấp khả năng đề kháng cho phôi gà và gà
con [72], [73], [74], [76], [77].
1.2.3. Kháng thể IgY
1.2.3.1. Cấu trúc và chức năng
Cấu trúc IgY của gà (chim) nói chung cũng giống như cấu trúc IgG ở
động vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L
(light chain) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfua (-S-S-). Trọng lượng
phân tử của IgY là 167.250Da, lớn hơn so với IgG của động vật có vú
(160.000 Da). Chuỗi nhẹ của IgY gồm một vùng thay đổi V L (variable region)
19


20

và một vùng hằng định CL (constant region), có trọng lượng phân tử là
18.660Da. Chuỗi nặng gồm một vùng thay đổi VH và bốn vùng hằng định ký
hiệu từ Cν1 đến Cν4, với trọng lượng phân tử là 65.105 Da (Hình 1.13) [72],
[74], [75].
Khác với chuỗi nặng của IgG, chuỗi nặng của IgY không có vùng bản
lề. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vùng Cν3, Cν4 của IgY tương tự như các
vùng Cγ2 và Cγ3 của IgG còn vùng bản lề của IgG được thay bằng vùng Cν2
ở IgY, điều này làm cho chuỗi nặng của IgY kém linh hoạt hơn. Đây có thể là
lý do làm cho IgY có nhiều đặc tính sinh học khác với IgG ở động vật có vú.
Vùng Fc của IgY gián tiếp quy định chức năng của nó như sự ngưng kết bổ
thể và opsonin hóa các kháng nguyên. Cụ thể IgY không gắn vào các thụ thể
Fc người và động vật có vú cũng như không hoạt hóa hệ thống bổ thể ở người
và động vật có vú khác, đồng thời cũng không tương tác với yếu tố dạng thấp
[72], [73], [75], [76], [78].

Hình 1.13. Cấu trúc IgY của gà (chim) và IgG của động vật có vú
* Nguồn: Schade R., et al. (1996) [75]

20


21

1.2.3.2. Sự vận chuyển IgY từ gà mẹ sang gà con
IgY được vận chuyển từ máu gà mẹ sang gà con trải qua 2 bước:
- Bước 1: IgY chuyển từ máu vào lòng đỏ trứng, tương tự như quá trình
vận chuyển IgG qua nhau thai ở động vật có vú.
- Bước 2: Sự vận chuyển IgY từ lòng đỏ trứng sang phôi trong quá trình
phát triển.
Sự tập trung IgY ở lòng đỏ trứng về cơ bản là thông qua sự chín của
noãn bào. Ở trong trứng, IgY không tồn tại ở lòng trắng trong khi IgA và IgM
lại không có ở lòng đỏ trứng. Lượng IgY được kết lại trong lòng đỏ trứng từ
ngày thứ 7 trở đi cho đến ít nhất là ngày thứ 18. Trên noãn bào có các thụ thể
(receptor) ái lực cao và thấp dành cho IgY. IgY sẽ gắn kết với thụ thể của nó
trên bề mặt noãn bào để chuyển từ máu gà mái sang trứng. Sau 3 đến 4 ngày
kể từ khi IgY xuất hiện trong huyết thanh thì IgY cũng được tìm thấy trong
lòng đỏ trứng. Tổng hàm lượng IgY trong gà mái mới nở là 2 – 3mg trong khi
đó ở lòng đỏ trứng dao động từ 100 - 400mg. Nồng độ IgY trong huyết thanh
của gà con mới nở là 1 - 1,5mg/ml, thời gian bán hủy trong vòng tuần hoàn là
36 giờ [72], [74], [75], [76].
1.2.3.3. Tính ổn định của IgY
Tính ổn định của IgY phụ thuộc vào các yếu tố như: nhiệt độ, pH và
enzyme protein.
- Yếu tố pH: khi pH acid, hoạt tính của IgY bị giảm ở pH = 3,5 hoặc

thấp hơn và bị thay đổi hoàn toàn ở pH = 3; và khi pH kiềm, trong điều kiện
này thì hoạt tính của IgY không thay đổi cho tới pH = 11.
- Yếu tố nhiệt độ và thời gian: nhiệt độ và thời gian ủ làm ảnh hưởng
đến hoạt tính của IgY, hoạt tính của nó sẽ giảm ở 75oC. Lạnh và khô không

21


22

làm ảnh hưởng đến hoạt tính của IgY trừ khi lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ làm
thay đổi cấu trúc cũng như khả năng bám dính của protein.
- Các enzyme thủy phân protein: IgY có khả năng đề kháng rất cao với
các enzyme đường tiêu hóa như trypsin, chymotrypsin… nhưng lại rất nhạy
cảm với pepsin. Trong môi trường chymotrysin thì IgY không những vẫn giữ
được hoạt tính cao mà sự phân cắt chuỗi polypeptide còn chưa rõ ràng. Còn
trong môi trường trypsin thì hoạt tính ngưng kết kháng nguyên và kết dính tế
bào vẫn còn những cấu trúc của chuỗi polypeptide đã bị phá vỡ. Theo một số
nghiên cứu thì hoạt tính IgY còn lại tới 39%, 41% theo thứ tự trong môi
trường trypsin, chymotrypsin sau 8 giờ.
IgY có thể bảo quản trong NaCl 0,9%, NaNO 3 ở 4°C hơn 10 năm mà
không bị mất hoạt tính. Ái lực và kháng thể gắn biotin vẫn còn hoạt tính cao
khi bảo quản ở 4°C sau 5 năm. Kháng thể được tinh chế vẫn còn ngưng kết
với kháng nguyên sau 6 tháng ở 20°C và sau 1 tháng ở 37°C. Một quả trứng
có thể bảo quản trong vòng 6 tháng ở 4oC mà hoạt tính của IgY giảm đi không
đáng kể [72], [74].
1.2.3.4. Tính ưu việt của việc sản xuất IgY
Gà mái được dùng để sản xuất kháng thể trong toàn bộ giai đoạn đẻ
trứng. Gà có thể sản xuất kháng thể có hoạt tính cao chỉ cần sau một lần gây
miễn dịch, trong khi đó để có kết quả tương tự như vậy ở cừu thì phải gây

miễn dịch 4 lần. Khi gây miễn dịch nhắc lại hàng tháng thì nhận thấy ở cừu
sản xuất kháng thể đặc hiệu gấp 10 lần so với ở gà, nhưng sự khác nhau này
có thể do khác nhau về kích cỡ và cả thời gian bán hủy kháng thể: ở cừu 1
ngày còn ở gà là 36 giờ.
Sau khi gây miễn dịch cho gà (một mũi tiêm tĩnh mạch hay ổ bụng),
nồng độ IgY trong huyết thanh cao nhất vào ngày thứ 7 - 9, có thể gây miễn

22


23

dịch dưới da hoặc trong cơ. IgY được tìm thấy trong lòng đỏ trứng gà từ ngày
thứ 4 - 7 sau khi xuất hiện trong huyết thanh.
Theo nhiều nghiên cứu, gà mái thường đẻ khoảng 20 trứng/tháng.
Lượng IgY thu được từ số trứng này khoảng 2g. Nồng độ IgY trong huyết
thanh gà khoảng 5 – 7mg/ml, như vậy 2g IgY từ trứng gà đẻ ra trong một
tháng tương đương với lượng IgY tách ra từ 300ml huyết thanh hoặc 600ml
máu gà. Tổng số sản lượng IgY thu hoạch từ trứng mà một con gà mái tạo ra
tương đương với lượng kháng thể thu được từ một con cừu hoặc một nửa con
ngựa được gây miễn dịch để chế tạo kháng huyết thanh. Với sản lượng kháng
thể tạo ra lớn như vậy, người ta thấy giá thành của kháng thể gà rẻ hơn 10 lần
so với kháng thể thỏ [79]. Tóm lại, tính ưu việt của IgY đã được ghi lại trong
Bảng 1.2 [75], [80].

23


24

Bảng 1.2. Tính ưu việt của IgY
Động vật có vú

Gà (gà mới

(ngựa, cừu, thỏ)

đẻ trứng)

Lấy máu

Thu thập trứng

200mg/lần lấy máu

50-100mg/trứng

(2 – 3 tháng/1 lần)

(5 - 7 trứng/tuần)

1.400mg

40.000mg

~ 5%

2 - 10%

Ngưng kết protein A/ protein G

Có

Không

Tương tác với yếu tố dạng thấp

Có

Không

Có

Không

Nguồn kháng thể
Loại mẫu để thu hoạch kháng
thể
Lượng kháng thể thu được
Số lượng kháng thể trong năm
Số lượng kháng thể đặc hiệu

Hoạt hóa bổ thể ở động vật có
vú

* Nguồn: Schade R., et al. (1991, 1996) [75], [80]

1.2.4. IgY và những ứng dụng trong dự phòng và điều trị
Ngày nay, tỷ lệ vi khuẩn đề kháng với thuốc kháng sinh ngày càng tăng
dần dẫn đến các loại thuốc kháng sinh cổ điển càng kém hiệu quả. Do đó, điều

quan trọng là phải tìm ra một giải pháp trị liệu khác để sử dụng mà có tác
dụng giống như thuốc kháng sinh nhằm để tiêu diệt các vi sinh vật hoặc bất
hoạt chúng. Kháng thể đặc hiệu đường uống là hướng đến hấp dẫn việc hình
thành miễn dịch bảo vệ chống lại những tác nhân gây bệnh ở dạ dày và ruột
của cả người lẫn động vật, và trị liệu miễn dịch này cũng có thể chống lại
những tác nhân gây bệnh khó điều trị với thuốc kháng sinh cổ điển [81].
Từ năm 1930, trị liệu miễn dịch thụ động đã bắt đầu được triển khai
bằng cách truyền tác nhân miễn dịch của cơ thể cho đã được mẫn cảm (kháng
24


25

thể) sang cơ thể nhận chưa có miễn dịch nhằm phòng ngừa hoặc giảm nhẹ
bệnh viêm gan siêu vi A và bệnh sởi[4]. Tiếp theo sau đó, việc sử dụng kháng
thể đặc hiệu đã được thực hiện ngày càng nhiều vào cuối thế kỷ XIX và đầu
thế kỷ XX.
Phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng (mAbs) bằng những tế bào
B bất tử và phát triển thành công nghệ lai đã tạo ra một cuộc cách mạng trong
trị liệu bằng kháng thể vào năm 1975. Đến năm 1980, kháng thể đơn dòng
chống CD3 đã được đưa vào ứng dụng lâm sàng để ngăn ngừa thải loại ghép
cơ quan. Năm 1990, trị liệu các bệnh nhiễm trùng bằng kháng thể đơn dòng
đã đưa vào nghiên cứu. Mãi đến năm 1998, chỉ có một loại kháng thể đơn
dòng, palivizumab, đã được cho phép điều trị bệnh nhiễm RSV (Respiratory
syncytial virus). Hơn thế nữa, vào năm 2004 đã có trên 12 loại kháng thể đơn
dòng đã được phép ứng dụng để điều trị các bệnh không nhiễm trùng [82].
Bên cạnh đó, trong thời gian này việc nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn
dòng đặc hiệu với các vi sinh vật gây bệnh cho người cũng đã và đang được
tiếp tục tiến hành và xin cấp phép. Ví dụ như:
- Bệnh than (Bacillus anthracis)

- Bệnh ho gà (Bordetella pertussis)
- Bệnh uốn ván (Clostridium tetani)
- Bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
- Viêm màng não (Neisseria meningitidis)
- Viêm phổi (Streptococcus pneumoniae)
- Viêm gan siêu vi B (Hepatitis B virus)
- Bệnh sởi (Measles virus)
- Bệnh dại (Rabies virus)

25