Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (NCKH)

ÐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ÐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NĂM 2016

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM SINH
HỌC CHỨA CHITINASE VÀ PROTEASE TỪ LECANICILLIUM LECANII
DIỆT NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG

Mã số: ĐH2016-TN04-01

Chủ nhiệm đề tài: TS. NGUYỄN HỮU QUÂN

Thái Nguyên, năm 2018


i
ÐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ÐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NĂM 2016

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM SINH
HỌC CHỨA CHITINASE VÀ PROTEASE TỪ LECANICILLIUM LECANII
DIỆT NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG

Mã số: ĐH2016-TN04-01

Xác nhận của tổ chức chủ trì

Chủ nhiệm đề tài

TS. Nguyễn Hữu Quân

Thái Nguyên, năm 2018


ii
DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA ÐỀ TÀI
TT

Họ và tên

1

TS. Nguyễn Hữu Quân

2

TS. Hoàng Phú Hiệp

3

CN. Nguyễn Thị Hồng Chuyên

Đơn vị

Nhiệm vụ

Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên
Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên
Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên

Chủ nhiệm

Thành viên

Thành viên

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Tên đơn vị trong và ngoài nƣớc

Nội dung phối

Họ và tên ngƣời

hợp nghiên cứu

đại diện đơn vị

Khoa Sinh học, Trường Đại học Phân
Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

tích

hóa PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

sinh, Phân tích

sinh học phân tử


iii
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................vi
DANH MỤC TỪ VIÊT TẮT .................................................................................... viii
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...................................................................ix
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3
1.1. Nấm Lecanicillium lecanii ....................................................................................... 3
1.2. Chitinase ................................................................................................................... 4
1.2.2. Phân loại chitinase ................................................................................................. 5
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase ..................................................... 6
1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase .............................................................................. 7
1.3. Protease ................................................................................................................... 10
1.3.1. Nguồn gốc và phân loại protease......................................................................... 11
1.3.2. Cấu trúc................................................................................................................ 13
1.3.3. Cơ chế xúc tác của protease ................................................................................ 14
1.3.4. Ảnh hưởng của môi trường lên khả năng sinh protease ...................................... 14
1.4. Ứng dụng của nấm L. lecanii và phức hệ chitinase/protease ................................. 15
1.5. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase ............................... 17
1.5.1. Trên thế giới ........................................................................................................ 17
1.5.2. Ở Việt Nam .......................................................................................................... 21
1.5.3. Vai trò của tín hiệu peptide ................................................................................. 23
2.1. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................ 25
2.1.1. Chủng giống ........................................................................................................ 25
2.1.2. Thiết bị ................................................................................................................. 25
2.1.3. Hóa chất ............................................................................................................... 25

2.1.4. Dung dịch và đệm ................................................................................................ 25
2.1.5. Môi trường nuôi cấy ............................................................................................ 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 26
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy ......................................................................................... 26
2.2.2. Phương pháp hóa sinh ......................................................................................... 28
2.2.3. Tinh sạch enzyme ................................................................................................ 31
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ bền của


iv
protease tự nhiên và rmchit1 ......................................................................................... 33
2.2.5. Các phương pháp sinh học phân tử ..................................................................... 34
2.2.6. Phương pháp thử nghiệm..................................................................................... 36
2.2.7. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 36
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 37
3.1. Nhân dòng gene mã hóa endochitinase không mang tín hiệu peptide từ chủng nấm
L. lecanii ........................................................................................................................ 37
3.2. Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gene mã hóa chitinase trong nấm men P. pastoris
X33 ................................................................................................................................ 38
3.2.1. Thiết kế plasmid pPImchit1 biểu hiện gen mchit1 trong nấm men ..................... 38
3.2.2. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris X33/pPImchit1 .................................. 39
3.3. Nghiên cứu chuyển cấu trúc gene mã hóa endochitinase không mang peptide tín
hiệu vào nấm men P. pastoris X33 ............................................................................... 39
3.3.1. Biểu hiện gene mã hóa endochitinase không mang peptide tín hiệu vào nấm men
P. pastoris X33 .............................................................................................................. 39
3.3.2. Sàng lọc các dòng nấm men P. pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp ......................... 40
3.4. Tinh sạch và đánh giá tính chất của rmchit1 .......................................................... 41
3.4.1. Tinh sạch rmchit1 ................................................................................................ 41
3.4.2. Đánh giá tính chất của rmchit1 ............................................................................ 43
3.5. Nghiên cứu điều kiện sinh protease và đánh giá tính chất lý hóa của protease từ

chủng nấm L. lecanii VTCC-F-1037 ............................................................................. 47
3.5.1. Khảo sát các điều kiện sinh protease từ nấm L. lecnaii VTCC-F-1037 .............. 47
3.5.2. Tinh sạch và đánh giá tính chất của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 . 52
3.6. Thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh hại cây trồng bởi phức hệ
protease/rmchit1 định hướng tạo chế phẩm diệt nấm bệnh ........................................... 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 59
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 59
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 60


v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy.................................................................. 26
Bảng 2.2. Các điều kiện nuôi nấm L. lecanii VTCC-F-1037 sinh tổng hợp protease .. 27
Bảng 2.3. Thành phần gel cô và gel tách ...................................................................... 32
Bảng 3.1. Hoạt tính rmchit1 của các dòng nấm men P. pastoris X33 tái tổ hợp ......... 40
Bảng 3.2. Các bước tinh sạch rmchit1 trong nấm men P. pastoris X33....................... 42
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rmchit1 ................ 45
Bảng 3.4. Các bước tinh sạch protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 .................... 52


vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. immitis [32] ...................................... 6
Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens [99] ...................... 8
Hình 1.3. Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn B. circulans [106] ....... 8
Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller...... 29
Hình 2.2. Đường chuẩn nồng độ tyrosine ..................................................................... 30
Hình 2.3. Các bước tinh sạch protease ......................................................................... 31

Hình 2.4. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo Bradford ................ 33
Hình 3.1. Kết quả nhân dòng gen mchit1 không mang tín hiệu peptide ...................... 37
Hình 3.2. Trình tự gene mchit1 và trình tự protein suy diễn không mang peptide tín
hiệu từ nấm L. lecanii 43H ............................................................................................ 38
Hình 3.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pPImchit1 ................................................ 39
Hình 3.4. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rmchit1 trong P. pastoris X33 ...... 40
Hình 3.5. Điện di SDS-PAGE của rmchit1 tinh sạch thông qua cột ProBondTM resin
(A) và Định tính rmchit1 trên đĩa cơ chất chitin khi nhuộm bằng lugol (B). ................ 41
Hình 3.6. Nhiệt độ tối ưu (A) và độ bền nhiệt (B) của rmchit1 .................................... 43
Hình 3.7. pH tối ưu (A) và độ bền pH (B) của rmchit1 ................................................ 44
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ (A) và chất tẩy rửa (B) lên hoạt tính của rmchit1
....................................................................................................................................... 46
Hình 3.9. Hoạt tính protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 trên đĩa thạch chứa cơ
chất casein 0,5% ............................................................................................................ 48
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy (A) và pH nuôi cấy (B) đến khả năng
sinh protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 ............................................................. 48
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy (A) và nồng độ casein (B) đến
khả năng sinh protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037.............................................. 48
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ (A) và nguồn cacbon (B) đến khả năng sinh
protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 ..................................................................... 51
Hình 3.13. Điện di SDS-PAGE của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 thông
qua cột Sephadex G-100 (A) và định tính protease trên đĩa cơ chất casein khi nhuộm
bằng Coomassie Brilliant Blue R-250 (B)..................................................................... 53


vii
Hình 3.14. Nhiệt độ tối ưu (A) và pH tối ưu (B) của protease từ L. lecanii VTCC-F-1037 55
Hình 3.15. Độ bền nhiệt (A) và độ bền pH (B) của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
....................................................................................................................................... 56
Hình 3.16. Ức chế sự phát triển của nấm F. oxysporum (A) và R. solani (B) bởi phức

hệ chitinase/protease. Giếng 1: nước, giếng 2-5: phức hệ protease/rmchit1................. 57
Hình 3.17. Sợi nấm của R. solani (A, B) và F. oxysporum (C, D) được xử lý với nước
(A, C) và với phức hệ chitinase/protease (B, D) ........................................................... 57


viii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Tiếng Anh

Tiếng Việt

BLAST
bp

Basic local alignment search tool
Base pair

Phần mềm so sánh trình tự
Cặp bazơ

Chit
DNA
dNTPs

Gene encoding chitinase
Deoxyribonucleic acid

Gen mã hóa chitinase
Acid deoxyribonucleic
Các nucleotide

2-Deoxynucleoside 5triphosphate

ĐC

Control

Đối chứng

IPTG

Isopropyl-beta-D-

Isopropyl-beta-D-

EDTA

thiogalactopyranoside
Ethylenediamine tetraacetic acid

thiogalactopyranoside
Axit ethylenediamine tetraacetic

EtBr
kb
kDa
M

Ethidium bromide
Kilo base

Kilo Dalton
Marker

Ethidium bromide
Kilo base
Kilo Dalton
Thang chuẩn

OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại gen

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

Ribonuclease

Enzyme thủy phân RNA
Chitinase tái tổ hợp

Điện di protein

RNase
rchit1
SDSPAGE
TBE
TE
TEMED
v/v
w/v

Sodium dodecyl sulfate
Polyacrylamide gel
electrophoresis
Tris boric acid EDTA
Tris EDTA

Tris boric acid EDTA
Tris EDTA

N,N,N,N-

N,N,N,N-

Tetramethylethylenediamine

Tetramethylethylenediamine

Volume/volume
Weight/volume

Thể tích/thể tích
Khối lượng/thể tích


ix

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung:
Tên đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa
chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng
Mã số: ĐH2016-TN04-01
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Hữu Quân
Tổ chức chủ trì: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
Thời gian thực hiện: Từ tháng 06/2016 đến tháng 6/2018
2. Mục tiêu
- Biểu hiện gene mã hóa chitinase từ nấm L. lecanii trong nấm men Pichia
pastoris X33.
- Nghiên cứu đặc tính và vai trò của phức hệ chitinase/protease trong quá trình
diệt nấm bệnh hại cây trồng nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học.
3. Tính mới và sáng tạo:
- Đề tài là công trình đầu tiên đã chứng minh được vai trò của tín hiệu peptide
liên quan tới: (1) năng suất biểu hiện của rmchit1 từ nấm L. lecanii 43H trong nấm
men P. pastoris X33, (2) phương pháp tinh sạch rmchit1, (3) các yếu tố ảnh hưởng tới
tính chất lý hóa của rmchit1.
- Đề tài bước đầu tinh sạch được protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 và xác
định được nhiệt độ, pH tối ưu, độ bền nhiệt và độ bền pH của protease.
- Đề tài bước đầu chứng minh được phức hợp chitinase/protease có vai trò trong
quá trình thủy phân nấm F. oxysporum và R. solani.
4. Kết quả nghiên cứu:

- Đã phân lập được gen mã hóa endochitinase không mang peptide tín hiệu
(mchit1) từ nấm L. lecanii 43H và nhân dòng trong vector pJET1.2 blunt.
- Đã thiết kế được vector biểu hiện pPImchit1 mang gen mchit1 trong vector
pPICZαA và biểu hiện được trong nấm men P. pastoris X33 với năng suất biểu hiện
2,048 U/ml.
- Đã tinh sạch được endochitinase tái tổ hợp không mang peptide tín hiệu
(rmchit1) thông qua cột ProBondTM resin có kích thước 43 kDa, hoạt tính riêng đạt
159,45 U/mg protein, độ sạch 16,93 lần và hiệu suất thu hồi đạt 45%.


x

- Đã chứng minh được nhiệt độ và pH tối ưu cho rmchit1 hoạt động là 45°C, pH
6.0; rmchit1 bền ở dải nhiệt độ từ 30-35°C; và pH 6.0 sau16 giờ ủ. Các dung môi hữu
cơ; chất tẩy rửa; ion kim loại và EDTA có ảnh hưởng đến hoạt tính của rmchit1.
- Đã tối ưu được điều kiện sinh tổng hợp protease từ nấm L. lecanii VTCC-F1037 và tinh sạch được protease thông qua tủa muối ammonium sulfate và qua cột sắc
ký lọc gel Sephadex G100 có kích thước 40 kDa, hoạt tính riêng đạt 78,73 U/mg
protein, độ sạch đạt 2,3 lần, hiệu suất thu hồi đạt 17%. Protease tinh sạch có nhiệt độ
và pH tối ưu lần lượt là 40°C và pH 6,0.
- Bước đầu xác định được chitinase/protease có khả năng thủy phân sợi nấm
F. oxysporum và R. solani.
5. Sản phẩm
5.1. Sản phẩm khoa học
03 bài báo khoa học công bố trên tạp chí quốc tế và kỷ yếu hội nghị quốc tế
1. Huu Quan Nguyen, Van Hanh Vu, Phuong Dung Le, Hoang Mau Chu (2018),
“High-level expression, purification and properties of an Endochitinase gene
without signal peptide from Lecanicillium lecanii 43H in Pichia pastoris”,
Molecular Biology Reports (SCIE, IF: 1,889).
2. Nguyen Huu Quan, Chu Hoang Mau, Tu Quang Tan (2018) “Purification and
properties of protease from Lecanicillium lecanii”, Proceding: 5th Academic

conference on natural science for young scientists, master and PhD. students from
Asean countries, tr. 197-203.
3. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh (2016) “Optimazation of culture conditions for
production of protease by Lecanicillium lecanii”. Proceding: The 4th Academic
conference on natural science for master and PhD students from Asean countries,
tr. 248-254.
5.2. Sản phẩm đào tạo
Hướng dẫn 02 đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học đã nghiệm thu
1. Đỗ Thị Kim Oanh, Thái Thị Hòa, Nguyễn Thị Vân (2017), Tối ưu điều kiện sinh
tổng hợp chitinase từ chủng nấm ký sinh côn trùng. Đề tài sinh viên nghiên cứu
khoa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2. Đinh Thị Thùy, Thân Thị Kim Phượng (2017), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme
ngoại bào từ các loài nấm sợi phân lập ở Thái Nguyên. Đề tài sinh viên nghiên


xi

cứu khoa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
6. Phƣơng thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích mang lại của
kết quả nghiên cứu.
- Kết quả chuyển thành công cấu trúc mang gen mchit1 vào nấm men P. pastoris
X33 là cơ sở cho việc sử dụng cấu trúc vector pPImchit1 chuyển vào nấm men
P. pastoris X33, góp phần tạo rmchit1 có năng suất cao.
- Các kết quả thu được là cơ sở phát triển nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển
gen nhằm nâng cao năng suất biểu hiện rmchit1, thuận lợi cho tinh sạch rmchit1 và
nghiên cứu các tính chất lý hóa, cũng như ứng dụng trong thủy phân nấm hại cây trồng
tại phòng thí nghiệm của Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
- Kết quả nghiên cứu và các bài báo công bố trên các tạp chí khoa học và kỷ yếu
quốc tế được sử dụng làm tài liệu phục vụ đào tạo và nghiên cứu cho sinh viên, học
viên cao học, nghiên cứu sinh và cán bộ của Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái

Nguyên và một số trường đại học khác.
Ngày 31 tháng 7 năm 2018
Tổ chức chủ trì

Chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Hữu Quân


xii

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information
- Project title: Research of gene expression and orientation of production of
probiotics contained chitinase and protease from Lecanicillium lecanii to control
against plant pathogenic fungi.
- Code number: DH2016-TN04-01
- Coordinator: Dr. Nguyen Huu Quan
- Implementing institution: Thai Nguyen University of Education.
- Duration: 24 months.
2. Objective(s)
- Expression of endochitinase gene from L. lecanii 43H in the P. pastoris X33
- Research the characterization and role of chitinase/protease associated with
hydrolysis of plant pathogenic fungus to produce bio-preparations
3. Creativeness and innovativeness
- Project is the first work that has demonstrated the role of signal peptide in
relation to: (1) expression of rmchit1 in P. pastoris X33, (2) rmchit1 purification, (3)
Factors affecting the physical and chemical properties of rmchit1
- The first step was to purify the protease from L. lecanii VTCC-F-1037 and
initially showed the optimal pH and temperature for protease activity.

- The first step was to confirm that the chitinase/protease complex plays a role in
the hydrolysis of F. oxysporum and R. solani.
4. Research results
- Isolated the gene encoding endochitnase without signal peptide (mchit1) from
the L. lecanii 43H and cloned in pJET1.2 blunt vector.
- Designed pPImchit1 plasmid expression of mchit1 gene in yeast with
expression yield of 2.048 U/ml.
- The rmchit1 was purified from the culture supernatant, by affinity
chromatography with ProBondTM resin, and thus revealed only one protein band of
approximately 43 kDa on SDS-PAGE (Fig. 5, lane 3) with a specific activity 159.45
U/mg protein, with a purification factor of 16.93 and a recovery of 45 %.
- It has been shown that the temperature and pH optimum for rmchit1 are 45°C,
pH 6.0; rmchit1 was stable at a temperature range of 30-35°C; and pH 6.0 after 16
hours of incubation. Organic solvents; detergents; metal ion and EDTA affect the


xiii

activity of rmchit1.
- The research determined the optimum conditions for protease biosynthesis from
L. lecanii VTCC-F-1037 and an extracellular protease was purified by ammonium
sulfate precipitation and throughout Sephadex G100 gel filtration chromatography; it
showed a molecular mass of approximately 40 kDa with a specific activity of 78.73
U/mg protein, and the purification factor of 2.3 with a yield of 17%. Optimum
temperature and pH were observed at 40°C and pH 6.0, respectively
- Initially, the ability to hydrolyze mycelial fungus F. oxysporum and R. solani by
the chitinase/protease complex.
5. Products
5.1. Journal papers
1. Huu Quan Nguyen, Van Hanh Vu, Phuong Dung Le, Hoang Mau Chu (2018),

“High-level expression, purification and properties of an Endochitinase gene
without signal peptide from Lecanicillium lecanii 43H in Pichia pastoris”,
Molecular Biology Reports (SCIE, IF: 1.889).
2. Nguyen Huu Quan, Chu Hoang Mau, Tu Quang Tan (2018) “Purification and
properties of protease from Lecanicillium lecanii”, Proceding: 5th Academic
conference on natural science for young scientists, master and PhD. students from
Asean countries, tr. 197-203.
3. Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh (2016) “Optimazation of culture conditions for
production of protease by Lecanicillium lecanii”. Proceding: The 4th Academic
conference on natural science for master and PhD students from Asean countries,
tr. 248-254.
5.2. Education
Bachelor training: Two Science research project of students
1.

Do Thi Kim Oanh, Thai Thi Hoa, Nguyen Thi Van (2017), Optimazation of
culture conditions for production of chitinase from entomopathogenic fungi.
Science research project of students. Thai Nguyen University of Education.

2.

Dinh Thi Thuy, Than Thi Kim Phuong (2017), Study on the ability of
extracellular enzyme from fungi isolated in Thai Nguyen. Science research
project of students. Thai Nguyen University of Education.


xiv

6. Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research
results

- The results of successful transferred of mchit1 structure into P. pastoris X33 is
the basis for using the transgenic vector constructs to transferred into P. pastoris X33,
contribute to high-level expression rmchit1.
- The results are the basis for the development of research on the application of
transgenic techniques to high-level expression of rmchit1, which facilitates the
purification of rmchit1 and to study the physicochemical properties as well as
applications in fungal hydrolyzate plant diseases at laboratories of Thai Nguyen
University of Education.
- Research results and articles published in the scientific and technological
journals are also used as references in teaching and scientific research for students,
undergraduate students, graduate students from Thai Nguyen University of Education
and some other universities.
Ngày 31 tháng 7 năm 2018
Implementing institution

Coordinator

Nguyen Huu Quan


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nấm Lecanicillium lecanii là loài nấm kí sinh côn trùng, chúng thường tác động
đến những loại mô nhất định như tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme
(chitinase, protease) của nấm. Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các
enzyme càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết
kiệm được thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một lượng lớn enzyme
đặc biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết.
Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl glucosamine,

chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1
và C4 của 2 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Chitinase có ứng
dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, y học.
Trong quá trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm L. lecanii, gen mã hóa chitinase
mang peptide tín hiệu là đoạn peptide nằm ở đầu N của chuỗi polypeptide có vai trò
trong quá trình tiết protein qua màng và được cắt bỏ bởi peptidase khu trú bề mặt phía
ngoài của màng tạo ra phân tử protein có hoạt tính sinh học.
Gen mã hóa chitinase mang tín hiệu peptide từ nấm L. Lecanii đã được nhân dòng
và biểu hiện trong nấm men P. pastoris. Tuy nhiên, việc biểu hiện gen chứa cả peptide tín
hiệu có thể ảnh hưởng đến năng suất biểu hiện, ảnh hưởng đến hoạt tính và tính chất của
enzyme tái tổ hợp. Do đó, biểu hiện chitinase tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu tự
nhiên có thể nâng cao năng suất biểu hiện enzyme tái tổ hợp và thay đổi một số tính chất
của enzyme tái tổ hợp. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài
“Nghiên cứu biểu hiện gene và định hƣớng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase
và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Biểu hiện gene mã hóa endochitinase từ nấm L. lecanii trong nấm men P. pastoris X33.
Nghiên cứu đặc tính và vai trò của phức hệ chitinase/protease trong quá trình diệt
nấm bệnh hại cây trồng nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nhân dòng gene mã hóa endochitinase không mang peptide tín hiệu từ chủng
nấm L. lecanii


2
- Thiết kế cặp mồi PCR nhân bản gene mã hóa mchit1 từ nấm L. lecanii 43H;
- Tách dòng phân tử và xác định trình tự gene mã hóa mchit1 không mang peptide
tín hiệu từ nấm L. lecanii 43H.
3.2. Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gene rmchit1 trong P. pastoris X33
- Thiết kế vector biểu hiện mang gene mã hóa rmchit1

- Kiểm tra cấu trúc của vector biểu hiện trước khi biến nạp vào P. pastoris X33.
3.3. Nghiên cứu chuyển cấu trúc gene mã hóa rmchit1 vào P. pastoris X33
- Biến nạp vector biểu hiện pPICZα mang gene mã hóa rmchit1 vào P. pastoris
X33 bằng phương pháp xung điện.
- Sàng lọc các dòng nấm men mang gene có khả năng sinh tổng hợp rmchit1.
- Tối ưu khả năng biểu hiện rmchit1 tái tổ hợp.
3.4. Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rmchit1.
- Tinh sạch chitinase tái tổ hợp từ chủng từ nấm men P. pastoris X33
- Đánh giá tính chất lý hóa của chitinase tái tổ hợp từ nấm men P. pastoris X33
3.5. Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp protease và đánh giá tính chất lý hóa
của protease từ chủng nấm L. lecanii VTCC-F-1037
- Khảo sát các điều kiện sinh tổng hợp protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
- Đánh giá một số tính chất lý hóa của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
3.6. Thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh hại cây trồng bởi phức hệ
chitinase/protease định hƣớng tạo chế phẩm diệt nấm bệnh


3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nấm Lecanicillium lecanii
Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp
Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae. Chi nấm Lecanicillium gồm
nhiều loài như: L. lecanii, L. attenuatum, L. longisporum, L. muscarium hoặc
L. nodulosum. Nấm L. lecanii trước đây được gọi là Verticillium lecanii. Ngày nay,
L. lecanii được biết là một hình thức sinh sản vô tính trong nhóm trùng thảo Cordyceps
confragosa [18].
Nấm Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn trùng
như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm [19], [20], [21],
[22], [23]. Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của
bào tử với côn trùng. Sau khi bám vào cơ thể côn trùng, các bào tử nảy mầm và tạo

thành sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể, tại đây chúng sinh trưởng và phá
hủy mô. Sau đó, sợi nấm sẽ phát triển xuyên qua các lớp biểu bì của côn trùng. Trong
điều kiện độ ẩm cao, bào tử được tạo thành bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây
truyền bệnh cho côn trùng khác [24].
Dựa vào đặc tính diệt côn trùng của nấm L. lecanii, các nghiên cứu hiện nay đi
theo hai hướng chính là: đi sâu khai thác đặc điểm sinh học của chế phẩm bào tử nấm
L. lecanii sử dụng trong kiểm soát côn trùng; và tìm hiểu vai trò của hệ enzyme
(chitinase, protease, lipase) hoặc độc tố do nấm L. lecanii sinh ra trong quá trình diệt
côn trùng.
Các nghiên cứu về chitinase từ nấm Lecanicillium đã được các tác giả nghiên cứu
theo các hướng chính là (i) tối ưu quá trình sinh tổng hợp chitinase; (ii) tinh sạch và xác
định khả năng thủy phân lớp vỏ trứng của côn trùng và (iii) nhân dòng và biểu hiện gen
mã hóa chitinase. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu chỉ dừng lại ở từng khâu nghiên
cứu riêng lẻ và hoạt tính chitinase sinh ra còn rất thấp. Mặt khác, chủng nấm L. lecanii
nói riêng và các vi sinh vật nói chung thường hay xuất hiện các biến dị và quá trình sinh
chitinase luôn thay đổi ở các điều kiện môi trường, dẫn tới tính chất của chitinase sinh
ra từ các chủng nấm là khác nhau. Do vậy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ
bước lựa chọn điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả năng tổng hợp
chitinase đến tinh sạch và xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme; cũng
như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii trong
nấm men để nâng cao khả năng biểu hiện, sau đó thử nghiệm hoạt tính của chitinase và


4
chế phẩm bào tử trong quá trình diệt rệp và nấm bệnh hại cây trồng là hướng nghiên
cứu cần thiết để nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học.
1.2. Chitinase
Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết
β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau
trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose. Chitinase được chia thành 2 loại chính là

endochitinase (EC 3.2.1.14) và exochitinase. Exochitinase gồm chitobiosidase (EC
3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3.2.1.30). Mỗi loại enzyme tham gia vào
thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ sự phối hợp hoạt động của các
enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo các đơn phân N-acetyl
glucosamine.
1.2.1. Nguồn gốc của chitinase
Chitinase được tổng hợp từ rất nhiều nguồn sinh vật khác nhau trong tự nhiên như
thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đó, vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp
chitinase nhiều hơn so với động vật và thực vật.
Chitinase được sinh ra từ vi sinh vật gồm 2 loại là endochitinase và exochitinase.
Nấm mốc là một trong những nhóm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitinase
mạnh nhất. Các loài nấm mốc thuộc các chi như Trichoderma [25], [26]; Glicocladium;
Metharhizium [27], [28]; Beauveria, Lecanicillium [29], [30], [31]; Aspergillus [32];
Penicillium [33] đã được nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh. Bên
cạnh đó, vi khuẩn cũng được xem là đối tượng có khả năng sinh chitinase khá phong
phú. Chitinase được sinh ra từ vi khuẩn thuộc các chi như Serratia [34], Aeromonas
[35], Arthrobacter [36], Micrococcus [37], Clostridium, Bacillus [38], [39] và đặc biệt
là nhóm Streptomycetes [40], [41].
Chitinase được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải chitin trong tự nhiên.
Thành tế bào của nấm sợi và nấm men được tạo nên từ các phân tử chitin và các hợp
chất khác (manan, glucan, cellulose). Tuy nhiên, cấu trúc chitin này so với chitin trong
tự nhiên có sự khác nhau về tính không tan, kích thước, độ nhớt, độ phức tạp phân tử và
tính không đồng nhất nên không bị thủy phân bởi chitinase của cơ thể.
Ở thực vật, chitinase có mặt chủ yếu trong thân, củ, hạt và hoa của các loài như
khoai tây, thuốc lá, đậu, cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan. Chitinase được sinh ra
trong giai đoạn phát triển sớm của cơ thể có vai trò tham gia vào quá trình hình thành


5
và phát triển phôi. Chitinase trong cây được sinh ra khi có sự kích thích của mầm bệnh

giúp cây chống lại sự tấn công của các nấm kí sinh gây bệnh. Ở thực vật, chitinase chủ
yếu thuộc loại endochitinase và có kích thước nhỏ hơn so với các nhóm khác.
Bên cạnh đó, hệ chitinase có thể được thu nhận từ một số động vật nguyên sinh và
từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương như
ruột khoang, giun tròn, chân đốt, thân mềm (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix
aspersa). Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ
dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của các loài chim, thú
ăn sâu bọ [42], [43].
Ngoài ra, hệ chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt
quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột
da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng cuticun của chúng trong quá trình biến thái
hay lột xác.
1.2.2. Phân loại chitinase
Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học
phân tử quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 (hydrolase, các enzyme xúc tác phản ứng
thủy phân), tổ 2 (glycosidase, thủy phân các liên kết glycoside), nhóm 1 (thủy phân liên
kết O- và S-glycoside).
Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất, chitinase được chia thành 2 dạng: dạng 1 là
endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng 2 là exochitinase gồm 2 loại là chitobiosidase
(EC.3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30). Endochitinase thủy phân điểm
cắt bên trong của phân tử chitin và chitodextrin tạo ra các phân tử có khối lượng thấp
như chitotriose, chitotetraose và diacetyl chitobiose. Chitobiosidase xúc tác quá trình
phân cắt các vi sợi chitin ở đầu không khử giải phóng ra các diacetyl chitobiose.
N-acetylglucosaminidase phân cắt các oligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi
endochitinase và chitobiosidase) để tạo ra các đơn phân N-acetyl glucosamine [44].
Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được sắp xếp vào 3 họ là glycosyl hydrolase
18, 19 và 20 [45]. Họ glycosyl hydrolase 18 là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180
chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các loài
thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus [46]. Họ glycosyl hydrolase 19 có hơn 130 chi,
chủ yếu ở thực vật (cà chua, cải, đậu Hà lan); xạ khuẩn Streptomyces griceus và một số

vi khuẩn (Haemophillus influenzae) [46]. Họ glycosyl hydrolase 20 bao gồm β-Nacetyl-D-Glucosamine acetyl hexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người.


6
Dựa vào trình tự amino acid đầu N, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện,
peptide nhận biết và vùng cảm ứng, chitinase được phân chia thành 5 nhóm: là nhóm I,
II, III, IV và V.
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase
1.2.3.1. Cấu trúc bậc một và bậc hai của chitinase
Các chitinase được sinh ra từ các cơ thể khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu
trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượng phân tử,
thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide.
Ở nấm, chitinase từ L. psalliotae có khối lượng phân tử là 45 kDa, được mã hóa từ
423 amino acid gồm 1 tín hiệu peptide dài 20 amino acid [30]. Zhu và đồng tác giả
(2008) đã nghiên cứu về cấu trúc của endochitinase từ L. lecanii thuộc họ glycosyl
hydrolase 18 là một chuỗi polypeptide cấu tạo bởi các dải α, β và các vùng nối.
Chitinase này là một protein có tính acid, giá trị pI là 5,55 [47]. Chitinase từ L. lecanii
có khối lượng phân tử là 40,93 kDa (CHI1) được mã hóa bởi 370 amino acid và 45,95
kDa (CHI2) được mã hóa bởi 423 amino acid [48].
Thomas và đồng tác giả (2000) đã nghiên cứu chi tiết về cấu trúc bậc 2 của
chitinase từ nấm C. immitis thuộc họ glycosyl hydrolase 18. Chitinase này là một chuỗi
polypeptide gồm 8 dải β (kí hiệu từ S1-S8) tạo thành lõi của enzyme và
8 dải α (kí hiệu từ H2-H9). Các dải β (S3-S6) và α (H3-H8) được nối đan xem với nhau.
Trong đó, không có xoắn α nằm giữa sợi β1 và β2 nên không có kí hiệu α1. Có 2 xoắn α
theo sau chuỗi 2 kí hiệu là H2a và H2b, hai xoắn này xếp liền nhau giống như 1 xoắn
liên tục và phình to ra. Một đoạn xoắn ngắn (H9) nối tiếp với xoắn H8 nằm gần vị trí
kết thúc của đầu C (Hình 1.1) [49].

Hình 1.1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. immitis [32]

7
1.2.3.2. Cấu trúc không gian
Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không
gian của các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất. Sự
khác nhau về cấu trúc không gian của các enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất
hóa lý của chúng.
Chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 thuộc họ glycosyl hydrolase 19 được
cấu tạo nên từ 6 chuỗi xoắn α là α1 (từ vị trí 111-123), α2 (từ vị trí 129-141), α3 (từ vị
trí 163-177), α4 (từ vị trí 186-204), α5 (từ vị trí 207-216) và α6 (từ vị trí
234-247); và 1 xoắn 310 (từ vị trí 154-156). Vị trí thủy phân (Glu141) được xác định ở
điểm cuối của xoắn α2 và được che phủ với vòng lặp dài nhất L-7 (từ vị trí 217-233),
nơi nối giữa xoắn α5 và α6. L-7 được gắn bởi mạng lưới liên kết hydro và tạo nên một
khoang hình ống [50].
1.2.3.3. Trung tâm hoạt động và vùng liên kết cơ chất
Trung tâm hoạt động của chitinase từ nấm L. lecanii chứa 9 gốc amino acid (PheAsp-Gly-Ile-Asp-Trp-Glu). Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân
chitin của chitinase được thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu. Các vùng liên kết đó
có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc không. Tùy thuộc vào từng loại
enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian khác nhau.
Vùng liên kết với cơ chất của chitinase từ nấm L. lecanii gồm 7 amino acid (Val-MetLeu-Ser-Ile-Gly-Gly) và vùng liên kết này nằm ở phía ngoài trung tâm hoạt động [47].
1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase
Cơ chế xúc tác của chitinase thực hiện theo 2 hướng: hướng thứ nhất là cơ chế
chuyển dịch với sự tham gia của nhóm lân cận; nhóm cacboxyl bề mặt hoạt động như
một tác nhân có ái lực với điện tích dương, dưới sự hỗ trợ từ Asp hoạt động để loại bỏ
proton H+ ra khỏi nhóm N-acetamido trong sự cố định của ion oxazolinium. Hướng thứ
hai là cơ chế hoạt động xúc tác các phần còn lại để hỗ trợ cho sự thủy phân các đơn
phân. Mô hình thủy phân chitin được giải thích bằng chitinase B từ vi khuẩn
S. marcescens là một loại exochitinase, với sự tham gia của các nhóm ái lực trong trung
tâm hoạt động của enzyme. Vị trí liên kết của chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18
với cơ chất có chứa 3 amino acid là Asp-140, Asp-142 và Glu-144. Sự luân chuyển

Asp-142 trên cơ chất có vai trò giúp ổn định điện tích dương của các ion trung gian
oxazolinium và là chất cho proton, dẫn tới làm giảm giá trị pKa của Glu-144. Glu-144
đóng vai trò là chất nhận proton, tham gia hình thành liên kết với cơ chất và giải phóng


8
phân tử nước. Khi ở trạng thái nghỉ Asp-142 nằm quá xa so với Glu-144 (Hình 1.2A) [7].

Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens [99]
Khi có sự liên kết của trung tâm hoạt động với cơ chất N-acetyl glucosamine gây
ra sự biến dạng của vòng pyranose làm luân chuyển Asp-142 về phía Glu-144, liên kết
hydro hình giữa các nhóm amin của Asp-142 và Glu-144 được hình thành (Hình 1.2B).
Sự thủy phân các ion trung gian oxazolinium để giải phóng các proton đến Glu-144 và
luân chuyển proton của Asp-142 nơi chia sẻ với Asp-140 (Hình 1.2C). Sau khi sự liên
kết giữa cơ chất và trung tâm hoạt động diễn ra, phân tử nước được giải phóng có vai
trò thủy phân các liên kết glycoside bởi axit amin Tyr-214.

Hình 1.3. Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn B. circulans [106]
Cơ chế thủy phân theo hướng 2 được giải thích bởi chitinase A từ vi khuẩn B.
circulans. Sự liên kết của chitinase A trên bề mặt phân tử chitin thông qua tương tác
của nhóm ái lực gồm 3 amino acid là Trp-69, Trp-33, Trp-245 và 1 phân tử N-acetyl
glucosamine trên bề mặt chuỗi đơn của chitin tại miền N-terminal. Chuỗi chitin tương


9
tác với nhóm ái lực của 3 amino acid được đưa vào bên trong của khe xúc tác từ các
điểm cuối của chuỗi thông qua sự tương tác với Phe-232. Sự tương tác với các điểm ái
lực càng nhiều dẫn đến sự liên kết càng chặt của chuỗi chitin với miền xúc tác thủy phân
của enzyme. Kết quả, các sản phẩm được giải phóng trong quá trình thủy phân các chuỗi
đơn trong tinh thể chitin là các nối đôi của N-acetyl glucosamine (Hình 1.3) [107].

1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase
Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme mạnh nhất ở
nhiệt độ và pH nhất định. Độ bền đối với nhiệt độ và pH hay mức độ và tính chất chịu
ảnh hưởng của các ion kim loại, chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ cũng có sự khác nhau.

1.2.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiệt độ. Enzyme xúc tác
phản ứng hoạt động thích hợp ở dải nhiệt độ từ 20-50°C. Tùy theo nguồn gốc thu nhận
chitinase mà giá trị nhiệt độ tối ưu cho enzyme hoạt động là khác nhau. Chitinase từ các
vi khuẩn như S. macescens B4A [51], Enterobacter sp. G-1 [52], B. subtilis và B.
atrophaeus [53] hoạt động tốt nhất ở 40°C; từ S. plymuthica HRO-C48 hoạt động tốt
nhất ở 55°C [54]; từ S. maltophilia [55] hoạt động tốt nhất ở 60°C. Trong khi, chitinase
từ vi khuẩn B. thuringiensis HBK-51 hoạt động tốt nhất ở 110°C và được coi là một
loại enzyme chịu nhiệt [56]. Các loài nấm như Lecanicillium [29], [57]; Talaromyces
flavus [57], Gliocladium catenulatum [59], M. anisopliae [27], Aspergillus fumigates
[32] hoạt động tốt ở dải nhiệt độ từ 40-60°C.

1.2.5.2. Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo
nghiên cứu trước đây cho thấy, chitinase từ một số loài như nấm Penicillium
ochrochloron MTCC 517 [60], L. psaliotae [30] và vi khuẩn S. marcescens MO-1 [61]
hoạt động tốt nhất ở pH 7,0 và được xem như một loại protein trung tính. Trong khi,
chitinase từ nấm L. chlamydosporium và L. suchlasporium [57], M. anisopliae [27], vi
khuẩn Streptomyces sp. M-20 [40] hoạt động tốt nhất ở pH 5,2-5,7 và thuộc loại
enzyme ưa acid.

1.2.5.3. Ảnh hưởng của ion kim loại, chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ
Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có thể kích
thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme. Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối
trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm cacboxyl, amine hoặc peptide

của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme có độ bền rất lớn; đồng thời


10
các ion kim loại này tạo ra một dạng thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết
gắn được với cơ chất. Do đó tốc độ thủy phân của enzyme được tăng lên. Các ion kim
loại nặng ở nồng độ gây biến tính có thể kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ của
enzyme. Theo nghiên cứu của Patil và đồng tác giả (2013), các ion Hg2+, Zn2+, K+ và
NH4+ ở nồng độ 10 mM ức chế hoàn toàn hoạt tính chitinase từ chủng nấm
P. ochrochloron MTCC 517; trong khi các ion Mg2+ và Ca2+ không ảnh hưởng tới hoạt
tính chitinase [60]. Các ion kim loại Mg2+, K+ và Ca2+ làm tăng hoạt tính chitinase từ vi
khuẩn Enterobacter sp. NRG4; trong khi các ion Cu2+, Co2+, Ag+ và Hg2+ ở nồng độ 1
mM ức chế hoạt tính của chitinase [62]. Để nghiên cứu ảnh hưởng của các cation tới
hoạt tính xúc tác của chitinase từ vi khuẩn S. marcescens B4A, Zarei và đồng tác giả
(2011) đã bổ sung các ion kim loại và EDTA ở nồng độ 1 mM cùng với enzyme. Kết
quả cho thấy các ion kim loại và EDTA được khảo sát đều làm giảm hoạt tính của
enzyme (ngoại trừ 2 ion Co2+ và Mn2+ làm hoạt tính chitinase tăng tới 36%) so với đối
chứng [51].
Các chất tẩy rửa và các dung môi hữu cơ cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính
của enzyme. Các chất tẩy rửa làm tăng hoạt tính chitinase bằng cách làm tăng khả năng
gắn kết giữa trung tâm hoạt động của enzyme và cơ chất thông qua việc giảm sức căng
bề mặt trong môi trường nước. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản
chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác
nhau. Chitinase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis MB-2 không bị ảnh hưởng bởi urê,
Tween 20 và Triton X-100, nhưng không bền với dimethyl sulphoxide và polyethylene
glycol [39]. Nghiên cứu trên vi khuẩn Bacillus sp. BG-11, Bhushan và Hoondal (1988)
nhận thấy chất tẩy rửa Triton X100 làm tăng hoạt tính của chitinase từ vi khuẩn
Bacillus sp. BG-11 [38]. Hoạt tính chitinase từ vi khuẩn S. griseus tăng lên khi xử lý
với 1 mM β-mercaptoethanol và hoạt tính bị mất hoàn toàn khi ủ với 1 mM
P-chloromercuri. Trong khi, SDS ở nồng độ 1 mM không làm thay đổi hoạt tính

chitinase [63]. Zarei và đồng tác giả (2011) nhận thấy, các chất tẩy rửa
Tween 80, Tween 20 và SDS ở nồng độ 0,1 mM làm tăng hoạt tính chitinase (hoạt tính
tăng lên 23%) từ vi khuẩn S. marcescens B4A.
1.3. Protease
Protease thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác cho quá trình phân giải các liên
kết peptide trong phân tử protein và polypeptide tạo ra sản phẩm cuối cùng là các acid
amin, peptid ngắn và pepton [64], [65].