Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (948.02 KB, 26 trang )
ÐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ÐẠI HỌC SƢ PHẠM
BÁO CÁO TÓM TẮT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NĂM 2016
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM SINH
HỌC CHỨA CHITINASE VÀ PROTEASE TỪ LECANICILLIUM LECANII
DIỆT NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG
Mã số: ĐH2016-TN04-01
Chủ nhiệm đề tài: TS. NGUYỄN HỮU QUÂN
Thái Nguyên, năm 2018
i
ÐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ÐẠI HỌC SƢ PHẠM
BÁO CÁO TÓM TẮT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NĂM 2016
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM SINH
HỌC CHỨA CHITINASE VÀ PROTEASE TỪ LECANICILLIUM LECANII
DIỆT NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG
Mã số: ĐH2016-TN04-01
Xác nhận của tổ chức chủ trì
Chủ nhiệm đề tài
TS. Nguyễn Hữu Quân
Thái Nguyên, năm 2018
ii
DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA ÐỀ TÀI
TT
Họ và tên
Đơn vị
Nhiệm vụ
Trường Đại học Sư phạm - Đại học
1
TS. Nguyễn Hữu Quân
2
TS. Hoàng Phú Hiệp
3
CN. Nguyễn Thị Hồng Chuyên
Thái Nguyên
Trường Đại học Sư phạm - Đại học
Thái Nguyên
Trường Đại học Sư phạm - Đại học
Thái Nguyên
Chủ nhiệm
Thành viên
Thành viên
ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
Tên đơn vị trong và ngoài nƣớc
Nội dung phối hợp
Họ và tên ngƣời
nghiên cứu
đại diện đơn vị
Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phân tích hóa sinh, PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm
phạm - Đại học Thái Nguyên
Phân tích sinh học
phân tử
iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................................................2
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................2
2.1. Vật liệu và hóa chất ...........................................................................................................................2
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................................2
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................................4
3.1. Nhân dòng gene mã hóa endochitinase không mang tín hiệu peptide từ chủng nấm L. lecanii........4
3.2. Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gene mã hóa chitinase trong nấm men P. pastoris X33 .................4
3.2.1. Thiết kế plasmid pPImchit1 biểu hiện gen mchit1 trong nấm men ................................................4
3.2.2. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris X33/pPImchit1..............................................................6
3.3. Nghiên cứu chuyển cấu trúc gene mã hóa endochitinase không mang peptide tín hiệu vào nấm
men P. pastoris X33 .................................................................................................................................6
3.3.1. Biểu hiện gene mã hóa endochitinase không mang peptide tín hiệu vào nấm men P. pastoris
X33 ...........................................................................................................................................................6
3.3.2. Sàng lọc các dòng nấm men P. pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp ....................................................6
3.4. Tinh sạch và đánh giá tính chất của rmchit1 .....................................................................................6
3.4.1. Tinh sạch rmchit1 ...........................................................................................................................6
3.4.2. Đánh giá tính chất của rmchit1 ......................................................................................................7
3.5. Nghiên cứu điều kiện sinh protease và đánh giá tính chất lý hóa của protease từ chủng nấm L.
lecanii VTCC-F-1037 ............................................................................................................................10
3.5.1. Khảo sát các điều kiện sinh protease từ nấm L. lecnaii VTCC-F-1037 .......................................10
3.5.2. Tinh sạch và đánh giá tính chất của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 ..........................12
3.6. Thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh hại cây trồng bởi phức hệ protease/rmchit1 định hướng
tạo chế phẩm diệt nấm bệnh ...................................................................................................................14
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................................................15
KẾT LUẬN ...........................................................................................................................................15
KIẾN NGHỊ ..........................................................................................................................................15
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Hoạt tính rmchit1 của các dòng nấm men P. pastoris X33 tái tổ hợp .....................................6
Bảng 3.2. Các bước tinh sạch rmchit1 trong nấm men P. pastoris X33 ..................................................7
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rmchit1 ...........................................9
Bảng 3.4. Các bước tinh sạch protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 .............................................12
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Kết quả nhân dòng gen mchit1 không mang tín hiệu peptide ..................................................4
Hình 3.2. Trình tự gene mchit1 và trình tự amino acids suy diễn không mang peptide tín hiệu từ nấm
L. lecanii 43H ...........................................................................................................................................5
Hình 3.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pPImchit1 ...........................................................................5
Hình 3.4. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rmchit1 trong P. pastoris X33 ..................................5
Hình 3.5. Điện di SDS-PAGE của rmchit1 tinh sạch thông qua cột ProBondTM resin (A) và Định tính
rmchit1 trên đĩa cơ chất chitin khi nhuộm bằng lugol (B). ......................................................................7
Hình 3.6. Nhiệt độ tối ưu (A) và độ bền nhiệt (B) của rmchit1 ...............................................................8
Hình 3.7. pH tối ưu (A) và độ bền pH (B) của rmchit1 ...........................................................................8
Hình 3.8. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ (A) và chất tẩy rửa (B) lên hoạt tính của rmchit1 ..............9
Hình 3.9. Hoạt tính protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 trên đĩa thạch chứa cơ chất casein 0,5%
................................................................................................................................................................10
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy (A) và pH nuôi cấy (B) đến khả năng sinh protease từ
nấm L. lecanii VTCC-F-1037 ................................................................................................................10
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy (A) và nồng độ casein (B) đến
khả năng sinh protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 .......................................................................10
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ (A) và nguồn cacbon (B) đến khả năng sinh protease từ nấm L.
lecanii VTCC-F-1037 ............................................................................................................................12
Hình 3.13. Điện di SDS-PAGE của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 thông qua cột Sephadex
G-100 (A) và định tính protease trên đĩa cơ chất casein khi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R250 (B) ...................................................................................................................................................13
Hình 3.14. Nhiệt độ tối ưu (A) và pH tối ưu (B) của protease từ L. lecanii VTCC-F-1037 ...........................13
Hình 3.15. Độ bền nhiệt (A) và độ bền pH (B) của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 ........................14
Hình 3.16. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum (A) và R. solani (B) bởi phức hệ
protease/rmchit1. Giếng 1: nước, giếng 2-5: phức hệ protease/rmchit1 ................................................14
Hình 3.17. Sợi nấm của R. solani (A, B) và F. oxysporum (C, D) được xử lý với nước (A, C) và với
phức hệ protease/rmchit1 (B, D) ............................................................................................................15
vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Tiếng Anh
Tiếng Việt
BLAST
Basic local alignment search tool
Phần mềm so sánh trình tự
bp
Chit
DNA
dNTPs
Base pair
Gene encoding chitinase
Deoxyribonucleic acid
2-Deoxynucleoside 5-triphosphate
Cặp bazơ
Gen mã hóa chitinase
Acid deoxyribonucleic
Các nucleotide
ĐC
IPTG
EDTA
EtBr
Control
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
Ethylenediamine tetraacetic acid
Ethidium bromide
Đối chứng
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
Axit ethylenediamine tetraacetic
Ethidium bromide
kb
Kilo base
Kilo base
kDa
Kilo Dalton
Kilo Dalton
M
Marker
Thang chuẩn
OD
Optical density
Mật độ quang
PCR
Polymerase chain reaction
Phản ứng khuếch đại gen
RNA
Ribonucleic acid
Axit ribonucleic
RNase
Ribonuclease
Enzyme thủy phân RNA
rchit1
SDSPAGE
Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide
gel electrophoresis
Chitinase tái tổ hợp
Điện di protein
TBE
Tris boric acid EDTA
Tris boric acid EDTA
TE
Tris EDTA
Tris EDTA
TEMED
N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine
N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine
v/v
Volume/volume
Thể tích/thể tích
w/v
Weight/volume
Khối lượng/thể tích
vii
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung:
Tên đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và
protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng
Mã số: ĐH2016-TN04-01
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Hữu Quân
Tổ chức chủ trì: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
Thời gian thực hiện: Từ tháng 06/2016 đến tháng 6/2018
2. Mục tiêu
- Biểu hiện gene mã hóa chitinase từ nấm L. lecanii trong nấm men Pichia pastoris X33.
- Nghiên cứu đặc tính và vai trò của phức hệ chitinase/protease trong quá trình diệt nấm bệnh
hại cây trồng nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học.
3. Tính mới và sáng tạo:
- Đề tài là công trình đầu tiên đã chứng minh được vai trò của tín hiệu peptide liên quan tới: (1)
năng suất biểu hiện của rmchit1 từ nấm L. lecanii 43H trong nấm men P. pastoris X33, (2) phương
pháp tinh sạch rmchit1, (3) các yếu tố ảnh hưởng tới tính chất lý hóa của rmchit1.
- Đề tài bước đầu tinh sạch được protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 và xác định được
nhiệt độ, pH tối ưu, độ bền nhiệt và độ bền pH của protease.
- Đề tài bước đầu chứng minh được phức hợp chitinase/protease có vai trò trong quá trình thủy
phân nấm F. oxysporum và R. solani.
4. Kết quả nghiên cứu:
- Đã phân lập được gen mã hóa endochitinase không mang peptide tín hiệu (mchit1) từ nấm L.
lecanii 43H và nhân dòng trong vector pJET1.2 blunt.
- Đã thiết kế được vector biểu hiện pPImchit1 mang gen mchit1 trong vector pPICZαA và biểu
hiện được trong nấm men P. pastoris X33 với năng suất biểu hiện 2,048 U/ml.
- Đã tinh sạch được endochitinase tái tổ hợp không mang peptide tín hiệu (rmchit1) thông qua
cột ProBondTM resin có kích thước 43 kDa, hoạt tính riêng đạt 159,45 U/mg protein, độ sạch 16,93 lần
và hiệu suất thu hồi đạt 45%.
- Đã chứng minh được nhiệt độ và pH tối ưu cho rmchit1 hoạt động là 45°C, pH 6.0; rmchit1
bền ở dải nhiệt độ từ 30-35°C; và pH 6.0 sau16 giờ ủ. Các dung môi hữu cơ; chất tẩy rửa; ion kim loại
và EDTA có ảnh hưởng đến hoạt tính của rmchit1.
- Đã tối ưu được điều kiện sinh tổng hợp protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 và tinh sạch
được protease thông qua tủa muối ammonium sulfate và qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 có kích
thước 40 kDa, hoạt tính riêng đạt 78,73 U/mg protein, độ sạch đạt 2,3 lần, hiệu suất thu hồi đạt 17%.
Protease tinh sạch có nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 40°C và pH 6,0.
- Bước đầu xác định được chitinase/protease có khả năng thủy phân sợi nấm F. oxysporum và R.
solani.
5. Sản phẩm
5.1. Sản phẩm khoa học
03 bài báo khoa học công bố trên tạp chí quốc tế và kỷ yếu hội nghị quốc tế
1. Huu Quan Nguyen, Van Hanh Vu, Phuong Dung Le, Hoang Mau Chu (2018), “High-level
expression, purification and properties of an Endochitinase gene without signal peptide
from Lecanicillium lecanii 43H in Pichia pastoris”, Molecular Biology Reports (SCIE, IF:
viii
2.
3.
1,889).
Nguyen Huu Quan, Chu Hoang Mau, Tu Quang Tan (2018) “Purification and properties of
protease from Lecanicillium lecanii”, Proceding: 5th Academic conference on natural science for
young scientists, master and PhD. students from Asean countries, tr. 197-203.
Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh (2016) “Optimazation of culture conditions for production of
protease by Lecanicillium lecanii”. Proceding: The 4th Academic conference on natural science
for master and PhD students from Asean countries, tr. 248-254.
5.2. Sản phẩm đào tạo
Hướng dẫn 02 đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học đã nghiệm thu
1. Đỗ Thị Kim Oanh, Thái Thị Hòa, Nguyễn Thị Vân (2017), Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp
chitinase từ chủng nấm ký sinh côn trùng. Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Trường Đại học
Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2. Đinh Thị Thùy, Thân Thị Kim Phượng (2017), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào từ
các loài nấm sợi phân lập ở Thái Nguyên. Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Trường Đại học
Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
6. Phƣơng thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên
cứu
- Kết quả chuyển thành công cấu trúc mang gen mchit1 vào nấm men P. pastoris X33 là cơ sở
cho việc sử dụng cấu trúc vector pPImchit1 chuyển vào nấm men P. pastoris X33, góp phần tạo
rmchit1 có năng suất cao.
- Các kết quả thu được là cơ sở phát triển nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng
cao năng suất biểu hiện rmchit1, thuận lợi cho tinh sạch rmchit1 và nghiên cứu các tính chất lý hóa,
cũng như ứng dụng trong thủy phân nấm hại cây trồng tại phòng thí nghiệm của Trường Đại học Sư
phạm - Đại học Thái Nguyên.
- Kết quả nghiên cứu và các bài báo công bố trên các tạp chí khoa học và kỷ yếu quốc tế được
sử dụng làm tài liệu phục vụ đào tạo và nghiên cứu cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh
và cán bộ của Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và một số trường đại học khác.
Ngày 31 tháng 7 năm 2018
Tổ chức chủ trì
Chủ nhiệm đề tài
Nguyễn Hữu Quân
ix
INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information
- Project title: Research of gene expression and orientation of production of probiotics contained
chitinase and protease from Lecanicillium lecanii to control against plant pathogenic fungi.
- Code number: DH2016-TN04-01
- Coordinator: Dr. Nguyen Huu Quan
- Implementing institution: Thai Nguyen University of Education.
- Duration: 24 months.
2. Objective(s)
- Expression of endochitinase gene from L. lecanii 43H in the P. pastoris X33
- Research the characterization and role of chitinase/protease associated with hydrolysis of plant
pathogenic fungus to produce bio-preparations
3. Creativeness and innovativeness
- Project is the first work that has demonstrated the role of signal peptide in relation to: (1)
expression of rmchit1 in P. pastoris X33, (2) rmchit1 purification, (3) Factors affecting the physical
and chemical properties of rmchit1
- The first step was to purify the protease from L. lecanii VTCC-F-1037 and initially showed the
optimal pH and temperature for protease activity.
- The first step was to confirm that the chitinase/protease complex plays a role in the hydrolysis
of F. oxysporum and R. solani.
4. Research results
- Isolated the gene encoding endochitnase without signal peptide (mchit1) from the L. lecanii
43H and cloned in pJET1.2 blunt vector.
- Designed pPImchit1 plasmid expression of mchit1 gene in yeast with expression yield of
2.048 U/ml.
- The rmchit1 was purified from the culture supernatant, by affinity chromatography with
ProBondTM resin, and thus revealed only one protein band of approximately 43 kDa on SDS-PAGE
(Fig. 5, lane 3) with a specific activity 159.45 U/mg protein, with a purification factor of 16.93 and a
recovery of 45 %.
- It has been shown that the temperature and pH optimum for rmchit1 are 45°C, pH 6.0; rmchit1
was stable at a temperature range of 30-35°C; and pH 6.0 after 16 hours of incubation. Organic
solvents; detergents; metal ion and EDTA affect the activity of rmchit1.
- The research determined the optimum conditions for protease biosynthesis from L. lecanii
VTCC-F-1037 and an extracellular protease was purified by ammonium sulfate precipitation and
throughout Sephadex G100 gel filtration chromatography; it showed a molecular mass of
approximately 40 kDa with a specific activity of 78.73 U/mg protein, and the purification factor of 2.3
with a yield of 17%. Optimum temperature and pH were observed at 40°C and pH 6.0, respectively
- Initially, the ability to hydrolyze mycelial fungus F. oxysporum and R. solani by the
x
chitinase/protease complex.
5. Products
5.1. Journal papers
1.
Huu Quan Nguyen, Van Hanh Vu, Phuong Dung Le, Hoang Mau Chu (2018), “High-level
expression, purification and properties of an Endochitinase gene without signal peptide
from Lecanicillium lecanii 43H in Pichia pastoris”, Molecular Biology Reports (SCIE, IF:
1.889).
2.
Nguyen Huu Quan, Chu Hoang Mau, Tu Quang Tan (2018) “Purification and properties of
protease from Lecanicillium lecanii”, Proceding: 5th Academic conference on natural science for
young scientists, master and PhD. students from Asean countries, tr. 197-203.
3.
Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh (2016) “Optimazation of culture conditions for production of
protease by Lecanicillium lecanii”. Proceding: The 4th Academic conference on natural science
for master and PhD students from Asean countries, tr. 248-254.
5.2. Education
Bachelor training: Two Science research project of students
1.
Do Thi Kim Oanh, Thai Thi Hoa, Nguyen Thi Van (2017), Optimazation of culture conditions
for production of chitinase from entomopathogenic fungi. Science research project of students.
Thai Nguyen University of Education.
2.
Dinh Thi Thuy, Than Thi Kim Phuong (2017), Study on the ability of extracellular enzyme
from fungi isolated in Thai Nguyen. Science research project of students. Thai Nguyen
University of Education.
6. Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research results
- The results of successful transferred of mchit1 structure into P. pastoris X33 is the basis for
using the transgenic vector constructs to transferred into P. pastoris X33, contribute to high-level
expression rmchit1.
- The results are the basis for the development of research on the application of transgenic
techniques to high-level expression of rmchit1, which facilitates the purification of rmchit1 and to
study the physicochemical properties as well as applications in fungal hydrolyzate plant diseases at
laboratories of Thai Nguyen University of Education.
- Research results and articles published in the scientific and technological journals are also
used as references in teaching and scientific research for students, undergraduate students, graduate
students from Thai Nguyen University of Education and some other universities.
Ngày 31 tháng 7 năm 2018
Implementing institution
Coordinator
Nguyen Huu Quan
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nấm Lecanicillium lecanii là loài nấm kí sinh côn trùng, chúng thường tác động đến những loại
mô nhất định như tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease) của nấm.
Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu
diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra
một lượng lớn enzyme đặc biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết.
Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl glucosamine, chitobiose hay
chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetyl
glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Chitinase có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, y học.
Trong quá trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm L. lecanii, gen mã hóa chitinase mang peptide tín
hiệu là đoạn peptide nằm ở đầu N của chuỗi polypeptide có vai trò trong quá trình tiết protein qua màng
và được cắt bỏ bởi peptidase khu trú bề mặt phía ngoài của màng tạo ra phân tử protein có hoạt tính
sinh học.
Gen mã hóa chitinase mang tín hiệu peptide từ nấm L. Lecanii đã được nhân dòng và biểu hiện
trong nấm men P. pastoris. Tuy nhiên, việc biểu hiện gen chứa cả peptide tín hiệu có thể ảnh hưởng đến
năng suất biểu hiện, ảnh hưởng đến hoạt tính và tính chất của enzyme tái tổ hợp. Do đó, biểu hiện
chitinase tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu tự nhiên có thể nâng cao năng suất biểu hiện enzyme tái tổ
hợp và thay đổi một số tính chất của enzyme tái tổ hợp. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành lựa
chọn đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gene và định hƣớng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và
protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Biểu hiện gene mã hóa endochitinase từ nấm L. lecanii trong nấm men P. pastoris X33.
Nghiên cứu đặc tính và vai trò của phức hệ chitinase/protease trong quá trình diệt nấm bệnh hại
cây trồng nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nhân dòng gene mã hóa endochitinase không mang tín hiệu peptide từ chủng nấm L. lecanii
- Thiết kế cặp mồi PCR nhân bản gene mã hóa mchit1 từ nấm L. lecanii 43H;
- Tách dòng phân tử và xác định trình tự gene mã hóa mchit1 không mang tín hiệu peptide từ
chủng nấm L. lecanii 43H.
3.2. Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gene rmchit1 trong P. pastoris X33
- Thiết kế vector biểu hiện mang gene mã hóa rmchit1
- Kiểm tra cấu trúc của vector biểu hiện trước khi biến nạp vào P. pastoris X33.
3.3. Nghiên cứu chuyển cấu trúc gene mã hóa rmchit1 vào P. pastoris X33
- Biến nạp vector biểu hiện pPICZα mang gene mã hóa rmchit1 vào P. pastoris X33 bằng
phương pháp xung điện.
- Sàng lọc các dòng nấm men mang gene có khả năng sinh tổng hợp rmchit1.
- Tối ưu khả năng biểu hiện rmchit1 tái tổ hợp.
3.4. Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rmchit1.
- Tinh sạch chitinase tái tổ hợp từ chủng từ nấm men P. pastoris X33
- Đánh giá tính chất lý hóa của chitinase tái tổ hợp từ nấm men P. pastoris X33
3.5. Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp protease và đánh giá tính chất lý hóa của protease từ
chủng nấm L. lecanii
- Khảo sát các điều kiện sinh tổng hợp protease từ nấm L. lecanii
- Đánh giá một số tính chất lý hóa của protease từ nấm L. lecanii
3.6. Thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh hại cây trồng bởi phức hệ chitinase/protease định
hƣớng tạo chế phẩm diệt nấm bệnh
2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Đề tài đã tham khảo 156 tài liệu để tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) nấm
Lecanicillium lecanii, (2) Chitinase; (3) Protease; (4) Ứng dụng của nấm L. lecanii và phức hệ
chitinase/protease, (3) Một số nghiên cứu về gen và biểu gen mã hóa chitinase.
Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4
của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose.
Chitinase được tổng hợp từ rất nhiều nguồn sinh vật khác nhau trong tự nhiên như thực vật, động vật và
vi sinh vật. Trong đó, vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp chitinase nhiều hơn so với động vật và
thực vật.
Nấm Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn trùng như rệp, ruồi
trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm. Do vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển
chế phẩm sinh học diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium là cần thiết.
Dựa vào đặc tính thủy phân chitin, chitinase đã được lựa chọn cho những ứng dụng cụ thể trong
thực tiễn như: ứng dụng trong y tế, nông nghiệp, bảo vệ môi trường và trong công nghệ sinh học.
Gen mã hóa chitinase được nghiên cứu trên nhiều đối tượng vi sinh vật như nấm Lecanicillium,
Beauveria, Trichoderma,...Gen mã hóa chitinase từ một số chủng nấm được nhiều tác giả nghiên cứu
biểu hiện ở các hệ thống biểu hiện khác nhau như biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, trong vi khuẩn
Bacillus, trong nấm men và trong thực vật.
Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu chitinase chủ yếu tập chung vào quá trình tối ưu khả năng sinh
chitinase trên một số chủng vi sinh vật và sử dụng chitinase để ức chế sự phát triển, cũng như nghiên
cứu biểu hiện gen chitinase trong thực vật giúp cây trồng có khả năng chống lại được một số nấm bệnh.
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và hóa chất
Chủng nấm L. lecanii VTCC-F-1037 và L. lecanii 43H do Phòng Các chất chức năng sinh học,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam cung cấp.
Vi khuẩn E. coli DH5α được sử dụng để nhân dòng gen và tế bào nấm men
P. pastoris X33 dùng để biểu hiện gen. Vector pJET1.2/blunt (Fermentas) để nhân dòng và pPICZαA
(Invitrogen) được dùng để biểu hiện gen mchit1.
Nấm F. oxysporum và R. solani do Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn
lâm KH&CN Việt Nam cung cấp.
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm đều mới, hiện đại và có độ chính xác cao thuộc Phòng
Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và Khoa
Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Đề tài sử dụng các nhóm phương pháp nghiên cứu như: (1) Phương pháp nuôi cấy; (2) Xác định hoạt
tính chitinase/protease; (3) Tinh sạch và nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và
độ bền của rmchit1 và protease; (4) Phương pháp sinh học phân tử; (5) Phương pháp thử nghiệm khả
năng ức chế nấm bệnh của rmchit1/protease; (6) Phương pháp phân tích, xử lý số liệu.
2.2.1. Nhóm các phƣơng pháp nuôi cấy
Hoạt hóa chủng nấm; nuôi cấy nấm thu sinh khối; nuôi cấy vi khuẩn E. coli, nấm men P. pastoris; nuôi
tối ưu và biểu hiện sinh tổng hợp protease.
2.2.2. Xác định hoạt tính chitinase/protease
3
2.2.3. Tinh sạch và nghiên cứu ảnh hƣởng của yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ bền của
rmchit1/protease
2.2.4. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.4.1. Nhóm các phương pháp nhân dòng gen
Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ nấm và DNA plasmid từ vi khuẩn → Nhân bản gen rmchit1
bằng PCR → Nhân dòng gen và xác định trình tự nucleotide: i) Tinh sạch sản phẩm PCR, ii) Ghép nối
đoạn gen vào vector nhân dòng pJET1.2, iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α; iv)
Tách chiết plasmid, v) Cắt kiểm tra sản phẩm cắt, vi) Xác định và phân tích trình tự nucleotide.
2.2.4.2. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen
Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA mang gen rmchit1.
Vector tái tổ hợp được biến nạp bằng xung điện vào nấm men P. pastoris X33 và hội nhập với
genome tại điểm AOX1.
2.2.5. Nhóm phƣơng pháp thử nghiệm khả năng ức chế nấm của rmchit1/protease
2.2.6. Phƣơng pháp phân tích, xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel và chương trình DNAStar.
4
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nhân dòng gene mã hóa endochitinase không mang tín hiệu peptide từ chủng nấm L. lecanii
Dựa trên trình tự nucleotide của gen chit1 mã hóa endochitinase chứa peptide tín hiệu từ nấm L.
lecanii 43H (DQ412945), cặp mồi mChitF (5'-GCGAATTCATGC TGGCTACGCCAATC-3') và
mChitR (5'-GCTCTAGATCTTTCATGCCATTCTTGA-3') được thiết kế để khuếch đại gene mchit1
không chứa peptide tín hiệu. Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 1,2 kb và lớn hơn so với
gen chit1 (gen chứa peptide tín hiệu) (Hình 3.1A). Sản phẩm PCR sau đó được gắn trực tiếp vào vector
pJET1.2/blunt hình thành plasmid tái tổ hợp pJEmchit1 và biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5.
Plasmid tái tổ hợp pJEmchit1 thu được có kích thước lớn hơn đối chứng (Hình 3.1B). Plasmid
pJEmchit1 được chọn lọc và cắt kiểm tra bằng enzyme EcoRI và XbaI. Sản phẩm cắt kiểm tra trên gel
agarose 0,8% có 2 băng DNA kích thước khoảng 3,0 kb tương ứng với vector pJET1.2/blunt và băng
còn lại có kích thước khoảng 1,2 kb tương ứng với đoạn gen mchit1 (Hình 3.1C).
a
c
A
B
C
Hình 3.1. Kết quả nhân dòng gen mchit1 không mang tín hiệu peptide
Điện di sản phẩm PCR của gene mchit1 (A), Plasmid tái tổ hợp pJEmchit1 (B) và sản phẩm cắt
PJEmchit1 bằng enzyme EcoRI/XbaI (C). Giếng M: marker, Giếng 1: Sản phẩm PCR gene mchit1,
Giếng 2: pJET1.2/blunt, Giếng 3: pJEmchit1, Giếng 4: pJEmchit1/EcoRI-XbaI.
Plasmid pJEmchit1 đã được tách và tinh sạch bằng kit QIAGEN để đọc trình tự nucleotide. Đoạn
gen mchit1 của chủng nấm L. lecanii 43H được xác định trình tự có chiều dài 1209 nucleotide (bao gồm
cả mã mở đầu và kết thúc), thuộc họ glycosyl hydrolase 18 thủy phân liên kết glycoside. Trình tự amino
acid suy diễn dài 403 amino acid, không chứa peptide tín hiệu ở đầu N là (phân tích bằng signal peptide
SignalP-3.0 ( Theo phân tích lý thuyết, protein này có khối
lượng phân tử khoảng 43 kDa, gồm 36 amino acid mang tính base mạnh, 41 amino acid có tính acid
mạnh, 147 amino acid kị nước và 126 amino acid phân cực (Hình 3.2).
3.2. Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gene mã hóa chitinase trong nấm men P. pastoris X33
3.2.1. Thiết kế plasmid pPImchit1 biểu hiện gen mchit1 trong nấm men
Plasmid pJEmchit1 mang gen mchit1 và vector pPICZαA cùng được cắt bằng EcoRI và XbaI.
Sau đó được nối với nhau bằng T4 ligase tạo plasmid tái tổ hợp pPImchit1. Dịch lai được biến nạp vào
vi khuẩn E. coli DH5α bằng sốc nhiệt. Plasmid pPImchit1 có kích thước lớn hơn, nên nằm cao hơn so
với pPICZαA (Hình 3.3A).
5
Hình 3.2. Trình tự gene mchit1 và trình tự amino acids suy diễn không mang peptide tín hiệu từ nấm
L. lecanii 43H
Plasmid pPImchit1 tinh sạch được cắt bằng enzyme EcoRI và XbaI cho hai băng là vector
pPICZαA (~3,6 kb) và gen mchit1 (1209 bp) (Hình 3.3 B). Plasmid pPImchit1 được đọc trình tự để
kiểm tra cấu trúc biểu hiện trước khi biến nạp và biểu hiện ở nấm men P. pastoris X33. Kết quả đọc
trình tự cho thấy cấu trúc của vector biểu hiện đúng khung đọc, DNA gen mchit1 chèn vào đúng vị trí
mong muốn, đủ điều kiện để đưa vào biểu hiện trong nấm men P. pastoris X33.
Hình 3.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pPImchit1
Giếng 1: Plasmid pPICZαA, Giếng 2: Plasmid pPImchit1, Giếng 3: Plasmid pPImchit1 được
cắt bởi enzyme EcoRI/XbaI, Giếng 4: Plasmid pPImchit1 được cắt bởi PmeI, Giếng M: Marker 1kb
6
3.2.2. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris X33/pPImchit1
Để biểu hiện gene mchit1, plasmid tái tổ hợp pPImchit1 được cắt mở vòng bằng PmeI thu được 1
băng có kích thước ~5,0 kb (ứng với kích thước của vecor pPICZαA và gene mchit1) (Hình 3.3C), sau
đó được biến nạp vào genome của nấm men P. pastoris X33 với mục đích tạo được chủng tái tổ hợp
biểu hiện rmchit1 hiệu quả, bền và ổn định đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Nghiên cứu chuyển cấu trúc gene mã hóa endochitinase không mang peptide tín hiệu vào
nấm men P. pastoris X33
3.3.1. Biểu hiện gene mã hóa endochitinase không mang peptide tín hiệu vào nấm men P. pastoris X33
Plasmid tái tổ hợp pPImchit1 sau khi cắt mở vòng bằng PmeI được biến nạp vào genome của
nấm men P. pastoris X33 với mục đích tạo được chủng tái tổ hợp. Kết quả biến nạp nhận thấy, các dòng
nấm men tái tổ hợp được nuôi trong môi trường YP bổ sung zeocin qua đêm, tách DNA, sau đó PCR với
cặp mồi đặc hiệu mChitF/mChitR để kiểm tra sự hội nhập của gene mchit1 vào genome của nấm men.
Hình 3.4 cho thấy, sáu dòng nấm men (giếng 3-8) xuất hiện 1 băng với kích thước ~1.2 kb tương ứng với
gene mchit1 trong vector pPImchit1 (giếng 2). Như vậy, có thể kết luận các dòng nấm men P. pastoris
X33 tái tổ hợp có chứa đoạn gen mchit1.
Hình 3.4. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rmchit1 trong P. pastoris X33
Giếng 1: Marker, Giếng 2: DNA từ pPImchit1, Giếng 3-8: DNA từ các dòng nấm men tái tổ hợp
3.3.2. Sàng lọc các dòng nấm men P. pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp
Sau khi biến nạp, 21 dòng tái tổ hợp được nuôi và xác định mức độ biểu hiện rmchit1. Bảng 3.1
nhận thấy, 21 dòng có hoạt tính endochitinase. Trong đó, dòng số 7 có hoạt tính enzyme cao nhất (2,048
U/ml). Dòng số 7 được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.1. Hoạt tính rmchit1 của các dòng nấm men P. pastoris X33 tái tổ hợp
Dòng
U/mL
Dòng
U/mL
Dòng
U/mL
1
2
3
4
5
6
7
0,950 ± 0,036
0,898 ± 0,006
1,717 ± 0,003
1,069 ± 0,050
1,107 ± 0,041
1,398 ± 0,012
8
9
10
11
12
13
14
0,585 ± 0,005
0,365 ± 0,080
1,095 ± 0,086
0,983 ± 0,003
0,261 ± 0,001
0,893 ± 0,006
1,473 ± 0,006
15
16
17
18
19
20
21
1,862 ± 0,041
1,179 ±0,050
1,412 ± 0,016
1,206 ± 0,007
1,076 ± 0,002
1,257 ± 0,024
0,575 ± 0,014
2,048 ± 0,013
3.4. Tinh sạch và đánh giá tính chất của rmchit1
3.4.1. Tinh sạch rmchit1
rmchit1 từ dòng nấm men P. pastoris X33 số 7 có hoạt tính 2,048 U/ml được tiến hành tinh sạch
bằng cột ProBondTM resin. Kết quả tinh sạch chỉ ra 1 băng protein duy nhất có kích thước khoảng 43
7
kDa trên bản điện di khi nhuộm bằng AgNO3 0,1% (Hình 3.5A, giếng 3), với hoạt tính riêng 159,45
U/.mg protein, độ sạch 16,93 lần và hiệu suất thu hồi 45% (Bảng 3.2). Hoạt tính của rmchit1 tổng số,
dịch gắn cột, rmchit1 tinh sạch và dịch rửa được định tính trên đĩa thạch có chứa 0,5% cơ chất chitin.
Kết quả chỉ ra vòng phân giải màu trắng vàng (giếng 1; 2 và 3) của vòng thủy phân chitin khi nhuộm
bằng thuốc nhuộm lugol (Hình 3.5B). Như vậy, chúng tôi đã tinh sạch được rmchit1 không chứa
peptide tín hiệu từ L. lecanii 43H thông qua cột ProBondTM resin.
A
B
Hình 3.5. Điện di SDS-PAGE của rmchit1 tinh sạch thông qua cột ProBondTM resin (A) và Định tính
rmchit1 trên đĩa cơ chất chitin khi nhuộm bằng lugol (B).
Giếng 1/vòng 1: rmchit1 tổng số, giếng 2/vòng 2: dịch gắn cột, giếng 3/vòng 3: rmchit1 tinh
sạch, vòng 4: dịch rửa, vòng 5: nước, and giếng M: marker
Bảng 3.2. Các bước tinh sạch rmchit1 trong nấm men P. pastoris X33
Mẫu
rmchit1 tổng số
Dịch gắn cột
Dịch rửa
rmchit1 tinh sạch
Hoạt tính
tổng số (U/ml)
16,38
5,90
0,92
7,38
Protein tổng
số (mg/ml)
1,74
0,71
0,25
0,05
Hoạt tính riêng
(U/mg)
9,42
8,28
3,73
159,45
Độ sạch
1
16,93
Hiệu suất
thu hồi (%)
100
36
6
45
3.4.2. Đánh giá tính chất của rmchit1
3.4.2.1. Xác định nhiệt độ và độ bền nhiệt của rmchit1
Nghiên cứu nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của rmchit1 có vai trò quan trọng trong quá trình tinh
sạch và sử dụng chế phẩm enzyme đạt hiệu quả cao hơn. rmchit1 từ nấm men P. pastoris X33 hoạt
động ở dải nhiệt độ rộng từ 20-65°C. Hoạt tính rmchit1 tăng dần từ 64% (30,86 U/mg protein) ở 20°C
đến tối đa 48,39 U/mg ở 45°C và giảm dần xuống 31% (14,83 U/mg protein) ở 65°C (Hình 3.6A). Như
vậy, nhiệt độ tối ưu cho rmchit1 hoạt động là 45°C.
Trong nghiên cứu này, hoạt tính của rmchit1 duy trì từ 100% đến 81% sau khi ủ trên 24 giờ ở
30°C. Hoạt tính còn lại của rmchit1 đạt trên 81% sau ủ 8 giờ và giảm xuống 65% sau ủ ở 24 giờ ở
35°C. Trong khi, hoạt tính của rmchit1 giảm mạnh khi ủ ở 40°C sau 24 giờ và hoạt tính còn lại là 50%
(Hình 3.6B). Như vậy, rmchit1 bền ở dải nhiệt độ 30-35°C.
8
A
B
Hình 3.6. Nhiệt độ tối ưu (A) và độ bền nhiệt (B) của rmchit1
3.4.2.2. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của rmchit1
Hoạt tính của enzyme bị ảnh hưởng bởi pH môi trường. Trong nghiên cứu này, hoạt tính rmchit1
đã được khảo sát ở dải pH từ 3,5-8,0. Kết quả cho thấy, hoạt tính rmchit1 bị mất hoạt tính hoàn toàn ở
pH 3,5 và hoạt tính tăng dần ở pH 4.0 (đạt 28%) đến tối đa ở pH 6,0 và sau đó giảm xuống ở dải pH
6,5-8,0 (Hình 3.7A).
Hoạt tính rmchit1 bền ở pH 6,0 và duy trì trên 80% hoạt tính sau ủ 16 giờ. Trong khi, hoạt tính
rmchit1 giảm mạnh ở pH 7,0 và pH 8,0 sau 6 giờ ủ và hoạt tính enzyme bị mất hoàn toàn sau 8-12 giờ
ủ. Ở pH 5,0 hoạt tính rmchit1 giảm mạnh sau 4 giờ ủ (Hình 3.7B). Như vậy, rmchit1 bền ở pH 6,0.
A
B
Hình 3.7. pH tối ưu (A) và độ bền pH (B) của rmchit1
3.4.2.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA tới hoạt tính rmchit1
Các ion kim loại và EDTA có ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme. Chúng hoạt động như một
cầu nối giữa enzyme và cơ chất, làm thay đổi thế năng và giảm quá trình oxy hóa giúp cho phân tử
enzyme (protein) ổn định. Mức độ ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA ở các nồng độ khác nhau
đối với hoạt tính rmchit1 từ nấm men P. pastoris X33 là khác nhau. Bảng 3.3 cho thấy, Ion Co2+ làm
tăng hoạt tính của rmchit1 ở cả ba nồng độ khảo sát, trong đó hoạt tính cao nhất ở nồng độ 5 mM (hoạt
tính tăng 11% so với đối chứng). Ion Cu2+ ở nồng độ 5-10 mM và Fe2+ ở nồng độ 5 mM làm tăng hoạt
tính của rmchit1. Các ion kim loại còn lại ở cả ba nồng độ khảo sát đều giảm hoạt tính của enzyme so
với mẫu đối chứng. Đặc biệt, chất ức chế mạnh nhất là Ag+ ở nồng độ 10-15 mM (rmchit1 không hoạt
động), tiếp theo là Al3+ và Hg2+ ở nồng độ 10 mM với hoạt tính enzyme giảm xuống dưới 20% so với
mẫu chứng và enzyme bị mất hoạt tính ở nồng độ 15 mM. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các ion ở nồng
độ khác có ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme là khác nhau. Hầu hết các ion ở nồng độ càng cao, hoạt tính
của enzyme càng bị giảm.
9
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rmchit1
Hoạt tính còn lại (%)*
Ion kim loại (mM)
5
10
15
K
Zn2+
Ni2+
95 ± 0,3
94 ± 3,1
94 ± 2,2
95 ± 0,3
94 ± 3,1
94 ± 2,2
95 ± 0,9
91 ± 2,5
82 ± 3,2
Ca2+
Ba2+
Mg2+
Mn2+
Fe2+
Cu2+
Co2+
Pb2+
Ag+
Al+
Hg2+
EDTA
Đối chứng
94 ± 2,4
91 ± 1,1
74 ± 1,7
79 ± 1,0
105 ± 1,4
111 ± 0,4
111 ± 2,1
90 ± 1,2
21 ± 2,0
80 ± 1,7
84 ± 2,3
69 ± 0,6
94 ± 2,4
91 ± 1,1
65 ± 1,4
90 ± 1,8
96 ± 1,1
127 ± 0,9
107 ± 2,1
86 ± 0,4
0±0
20 ± 0,2
18 ± 1,3
65 ± 1,7
100 ± 3,9
90 ± 1,8
95 ± 2,6
48 ± 1,7
89 ± 1,8
89 ± 0,1
94 ± 1,0
107 ± 1,6
77 ± 0,4
0±0
0±0
0±0
54 ± 0,4
+
Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
*
3.4.2.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính rmchit1
Tất cả các dung môi hữu cơ MeOH, IsOH, EtOH, Acet và BuOH ở các nồng độ khác nhau đều
ảnh hưởng đến hoạt tính của rmchit1. Việc bổ sung các dung môi hữu cơ ở nồng độ 10-30% làm giảm
hoạt tính enzyme so với đối chứng. Tuy nhiên, dung môi MeOH và Acet ở nồng độ 10% và 20% làm
tăng hoạt tính rmchit1 từ 2% đến 21% so với đối chứng (Hình 3.8A).
A
B
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ (A) và chất tẩy rửa (B) lên hoạt tính của rmchit1
MeOH: methanol, IsOH: isopropanol, EtOH: Ethanol, Acet: acetone, BuOH: butanol; TW80: Tween
80, TW20: Tween 20, TX100: Triton X-100, TX114: Triton X-114, SDS: sodium dodecyl sulfate,
CT: Đối chứng
3.4.2.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính rmchit1
Một số chất tẩy rửa có hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80, Triton X100, Triton X114
hay SDS ảnh hưởng tới hoạt tính của rmchit1. Chất tẩy rửa Tween 80 làm tăng hoạt tính của rmchit1 ở
nồng độ từ 0,5% đến 2,0%; trong đó hoạt tính tăng mạnh nhất ở nồng độ 1,5% (tăng 23% so với đối
10
chứng). Tween 20 và Triton X-114 tương ứng ở nồng độ 0,5-2,0% và 0,5% không ảnh hưởng tới hoạt
tính của rmchit1. Triton X-114 ở nồng độ 1,0-2,0 %; Triton X-100 và SDS ở nồng độ 0,5-2,0 % làm
giảm hoạt tính của enzyme so với đối chứng. Đặc biệt, hoạt tính rmchit1 giảm mạnh nhất khi sử dụng
SDS, hoạt tính duy trì còn 14% so với đối chứng (Bảng 3.8B).
3.5. Nghiên cứu điều kiện sinh protease và đánh giá tính chất lý hóa của protease từ chủng nấm
L. lecanii VTCC-F-1037
3.5.1. Khảo sát các điều kiện sinh protease từ nấm L. lecnaii VTCC-F-1037
3.5.1.1. Nghiên cứu khả năng sinh protease
Nấm L. lecanii được nuôi trong môi trường MT, sau 120 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C hoạt tính
protease sinh ra đạt 2,2 U/ml. Dịch enzyme được định tính trên đĩa thạch có chứa cơ chất casein 0,5%, kết
quả hình 3.9 cho thấy, vòng phân giải casein xuất hiện sau khi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue 250.
Như vậy, nấm L. lecanii trong nghiên cứu của chúng tôi có khả sinh tổng hợp protease ngoại bào.
Hình 3.9. Hoạt tính protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 trên đĩa thạch
chứa cơ chất casein 0,5%
3.5.1.2. Thời gian sinh protease
Thời gian lên men là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
enzyme của nấm. Nấm L. lecanii VTCC-F-1037 bắt đầu sinh protease sau 48 giờ nuôi (hoạt tính đạt
0,936 U/ml), hoạt tính tiếp tục tăng khi tăng thời gian lên men và đạt cực đại sau 144 giờ, hoạt tính đạt
3,001 U/ml. Khi thời gian tiếp tục tăng thì sinh tổng hợp enzyme lại giảm, hoạt tính chỉ còn 1,48 U/ml
sau 240 giờ (Hình 3.10A).
A
B
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy (A) và pH nuôi cấy (B) đến
khả năng sinh protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
3.5.1.3. pH môi trường nuôi cấy
11
Ở các pH môi trường khảo sát, khả năng sinh protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 tăng dần từ
pH 4,0 (đạt 2,093 U/ml) đến cực đại ở pH 6,5 (đạt 3,863 U/ml). Hoạt tính protease giảm xuống còn 1,836
U/ml ở pH 9,0 (Hình 3.10B).
3.5.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme. Mỗi chủng vi sinh vật có khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp
enzyme. Nhiệt độ càng tăng hoạt lực của enzyme cũng tăng theo song đến một mức nhiệt độ giới hạn
thì hoạt lực enzyme lại giảm xuống. Kết quả nghiên cứu hình 3.11A cho thấy, nấm L. lecanii VTCC-F1037 được nuôi cấy trong môi trường MT bổ sung 1,0% casein, nuôi lắc 200 vòng/phút, pH 6,5 cho khả
năng sinh tổng hợp protease cao nhất ở 30°C (hoạt tính đạt 4,451 U/ml) khi khảo sát nhiệt độ lên men
từ 25-37°C.
A
B
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy (A) và nồng độ casein (B) đến
khả năng sinh protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
3.5.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Cơ chất cảm ứng đóng vai trò là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp một loại enzyme
tương ứng. Khi sử dụng cơ chất casein vào môi trường nuôi cấy sẽ tác động mạnh đến sinh trưởng và
sinh tổng hợp protease của nấm L. lecanii VTCC-F-1037. Kết quả cho thấy, ở nồng độ casein 1,5% hoạt
tính protease sinh ra cao nhất, hoạt tính đạt 4,491 U/ml, cao hơn so với lượng casein ban đầu (0,5%)
(Hình 3.11B).
3.5.1.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Mức độ ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đối với khả năng sinh protease của chủng nấm
L. lecanii VTCC-F-1037 là khác nhau. Kết quả hình 3.6 cho thấy, nấm L. lecanii VTCC-F-1037 được
nuôi cấy trong môi trường MT pH 6,5 ở 30°C, bổ sung casein 1,5% làm nguồn cơ chất cảm ứng thì hoạt
tính protease sinh ra cao nhất khi môi trường bổ sung bột đậu tương 0,5% làm nguồn nitơ, hoạt tính đạt
5,276 U/ml và cao hơn so với đối chứng (pepton). Tiếp theo là cao thịt và casein hoạt tính lần lượt đạt
5,19 và 5,103 U/ml. Hoạt tính thấp nhất trong môi trường có bổ sung nguồn nitơ là urê, hoạt tính đạt
1,047 U/ml (Hình 3.12A).
3.5.1.7. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Nguồn cacbon được biết đến như một nguồn năng lượng và có ảnh hưởng tới hoạt tính sinh
protease của chủng L. Lecanii VTCC-F-1037. Các nguồn cacbon khác nhau thì khả năng sinh proteae là
khác nhau. Khi sử dụng bột ngô là nguồn cacbon để nuôi cấy chủng L. Lecanii VTCC-F-1037 thì hoạt
tính protease sinh ra là cao nhất, hoạt tính protease đạt 6,842 U/ml, tiếp theo là cao nấm men (hoạt tính
đạt 5,214 U/ml) và cao hơn so với các môi trường bổ sung các nguồn cacbon khác. Trong môi trường
12
có nguồn cacbon là vỏ lạc, vỏ cà phê, trấu cámvà CMC hoạt tính protease sinh ra khá thấp, hoạt tính chỉ
đạt được 1,32-1,822 U/ml (Hình 3.12B).
A
B
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ (A) và nguồn cacbon (B) đến khả năng sinh protease từ nấm
L. lecanii VTCC-F-1037
PT: pepton, BĐT: bột đậu tương, CS: casein, CT: cao thịt, UR: urea, Na: NaNO3, KN: KNO3,
AS: (NH4)2SO4, AN: NH4NO3
Glu: glucose, CNM: cao nấm men, LN: lõi ngô, BM: bã mía, VL: vỏ lạc, VCP: vỏ cà phê, TC:
trấu cám, CMC: cacboxyl methyl cellulose, VQ: vỏ quyết, TB: tinh bột, BS: bã sắn, BN: bột ngô
3.5.1.8. Môi trường thay thế
Từ những kết quả trên, chúng tôi lựa chọn môi trường từ các nguyên liệu có sẵn trong tự nhiên bằng
cách giữ nguyên các thành phần khoáng trong môi trường MT, thay pepton bằng bột đậu tương, thay cao
nấm men bằng bột ngô với nồng độ 0,5%; nồng độ casein là 1,5%. Khả năng sinh tổng hợp protease từ
nấm L. lecanii VTCC-F-1037 trong môi trường thay thế tăng 2,3 lần so với môi trường ban đầu.
Như vậy, khi sử dụng môi trường từ một số nguyên liệu rẻ tiền có sẵn ở Việt Nam như: bột đậu
tương, bột ngô để nuôi cấy chủng nấm L. lecanii VTCC-F-1037 thì hoạt tính protease sinh ra cao hơn so
với môi trường ban đầu. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong thực hiện mục tiêu tạo ra một lượng lớn
protease qua đó góp phần làm giảm giá thành các chế phẩm protease trên thị trường hiện nay.
3.5.2. Tinh sạch và đánh giá tính chất của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
3.5.2.1. Tinh sạch protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
Protease được tạo ra từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 trong môi trường nuôi cấy là 5,62 U/ml
(34,33 U/mg protein) sau 144 giờ nuôi cấy. Enzyme tổng số được rủa với muối ammonium sulfate 65%,
sau đó thẩm tách loại muối và cho qua cột Sephadex G100. Thông qua bước tủa muối ammonium
sulfate, protease thu được có hoạt tính riêng đạt 87,51 U/mg protein với độ sạch 1,2 lần và hiệu suất thu
hồi đạt 81%. Protease sau đó được cho qua cột Sephadex G-100, hoạt tính enzyme tinh sạch đạt 78,73
U/mg; độ sạch đạt 2,3 lần và hiệu suất thu hồi đạt 17% (Bảng 3.4). Protease tổng số và các phân đoạn
tinh sạch được điện di trên SDS-PAGE thu được một băng protein duy nhất với kích thước khoảng 40
kDa khi nhuộm với AgNO3 0,1% (Hình 3.13A, giếng 2-4).
Bảng 3.4. Các bước tinh sạch protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
Mẫu
Enzyme tổng số
65% (NH4)2SO4
Qua cột G100
Protein tổng
số (mg)
9,95
6,62
0,75
Hoạt tính tổng số
(U/ml)
342,1
276,4
59,0
Hoạt tính riêng
(U/mg)
4,38
41,78
78,73
Độ
sạch
1
1,2
2,3
Hiệu suất thu
hồi (%)
100
81
17
13
Hoạt tính của protease tổng số và các phân đoạn qua cột được định tính trên đĩa thạch có chứa cơ
chất casein 0,5%. Kết quả nhận thấy, trên đĩa thạch xuất hiện vòng phân giải màu trắng của protease khi
thủy phân casein được nhuộm với Coomassie Brilliant Blue R-250 (Hình 3.13B). Như vậy, chúng tôi đã
tinh sạch được protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037.
B
A
Hình 3.13. Điện di SDS-PAGE của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 thông qua cột
Sephadex G-100 (A) và định tính protease trên đĩa cơ chất casein khi nhuộm bằng Coomassie
Brilliant Blue R-250 (B)
Giếng 1/vòng 1: enzyme tổng số; giếng/vòng 2-4: các phân đoạn qua cột Sephadex G100; giếng 5: marker
3.5.2.2. Nhiệt độ và pH tối ưu của protease từ nấm L. Lecanii VTCC-F-1037
Hoạt tính protease tăng dần từ 62% (44,24 U/mg) ở 30°C đến tối đa (71,53 U/mg) ở 40°C, giảm
mạnh xuống 78% (55,56 U/mg) ở 50°C và giảm xuống 64,5 U/mg (10%) ở 70°C. Như vậy, nhiệt độ tối
ưu cho protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 hoạt động là 40°C (Hình 3.14A).
Hoạt tính enzyme của protease được xác định ở dải pH khác nhau trong đệm khác nhau. Kết quả
cho thấy, protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 hoạt động ở dải pH rộng từ 4,0-8,0. Hoạt tính
protease không thay đổi từ 20% (đạt 29,72 U/mg) ở pH 4,0 đến 48% (đạt 72,85 U/mg) ở pH 4,5; tiếp
theo tăng lên 79% (đạt 118,86 U/mg) ở pH 5,5 và đạt cực đại 100% (đạt 151,32 U/mg) ở pH 6,0; sau đó
tăng đến 61% (đạt 92,41 U/mg ở pH 6,5). Đệm tốt nhất cho protease hoạt động là đệm phosphat và pH
tối đa cho enzyme hoạt động là pH 6.0 với hoạt tính đạt 151,32 U/mg (Hình 3.14B).
A
B
Hình 3.14. Nhiệt độ tối ưu (A) và pH tối ưu (B) của protease từ L. lecanii VTCC-F-1037
3.5.2.3. Độ bền nhiệt và độ bền pH của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
Protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037 bền ở nhiệt độ 30°C sau ủ 10 giờ và hoạt tính enzyme
duy trì trên 80% hoạt tính ban đầu. Hoạt tính protease duy trì trên 80% ở 35 và 40°C sau ủ 2 giờ. Hoạt
14
tính protease giảm đáng kể sau 4 và 10 giờ ủ và giảm mạnh sau 12 giờ ủ (Hình 3.15A). Enzyme bền ở
pH 6,0 sau ủ trong 8 giờ và duy trì trên 80% hoạt tính so với ban đầu. Ở pH thấp (5,0) hoặc cao hơn
pH (7,0) hoạt tính protease giảm đáng kể trong khoảng thời gian ủ từ 4-12 giờ, hoạt tính duy trì
khoảng 36% so với đối chứng (Hình 3.15B).
A
B
Hình 3.15. Độ bền nhiệt (A) và độ bền pH (B) của protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-1037
Mục đích của nghiên cứu này là xác định nhiệt độ, pH tối ưu, cũng như độ bền nhiệt và độ bền
pH cho protease được sử dụng trong quá trình tạo chế phẩm sinh học. Từ những kết quả đã công bố,
chúng tôi có thể xác nhận protease từ nấm L. lecanii VTCC-F-037 khá bền bới nhiệt và có thể dự trữ ở
nhiệt độ phòng và thuận lợi trong quá trình nghiên cứu enzyme; đặc biệt là nghiên cứu tạo chế phẩm
sinh học.
3.6. Thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh hại cây trồng bởi phức hệ chitinase/protease định
hướng tạo chế phẩm diệt nấm bệnh
Phức hệ chitinase/protease có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum và
R. solani. Đường kính vòng ức chế của 2 chủng nấm này lần lượt là 5,4 và 4,4 mm, trong khi ở giếng
đối chứng (bổ sung nước) không xuất hiện vòng ức chế (Hình 3.16).
A
B
Hình 3.16. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum (A) và R. solani (B) bởi phức hệ
protease/rmchit1. Giếng 1: nước, giếng 2-5: phức hệ protease/rmchit1
Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 160 lần cho thấy, sự ức chế quá trình phát triển sợi nấm
bởi chitinase đi kèm với sự thủy phân sợi nấm và giải phóng các tế bào riêng lẻ, trong khi sợi nấm được
xử lý với nước vẫn duy trì hình dạng (Hình 3.17). Lượng đường N-acetyl glucosamine giải phóng khi xử
lý nấm F. oxysporum và R. solani với chitinase/protease được xác định lần lượt là 11,07 và 9,18 μg/ml.
