Tinh sạch, nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa và tác dụng sinh học của polisaccarit từ lá cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk (Luận văn thạc sĩ)

br

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ VÂN ANH

Tinh sạch, nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa
và tác dụng sinh học của polisaccarit từ lá cây Xuân Hoa
Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ VÂN ANH

Tinh sạch, nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa
và tác dụng sinh học của polisaccarit từ lá cây Xuân Hoa
Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số

: 6042 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. VÕ HOÀI BẮC

HÀ NỘI - 2017


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh
LỜI CẢM ƠN

Trong lời đầu tiên của luận văn Thạc sỹ Khoa học này, em muốn gửi
những lời biết ơn chân thành của mình tới tất cả những người đã hỗ trợ, giúp
đỡ em về chuyên môn, vật chất và tinh thần trong quá trình thực hiện luận văn
này.
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo TS. Võ Hoài Bắc,
Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam, người thầy đã trực
tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, nhận xét và giúp đỡ em tận tình trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Em xin cảm ơn các thầy, cô Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam, đơn vị đào tạo và bồi dưỡng sau đại học,
những người đã dạy dỗ, chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu vừa qua.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè và các thành
viên trong khóa đào tạo Thạc sỹ K19 đã luôn đồng hành, giúp đỡ và động viên
em rất nhiều trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Do thời gian thực hiện có hạn, kiến thức chuyên môn còn nhiều hạn chế
nên luận văn của em thực hiện không tránh khỏi những thiếu sót nhất định.
Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy, cô và các bạn để em có thể
hoàn thiện luận văn tốt nghiệp của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2017

Học viên

Trần Thị Vân Anh


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................... Error! Bookmark not defined.
Đặt vấn đề..............................................................Error! Bookmark not defined.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài............................Error! Bookmark not defined.
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......... Error! Bookmark not defined.
1.1. Polisaccarit ..............................................Error! Bookmark not defined.
1.2 Vai trò sinh học và tác dụng của polisaccarit thực vật ............... Error!
Bookmark not defined.
1.3

Giới

thiệu

chung

về

cây

Xuân

Hoa

Pseuderanthemum

palatiferum .......................................................... Error! Bookmark not defined.
1.4. Khái niệm viêm ......................................Error! Bookmark not defined.
1.5. Vai trò của đại thực bào (macrophage) trong đáp ứng viêm ... Error!
Bookmark not defined.
1.6. Vai trò của các cytokine trong đáp ứng viêmError! Bookmark not
defined.
PHẦN II ..................................................... Error! Bookmark not defined.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not
defined.
2.1. Vật liệu .....................................................Error! Bookmark not defined.
2.1.1. Nguyên liệu thực vật ..................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị ........................................... Error! Bookmark not defined.

2.2. Phương pháp nghiên cứu......................Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Xử lý nguyên liệu........................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Các phản ứng định tính đặc trưng...............................................21
2.2.3. Định lượng polisaccarit bằng phương pháp phenol - sunfuric axit
(Dubois, 1956)........................................................... Error! Bookmark not defined.


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh

2.2.4. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu chiết rút polisaccarit .Error! Bookmark

not defined.

2.2.5. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry...............24
2.2.6. Phương pháp tinh sạch polisaccarit ........... Error! Bookmark not defined.
2.2.7. Phân tích độ sạch của chế phẩm polisaccarit bằng phổ UV ......... Error!
Bookmark not defined.

2.2.8. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC xác định độ sạch và trọng
lượng phân tử của polisaccarit. ............................. Error! Bookmark not defined.
2.2.9. Xác định độ nhớt polisaccarit ..................... Error! Bookmark not defined.
2.2.10. Xác định ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tới chất lượng của chế
phẩm polisaccarit. .................................................. Error! Bookmark not defined.
2.2.11. Phương pháp xác định mức ảnh hưởng của polisaccarit lên khả
năng sống sót của đại thực bào.............................. Error! Bookmark not defined.
2.2.12. Phương pháp định lượng nồng độ cytokine IL-6 và TNF-α ....... Error!
Bookmark not defined.

2.2.13. Xác định hoạt tính quét các gốc tự do sử dụng phương pháp DPPH
.................................................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.14. Đánh giá tác dụng làm lành vết thương trên tế bào nguyên sợi da
người theo phương pháp của Laing ..................... Error! Bookmark not defined.
2.2.15. Thử nghiệm tác dụng của chế phẩm polisaccarit trên chuột được
tiêm cyclophosphamide .......................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.16. Phân tích thống kê ...................................... Error! Bookmark not defined.

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.
3.1. Định tính nhận biết polisaccarit và polisaccarit peptic trong nguyên
liệu............................................................... Error! Bookmark not defined.
3.2. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu chiết rút polisaccarit ............ Error!
Bookmark not defined.

3.2.1. Lựa chọn dung môi chiết rút hiệu quả polisaccaritError! Bookmark not
defined.

3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết rút polisaccarit ....... Error!
Bookmark not defined.

3.2.3. Thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit ....... Error! Bookmark not defined.


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh

3.2.4. Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi thích hợp chiết rút polisaccarit ... Error!
Bookmark not defined.

3.3. Tinh sạch polisaccarit ........................ Error! Bookmark not defined.
3.4. Nghiên cứu một số tính chất của polisaccarit tinh sạch. ......... Error!
Bookmark not defined.
3.4.1. Xác định độ sạch và trọng lượng phân tử của chế phẩm polisaccarit
.................................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.4.2. Xác định độ nhớt của chế phẩm polisaccarit......... Error! Bookmark not
defined.

3.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tới chất lượng của chế phẩm
polisaccarit. ............................................................... Error! Bookmark not defined.

3.5. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của polisaccarit tinh sạch được
từ lá Xuân Hoa P. palatiferum.................. Error! Bookmark not defined.
3.5.1. Xác định hoạt tính quét các gốc tự do ....... Error! Bookmark not defined.

3.5.2. Đánh giá hoạt tính độc tố của polisaccarit tới khả năng sống của tế
bào macrophage....................................................... Error! Bookmark not defined.
3.5.3. Đánh giá ảnh hưởng của polisaccarit đến sự giải phóng cytokine
.................................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.5.4. Đánh giá tác dụng làm lành vết thương trên tế bào nguyên sợi da
người .......................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.5.5. Đánh giá khả năng tăng cường miễn dịch của polisaccarit từ từ cây
Xuân Hoa P. Palatiferum ....................................... Error! Bookmark not defined.

PHẦN IV .................................................................................................... 58
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 58
4.1. Kết luận ............................................................................................................. 58
4.2. Đề nghị .............................................................................................................. 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 59


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Xây dựng đồ thị chuẩn glucoz ................................................. 22
Bảng 2.2. Xây dựng đồ thị chuẩn protein theo phương pháp Lowry .. 25
Bảng 3.1. Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit và polisaccarit
peptic .......................................................................................................... 34
Bảng 3.2. So sánh phương pháp loại protein bằng Sevag và TCA ...... 41
Bảng 3.3. Hoạt tính polisaccarit các phân đoạn qua cột Sephadex G100 ..... 42

Bảng 3.4. Các bước tinh sạch polisaccarit từ lá cây Xuân Hoa P.
Palatiferum ................................................................................................. 42

Bảng 3.5. Xác định hoạt tính quét các gốc tự do sử dụng phương pháp
DPPH .......................................................................................................... 49
Bảng 3.6. Sự thay đổi trọng lượng của chuột trong 5 ngày thí nghiệm 55
Bảng 3.7. Trọng lượng tương đối của tuyến ức, lách, hàm lượng
hemoglobin (Hb), số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu (BC) .................. 56


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees)
Radlk .......................................................................................................... 11
Hình 3.1. Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit............................. 35
Hình 3.2. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng polisaccarit 36
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polisaccarit chiết xuất
..................................................................................................................... 37
Hình 3.4. Thời gian tối ưu chiết rút polisaccarit. ................................... 38
Hình 3.5. Tỷ lệ dung môi thích hợp chiết rút polisaccarit. ................... 39
Hình 3.6. Sắc ký qua cột Sephadex G100................................................ 41
Hình 3.7. Sơ đồ tinh sạch chế phẩm polisaccarit ................................... 44
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng của polisaccarit chiết
từ lá cây Xuân Hoa .................................................................................... 45
Hình 3.9. Phổ sắc ký thẩm thấu gel GPC của polysaccharit tinh sạch từ
cây Xuân Hoa P. palatiferum .................................................................... 46
Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH đến chế phẩm polisaccarit ................... 47
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm
polisaccarit ................................................................................................. 48
Hình 3.12. Ảnh hưởng của polisaccarit lên khả năng sống chết của tế

bào RAW264.7 ........................................................................................... 50
Hình 3.13. Ảnh hưởng của polisaccarit tinh sạch trên sự giải phóng .. 51
của IL-6 ...................................................................................................... 51
Hình 3.14. Ảnh hưởng của polisaccarit tinh sạch trên sự giải phóng của
TNF-α ......................................................................................................... 52


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh

Hình 3.15. Hình ảnh trên kính hiển vi sự hàn gắn vết rạch trên nguyên
bào sợi của polisaccarit ............................................................................. 53
Hình 3.16. Mức độ hàn gắn vết rạch của polisaccarit XH trên nguyên bào sợi
..................................................................................................................... 54


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

A490

: Bước sóng 490

A660

: Bước sóng 660

BSA

: Bovine Seurum Albumin

CY

: Cyclophosphamide

DPPH

: 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl

HPLC

: High performance liquid chromatography

IL-6

: interleukin-6

MTT

: [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]

OD

: Optical Density

TCA

: trichloroacetic acid

TNFα

: Tumor necrosis factor-alpha


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh
MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề
Polisaccarit là hợp chất hydrate carbon cao phân tử do nhiều gốc
monosaccharide kết hợp với nhau. Nhiều polisaccarit khác nhau trong thực vật
đã được các tác giả trên thế giới nghiên cứu chứng minh tác dụng trong Y học:
kháng viêm, phân hủy fibrin, làm lành vết thương... (Fujiwara 1984; Wong,
1994, Dourado, 2004 ; Chan, 2007). Các polisaccarit như: Beta-glucans
(Vetvicka, 2008), pectin (Puhlann, 1992; Lim, 2003), chất nhày (nhóm
galactomannan) (Santander, 2011; Hussein, 1998) có tác dụng tăng cường miễn
dịch, kháng viêm cao. Các pectin từ thực vật có tác dụng kháng viêm, giảm các
cytokine tiền viêm ở chuột khi tiêm LPS (Ovodova, 2009; Sherry, 2010).
Fucans, một polisaccarit từ tảo Lobophora variegate có khả năng kháng viêm,
giảm sự giải phóng các TNFα (Almino, 2011). Tại Việt Nam, các bệnh về viêm,
điều trị các vết thương thường sử dụng các thuốc hóa học tổng hợp, cần phải
điều trị dài ngày và thường gây hiệu quả phụ cho sức khỏe người bệnh. Vì vậy,
hướng nghiên cứu và sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên trong Y,
Dược đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và Việt
Nam bởi việc sử dụng các thuốc có nguồn gốc thảo dược sẽ giảm tác dụng phụ
và chi phí điều trị.

Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy trong lá cây Xuân Hoa
Pseuderanthemum palatiferum chứa hàm lượng cao polisaccarit. Cây Xuân
Hoa P. palatiferum (Nees) Radlk thuộc họ Ôrô Acanthaceae được dùng trong
dân gian Việt Nam để chữa nhiều bệnh. Trong khoảng 15 năm gần đây, nhiều
nhà khoa học Việt Nam và thế giới đã xác minh được một số tác dụng sinh học
của lá cây thuốc này như: kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống oxi hóa,
giảm huyết áp, hạ đường huyết... Tuy nhiên việc nghiên cứu cấu trúc, đặc tính
và tác dụng dược lý chỉ tập trung vào nhóm các chất như: flavonoids, phytol,

1


Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Thị Vân Anh

triterponoid saponin, stigmasterol, salicylic acid… Cho đến nay chưa có công
bố nào nghiên cứu về các đặc tính sinh hóa và tác dụng dược lý của polisaccarit
từ cây thuốc Xuân Hoa P. palatiferum.
Trong khóa luận này, chúng tôi sẽ nghiên cứu các điều kiện tách chiết,
tinh sạch và xác định các tính chất sinh hóa và một số tác dụng dược lý (kháng
viêm, điều hòa miễn dịch và làm lành vết thương của polisaccarit từ cây thuốc
này). Các kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung những thông tin
khoa học mới về cây thuốc quý của Việt Nam, đồng thời có thể đáp ứng được
nhu cầu sử dụng nguồn dược liệu trong nước với giá thành rẻ để phục vụ nhân
dân.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
•

Chiết rút và tinh sạch được polisaccarit từ lá cây thuốc Xuân Hoa P.

palatiferum (Nees) Radlk có độ sạch đạt trên 90%.
•

Xác định được một số đặc tính sinh hóa như: độ sạch, độ nhớt, trọng

lượng phân tử của polisaccarit, ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến chất lượng
của chế phẩm polisaccarit tinh sạch.
•

Điều tra một số tác dụng dược lý (tác dụng kháng viêm, tăng cường

miễn dịch và làm lành vết thương) của polisaccarit từ cây thuốc này.

2


Luận văn đủ ở file: Luận văn full