Xác định đặc điểm kháng thuốc của HIV trên bệnh nhân đang điều trị ARV phác đồ bậc 2 tại bệnh viện bệnh nhiệt đới trung ương

HỌ VÀ TÊN HỌC VIÊN : NGUYỄN THỊ HÒA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
---------------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI:
XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THUỐC CỦA HIV TRÊN BỆNH NHÂN
ĐANG ĐIỀU TRỊ ARV PHÁC ĐỒ BẬC 2 TẠI
BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG

KHÓA HỌC: 2015-2017

NGUYỄN THỊ HÒA

Hà Nội, 01/2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
---------------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ
ĐỀ TÀI:
XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THUỐC CỦA HIV TRÊN BỆNH NHÂN
ĐANG ĐIỀU TRỊ ARV PHÁC ĐỒ BẬC 2 TẠI
BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60420201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. LÊ VĂN DUYỆT
HỌC VIÊN THỰC HIỆN

: NGUYỄN THỊ HÒA

Hà Nội, 01/2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của Tiến sỹ Lê Văn Duyệt. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung
thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Học viên

Nguyễn Thị Hòa


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành bày tỏ kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Lê Văn Duyệt
đã tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và
hoàn thành luận văn này. Toàn bộ nội dung nghiên cứu trong khóa luận này được
thực hiện và hoàn thành tại Phòng khám ngoại trú, Khoa Xét nghiệm của Bệnh viện
Bệnh Nhiệt đới Trung ương. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập

thể cán bộ trong khoa.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa
Sau đại học – Viện đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp và gia đình đã luôn
quan tâm giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành khóa
luận này.

Hà Nội, Ngày… tháng 01 năm 2018
Học viên

Nguyễn Thị Hòa


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... 1
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................... 2
1.1. Tổng quan về Human Immunodeficiency Virus (HIV) ................................... 2
1.1.1. Tác nhân gây bệnh .................................................................................. 2
1.1.2. Dịch tễ học .............................................................................................. 2
1.1.3. Sinh bệnh học của HIV ........................................................................... 5
1.2. Tình hình điều trị ARV tại Việt Nam.............................................................. 7

1.3. Các phác đồ điều trị HIV ở Việt Nam ............................................................. 8
1.4. Kháng thuốc của HIV ..................................................................................... 9
1.4.1. Khái niệm về HIV kháng thuốc ............................................................... 9
1.4.2. Các loại đột biến kháng thuốc thường gặp ............................................. 10
1.4.3. Các yếu tố liên quan đến đề kháng ........................................................ 11
1.5. Chẩn đoán kháng thuốc ................................................................................. 11
CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 14
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 14
2.2. Trang thiết bị, vật liệu nghiên cứu ................................................................ 14
2.2.1. Trang thiết bị ......................................................................................... 14
2.2.2. Vật liệu ................................................................................................. 14
2. 3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 16
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................... 16
2.3.2. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................... 16
2.3.3. Các bước tiến hành ................................................................................ 17


iv

2.4. Nhập, quản lý và xử lý số liệu ....................................................................... 25
2.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................... 25
2.6. Đạo đức trong nghiên cứu ............................................................................ 25
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ ....................................................................................... 26
3.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu ......................................... 26
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới........................................................................ 26
3.1.2. Đặc điểm đường lây truyền và thời gian nhiễm HIV.............................. 27
3.2 . Đặc điểm của bệnh nhân thất bại điều trị bậc phác đồ bậc 1 ........................ 28
3.2.1 Số lượng CD4 và tải lượng vi rút của bệnh nhân thất bại điều trị phác
đồ bậc 1 ............................................................................................................... 28

3.2.2. Tuân thủ phác đồ điều trị của các bệnh nhân HIV ................................. 29
3.2.3. Đột biến điểm liên quan đến kháng thuốc phác đồ bậc 1 của HIV ......... 29
3.2.4. Đặc điểm đề kháng thuốc ARV phác đồ bậc 1 của HIV......................... 31
3.3. Đặc điểm kháng thuốc của HIV ở các bệnh nhân đang điều trị phác đồ bậc 2 .......34
3.3.1 Số lượng tế bào CD4 và tải lượng vi rút ................................................. 34
3.3.2 Kết quả xác định đột biến liên quan đến đề kháng ARV phác đồ bậc 2... 35
3.3.3. Mối liên quan giữa tần xuất đột biến và mức độ kháng ARV bậc 2 ....... 36
3.3.4. Mối liên quan giữa tần xuất mang đột biến và một số yếu tố liên quan .. 37
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN ..................................................................................... 40
4.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu ........................................ 40
4.2. Đặc điểm về tình trạng miễn dịch và vi rút học của bệnh nhân thất bại điều
trị ARV phác đồ bậc 1 ......................................................................................... 42
4.3. Đột biến điểm liên quan đến kháng thuốc ARV phác đồ bậc 1, một số đặc
điểm và so sánh các yếu tố liên quan ................................................................... 44
4.4. Đột biến điểm liên quan đến kháng thuốc ARV phác đồ bậc 2, một số đặc
điểm và so sánh các yếu tố liên quan ................................................................... 47
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 52
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 54


v

BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết
tắt
HIV

Từ gốc tiếng Anh

Từ gốc tiếng Việt

Human immunodeficiency
virus
Acquired Immunodeficiency
Syndrome
Antiretroviral

Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở
người
Hội chứng suy giảm miễn dịch
mắc phải
Kháng retro vi rút

PIs
3TC
ABC
AZT

Nonnucleoside reverse
transcriptase inhibitors
Nucleoside reverse
transcriptase inhibitors
Protease inhibitors
Lamivudine
Abacavir
Zidovudine

Nhóm thuốc ức chế men sao chép
ngược non-nucleoside

Nhóm thuốc ức chế men sao chép
ngược nucleoside
Nhóm thuốc ức chế protease
Thuốc ARV
Thuốc ARV
Thuốc ARV

d4T

Stavudine

Thuốc ARV

ddI

Didanosine

Thuốc ARV

EFV

Efavirenz

Thuốc ARV

ETR

Etravirine

Thuốc ARV

FTC

Emtricitabine

Thuốc ARV

NVP

Nevirapine

Thuốc ARV

TDF

Tenofovir

Thuốc ARV

AIDS
ARV
NNRTIs
NRTIs

BN
KTC
DNA
RT
TAM
WHO

PCR
PR
TLVR

Confidence interval
Ribonucleic acid
Reverse transcriptase
Thymidine analogue
mutations
World Health Organization
Polymerase Chain Reaction
Prot - Gen protease

Bệnh nhân
Khoảng tin cậy

Tổ chức Y tế Thế giới
Phản ứng chuỗi trùng hợp
Gen prot
Tải lượng vi rút


vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Các cặp mồi đặc hiệu cho các gen mã hóa RT và PR (tài liệu tham khảo).. 15
Bảng 3.2: Đánh giá bệnh nhân tuân thủ điều trị ARV phác đồ bậc 1 .......................... 29
Bảng 3.3: Đột biến điểm liên quan đến đề kháng thuốc ARV nhóm NRTIs ............... 29
Bảng 3.4: Tỷ Đột biến điểm liên quan đến đề kháng thuốc ARV nhóm NNRTIs ....... 30
Bảng 3.5: Mối liên quan giữa điều trị các bệnh đồng nhiễm và tần xuất mang đột

biến kháng thuốc nhóm NNRTIs ................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.6: Mối liên quan giữa điều trị các bệnh đồng nhiễm và tần xuất mang đột
biến kháng thuốc nhóm NRTIs .................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.7: Tần xuất mang đột biến kháng ARV nhóm NRTIs, NNRTIs và PIs của
bệnh nhân đang điều trị phác đồ bậc 2 (n=6).............................................................. 35
Bảng 3.11: Mối liên quan giữa tuân thủ điều trị và tần xuất mang đột biến (n=6) ...... 37
Bảng 3.12: Mối liên quan giữa tần xuất mang đột biến kháng ARV bậc 2 và điều trị
các bệnh đồng nhiễm ................................................................................................. 39


vii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Phân bố giới tính trong nhóm bệnh nhân ............................................... 26
Biểu đồ 3.2: Phân bố độ tuổi của các bệnh nhân trong nghiên cứu ............................. 26
Biểu đồ 3.3: Các con đường lây truyền HIV của bệnh nhân trong nghiên cứu ........... 27
Biểu đồ 3.4: Thời gian nhiễm HIV của các bệnh nhân trong nghiên cứu ................... 27
Biểu đồ 3.5: Số lượng tế bào CD4 của bệnh nhân thất bại điều trị bậc 1 .................... 28
Biểu đồ 3.7: Đặc điểm đề kháng thuốc nhóm NRTIs ................................................. 31
Biểu đồ 3.8: Đặc điểm đề kháng thuốc nhóm NNRTIs .............................................. 31
Biểu đồ 3.9: Mối liên quan giữa thời gian điều trị và tần xuất mang đột biến kháng
nhóm NNRTIs ........................................................................................................... 32
Biểu đồ 3.10: Mối liên quan giữa thời gian điều trị và tần xuất mang đột biến kháng
nhóm NRTIs .............................................................................................................. 33
Biểu đồ 3.11: Số lượng CD4 của nhóm bệnh nhân đang điều trị ARV phác đồ bậc 2. 34
Biểu đồ 3.13: Mối liên quan giữa đột biến và mức độ kháng ARV bậc 2 nhóm NRTIs ......36
Biểu đồ 3.14: Mối liên quan giữa đột biến và mức độ kháng ARV bậc 2 nhóm
NNRTIs ..................................................................................................................... 37
Biểu đồ 3.15: Mối liên quan giữa đột biến và mức độ kháng ARV bậc 2 nhóm PIs ... 37
Biểu đồ 3.16: Mối liên quan giữa thời gian điều trị ARV bậc 2 và tần xuất mang đột

biến kháng thuốc nhóm NRTIs .................................................................................. 38
Biểu đồ 3.17: Mối liên quan giữa thời gian điều trị ARV bậc 2 và tần xuất mang đột
biến kháng thuốc nhóm NNRTIs ............................................................................... 39
Biểu đồ 3.18: Mối liên quan giữa thời gian điều trị ARV bậc 2 và tần xuất mang đột
biến kháng thuốc nhóm PIs........................................................................................ 39


viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Vòng đời của HIV với các điểm hoạt động của nhiều nhóm thuốc kháng vi
rút ................................................................................................................................ 5
Hình 2.1: Hình ảnh giải trình tự nucleotide gen PR của bệnh nhân số 23 và kết quả
tìm đột biến kháng thuốc của gen PR trên ngân hàng dữ liệu HIV của đại học
Stanford ..................................................................................................................... 25


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tại các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, HIV/AIDS vẫn là nguyên
nhân hàng đầu gây ra gánh nặng bệnh tật và tỷ lệ tử vong cao. Theo báo cáo của
Cục Phòng, chống HIV/AIDS, Bộ Y tế, tính đến quý 3 năm 2017 số người nhiễm
HIV hiện được báo cáo đang còn sống là 208,371 trường hợp, trong đó chỉ quản lý
được 80% số bệnh nhân này [1].
Thuốc kháng vi rút (ARV) ra đời đã mang lại niềm hy vọng cho các bệnh nhân
HIV/AIDS. Thuốc ARV hiện sử dụng để điều trị HIV type 1 (HIV-1) được phân
thành ba nhóm dựa vào chức năng: 1) Các chất ức chế quá trình phiên mã ngược sợi
ARN genome của vi rút thành phân tử ADN, 2) Các chất ức chế enzyme protease
của vi rút [2], 3) Các chất ức chế sự nhập bào của các hạt vi rút HIV vào các tế bào

đích (CD4). Việc kết hợp nhiều loại thuốc ARV trong điều trị HIV được gọi là liệu
pháp điều trị kháng vi rút hoạt tính cao (HAART) [16].
Tuy nhiên, điều trị HIV/AIDS phải duy trì suốt đời, trong thời gian dài, bệnh
nhân phải đối mặt với nhiều thách thức như tuân thủ điều trị, tác dụng phụ của
thuốc, và đặc biệt là tình trạng kháng thuốc của HIV ngày càng tăng. HIV đã đề
kháng thuốc ARV phác đồ bậc 1 ở mức rất độ cao, nhiều bệnh nhân chuyển sang
điều trị ARV phác đồ bậc 2 cũng đã xuất hiện đề kháng ngày càng nhiều. Trong khi
đó các hướng dẫn điều trị cho những bệnh nhân thất bại điều trị cả phác đồ bậc 1 và
bậc 2 còn rất hạn chế và nguồn lực rất eo hẹp. Do vậy việc tìm hiểu các yếu tố liên
quan, đặc điểm đề kháng và phương pháp chẩn đoán HIV kháng thuốc là cần thiết
để tìm hiểu nguyên nhân thất bại điều trị và đặc điểm đề kháng, từ đó đưa ra dự báo
và đề xuất các giải pháp phù hợp cho việc điều trị ARV hiệu quả hơn. Trên cơ sở
đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định đặc điểm kháng thuốc của HIV trên
bệnh nhân đang điều trị ARV phác đồ bậc 2 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
Trung ương” với các mục tiêu sau:
Tìm hiểu các yếu tố liên quan và xác định đặc điểm kháng thuốc, mức độ
kháng thuốc của HIV trên những bệnh nhân đang được điều trị ARV phác đồ bậc 2
tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.


2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Human Immunodeficiency Virus (HIV)
1.1.1. Tác nhân gây bệnh
Căn nguyên gây hội chứng suy giảm miễn dịch ở người (Human
Inmmunodeficiency Virus - HIV) là một vi rút thuộc chi Lentivirus, họ
Retroviridae. Tương tự như một số loài vi rút khác, HIV có cấu tạo genome là
ARN, tuy nhiên điểm khác biệt mà HIV có được đó là chúng phiên mã ngược sợi
ARN thành ADN sợi đôi ở ngoài tế bào chất dưới sự xúc tác của enzyme phiên mã

ngược (reverse transcriptase), sau đó di chuyển vào trong nhân để gắn xen vào trong
hệ genome của người [17]. Nhờ sở hữu đặc tính này mà HIV có thể nhân lên với tốc
độ rất nhanh và rất khó tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch của con người. Ngoài ra, do
việc phải trải qua giai đoạn phiên mã ngược để tổng hợp sợi đổi ADN, sau đó sử
dụng hệ thống sinh học của tế bào chủ lại phiên mã ra sợi ARN để tạo ra hạt vi rút
mới, vì vậy mà HIV thường xảy ra đột biến và có tính đa dạng di truyền cao. Đã xác
định được hai loại HIV gây bệnh chính ở người bao gồm HIV-1 và HIV-2, tỷ lệ gây
bệnh của hai loại HIV này có nhiều sự khác biệt, HIV-1 là căn nguyên gây bệnh chủ
yếu và thường gặp nhất trên thế giới và cũng là loại có độc tính rất cao. Trong khi
đó HIV-2 chủ yếu gây bệnh ở một số khu vực của lục địa Châu Phi, rất hiếm khi
gặp những ca bệnh mà do HIV-2 là căn nguyên và thường chúng có độc lực thấp
hơn, do đó thời gian ủ bệnh dài hơn tuy nhiên chúng vẫn gây ra các triệu chứng lâm
sàng điển hình khi chuyển sang giai đoạn AIDS như HIV-1. Cả hai loại HIV-1 và
HIV-2 đều có cấu tạo tương tự nhau, bao gồm lớp vỏ ngoài bao bọc bên trong lõi là
hai phân tử ARN đơn dương , trong lõi chứa 2 phân tử ARN đơn là bộ gen di truyền
của HIV (genome), có khả năng tích hợp vào DNA của tế bào vật chủ [18]. Điều
này gây khó khăn lớn cho vật chủ để quét sạch vi rút, vì genome tiền vi rút có thể
tồn tại mà không bị hệ thống miễn dịch và tránh được tác động của các chất kháng
vi rút. Vi rút hoàn chỉnh có hình cầu đường kính 80-120 nm.
1.1.2. Dịch tễ học
Dịch HIV xuất hiện trên người sau khi bị nhiễm trùng với một loại vi rút gây
suy giảm miễn dịch ở khỉ và động vật linh trưởng ở Châu Phi [39]. Thợ săn thịt thú


3

rừng là nhóm người đầu tiên được cho là bị nhiễm HIV. Trong đó HIV-1 truyền
bệnh từ khỉ không đuôi và HIV-2 từ khỉ mặt bồ hóng. HIV-1 gồm có bốn nhóm
chính, ba nhóm được truyền bệnh từ loài tinh tinh là M, N, O và một từ khỉ đột (P).
Tuy nhiên nhóm N, O, P bị hạn chế gây bệnh ở khu vực Tây Phi. Ngược lại nhóm

M lại là nguyên nhân chính gây ra đại dịch HIV trên toàn cầu, bắt đầu từ khoảng
100 năm trước. HIV-1 nhóm M bao gồm chín phân nhóm, gồm A-D, F-H, J, K và
subtype C chiếm ưu thế ở châu Phi và Ấn Độ, và chiếm 48% các trường hợp nhiễm
HIV-1 trong năm 2007 trên toàn thế giới. Type B chiếm ưu thế ở Tây Âu, Châu Mỹ,
và Úc. Tuy nhiên việc tái tổ hợp các phân nhóm hiện đang được lưu hành phổ biến
hơn. Sự đa dạng di truyền của HIV-1 là hệ quả tất yếu của phân nhóm đang trở nên
phổ biến hơn. Sự đa dạng di truyền rõ rệt của HIV-1 là một hệ quả của hàm
errorprone của phiên mã ngược, mà kết quả trong một tỷ lệ đột biến cao. HIV-2 tập
trung chủ yếu vào phía Tây châu Phi và gây ra một căn bệnh tương tự như HIV-1,
nhưng suy giảm miễn dịch tiến triển chậm hơn và HIV-2 là ít lây lan. Trong năm
2012 ước tính 35,3 triệu người đang sống với HIV. Vùng hạ Sahara châu Phi, đặc
biệt là miền nam châu Phi, có những gánh nặng HIV toàn cầu cao nhất (70,8%).
Dịch tễ học toàn cầu nhiễm HIV đã thay đổi rõ rệt như một kết quả của sự mở rộng
tiếp cận điều trị ARV, vào năm 2012 có 9,7 triệu người ở các nước thu nhập trung
bình và thu nhập thấp đã bắt đầu điều trị ARV. Tỷ lệ nhiễm HIV trên toàn cầu đã
tăng từ 31,0 triệu người năm 2002, với 35,3 triệu USD trong năm 2012, bởi vì mọi
người đang điều trị thuốc kháng vi rút được sống lâu hơn, trong khi đó tỷ lệ trên
toàn cầu đã giảm từ 3,3 triệu người năm 2002, với 2,3 triệu trong năm 2012 [19].
Việc giảm tỷ lệ nhiễm HIV toàn cầu phần lớn là do giảm lây truyền tình dục khác
giới. Thái độ trừng phạt đối với những người tiêm chích ma túy (đặc biệt là ở Đông
Âu) hạn chế việc thực hiện các điều trị thay thế chất gây nghiện và các chương trình
bơm kim tiêm, đó là chiến lược phòng chống có hiệu quả làm giảm lây truyền HIV.
Tại các vùng đường lây truyền chính là người đàn ông có quan hệ tình dục với nam
giới (ví dụ, Tây và Trung Âu và châu Mỹ), tỷ lệ này là ổn định mặc dù phạm vi điều
trị kháng vi rút cao (ví dụ, 75% ở châu Mỹ Latin vào năm 2012, và 80% trong Anh
vào năm 2010). Các quá trình điều khiển của đại dịch HIV ở nam giới có quan hệ


4

tình dục với nam giới rất phức tạp, và bao gồm các hành vi nguy cơ ngày càng tăng
kể từ khi áp dụng liệu pháp kháng vi rút có hiệu quả (một hiện tượng gọi là lạc quan
trị), truyền nguy cơ cao của giao hợp qua đường hậu môn dễ tiếp thu, mạng tình
dục, và sự kỳ thị hạn chế tiếp cận với chăm sóc.
Số ca nhiễm mới ở trẻ em tại các nước châu Phi ưu tiên trong Chương trình
Liên Hợp Quốc về HIV/AIDS (UNAIDS) kế hoạch toàn cầu giảm 38% giữa năm 2009
và 2012, do việc tiếp cận với thuốc kháng vi rút để ngăn ngừa lây truyền từ mẹ sang
con. Tuy nhiên, dùng thuốc kháng vi rút là thấp hơn nhiều ở trẻ em hơn người lớn.
HIV là một đóng góp lớn vào gánh nặng bệnh tật toàn cầu. Trong năm 2010,
HIV là nguyên nhân gây tàn phế hàng đầu điều chỉnh năm sống trên toàn thế giới
cho những người từ 30-44 năm, và các nguyên nhân thứ năm cho tất cả các lứa tuổi.
Trường hợp tử vong liên quan đến AIDS toàn cầu đạt đỉnh 2,3 triệu USD trong năm
2005, và giảm xuống còn 1,6 triệu 2012. Khoảng 50% của tất cả các trường hợp tử
vong ở những người điều trị ARV ở các nước có thu nhập cao không phải do AIDS.
Trong một nghiên cứu, nguyên nhân chính gây tử vong không liên quan đến AIDS
là căn bệnh ung thư không xác định AIDS (23,5%), bệnh tim mạch (15,7%), và
bệnh gan (14,1%). Những người có HIV có nguy cơ gia tăng 50% của nhồi máu cơ
tim hơn làm người không có HIV sau khi điều chỉnh các yếu tố nguy cơ tim mạch.
Bệnh gan là phổ biến, chủ yếu là do đồng nhiễm viêm gan B và C, trong đó chia sẻ
tương tự đường lây truyền HIV [20].
Lao tiếp tục là một nguyên nhân chính của bệnh tật và tử vong ở thu nhập thấp
và các nước thu nhập trung bình, đặc biệt là ở châu Phi. Kết quả của một nghiên cứu
được thực hiện tại Nam Phi trong thời kỳ điều trị kháng vi rút trước đã cho thấy
rằng bệnh lao tăng gấp đôi trong vòng một năm sau khi nhiễm HIV, sau đó tỷ lệ
tăng như khả năng miễn dịch giảm, và đạt đến một tỷ lệ rất cao 25,7/100 người/năm
ở bệnh nhân với CD4 T-cell đếm thấp hơn 50 tế bào/ml [20]. Trên thế giới, tỷ lệ tử
vong liên quan đến bệnh lao HIV đang giảm dần, nhưng nhiều người có HIV ở châu
Phi chết vì bệnh lao không được chẩn đoán.

5

1.1.3. Sinh bệnh học của HIV
1.1.3.1. Vòng đời của HIV
Sự lây lan trên toàn thế giới của HIV-1 cho thấy vi rút có hiệu quả chống hiện
bẩm sinh, thích ứng, khả năng miễn dịch và nội tại. Mặc dù kích thước hệ gen của
HIV khá khiêm tốn (dưới 10 kb) và chỉ mang có vài gen, HIV-1 rất giỏi trong việc
tận dụng các thành phần có sẵn của tế bào vật chủ, trong khi có khả năng trung hoà
và ẩn mình khỏi sự truy tìm của các tế bào chức năng trong hệ thống miễn dịch.
Vòng đời HIV-1 khá phức tạp, thời gian lây nhiễm và sinh trưởng phụ thuộc
vào loại tế bào mục tiêu và mức độ hoạt hóa tế bào [21].

Hình 1: Vòng đời của HIV với các điểm hoạt động của nhiều nhóm thuốc
kháng vi rút
Trong bước khởi đầu, HIV-1 tăng khả năng bám vào các tế bào mà không gây
ra gây chết tế bào đích ngay lập tức, tuy nhiên quá trình xâm nhập có thể kích thích


6

các tín hiệu nội bào thác, do đó có thể tạo điều kiện cho sự nhân lên của vi rút.
Hai phân tử trên hạt vi rút HIV-1, các glycoprotein bên ngoài (gp120) và các
protein xuyên màng (gp41), hình thành nên các gai trên bề mặt của hạ vi rút. Trong
quá trình xâm nhập, gp120 gắn vào màng tế bào đích bằng cách liên kết với các thụ
thể CD4+. Tương tác tiếp theo giữa vi rút và chemokine đồng thụ thể (ví dụ, CCR5,
CXCR4) kích hoạt sự thay đổi về hình dạng của tế bào đích. Các liên kết thực tế
diễn ra chỉ trong vòng vài phút nhưng có thể tạo ra các lỗ thủng trên bề mặt tế bào
đích và từ đó vi rút bơm phần lõi chứa vật liệu di truyền vào bên trong tế bào chất.
Sau khi cởi áo phần lõi, bộ gen của vi rút được lại phiên mã ngược ra DNA sử dụng
enzyme sao chép ngược của chính vi rút. Tiếp đó, enzyme integrase của vi rút kết

hợp với enzyme sửa chữa DNA vật chủ chèn bộ gen của vi rút vào hệ gen của tế
bào đích. Trong các bước cuối, sản xuất các hạt vi rút cần bộ máy của tế bào vật chủ
điều khiển cũng như định hướng phiên mã và dịch mã. Protein vi rút được vận
chuyển đến và lắp ráp gần với màng tế bào. Hạt vi rút được giải phóng ra từ các tế
bào bằng cách mọc chồi [21].
1.1.3.2. Thuốc ARV dùng trong điều trị HIV
Hiện nay các thuốc ARV dùng trong điều trị HIV đang lưu hành có thể chia
thành một số nhóm dựa vào chức năng tác động của chúng:
Thuốc ARV cổ điển [40]. : bao gồm
-

Thuốc ức chế enzyme sao chép ngược tương tự nucleoside (Nucleoside
reverse transcriptase inhibitors – NRTIs): Lamivudin, stavudin, zizovudin,
emtricitabin didanosin, didanosin, abacavir, tenofovir. Các thuốc này có chức
năng cạnh tranh với các nucleotide tự nhiên, gắn xen vào mạch ADN đang
tổng hợp, qua đó ngăn chặn enzyme RT kéo dài chuỗi ADN mới.

-

Thuốc ức chế enzyme sao chép ngược non-nucleoside (Nonenucleoside
reverse transcriptase – NNRTIs): Nevirapin, efavirenz, delavirdin. Các thuốc
này có chức năng gắn xen trực tiếp vào enzyme RT và ức chế hoạt động sao
chép ngược sợi ARN của vi rút thành ADN.

-

Thuốc ức chế protease (Protease inhibitors – PIs): Raltegravir, elvitegravir,
enfuvirtide. Nhóm này có tác dụng ức chế sự gắn xen sợi ADN của vi rút vào

7

hệ gen của tế bào vật chủ, riêng enfuvirtide có chức năng ngăn cản sự hòa
màng của vi rút vào màng tế bào đích.
Thuốc ARV thế hệ mới [41].: bao gồm
-

Các chất ức chế xâm nhập: gồm ức chế CD4, ức chế đồng thụ thể và ức chế
hòa màng

-

Các chất ức chế tích hợp (Intergrase inhibitors – II)

-

Các chất ức chế trưởng thành (Maturation inhibitors – MI)

1.2. Tình hình điều trị ARV tại Việt Nam
Từ năm 1993 một số bệnh nhân nhiễm HIV tại các bệnh viện trung ương của
các thành phố lớn đã được tiếp cận điều trị ARV thông qua các chương trình viện
trợ hợp tác quốc tế với chính phủ Việt Nam hoặc theo con đường tự túc mua thuốc
mang từ nước ngoài về bán trôi nổi ở ngoài thị 5 trường. Các phác đồ điều trị chủ
yếu dựa vào nguồn thuốc sẵn có và kinh nghiệm của các bác sỹ lâm sàng. Từ đó dẫn
đến việc điều trị với phác đồ chỉ 1 hoặc 2 thứ thuốc như chỉ dùng AZT đơn độc
hoặc AZT kết hợp với 3TC hoặc thậm chí d4T với ddI. Đây cũng là một trong
những nguyên nhân dẫn đến gia tăng thất bại điều trị và kháng thuốc sau này. Sau
thời gian điều trị một hoặc hai loại thuốc kết hợp, người ta đã nhận thấy hiệu quả
điều trị của những phương pháp này không có tính ổn định lâu dài. Trong thời gian
đầu số lượng HIV giảm xuống nhanh chóng kèm theo những cải thiện rõ rệt về lâm

sàng. Trong những năm qua, việc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS bằng thuốc
kháng vi rút (ARV) ở Việt Nam đã có những tiến bộ đáng kể giúp bệnh nhân kéo
dài tuổi thọ, nâng cao chất lượng cuộc sống. Tuy nhiên việc tăng cường tuân thủ,
đánh giá thất bại điều trị và kháng thuốc là việc làm quan trọng luôn được các nhà
lâm sàng đặt ra trong quá trình điều trị nhằm phát hiện sớm và chuyển đổi phác đồ
kịp thời. Từ năm 2005, với sự quyết tâm của Chính phủ và sự giúp đỡ của các tổ
chức quốc tế, các chương trình điều trị thuốc ARV miễn phí bắt đầu được triển 6
khai và liên tục được mở rộng trên toàn quốc. Tính đến tháng 6 năm 2015, toàn
quốc có 312 phòng khám ngoại trú và 526 điểm cấp phát thuốc ARV tại xã/phường;
đang điều trị ARV tại 23 trại giam và 33 Trung tâm. Hiện có 95.752 bệnh nhân
đang điều trị ARV, trong đó 91.156 người lớn, 4.596 trẻ em [6].


8

1.3. Các phác đồ điều trị HIV ở Việt Nam
Theo hướng dẫn của Bộ Y tế năm 2005 phác đồ điều trị ARV bậc 1 [7]:
- Phác đồ ưu tiên: d4T + 3TC + NVP
- Các phác đồ thay thế:
• d4T + 3TC + EFV
• ZDV + 3TC + NVP
• ZDV + 3TC + EFV
Đến năm 2011 các phác đồ điều trị ARV bậc 1 [8].:
- Phác đồ chính: TDF + 3TC + NVP hoặc TDF + 3TC + EFV.
- Phác đồ thay thế: - AZT + 3TC + EFV hoặc AZT +3TC + NVP
Hướng dẫn 2009 của Bộ Y tế Việt Nam đưa ra các lựa chọn phác đồ bậc hai
tùy theo phác đồ bậc một mà bệnh nhân đã sử dụng và bản cập nhật 2011 bổ sung
thêm các lựa chọn do có sự thay đổi các phác đồ bậc một trong giai đoạn hiện nay
với việc ưu tiên sử dụng tenofovir và loại bỏ stavudine trong các phác đồ bậc 1.
Hướng dẫn phác đồ bậc 1 theo hướng dẫn 2009 của Bộ Y tế:

- AZT/d4T + 3TC + NVP
- AZT/d4T + 3TC + EFV
- AZT/d4T + 3TC + ABC
- ABC + 3TC + NVP/EFV
Hướng dẫn phác đồ bậc 2 theo hướng dẫn 2009 của Bộ Y tế:
- ddI + ABC + LPV/r (hoặcATV/r)
- ddI + EFV + LPV/r (hoặc ATV/r)
- ddI + NVP + LPV/r (hoặc ATV/r)
- AZT + 3TC (có thể thêm ddI) + LPV/r (hoặc ATV/r)
- d4T + 3TC + LPV/r (hoặc ATV/r)
Hướng dẫn lựa chọn phác đồ bậc 1 có bổ sung năm 2011[2].:
- TDF + 3TC + NVP/EFV
- AZT + 3TC + NVP/EFV
Hướng dẫn lựa chọn phác đồ bậc 2 có bổ sung năm 2011[8].:
- AZT + 3TC + LPV/r hoặc ATV/r


9

- TDF + 3TC + LPV/r hoặc ATV/r
1.4. Kháng thuốc của HIV
1.4.1. Khái niệm về HIV kháng thuốc
Hai khái niệm quan trọng đối với sự hiểu biết về sự phát triển kháng thuốc.
Đầu tiên, nhiễm HIV được đặc trưng bởi tải lượng vi rút ở mức độ cao. Ở những
bệnh nhân không được điều trị nhất, tổng số hạt vi rút xâm nhập trong các tế bào
bạch huyết được ước tính là khoảng 107 đến 108. Trong giai đoạn mạn tính của
nhiễm HIV, con số này là tương đối ổn định, phản ánh sự cân bằng giữa sự lây
nhiễm các tế bào mục tiêu mới và giải phóng hạt vi rút sau lây nhiễm tế bào. Do
thời gian bán hủy của các tế bào bị nhiễm bệnh là rất ngắn (1-2 ngày), duy trì trạng
thái ổn định này đòi hỏi rằng HIV lây nhiễm tế bào mục tiêu mới với tốc độ rất cao.

Thứ hai, số lượng hạt vi rút trong một người đã bị nhiễm bệnh là rất không đồng
nhất. Các enzyme phiên mã ngược sợi ARN của vi rút thành DNA thường rất dễ bị
lỗi, tỷ lệ lỗi sao chép trung bình trong mỗi lần sao chép của vi rút dao động từ 1-3
đột biến, tuy nhiên các dạng đột biến lặp đoạn, chuyển đoạn, và đảo đoạn cũng có
thể xảy ra. Tỷ lệ nhiễm HIV cao, kết hợp với tỷ lệ đột biến cao xảy ra trong mỗi chu
kỳ nhiễm, dẫn đến tình trạng bệnh nhân có thể mang nhiều chủng vi rút khác nhau,
đa dạng về mức độ đột biến gen. Điều này cho thấy, các đột biến diễn ra có thể tạo
ra ưu thế chọn lọc để vi rút giảm tính nhạy cảm với các loại kháng vi rút. Tốc độ đề
kháng nhanh hay chậm phụ thuộc vào các ưu thế chọn lọc theo các dạng đột biến, tỷ
lệ đột biến trong quần thể vi rút và mức độ tác dụng đích của các loại thuốc kháng
vi rút [14]. Trong phần lớn các trường hợp, vi rút tạo ra sự thay thế các amino acid
để hình thành các đề kháng mức độ cao.
HIV kháng thuốc lây truyền: xảy ra ở các trường hợp trước đó chưa nhiễm
HIV nhưng lại bị nhiễm bởi chủng HIV có kháng thuốc. Thuật ngữ “HIV kháng
thuốc lây truyền” chỉ phù hợp với các trường hợp mới nhiễm HIV. HIV kháng
thuốc lây truyền thường được xác định trong quần thể người nhiễm HIV còn trẻ tại
cơ sở tư vấn xét nghiệm HIV hoặc tại các cơ sở chăm sóc thai nghén; HIV kháng
thuốc lây truyền có thể xuất hiện trong nhiều tháng hoặc nhiều năm khi không có áp
lực chọn lọc của thuốc ARV (khi bệnh nhân chưa điều trị ARV). Vì thời gian trung


10

bình từ khi nhiễm HIV cho đến khi đủ tiêu chuẩn điều trị ARV ước tính từ 7 – 9
năm, HIV kháng thuốc lây truyền có thể đã chuyển thành dạng hoang dại hoặc ở
“dạng ngủ” dưới ngưỡng phát hiện bằng các kỹ thuật định gen kháng thuốc [42].
HIV kháng thuốc mắc phải: là tình trạng các đột biến HIV kháng thuốc
xuất hiện trên quần thể bệnh nhân đang điều trị ARV. Các đột biến này xuất hiện
dưới áp lực chọn lọc thuốc ARV. HIV kháng thuốc mắc phải có thể xuất hiện do
tuân thủ điều trị kém, gián đoạn điều trị, nồng độ thuốc trong huyết thanh không đủ

hoặc sử dụng các phối hợp thuốc hoặc phác đồ thuốc không tối ưu. Theo chiến lược
tiếp cận của WHO về đánh giá tình trạng HIV kháng thuốc mắc phải, các mốc được
đánh giá bao gồm sau 12 tháng điều trị ARV (đánh giá sớm), sau 48 tháng và sau 60
tháng điều trị ARV [26].
1.4.2. Các loại đột biến kháng thuốc thường gặp:
Phân loại đột biến theo nhóm thuốc ức chế, bao gồm đột biến nhóm NRTI,
NNRTI và PI
• Đột biến nhóm NRTIs
- M184V: tạo ra đề kháng với thuốc 3TC, AZT và ABC
- Đột biến TAM: M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, K219Q/E – tạo
ra đề kháng với AZT, d4T, kháng chéo với các thuốc nhóm NRTI trừ 3TC
- Q151M: tạo ra đề kháng với các thuốc nhóm NRTI
- T69S: tạo ra đề kháng với các thuốc nhóm NRTI
- K65R: có đề kháng với ABC, TDF và ddI
- Y115F: đề kháng với ABC
- L74V: đề kháng với ddI
• Đột biến nhóm NNRTI
- K103N: đề kháng với hầu hết các thuốc nhóm NNRTI
- Y181C, Y188C, C108I, Y188L: đề kháng với NVP, EFV
- L100I, V106A, G190A/S: đề kháng với hầu hết thuốc nhóm NNRTI
• Đột biến nhóm PI
- L90M: đề kháng các thuốc PI, đặc biệt là SQV
- V82A/F/T: đề kháng các thuốc PI, đặc biệt là RTV và IDV


11

- D30N, N88D/S: đề kháng với NFV
- L10I/F, K20R/M, M36I, M46I/L, I54V/L, A71V/T, G73S, V77I, M93L,
I84V: đề kháng với hầu hết thuốc nhóm PI

- G48V: đề kháng với SQV
- L24I: đề kháng với IDV hay LPV
- I47V, I50V: đề kháng với APV và LPV
- V32I, F53L: đề kháng với nhiều thuốc thuộc nhóm PI
1.4.3. Các yếu tố liên quan đến đề kháng
Kháng thuốc do bản thân vi rút: HIV có tốc độ nhân lên rất nhanh, khoảng 10
tỷ bản sao/ngày. Như đã đề cập ở trên, quá trình phiên mã sợi ARN thành sợi ADN
có thể tạo ra các đột biến chọn lọc, giúp cho HIV hình thành đột biến kháng thuốc.
Chủng vi rút mang đột biến kháng thuốc có thể nhanh chóng lan truyền trong quần
thể và sản sinh ra nhiều chủng kháng thuốc mới. Vì vậy, ở các bệnh nhân nhiễm
HIV không được điều trị ARV, nguy cơ mắc kháng thuốc là rất cao [5].
Kháng thuốc do lựa chọn phác đồ điều trị: việc áp dụng điều trị HIV bằng
phác đồ kháng vi rút hoạt tính cao (HAART) rất hiệu, thông thường sử dụng kết
hợp 3 loại thuốc trong một phác đồ điều trị. Tuy nhiên nếu sử dụng ít hơn 3 loại
thuốc hoặc kết hợp 3 loại thuốc không phù hợp có thể làm gia tăng nguy cơ thất bại
vi rút học và xuất hiện tình trạng kháng thuốc.
Kháng thuốc do kém tuân thủ điều trị: sử dụng thuốc đúng thời điểm và thời
gian đóng vai trò quyết định đến sự thành công của điều trị. Tuân thủ điều trị kém,
có thể quên uống thuốc hoặc uống thuốc sai giờ, sẽ dẫn đến gia tăng nguy cơ kháng
thuốc rất cao [4],[24].
1.5. Chẩn đoán kháng thuốc
Thất bại điều trị xuất hiện khi HIV đã giảm nhạy cảm với thuốc
kháng vi rút ARV do thuốc không đủ hoạt độ để ức chế vi rút tiếp tục nhân bản và
sản sinh các đột biến kháng thuốc. Thời gian vi rút nhân bản khi đã kháng thuốc
càng kéo dài thì số đột biến kháng thuốc và tính kháng thuốc càng tăng.
Theo hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS của Bộ Y tế ban hành
ngày 19-8-2009: được coi là thất bại điều trị ARV khi bệnh nhân đã uống ARV


12

đúng phác đồ 3 thuốc trong ít nhất 6 tháng, người bệnh tuân thủ tốt mà
lâm sàng, miễn dịch và vi rút học có những diễn biến như sau [2].
- Thất bại về lâm sàng:
Xuất hiện mới hoặc tái phát các bệnh lý giai đoạn lâm sàng 4 sau điều
trị ít nhất 6 tháng. Trên thực tế trong bối cảnh còn hạn hẹp về nguồn lực, các
thất bại về lâm sàng vẫn được xem là đánh giá quan trọng khi xác định thất
bại điều trị.
- Thất bại về miễn dịch:
Được xem là thất bại về miễn dịch khi sau điều trị ARV đúng phác đồ 3
thuốc trong ít nhất 6 tháng, người bệnh tuân thủ tốt, xét nghiệm số lượng tế bào
CD4 giảm xuống bằng hoặc dưới mức CD4 ban đầu trước điều trị, hoặc CD4
giảm dưới một nửa so với mức CD4 cao nhất đạt được (nếu biết giá trị này),
hoặc CD4 dưới 100 tế bào/cm3 máu liên tục trong 1 năm liền, không tăng.
- Thất bại về vi rút học:
Thất bại về vi rút học được thể hiện số lượng bản sao HIV-RNA của vi rút đo
được bằng kỹ thuật Realtime PCR hoặc bằng các kỹ thuật liên quan > 3000 bản
sao/ml
Khi xuất hiện các diễn biến liên quan đến kháng thuốc của HIV cần tiến hành
ngay xét nghiệm để chẩn đoán đặc điểm kháng thuốc của HIV cho bệnh nhân để lựa
chọn các thuốc điều trị cho phù hợp. Hiện nay có hai phương pháp dùng để đo độ
nhạy cảm của HIV với thuốc ARV, xét nghiệm kiểu hình và xét nghiệm kiểu gen.
• Xét nghiệm kiểu hình xác định HIV kháng thuốc [42]: là phương pháp do
trực tiếp mức độ nhạy cảm với thuốc của HIV. Tốc độ nhân bản của vi rút được đo
trực tiếp trên môi trường nuôi cấy (có chứa các tế bào phù hợp) dưới áp lực chọn
lọc của thuốc ở các nồng độ tăng dần và so sánh với tốc độ nhân bản của chủng vi
rút hoang dại. nồng độ thuốc được biểu thị bằng giá trị IC50 (là nồng độ thuốc mà ở
đó có 50% số vi rút bị ức chế không thể nhân bản). Độ nhạy cảm của vi rút với
thuốc được tính bằng tỷ số giữa giá trị IC50 của chủng vi rút gây bệnh và IC50 của
chủng vi rút hoang dại. Điểm cut-off (giá trị ngưỡng) được xác định là tỷ số giữa

IC50 của vi rút gây bệnh và IC50 của vi rút hoang dại mà tại đó chủng HIV vẫn còn


13

nhạy cảm với thuốc. Việc xác định được giá trị ngưỡng rất quan trọng trong đánh
giá kháng thuốc của HIV.
• Xét nghiệm kiểu gen xác định kháng thuốc của HIV [43]: là xét nghiệm
dựa trên phân tích trình tự nucleotide để tìm ra các đột biến liên quan tới kháng
thuốc. Phương pháp này dựa trên nguyên lý nhân dòng đặc hiệu các gen đích (gen
mã hóa các protein chịu tác độ của thuốc kháng vi rút ARV như gen mã hóa enzyme
Reverse Transcriptase, Protease, Gyrase), sau đó giải trình tự nucleotide của các gen
này bằng máy phân tích chuyên dụng. Các trình tự nucleotide của chủng gây bệnh
thu được sẽ tiến hành so sánh với trình tự nucleotide của chủng hoang dại để tìm ra
các đột biến điểm liên quan đến tính kháng thuốc của HIV.
Mục đích chung của cả hai phương pháp này đều được dùng để đo mức độ
đề kháng của HIV với các thuốc sử dụng trong điều trị, tuy nhiên cả hai phương
pháp này đều có các nhược điểm đó là chúng đều cần một tải lượng vi rút tối thiểu
để có thể tiến hành thành công được xét nghiệm, nếu tải lượng vi rút dưới ngưỡng
500-1000 bản sao/ml thì cả hai phương pháp đều không thể phát hiện được kháng
thuốc. Ngoài ra, phương pháp xác định kháng thuốc bằng kiểu hình còn có thêm
nhược điểm là thời gian xét nghiệm rất dài, chi phí rất tốn kém và hiệu quả lại thấp,
ngược lại, phương pháp xác định bằng kiểu gen chỉ có thể phát hiện được kháng
thuốc khi có ít nhất 20-30% tổng số chủng vi rút mang đột biến và đây là một cách
đo gián tiếp.


14

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng là 33 bệnh nhân đang điều trị ARV phác đồ bậc 2 tại phòng khám
ngoại trú Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương trong đó có 27 năm và 6 nữ.
Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Tuổi: từ 18 tuổi trở lên
- Người nhiễm HIV đang điều trị ARV phác đồ bậc 2
- Bệnh nhân được điều trị phác đồ bậc 2 trên 3 tháng và có tải lượng vi rút
> 20 bản sao/ml
- Bệnh nhân có làm giải trình tự gen kháng thuốc chuyển đổi phác đồ điều
trị từ phác đồ 1 sang phác đồ 2
Tiêu chuẩn loại trừ:
-

Bệnh nhân hiện đang tham gia vào một nghiên cứu khác

-

Bệnh nhân không đủ các tiêu chuẩn lựa chọn

2.2. Trang thiết bị, vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Trang thiết bị
- Tủ lạnh -20oC, tủ lạnh thường.
- Máy luân nhiệt PCR (Applied Biosystem - Mỹ).
- Máy ly tâm tốc độ tối đa 16,000 vòng/phút (hãng Eppendorf - Đức).
- Máy vortex (Biorad - Mỹ), block nhiệt (Anh).
- Máy ly tâm lạnh (Nhật).
- Bộ điện di ADN Mupid-2plus (Nhật).
- Máy chụp ảnh Geldoc (Biorad - Mỹ)

- Máy giải trình tự gen tự động sequencer 3130 (Applied Biosystem - Mỹ).
- Các loại pipette, các loại đầu týp, ống eppendorf 1,5ml vô trùng, giá đựng
ống, ống PCR 0,2ml vô trùng.
2.2.2. Vật liệu
Vật liệu dùng cho PCR nhân dòng các gen RT và PR của HIV


15

- Dung dịch đệm TAE – Tris Acetate EDTA (Invitrogen - Mỹ).
- Cồn 96-100 % (Meck - Đức).
- Kít tách chiết ADN: (QIAamp DNA Mini Kit hãng QIAGEN - Đức).
- PCR Master mix của hãng QIAGEN.
- PCR purification Kit (Norgen – Canada).
- Agarose dùng trong điện di phát hiện ADN (Invitrogen - Mỹ).
- GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000 x dùng để nhuộm ADN (Biotium Canada).
- Dung dịch đệm TE - Tris EDTA (Invitrogen - Mỹ).
- PBS - Phosphate Buffer Saline (First Base – Singapore).
- Nước cất vô trùng (Invitrogen - Mỹ).
- Các cặp mồi:
Bảng 2.1: Các cặp mồi đặc hiệu cho các gen mã hóa RT và PR [43]:
Gen đích
RT
RT
PR
PR

Tên mồi

Trình tự nucleotide (5’ – 3’)

2485F

GACCTACACATGTCAACATAATTGG

3372R

TAATCCCTGCATAAATTTGACTTGC

2574F

CCAGTAAMATTATAGCCAG

3335R

TCCCACTAACTTCTGTATATC

DRPR05

AGACAGGYTAATATTTTAGGGA

DRPR02

TATGGATTTTCAGGCCCAATTTTTGA

DRPR01

AGAGCCAACAGCCGCACCAG

DRPR06

ACTTTTGGGCGATCCATTCC

Vật liệu dùng cho giải trình tự nucleotide các gen RT và PR của HIV
- BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem – Mỹ)
- BigDye® Terminator V3.1 Purification Kit (Applied Biosystem – Mỹ).
- Capillary Array, 4 x 50cm (Applied Biosystem – Mỹ).
- POP7 Polymer (Applied Biosystem – Mỹ)
- Running buffer 10X (Applied Biosystem – Mỹ)
- BigDye® XterminatorTM (Applied Biosystem – Mỹ).