Nghiên cứu biện pháp phòng trừ sinh học để kiểm soát bệnh héo rũ cây trồng do vi khuẩn (the bacterial wilt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
…………...……………

NGUYỄN THỊ HỒNG HẢI

NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ SINH
HỌC ĐỂ KIỂM SOÁT BỆNH HÉO RŨ CÂY
TRỒNG DO VI KHUẨN (THE BACTERIAL WILT)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2005


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
…………...……………

NGUYỄN THỊ HỒNG HẢI

NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ SINH
HỌC ĐỂ KIỂM SOÁT BỆNH HÉO RŨ CÂY
TRỒNG DO VI KHUẨN (THE BACTERIAL WILT)

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Ngành: Công nghệ Sinh học

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Ngọc Cường

HÀ NỘI – 2005

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi là chính. Những
kết quả trong luận văn là trung thực, một phần được công bố trên các tập san
và tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng
tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào
khác.

Người cam đoan

Nguyễn Thị Hồng Hải


iii

Lời cảm ơn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn
Ngọc Cường, người đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Đào tạo và Bồi dưỡng
sau Đại học cùng các Thầy Cô giáo – Trường Đại học Bách khoa
Hà Nội đã tổ chức khoá đào tạo và tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông

nghiệp và tập thể cán bộ phòng Di truyền và Công nghệ Vi sinh Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt
quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã
động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Hà nội ngày 26 tháng 10 năm 2005

Nguyễn Thị Hồng Hải


iv

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa ................................................................................... i
Lời cam đoan .................................................................................. ii
Lời cảm ơn ..................................................................................... iii
Mục lục ......................................................................................... iv
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ...................................... viii
Danh mục các bảng ........................................................................ ix
Danh mục các hình và đồ thị ......................................................... xi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................... 1
2. Cơ sở khoa học của đề tài ............................................................................ 3
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ..................................................... 3
4. Mục tiêu của đề tài ....................................................................................... 4
5. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 4
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 5

1.1. Tình hình gieo trồng vừng, cà chua ở Việt Nam và trên thế giới ....... 5
1.1.1. Tình hình gieo trồng vừng ........................................................... 5
1.1.2. Tình hình gieo trồng cà chua ...................................................... 5
1.2. Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum ........................... 6
1.2.1.Khái quát về bệnh héo xanh cây trồng.......................................... 6
1.2.2. Biểu hiện triệu trứng của cây nhiễm bệnh .................................. 8
1.2.3. Vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum ............... 9
1.3. Vi sinhvật đối kháng ............................................................................. 14


1.3.1. Quan hệ đối kháng trong thế giới vi sinh vật............................. 14
1.3.2. Vi sinh vật nội sinh đối kháng ................................................... 16
v

1.4. Biện pháp phòng trừ sinh học bằng phương pháp sử dụng vi
sinh vật đối kháng với vi khuẩn R. solanacearum .......................................... 18
1.4.1. Cơ chế đối kháng giữa vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn
héo xanh R. solanacearum .................................................................. 19
1.4.2. Các loại vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn
R. solanacearum ................................................................................. 20
1.4.3. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phát triển nền nông
nghiệp bền vững ................................................................................... 24
1.5. Phân loại vi khuẩn ................................................................................ 25
1.5.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống ................................. 25
1.5.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại bằng cách sử dụng
kit “Api” và Vitek. .............................................................................. 26
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................... 27
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 27
2.1.1. Nguồn vi sinh vật ....................................................................... 27
2.1.2. Các thiết bị hoá chất và một số giống cây nghiên cứu .............. 27

2.1.3. Các môi trường và dung dịch đệm chủ yếu .............................. 27
2.2. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh
R.solanacearum ............................................................................................. 28
2.2.1. Phương pháp điều tra thu mẫu ................................................... 28
2.2.2. Phương pháp thu thập, phân lập vi khuẩn gây bệnh từ mẫu
cây bệnh ............................................................................................... 29
2.2.3. Phương pháp đánh giá tính độc của R. solanacearum ............. 30
2.2.4. Phương pháp nhận dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh R.
solanacerum bằng kỹ thuật PCR.................................................................... 31
2.2.5. Phương pháp xác định thứ sinh học (biovar) ............................. 33


2.3. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn
R.solanacearum ............................................................................................. 34
vi ...................................................... 34
2.3.1. Phân lập vi khuẩn đối kháng

2.3.2. Phương pháp phân loại vi khuẩn đối kháng .............................. 35
2.3.3. Phương pháp đánh giá tác động của vi khuẩn đối kháng
lên sự nảy mầm của hạt cà chua và hạt vừng ..................................... 37
2.3.4. Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng vi
khuẩn đối kháng lên cây cà chua trong nhà kính ................................. 37
2.3.5. Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng lên cây cà chua
và cây vừng trong nhà kính.................................................................. 38
2.3.6. Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng lên cây vừng
trên đồng ruộng .................................................................................... 39
2.4. Đánh giá hiệu quả kinh tế của vi khuẩn đối kháng trên cây vừng ...... 39
2.5. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 39
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 41
3.1. Bệnh héo xanh cây cà chua và cây vừng do vi khuẩn R.

solanacearum ................................................................................................ 41
3.1.1. Điều tra và thu mẫu .................................................................... 41
3.1.2. Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn gây bệnh héo
xanh ..................................................................................................... 45
3.1.3. Nhận dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh R. solanacearum.............48
3.1.3.1. Thử nghiệm tính độc của các chủng vi khuẩn R.
solanacearum trên dòng cà chua mẫn cảm L-390 và giống vừng
V6 ......................................................................................................... 48
3.2. Vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh R. solanacearum .........54
3.2.1. Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng ............. 54
3.2.2. Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn ............... 56
3.2.3. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đối kháng .............. 58


3.3. Xác định vị trí phân loại của vi khuẩn đối kháng đại diện ............... 60
3.3.1. Một số đặc điểm cơ bản của các chủng vi khuẩn đối kháng
sử dụng trong xác định vị trí phân loại của chúng ............................. 60
vii

3.3.2. Phân loại bằng kit “API 20 NE” và hệ thống Vitek ................. 61
3.4. Quan hệ giữa nhóm vi sinh vật đối kháng có lợi với cây trồng
(cây cà chua và cây vừng) ............................................................................ 62
3.4.1. Nhóm vi khuẩn hệ rễ (Rhizosphere bacteria) ............................ 62
3.4.2. Nhóm vi khuẩn nội sinh (Endophytic bacteria) ......................... 63
3.5. Ảnh hưởng của các chủng đối kháng lên sự nảy mầm của hạt
cà chua và hạt vừng...................................................................................... 66
3.6. Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đối kháng trên cây
cà chua trong nhà kính ................................................................................ 68
3.6.1. Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn đối
kháng với vi khuẩn R. solanacearum ................................................. 68

3.6.2. Đánh giá sự tác động của các chủng vi khuẩn đối kháng
lên sinh trưởng và phát triển của cây cà chua ..................................... 71
3.7. Hiệu quả phòng trừ bệnh héo rũ do R. solanacearum của các
chủng vi khuẩn đối kháng trên cây vừng ................................................... 73
3.7.1. Hiệu quả phòng trừ trong điều kiện nhà kính ........................... 73
3.7.2. Hiêụ quả đối kháng vi khuẩn héo xanh của vi khuẩn nội
sinh bằng xử lý tế bào chết trên cây vừng . ......................................... 77
3.7.3. Hiệu quả gieo trồng cây vừng ngoài đồng ruộng ..................... 79
3.7.4. Hiệu quả kinh tế và năng suất cây vừng khi có bổ sung vi
khuẩn nội sinh đối kháng. ................................................................... 81
KẾT LUẬN ................................................................................................... 84
KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 85
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 86
PHỤ LỤC ..................................................................................................... 95
v


viii

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ADN

Axit deoxy ribonucleic (Deoxy ribonucleic Acid)

AVRCD

Asian Vegtable Research Development Center

C

Cacbon

cfu

Đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit)

EDTA

Ethylen Diamine Tetraacetic Acid

EPS

Exopolysacchride

FAO

Tổ chức Nông Lương Thế giới

IAA

Axít indol – 3 – axetic

KB

Môi trường King B

PBMT

Photphat Bufer Malat Tetrazodium chloride

STT

Số thứ tự

tb

Tế bào

TBE

Trisbase Boric acid EDTA

TTC

Triphenyl Tetrazolium chloride


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Những đặc tính sinh lí sinh hoá chính của vi khuẩn
R.solanacearum.............................................................................. 10
Bảng 1.2. Vi khuẩn đói kháng với R.solanacearum ....................................... 21
Bảng 2.1. Phân định mức độ độc của R.solanacearum................................... 30
Bảng 2.2. Cách thức phân loại vi khuẩn gây bệnh héo xanh thành các
Thứ sinh học ................................................................................ 34
Bảng 3.1. Tỷ lệ (%) cây cà chua và cây vừng bị bệnh héo xanh ngoài
đồng ruộng ở 5 tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam ............. 42

Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng gây
biểu hiện triệu chứng bệnh héo xanh ............................................ 46
Bảng 3.3. Khả năng chuyển hoá các nguồn cacbon của các chủng vi
khuẩn R. solanacearum phân lập thể hiện tính độc ...................... 52
Bảng 3.4. Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn
phân lập được ................................................................................ 55
Bảng 3.5. Hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn với đại diện các
chủng R. solanacearum................................................................. 56
Bảng 3.6. Một số đặc điểm hình thái nuôi cấy của 8 chủng vi khuẩn đối kháng .......58
Bảng 3.7. Một số đặc điểm cơ bản phục vụ mục đích phân loại các
chủng vi khuẩn đối kháng. ........................................................... 60
Bảng 3.8. Phân loại các chủng vi khuẩn đối kháng bằng kit API 20 NE
và hệ thống Vitek (bio Mérieux) ................................................. 61
Bảng 3.9. Mật độ và khả năng tồn tại của hai chủng vi khuẩn nội sinh
NA3, NA4 trong mô rễ cây rừng .................................................. 64
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của 8 chủng vi khuẩn đối kháng lên khả năng
nảy mầm của hạt cà chua và hạt vừng. ......................................... 66


x

Bảng 3.11. Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn của các
chủng vi khuẩn đối kháng trên cây cà chua trong điều kiện
nhà kính ......................................................................................... 68
Bảng 3.12. Đánh giá thống kê học tác dụng phòng trừ bệnh héo rũ vi
khuẩn của các chủng đối kháng đối với các giống cà chua sản
xuất ............................................................................................................ 70
Bảng 3.13. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cà chua khi có bổ sung vi
khuẩn đối kháng ............................................................................ 71
Bảng 3.14. Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh các giống vừng sản xuất

do vi khuẩn trong điều kiện nhà kính của các chủng vi khuẩn
đối kháng hệ rễ và nội sinh ........................................................... 74
Bảng 3.15. Đánh giá thống kê học tác dụng phòng trừ bệnh héo xanh vi
khuẩn của các chủng đối kháng đối với các giống vừng sản xuất ...... 75
Bảng 3.16. Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh do R. solanacearum khi
xử lý với tế bào sống và tế bào chết của hai chủng vi khuẩn
nội sinh NA3 và NA4 .................................................................... 77
Bảng 3.17. Hiệu quả phòng trừ bệnh héo rũ cây vừng do vi khuẩn ngoài
đồng ruộng của các chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng ............... 80
Bảng 3.18. Hiệu quả về năng suất do biện pháp kiểm soát bệnh héo rũ
vi khuẩn cây vừng V6 ngoài đồng ruộng bằng các chủng đối
kháng nội sinh mang lại ................................................................ 82


xi

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 2.1. Chỉ tiêu đánh giá mức độ nhiễm bệnh ........................................... 31
Hình 3.1. Ruộng cà chua và vừng bị héo xanh do vi khuẩn .......................... 41
Hình 3.2. Cây cà chua và cây vừng bị chết héo xanh do vi khuẩn ngoài
đồng ruộng .......................................................................................... 44
Hình 3.3. Lát cắt dọc đoạn thân sát cổ rễ cây cà chua và cây vừng biểu
hiện triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn ........................... 44
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng phân lập vi khuẩn gây
bệnh héo xanh ..................................................................................... 48
Hình 3.5. Sản phẩm PCR của đại diện một số chủng R. solanacearum
với cặp mồi P.759/760 trên gel agaroza 1% ....................................... 51
Hình 3.6. Sự chuyển hoá nguồn cacbon của các chủng thể hiện độc tính ......... 53
Hình 3. 7. Vòng ức chế phát triển của các chủng vi khuẩn độc VT3,

ML2002 do các chủng N1,17 gây ra ..................................................... 57
Hình 3.8. Hình thái khuẩn lạc điển hình của một số chủng đối kháng đại
diện ..............................................................................................................59
Hình 3.9. Tế bào của chủng vi khuẩn nội sinh đối kháng NA4 chụp dưới
kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 10.000 - 20.000 lần ................ 59
Hình 3.10. Kết quả thử kit API 20 NE và Vitek của đại diện một số chủng
đối kháng ........................................................................................................ 62
Hình 3.11. Biến động quần thể của hai chủng vi khuẩn nội sinh NA3 và
NA4 trong mô rễ cây vừng .................................................................. 64
Hình 3.12. Sự tồn tại của vi khuẩn NA3 và NA4 trong gian bào mô rễ
cây vừng .............................................................................................. 65


xii

Hình 3.13. Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn của các chủng
vi khuẩn đối kháng đối với cà chua ................................................... 69
Hình 3.14. Tác dụng kích thích sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lên
cây cà chua giống VL2500, Trang Nông............................................ 72
Hình 3.16. Tác dụng phòng trừ bệnh của các chủng đối kháng với vi
khuẩn R. solanacearum trên cây vừng trong điều kiện nhà kính ....... 76
Hình 3.17. Hiệu quả đối với vi khuẩn R. solanacearum của tế bào hai
chủng đối kháng nội sinh trên cây vừng. ............................................ 78
Hình 3.18. Hình ảnh cây vừng ngoài đồng ruộng ......................................... 80
Hình 3.19. Tỷ lệ % cây vừng sống sót của thí nghiệm đồng ruộng ............... 81


Mở đầu
1.Tính cấp thiết của đề tài.
N-ớc ta có điều kiện khí hậu, đất đai phù hợp với hầu hết các loại rau

và cây công nghiệp gieo trồng trên thế giới, lại còn có thể sản xuất gần nh- là
quanh năm. Đây là những lợi thế không phải bất kỳ n-ớc nào trên thế giới
cũng có. Với kinh nghiệm lâu đời của ng-ời sản xuất, ngành sản xuất rau và
cây công nghiệp không chỉ cung cấp những sản phẩm cho tiêu dùng nội địa
mà còn xuất khẩu sang các n-ớc vĩ độ thấp nh- bắc châu , châu Âu và Bắc
Mỹ [12]
So với cây l-ơng thực và nhiều loại cây khác cây vừng và cà chua là
những cây có giấ trị kinh tế cao trên một đơn vị diện tích. Do vậy phát triển
trồng vừng và cà chua không chỉ thúc đẩy chuyển dịch cơ cấu cây trồng trong
nông nghiệp mà còn nâng cao thu nhập cho ng-ời sản xuất.
Cây vừng có tên khoa học là Sesaum indicum L, là cây lấy dầu với bộ
phận thu hoạch chủ yếu là hạt. Hạt vừng có hàm l-ợng dầu rất cao, giá trị sử
dụng chủ yếu là làm thực phẩm, kể cả ở dạng dầu tinh khiết cũng nh- ở dạng
hạt thô. Bên cạnh giá trị dinh d-ỡng, cây vừng còn là loại cây chịu hạn, có thể
trồng ở các vùng đất nghèo dinh d-ỡng nh- đất cát pha đất cát. Bên cạnh đó
vừng là loại cây nhiệt đới có thể chịu đ-ợc nhiệt độ từ 25- 32oC, vì vậy chúng
đ-ợc trồng khá rộng rãi ở các tỉnh miền Trung và các tỉnh Nam trung bộ n-ớc
ta. Vòng đời sinh tr-ởng của vừng khá ngắn chỉ vào khoảng từ 60 đến 90 ngày
nên lợi ích do phát triển trồng vừng đem lại là rất cao [12]
Cà chua (Lycopersion esculentum Mill) là loại rau ăn quả quan trọng
đ-ợc trồng phổ biến trên khắp thế giới, từ xích đạo Bắc cực (Alaska). Cà chua
không chỉ để ăn t-ơi mà còn là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp chế
biến ra hàng loạt sản phẩm đa dạng và phong phú nh- n-ớc uống, sốt cà chua,
dạng bột, cà chua đóng hộp nguyên quả... Về sản l-ợng, cà chua chiếm 1/6
tổng sản l-ợng rau hàng năm trên thế giới và luôn ở vị trí số một. Theo số liệu
của FAO (2002), diện tích trồng cà chua trên thế giới năm 2002 đạt xấp xỉ
3,754 triệu ha, sản l-ợng đạt 98,62 triệu tấn. ở n-ớc ta cà chua đ-ợc trồng

1

nhiều ở các tỉnh miền Bắc, là loại cây ngắn ngày nh-ng cho hiệu quả kinh tế
cao. Ngoài việc tăng l-ợng cà chua cung cấp cho thị tr-ờng trong n-ớc, còn
phải cung cấp nguyên liệu một số nhà máy chế biến cà chua cô đặc và xuất
khẩu ở dạng quả t-ơi.
Nh-ng thực tế, vấn đề trồng vừng, cà chua trên thế giới nói chung và ở
Việt Nam nói riêng, gặp rất nhiều khó khăn bởi bệnh héo xanh do vi khuẩn
Ralstonia solanacearum gây ra. Đây là một trong 5 loại bệnh cây trồng thuộc
đối t-ợng quan tâm nhất của ch-ơng trình phòng trừ tổng hợp của FAO. Theo
báo cáo tại hội nghị quốc tế tổng kết về bệnh héo xanh của Trung tâm Nghiên
cứu và Phát triển rau Châu á (AVRDC), thì thiệt hại do bệnh này có thể là
100%. Riêng ở Đài Loan thiệt hại đối với thị tr-ờng cà chua sạch hàng năm
vào khoảng 12 triệu đô la [56]. Ước tính mức độ thiệt hại cho sản xuất cà chua
do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra là 15% 95% [76].
ở n-ớc ta bệnh héo xanh do vi khuẩn đã phát sinh ở hầu hết các địa
ph-ơng có trồng các cây nh-: vừng, cà chua, lạc, thuốc lá, khoai tây, ở các
tỉnh, thành phố: Hà nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Thái Nguyên, Thanh Hoá,
Nghệ An... có nơi có lúc bệnh gây thiệt hại nặng tới mức gây chết 100% cây
trồng. Tình hình gây hại là nh- vậy nh-ng cho tới nay những nghiên cứu về
bệnh héo xanh vi khuẩn ở vừng và cà chua ch-a nhiều, chủ yếu chỉ giới hạn
trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân bố của bệnh và b-ớc đầu xác
định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống cà chua hiện có. ở Việt Nam
ch-a có các công trình nghiên cứu cơ bản về mức độ biến dị tính trạng độc, sự
đa hình di truyền (đa hình ADN) các cá thể trong quần thể của vi khuẩn gây
bệnh và sự l-u hành của chúng ở các vùng sản xuất khác nhau làm cơ sở khoa
học cho các giải pháp phòng chống và chọn, tạo giống kháng bệnh. Tuy nhiên
do bản chất kháng bệnh và sự biến đổi đặc tính độc của các phân lập vi khuẩn
gây bệnh trên toàn thế giới nên các biện pháp phòng chống thay thế nhphòng trừ sinh học đang thu hút đ-ợc sự quan tâm đáng kể.
Phòng trừ sinh học bệnh héo xanh bằng các vi sinh vật đối kháng với vi
khuẩn Ralstonia solanacearum đã cho thấy nhiều hứa hẹn khả quan và là biện

pháp rất cần thiết để thay thế các loại thuốc bảo vệ thực vật hoá học.
Do đó, vấn đề phân lập và bảo quản một bộ s-u tập những chủng vi
khuẩn R. solanacearum có độc tính cao để sử dụng trong việc chọn, tạo giống

2


vừng và cà chua kháng bệnh héo xanh, đồng thời tuyển chọn các chủng vi sinh
vật đối kháng với chúng và kích thích sự sinh tr-ởng, phát triển cây chủ nhcác tác nhân phòng trừ sinh học là rất cần thiết. Xuất phát từ những lý do và
đòi hỏi nêu trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu biện
pháp phòng trừ sinh học để kiểm soát bệnh héo rũ cây trồng do vi khuẩn
(the bacterial wilt)"
2. Cơ sở khoa học của đề tài
Bệnh héo xanh cây trồng ngày càng gây thiệt hại trầm trọng trong thực
tế sản xuất ở Việt Nam và trên toàn thế giới. Hơn nữa vi khuẩn gây độc ở các
vùng địa lý khác nhau và các cây ký chủ khác nhau là có thể không giống
nhau. Vì vậy cần phải có những nghiên cứu cơ bản để có những kết quả chính
xác và khoa học về loài vi khuẩn này để từ đó có những biện pháp phòng trừ
hiệu quả.
- Dựa vào các ph-ơng pháp truyền thống và ph-ơng pháp sinh học hiện
đại nh- ph-ơng pháp nhân bản (PCR) để nhận dạng, giám định vi khuẩn R.
solanacearum nòi độc và vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn này.
- Các cặp ADN mồi và kỹ thuật nhân bản đã thực sự là một công cụ hữu
hiệu cho phép nhận dạng nhanh chóng vi khuẩn gây bệnh. Điều này có nghĩa
là hiện nay các nhà khoa học nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn đã có thể
phát hiện các dạng di truyền mới từ các dạng hiện có, những đặc tính gây độc
phổ cây chủ tiềm tàng.
- Dựa vào một số ph-ơng pháp phân lập, thử nghiệm vi sinh vật có khả
năng kích thích sự phát triển của cây trồng (chủ) và đối kháng với vi khuẩn R.
solanacearum để góp phần vào chiến l-ợc phòng trừ tổng hợp vi khuẩn gây

bệnh này.
- Các nhà khoa học đang tiến dần tới chỗ xác định đ-ợc cơ chế của
quan hệ vi khuẩn gây bệnh cây chủ, mức độ độc tính và quan hệ vi khuẩn đối
kháng - cây chủ vi khuẩn gây bệnh, để tiềm tàng khả năng can thiệp và tác
động lên quá trình hình thành dịch bệnh theo h-ớng mong muốn của con
ng-ời.
3. ý nghĩa khoa học, thực tiền của đề tài
Góp phần làm sáng tỏ từ tìm hiểu mức độ đa dạng sinh học và độc tính
của quần thể vi khuẩn gây bệnh héo xanh để giải thích nguyên nhân lan rộng

3


của bệnh đến mức độ trầm trọng ở một số tỉnh thành ở Miền Bắc và Miền
Trung Việt Nam.
- Khẳng định sự có mặt của R. solanacearum nh- là một trong những
loài vi khuẩn chính gây ra các vụ dịch chết héo xanh cây vừng đang phổ biến
ở nhiều địa ph-ơng góp phần làm sáng tỏ nguyên nhân bùng phát dịch bệnh
héo xanh tới mức trầm trọng ở Nghệ An.
- Chứng minh sự đa dạng sinh học của R. solanacearum và vi khuẩn đối
kháng với chúng ở Việt Nam .
- Xác định đ-ợc những chủng vi khuẩn có tác dụng kích thích sinh
tr-ởng cây cà chua và hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn R. solanacearum.
- Lần đầu tiên ở Việt Nam xác định đ-ợc những chủng vi khuẩn nội
sinh cây trồng có hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn R. solanacearum trong
điều kiện nhà kính và đồng ruộng.
4. Mục tiêu của đề tài.
- Phân lập và tuyển chọn một bộ s-u tập những chủng vi khuẩn R.
solanacearum gây bệnh héo xanh vừng, cà chua và vi khuẩn đối kháng với
chúng.

- Xác định và sử dụng một số chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn
gây bệnh chết héo, đồng thời kích thích cây sinh tr-ởng phát triển và có triển
vọng áp dụng thực tiễn, nhằm góp phần vào việc phòng trừ bệnh héo xanh có
hiệu quả.
5. Nội dung nghiên cứu
- Điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn, phân lập và tuyển chọn các
chủng R. solanacearum gây bệnh héo xanh trên vừng và cà chua.
- Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mới đặc hiệu loài AU.PT59/ 760 để
nhận dạng nhanh vi khuẩn R. solanacearum.
- Phân lập, tuyển chọn những chủng vi khuẩn hệ rễ, vi khuẩn nội sinh
đối kháng với R. solanacearum.
- Đánh giá mức độ kích thích sinh tr-ởng của một số chủng vi khuẩn
đối kháng lên cây và hoạt lực đối kháng với vi khuẩn R. solanacearum trong
điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính và ngoài đồng ruộng trên cây vừng và cà
chua, đồng thời tìm hiểu sự t-ơng tác giữa vi khuẩn đối kháng cây chủ vi
khuẩn gây bệnh.

4


Ch-ơng I. Tổng quan tàI liệu
1.1. Tình hình gieo trồng vừng và cà chua ở Việt nam và trên thế giới.
1.1.1. Tình hình gieo trồng vừng
ở n-ớc ta, vừng đ-ợc trồng nhiều tại Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh,
Quảng Nam, Quảng Bình,... và một số ít tại vùng Bắc bộ. Thờivụ gieo trồng
vừng th-ờng là:
- Vụ xuân: từ 15 tháng 2 đến 10 tháng 3 (tuỳ điều kiện canh tác)
- Vụ hè thu: từ 10 tháng 5 đến 5 tháng 6 (tuỳ điều kiện canh tác)
Giống vừng đ-ợc trồng chủ yếu là giống vừng V6 (vừng trắng) của
Nhật đ-ợc nhập vào Việt Nam cách đây 10 năm và năm 2000 đ-ợc công nhận

là giống chuẩn quốc gia. Năng suất trung bình đạt 1,2 tấn/ha. Ngoài ra còn có
giống vừng địa ph-ơng nh- vừng đen, vừng trắng,... Cây vừng có khả năng
chịu hạn tốt nh-ng khả năng chịu úng kém. Cây vừng dễ trồng, không đòi hỏi
vốn đầu t- lớn. Vừng không kén đất nên có thể sinh tr-ởng, phát triển tốt trên
nhiều loại đất. Đất trồng vừng phải là đất dễ thoát n-ớc vì cây vừng chịu úng
kém.
Sản l-ợng vừng trên thế giới là khác nhau, sản l-ợng hàng năm 2 triệu
tấn chủ yếu ở Châu á (55 - 60%), Châu Mỹ (18 - 20%), Châu Phi (18 - 20%),
ngoài ra còn có ở Châu âu, Châu Đại D-ơng tuy chỉ rải rác, không nhiều. Các
quốc gia trồng vừng trên thế giới là ấn Độ (400.000 tấn/năm), Trung Quốc
(320.000 tấn/năm), Su Đăng (200.000 tấn/năm), Mêxicô (180.000 tấn/năm).
1.1.2. Tình hình gieo trồng cà chua
Cà chua đ-ợc trồng rất phổ biến ở n-ớc ta, những năm gần đây diện tích
trồng cà chua vào khoảng 10000 - 12000 ha mỗi năm. Cà chua đ-ợc trồng
chính vụ vào tháng 10 hàng năm và thu hoạch đến hết tháng 2 năm sau, nh-ng
th-ờng có vụ sớm và vụ muộn. Vụ sớm đ-ợc trồng vào tháng 8 hàng năm còn
vụ muộn vào tháng giêng năm sau. ở miền Bắc cà chua đ-ợc trồng chủ yếu ở
những vùng ven đô và những vùng trọng điểm canh tác rau màu của một số

5


tỉnh, thành phố nh-: Hải D-ơng, H-ng Yên, Hải Phòng, Hà Nội, Bắc Ninh,
Bắc Giang, Hà Tây, Vĩnh Phúc. Hơn 70% sản l-ợng (khoảng 80000 tấn) đ-ợc
thu hoạch trong vụ đông xuân (tháng 12 năm tr-ớc đến tháng 3 năm sau).
Theo số liệu của FAO năm 1999, trên thế giới hiện có 158 n-ớc trồng
cà chua với tổng diện tích khoảng 3,594 triệu ha, đứng đầu trong các loại rau,
năng suất trung bình là 25,4 tấn/ha và sản l-ợng hàng năm xấp xỉ 91,29 triệu
tấn quả. Châu á là khu vực trồng cà chua nhiều nhất: 1,19 1,22 triệu ha và
cũng là nơi có sản l-ợng cao nhất: 26,7 28,5 triệu tấn. Các n-ớc có diện tích

trồng cà chua lớn nh-: Trung Quốc: 339300 ha, Ai cập: 140000 ha, Philipin:
16500 ha, Thái Lan: 12000 ha. Nhìn chung diện tích trồng cà chua ở Việt
Nam và trên thế giới là rất lớn [33]
1.2. Bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum
1.2.1. Khái quát về bệnh héo xanh cây trồng
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh héo xanh do vi khuẩn
Ralstonia Solanacearum gây ra.
Năm 1875, Hallier lần đầu tiên đã phát hiện ra loại vi khuẩn gây thối củ
khoai tây. Sau này, vào năm 1985, E. F Smith đã phát hiện thêm và nghiên cứu
sâu, rộng trên nhiều loại vi khuẩn và trên hầu hết các loại cây trồng. Năm
1892 Halsted khởi đầu cho các nghiên cứu bệnh héo xanh cà chua. Càng về
sau này càng có nhiều công trình nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá, di
truyền của các loại vi khuẩn gây bệnh héo xanh. Năm 1896 E. F Smith đã mô
tả bệnh héo xanh do vi khuẩn ở khoai tây, cà chua, cà tím. Năm 1909 ông lại
phát hiện thêm bệnh này ở cây thuốc lá. Năm 1953 Kelman công bố bệnh héo
xanh do vi khuẩn ở trên 200 loại thực vật, cùng năm đó ông tìm ra môi tr-ờng
2,3,5 Triphenil Tetrazolium clorit (TTC) đặc tr-ng để nhận biết loài vi
khuẩn này [42].
Năm 1991 Denny, T.P và Back, S.R đ-a ra bằng chứng rằng, chính
polysaccharit ngoại bào (ESP) đ-ợc tạo ra do vi khuẩn P. solanacearum (tên
gọi cũ của Ralstonia Solanacearum) là nguyên nhân chính gây bệnh héo xanh
[31]. Nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới đã cố gắng chứng minh
điều đó và cấu trúc những thành phần chính của polysaccharit ngoại bào đã

6


đ-ợc xác định (Orgambide etal, 1991). Những gen phức tạp trong quá trình
sinh tổng hợp chúng cũng đã đ-ợc tách thành công (Cook and Sequeira 1991)
[30].

Cấu trúc thành phần của những thành phần EPS có tính chất axit đã đ-ợc
làm sáng tỏ và ng-ời ta đã tìm ra một đơn vị của 2 đ-ờng không thay thế là
baclosamin (2,4,6 trideaxit- glucoza) và galactosaminuronic axit (Orgambide
etal, 1991). Một vài gen sinh tổng hợp đ-ợc xác định ở 1 vùng gọi là OPS. Chúng
đã đ-ợc xác định là có chứa ít nhất 7 tiểu phần thể hiện chức năng có ảnh h-ởng
lên sự tổng hợp của cả OPS và LPS (Lipopolysacharit). E.F.Smith coi bệnh héo
xanh là bệnh thực vật quan trọng nhất có nguồn gốc từ vi khuẩn trên toàn thế giới.
Loài này còn có tên mới là Ralstonia solanacearum (Hashimoto và cộng sự,
1992).
Trong số hơn 2600 chủng đ-ợc thử thì hơn 500 chủng có ở 4 dạng thực
vật đã đ-ợc đặc tr-ng là có khả năng chống chịu cao, bao gồm 3 kiểu dại,
chúng có thể sử dụng trong công tác chọn giống và đánh giá giống. Mầm bệnh
có thể biến đổi cả về kiểu gen và kiểu hình với phổ cây chủ đa dạng. Không
chỉ với các cây chủ họ cà mà còn ở cả các loài thuộc 50 họ thực vật khác cũng
đều có thể bị nhiễm (Hayward,1994) [37]. Bệnh này phá huỷ chủ yếu ở các
vùng nhiệt đới, nơi mà có các cây trồng chủ yếu nh- cà chua, lạc, khoai tây,
cà tím, gừng. Chúng làm giảm năng suất của cây trồng một cách đáng kể.
Thông th-ờng xét về mặt hình thái thì những khuẩn lạc dạng chảy sẽ có
tính độc nh-ng năm 1990 Xu, PL, Iwata. M, Leong, S, Sequeira, L bằng
ph-ơng pháp đột biến nhờ gen nhảy Tn5, đã phân lập đ-ợc một loạt các đột
biến mà hình thái khuẩn lạc không chảy nh-ng vẫn duy trì đ-ợc khả năng gây
héo và gây chết thuốc lá. Năm 1990 Huang, Y, Sequeira, L đã nhận ra đ-ợc
một vùng (locus) điều khiển chức năng nhân lên của R. solanacearum. Khi R.
solanacearum K60 mang một plasmit có nhiều bản sao chứa dòng cosmit
pE6C (từ nòi K60 kiểu dại) hoặc pBE6 (từ nòi B1 không có tính độc), một vài
thay đổi hình thái đã đ-ợc quan sát, cụ thể: Mất tình độc, giảm hàm l-ợng
polysachrit ngoại bào và tăng hoạt tính của polygalacturonasa. Cả hai cosmit
đều chứa một đoạn ADN có kích th-ớc 8000 đôi gốc bazơ đủ cho sự thay đổi
kiểu hình. Nhìn chung có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn R. solanacearum ở

7


các khía cạnh khác nhau, nh- di truyền, sinh lý, sinh hoá, sinh học phân tử
v.v
Năm 1905 ở Indonesia đã phát hiện bệnh héo xanh gây hại trên cà chua,
lạc, khoai tây ở vùng Cirebon Tây Java, Breda de Hann (1990). Trong thời kỳ
1992 1994 các nhà nghiên cứu đã thu thập và tiến hành xác định nòi (race),
thứ sinh học (biovar) của 264 chủng phân lập từ các cây ký chủ nh- cà chua,
khoai tây, lạc, cà, ớt. Các nguồn vi khuẩn thu thập từ những vùng có độ cao
trên 1000 m đã đ-ợc xác định hầu hết thuộc nòi 1, biovar 3, chỉ có 1 hoặc 2
nguồn từ Iran thuộc nòi 1, biovar 4. Machmud (1993).
1.2.2. Biểu hiện triệu trứng của cây nhiễm bệnh
Biểu hiện đầu tiên có thể quan sát thấy đó là những lá non ở phần ngọn
của cây bị héo tr-ớc tiên và dần dần rủ xuống. Sau đó phần bị héo chuyển dần
xuống phía d-ới gốc cây (trong phần lớn các tr-ờng hợp thấy các nhánh cây
có biểu hiện héo tr-ớc). Những triệu chứng điển hình nh- trên th-ờng gặp ở
những cây đang vào giai đoạn sinh tr-ởng, phát triển mạnh nhất, đó là thời kỳ
cây bắt đầu ra hoa, kết quả. Hiện t-ợng này phổ biến đến mức làm cho nhiều
nhà nghiên cứu th-ờng băn khoăn tự hỏi, phải chăng có sự biến đổi sinh lý sâu
sắc trong cây ở giai đoạn này nên khiến cho cây dễ bị nhiễm và phát bệnh?
Berhalim (Halim, 1996) thông báo rằng một số nhà nghiên cứu đã tìm thấy có
sự t-ơng quan tỷ lệ thuận giữa tỷ lệ mắc bệnh và mức độ giảm của hàm l-ợng
kali trong cây. Nếu quan sát kỹ thì ta thấy có hiện t-ợng vàng nhẹ ở phần gốc
cây sát ngang bề mặt đất. Triệu chứng này th-ờng là do mức độ sinh sản IAA
trong cây tăng lên.
Năm 1965 Kelman và Sequeira đã tìm ra đ-ợc một số cơ chế phát sinh
của bệnh. Nhờ khả năng thiết lập một quần thể động trong quản bào và mạch
gỗ mà nó khác biệt so với phần lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa, và gây khối
u. Một số giai đoạn của cơ chế phát sinh bệnh do R. solanacearum gây ra ở

cây chủ nh- sau:
- Sự xâm nhập của một số ít tế bào vi khuẩn và tiểu phần mô gỗ.
- Sự nhân lên của chúng ở vùng mạch và sự lan truyền của quần thể vi
khuẩn gây bệnh không gây ra các biến đổi nhận thấy ở vùng mô mềm cận gỗ
hoặc các tế bào libe.

8


- Những biến đổi bệnh lý ở phần lớn những thành phần của nhu mô nhbiểu hiện của phản ứng nhiễm bệnh hệ thống th-ờng gặp dẫn đến suy yếu
nghiêm trọng sự mao dẫn n-ớc và sự xuất hiện héo xanh.
- Phá huỷ thành tế bào và các tế bào nhu mô kế cận, dần dần hình thành
các nội hốc xâm nhiễm libe lõi, mô vỏ hoặc phá huỷ đồng thời cùng một lúc
nhất là các mô non và cây non. Sự cố đầu tiên trong chuỗi các sự cố này có
nghĩa quyết định để xác định sự đề kháng của cây chủ và tính đặc hiệu của vi
khuẩn gây bệnh. Ng-ời ta còn hiểu biết rất ít về các giai đoạn sau của diễn
biến bệnh héo xanh. Dọc theo phần gỗ phía trong thân cây bệnh th-ờng bắt
gặp các vết màu nâu hoặc màu đỏ sẫm ở vùng hệ mạch, càng lên cao dọc theo
thân những vết này càng mỏng hơn và có màu sáng hơn.
1.2.3. Vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum
1.2.3.1. Hình thái vi khuẩn
Tế bào loài vi khuẩn này có hình ovan ngắn, gram âm, tròn ở 2 đầu.
Th-ờng gặp tế bào ở dạng đơn lẻ, ghép đôi hoặc ghép bốn, hiếm khi thấy
chúng kết thành chuỗi. Kích th-ớc của chúng khoảng 1,0-1,5 x 0,5-0,6 (m).
Vi khuẩn có từ một đến vài tiên mao và luôn chuyển động. Khuẩn lạc của nó
th-ờng có bề mặt trơn nhẵn, ít khi gồ ghề, hơi chảy hoặc không chảy, có thể
có màu trắng, trắng đục hoặc phớt hồng. Cả nguồn tính độc cao và nguồn tính
độc thấp đều có các lông nhỏ ở rìa (Mehan và cs, 1994) [51].
1.2.3.2. Đặc tính sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn gây bệnh héo xanh
Vi khuẩn R. solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào

tử, có khả năng tổng hợp poly--hydroxybutyrat nh- là nguồn cacbon dự trữ.
Mặc dù nó không tạo ra sắc tố phát huỳnh quang nh-ng nó có thể tổng hợp
sắc tố khuếch tán mầu nâu trên môi tr-ờng thạch có chứa Tyrozin.
R.solanacearum có thể khử nitrat thành nitrit và tạo ra khí nh-ng không thể
thuỷ phân tinh bột, hoá lỏng yếu hoặc không hoá lỏng gelatin.
Những đặc tính sinh hoá chính của vi khuẩn R. solanacearum đ-ợc tóm
tắt ở bảng 1 (Hayward , 1960 và He và cs, 1983) [36, 38]:

9


Bảng 1.1. Những đặc tính sinh lí sinh hoá chính của vi khuẩn R.solanacearum
Các chất thử
Phản ứng
Sự hoá lỏng gelatin
Sự thuỷ phân tinh bột
Kiểm tra MRI
Khả năng tạo indol
Sử dụng Arginin
Khả năng tạo H2S
+
Khử nitrat
+
Sinh khí từ nitrat
+ (Phần lớn các phân lập của Thứ sinh học 3, 4)
Thuỷ phân T.ween 80
+
Tổng hợp Le-van
+
Tác động đối với sức

+
Phản
+
litmutứng oxidasa
Catalasa
+
Urê
+
Pectin
+
Sự ôxi hoá axetat
+
Sự ôxi hoá xitrat.
+
Sự ôxi hoá malonat
+
Sự ôxi hoá gluconat
+
Chú thích:
(+): Phản ứng d-ơng hoặc phát triển đ-ợc.
(-): Phản ứng âm hoặc không phát triển.
Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển thay đổi từ 25-350C.
R.solanacearum có phản ứng khác nhau với chất kháng sinh, các nòi vi khuẩn
có thể mẫn cảm với Streptomyxin, chống chịu với Penixilin, Viomyxin,... (He
và cs, 1983) [38].
Về mặt sinh hoá của tính độc, năm 1963, khi nghiên cứu so sánh sự
tổng hợp IAA (axit indol 3-axetic) ở R. solanacearum dạng chảy (lỏng) không
cố định có độc tính và dạng chai không độc, Sequeira và Williams đã phát
hiện ra rằng cả 2 dạng đều tổng hợp IAA dễ dàng ngay cả khi Triptophan
không có mặt trong môi tr-ờng nuôi cấy. Hơn nữa, 1 chủng R. solanacearum

10


có độc tính đã tổng hợp IAA từ nhân vòng của Triptophan chứ không phải từ
mạch thẳng. Nh- vậy là chủng thuộc dạng khuẩn lạc chảy lỏng và có độc tính
này đã không tuân thủ trình tự chuyển hoá: Triptophan Indol - axetaldehit
IAA nh- đã thấy ở hầu hết các vi sinh vật và thực vật bậc cao [55]. Trong
khi đó, đột biến có dạng khuẩn lạc hình chai không độc lại chuyển hoá cả
nhân vòng và mạch thẳng của Tryptophan thành IAA (Sequiera, 1992) [53].
1.2.3.3. Phân loại vi khuẩn R. solanacearum
Vị trí phân loại của R. solanacearum đ-ợc sắp xếp nh- sau: BacteriaProteobacteria-

Proteobacteria-

Burkholderiales-

Burkholderiaceae-

Ralstonia solanacearum.
Trong gần 30 năm qua, một hệ thống phân loại theo hai xu h-ớng đã
đ-ợc sử dụng, nó phản ánh những h-ớng tiếp cận thật khác biệt để giải quyết
vấn đề phân loại d-ới loài.
- Xu h-ớng thứ nhất, đề cao ái lực giữa vi khuẩn với cây chủ và xác lập
ra các nòi race.
- Xu h-ớng thứ hai, khai thác các đặc điểm sinh hoá đã đ-ợc lựa chọn
kỹ, làm cơ sở để phân biệt thành các chủng sinh học (biovar).
Chủng và chủng sinh học đều là cách ghép nhóm mang tính hình
thức ở mức độ cấu trúc d-ới loài và không bị ràng buộc bởi bất kỳ một khoá
phân loại vi khuẩn nào. Kết quả 5 chủng đã đ-ợc mô tả dựa vào quan hệ mật

thiết với cây chủ và 5 biovar khác nhau dựa vào khả năng sử dụng các nguồn
cacbon khác nhau (3 đ-ờng và 3 r-ợu). Biovar 1 và 2 thuộc loại dinh d-ỡng
kém linh hoạt so với biovar 3 và 4, giữa các biovar còn khác nhau bởi các hình
ảnh điện di đồ, các protein màng. Biovar 1 và 2 còn khác biovar 3, 4 và 5 trên
cơ sở các mẫu ADN thăm dò và trên cơ sở phân tích RFLP.
Biovar 1 và 2 chiếm -u thế ở châu Mỹ, biovar 3 ở châu á. ở Philippin
thấy có mặt cả 4 biovar, còn biovar 2 có phân bố địa lý rộng nhất, trong khi đó
biovar 3 có đặc điểm dinh d-ỡng linh hoạt hơn cả. Có một bằng chứng cho
rằng R. solanacearum là một loài cổ, chỉ có quan hệ xa với các loài thuộc chi
Ralstonia. Theo phân loại, R. solanacearum nh- là một nhóm ở bên trong

11


Ralstonia đã đ-ợc biết trong nhiều năm dựa vào phân tích số liệu của những
đặc điểm hình thái, lai ADN - ADN hoặc ARN-ARN.
Các chủng R. solanacearum biến đổi mạnh về các hoạt động sinh hoá,
phổ cây chủ và khả năng gây bệnh. Năm 1962, Buddenhagen đã đề cập đến
các sơ đồ phân loại khác nhau và chia R. solanacearum thành 3 chủng dựa
trên hình thái và sinh thái học của chúng :
Chủng1: Gồm các cá thể gây bệnh ở thuốc lá, các cây chủ họ cà
(Solanaceae) và một số loài thực vật khác.
Chủng 2: Gồm các cá thể gây bệnh ở cây chủ thuộc họ Musaceae.
Chủng 3: Gồm các cá thể gây bệnh ở lạc, khoai tây và một số ít cây chủ
khác.
Năm 1964, Hayward đã nhóm các chủng thuộc loài R. solanacearum
thành 5 biovar. Dựa vào sự đa hình về chiều dài đoạn ADN đ-ợc tạo ra bởi các
enzym cắt giới hạn (RFLP), Cook đã chia các chủng sinh học thành hơn 40
nhóm RFLP [29], [71]. Kelman và Hayward cho rằng R. solanacearum là một
loài không đồng nhất, đa dạng với tính chuyên hoá khác nhau, bao gồm một

số biovar và pathovar khác biệt nhau [37], [42].
1.2.3.4. Tính độc của vi khuẩn R. solanacearum
Kelman đã kết luận rằng có mối quan hệ giữa hình thái khuẩn lạc với
tính độc và các chủng tổng hợp polysacharit ngoại bào là các chủng có tính
độc (Kelman và cs 1954) [42]. Các nòi đột biến của R. solanacearum có thể
đ-ợc phát hiện dễ dàng khi chúng đ-ợc cấy vạch trên môi tr-ờng thạch
Kelman có 2, 3, 5- Triphenyl Tetrazolium Clorit (TTC) sau 36-48 giờ (Kelman,
1954) [41]. Những đột biến có tính độc hoặc không có tính độc hình thành các
khuẩn lạc nhỏ hình chai có một quầng đỏ xẫm nổi bật. Nòi dại có độc tính
hình thành những khuẩn lạc màu trắng, thể lỏng, khoanh tròn không chuẩn
mực với màu phớt hồng ở tâm. Những đột biến mất độc tính hình chai có thể
tách trực tiếp từ cây bệnh tuy với số l-ợng ít so với loại có độc tính. Sự hình
thành các cá thể không có độc tính trong canh khuẩn dao động phụ thuộc vào
điều kiện bảo quản. Những vi khuẩn có độc tính có thể bảo quản dễ dàng
trong n-ớc cất vô trùng (Kelman và cs, 1961) [40].

12