Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.85 MB, 51 trang )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN

======

ĐẶNG THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC OMEPRAZOLE CỦA
MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN

======

ĐẶNG THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC OMEPRAZOLE CỦA
MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học

TS. NGUYỄN PHÚC HƯNG

HÀ NỘI, 2018

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu tại Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, em đã
nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của thầy cô, anh chị và các bạn.
Đầu tiên, với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành
cảm ơn TS. Nguyễn Phúc Hưng, người thầy đã hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu khả
năng giải phóng thuốc Omeprazole của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ
môi trường nước dừa già”
Em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh KTNN cùng các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp của mình.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tốt
nhất nhưng do bước đầu đi vào thực tế sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến
thức của em còn hạn chế. Do vậy không tránh khỏi những thiếu xót trong quá
trình thực hiện, em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh
viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa em xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, cảm ơn gia
đình cùng toàn thể các bạn, đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ và khích lệ em
hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Đặng Thị Yến

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài này là của chính tôi thực hiện dưới sự hướng
dẫn của TS. Nguyễn Phúc Hưng. Những số liệu kết quả nghiên cứu trong khóa
luận này là trung thực và không trùng lặp hay sao chép với một đề tài nào khác.
Những trích dẫn, kết quả nghiên cứu có trong khóa luận lấy từ các công bố chính
thức và có ghi chú rõ ràng.
Hà Nội, tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Đặng Thị Yến

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1. Lí do chọn đề tài ................................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu .......................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................................... 2
4. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn............................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU .......................................................... 4
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ................................ 4
1.1.1. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum ............................................. 4
1.1.1.1. Vị trí phân loại........................................................................................... 4
1.1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum .................................................. 4
1.1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A. xylinum .......................................... 4
1.1.2. Cấu trúc và đặc tính của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum ............. 5
1.1.2.1. Cấu trúc của màng CVK ........................................................................... 5
1.1.2.2. Đặc tính của màng CVK ........................................................................... 5
1.1.2.3. Sinh tổng hợp CVK ................................................................................... 6

1.1.2.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................................... 6
1.1.3. Giới thiệu tổng quan về thuốc Omeprazole ................................................. 7
1.2. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............... 8
1.2.1. Trên thế giới ................................................................................................. 8
1.2.2. Ở Việt Nam................................................................................................... 8
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 10
2.1. Vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu ............................................................. 10
2.1.1 Chủng vi sinh .............................................................................................. 10

2.1.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 10
Các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1: ................... 10
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................... 10
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu như bảng 2.2: .......................................... 10
2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 11
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 12
2.3.1. Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men ....................... 12
2.3.2. Phương pháp tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già ........................ 12
2.3.3.Phương pháp xử lý màng CVK trước khi nạp Omeprazole........................ 13
2.3.4. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu CVK ................................................... 14
2.3.5. Phương pháp dựng đường chuẩn ............................................................... 15
2.3.6.Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK ..................... 16
2.3.7.Chuẩn bị môi trường đệm ........................................................................... 17
2.3.8. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng CVK nạp thuốc.18
2.3.9. Phương pháp đánh giá động học giải phóng của Omeprazole…………...20
2.3.10. Phương pháp xử lí số liệu thống kê……………………………………..21
2.4. Địa điểm tiến hành nghiên cứu ..................................................................... 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 22
3.1. Màng Cellulose vi khuẩn nuôi cấy từ môi trường nước dừa già .................. 22
3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường................................................................ 23

3.4. Kết quả quét phổ và xây dựng phương trình đường chuẩn của Omeprazole 26
3.5. Màng sau khi được nạp thuốc Omeprazole................................................... 30
3.6. Lượng thuốc giải phóng từ màng CVK vào các môi trường pH .................. 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 40

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 10
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu................................. 11
Bảng 2.3: Thành phần môi trường tạo màng CVK .............................. 12
Bảng 3.1. Bảng nồng độ Omeprazole giá trị OD 276nm (pH = 2) ...... 27
Bảng 3.2. Bảng nồng độ Omeprazole giá trị OD 275nm (pH = 4,5) ... 28
Bảng 3.3. Bảng nồng độ Omeprazole giá trị OD 275nm (pH = 6,8) ... 29
Bảng 3.4. Giá trị trung bình của 3 lần đo được của màng dừa ............ 31
hấp thụ thuốc Omeprazole ................................................................... 31
Bảng 3.5: Khối lượng thuốc omeprazole hấp thụ vào màng CVK ...... 32
tại thời điểm 2h .................................................................................... 32
Bảng 3.6. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc trong các môi
trường pH khác nhau tại các thời điểm khác nhau (n = 3)................... 33
Bảng 3.7. Tỉ lệ phần trăm giải phóng thuốc omeprazole của các màng
ở các môi trường pH khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau
.............................................................................................................. 36
Bảng 3.8: Hệ số tương quan R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số số
mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau .................... 38

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Sơ đồ tinh chế màng CVK ................................................................. 13
Hình 2.2. Chuẩn bị môi trường đệm ở pH 2; 4,5; 6,8 ....................................... 18

Hình 2.3. Chuẩn bị điều kiện cho giải phóng máy khuấy từ 50 vòng/phút và ở
nhiệt độ 37°C........................................................................................................ 19
Hình 3.1. Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già............... 23
Hình 3.2. Thu màng CVK thô ở các khoảng thời gian khác nhau ..................... 24
Hình 3.4. Màng đã được tinh chế và kiểm tra độ tinh sạch ............................... 26
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH 2 .................. 27
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH 4,5 ............... 28
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của Omeprazole ở pH 6,8 ............... 30
Hình 3.8. Mật độ quang phổ của màng CVK - Omeprazole trong các độ dày,
thời gian và môi trường pH khác nhau ................................................................ 35
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ giải phóng thuốc từ màng CVK ....................... 37

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một số loài vi khuẩn,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum [2, 4]. Màng sinh học (CVK) có cấu trúc
và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β - 1,4 glucozit). Nhưng cellulose vi khuẩn cũng khác với
cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin,
hemicellulose, peptin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với
độ dẻo dai, bền chắc, có khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm và độ tinh khiết
cao [2,5]. Trên thế giới màng Cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng nhiều trong
các lĩnh vực công nghệ như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước,
chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi
độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh
học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [7]. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng
CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng
[3, 4], loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ
dưỡng da cho con người. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK

còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu
nghiên cứu.
Omeprazole được dùng để điều trị các rối loạn về dạ dày và thực quản
(như trào ngược axit, viêm loét). Thuốc hoạt động bằng cách làm giảm lượng
axit do dạ dày tiết ra. Thuốc giúp làm giảm các triệu chứng như ợ nóng, khó nuốt
và ho dai dẳng. Thuốc giúp chữa lành tổn thương dạ dày và thực quản do axit,
giúp ngăn ngừa các vết loét, và có thể giúp ngăn ngừa ung thư thực quản.
Omeprazole thuộc nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPI).

1

Nhờ những đặc tính độc đáo trên của CVK nhằm tăng khả năng hấp thụ
thuốc có kiểm soát, tăng khả dụng sinh học của thuốc Omeprazole trong điều trị
bệnh, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Ngiên cứu khả năng giải phóng thuốc
omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa
già”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Thiết kế hệ thống màng CVK được lên men từ môi trường nước dừa già.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK lên
men từ môi trường nước dừa già.
- Sử dụng màng để bảo vệ thuốc Omeprazole tránh tác nhân gây ảnh hưởng
tới thuốc trong quá trình sử dụng.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng và xử lí màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già.
- Thiết kế, chế tạo màng CVK nạp thuốc Omeprazole.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng Omeprazole từ hệ thống CVK đã được
nạp thuốc ở môi trường pH khác nhau, định hướng sử dụng.
4. Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí

nghiệm.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
+ Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK, định hướng việc khắc
phục nhược điểm của thuốc.
+ Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK vào việc khắc phục hạn chế của
thuốc Omeprazole sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không chỉ dừng lại

2

ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên
nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển
hơn. Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của
màng CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính của
màng CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều
lĩnh vực khác nhau.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum.
+ Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng để nghiên cứu khả năng giải
phóng thuốc nhằm khắc phục được những tác dụng phụ không mong
muốn trong việc điều trị rối loạn dạ dày và thực quản bằng thuốc
Omeprazole.
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.

3

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Đặc điểm phân loại của Acetobacter xylinum
1.1.1.1. Vị trí phân loại
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ
Pseudomonadaceae.
Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào.
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc:
+ Lớp: Schizomycetes
+ Bộ: Pseudomonadales
+ Bộ phụ: Pseudomonadieae
+ Họ: Pseudomonadaceae
1.1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng
0,6 - 0,8µm, dài khoảng 2 - 3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di
động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi. Nhưng khi tế bào già hay do điều
kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to
ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh.
Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 – 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu
được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 – 5mm, tròn, nhày, rìa mép
trơn, có màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe
sữa rồi khô dần.
1.1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A. xylinum

4

A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển
từ 25 – 300C, ở 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn và nhiệt độ thích hợp nhất
là 250C. Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối ưu để sản xuất
cellulose là 5,5.

A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau. Tùy thuộc vào
chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho
hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất
thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose.
Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ sung
acid acetic vào môi trường.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa
thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 – 48h lớp
màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 19 ngày.
1.1.2. Cấu trúc và đặc tính của màng CVK tạo bởi Acetobacter xylinum
1.1.2.1. Cấu trúc của màng CVK
Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1,4 glucopyranose
không phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của
CVK giống cellulose của thực vật (plant cellulose – PC), tuy nhiên chúng khác
nhau về cấu trúc đại thể [7].
Theo AJ. Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp
thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 - 8nm.
1.1.2.2. Đặc tính của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng lỏng
thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm

5

tương tự như giấy da với độ dày 0,01 – 0,5nm. Sản phẩm này có những tính chất
rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ
học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không
độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản
khuẩn. Với các tính chất này CVK được ứng dụng rất nhiều trong các ngành

công nghiệp khác nhau trong đó có y học.
1.1.2.3. Sinh tổng hợp CVK
Quá trình lên men:
-

Pha sinh trưởng

-

Pha tích tụ sản phẩm

-

Quá trình tổng hợp cellulose của A. xylinum

1.1.2.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh
dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố
tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Nhu cầu sử dụng đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng
các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường, nước dừa
già, nước mía...để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A. xylinum. Trong đó nước dừa
già được xem là môi trường điển hình trong nuôi cấy A. xylinum.
Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn do trong nước
dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tăng trưởng như 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,...Vì vậy, A. xylinum rất
thích hợp phát triển trong môi trường này.
Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu

6

làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất kém.
1.1.3. Giới thiệu tổng quan về thuốc Omeprazole
Nhóm dược lí: Thuốc đường tiêu hóa
Tên biệt dược: Abacid, Bicasan, Drivo
Dạng bào chế: viên nang; viên nén bao phim; viên nén; bột pha dung dịch
tiêm
Thành phần: Omeprazole
Công thức hóa học:

Công thức phân tử: C17H19N3O3S [1]
Tên khoa học: 5-methoxy-2-[4 methoxy-3,5 dimethyl-2 pyridinyl methyl
sulfinyl] -1H-benzimidazole [1]
Trọng lượng phân tử: 345,4
Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng. Rất khó tan trong nước, tan trong
dicloromethan, hơi tan trong ethanol 96% và methanol, tan trong dung dịch kiềm
loãng [1].
Dược lực: Omeprazole là chất ức chế đặc hiệu tác dụng bằng cách khóa hệ
thống enzyme của Hydrogen-potassium Adenosine Triphosphatase, cũng gọi là
bơm proton H+ K+ ATPase của tế bào thành dạ dày.
Dược động học: Omeprazole bị hủy trong môi trường acid, nên thuốc ở
dưới dạng viên bao không tan ở dạ dày chỉ hấp thụ ở tá tràng, ruột non [16].

7

Thuốc bắt đầu tác dụng 1 giờ sau uống, đạt đỉnh cao nồng độ huyết tương sau 2
giờ, và sự hấp thụ hoàn toàn sau 3 giờ đến 6 giờ.
Omeprazole bị sinh biến đổi ở gan. Các chất chuyển hóa không hoạt tính

trong huyết tương là sulfon, sulfua, hydroxyl omeprazole. 80% các chất chuyển
hóa bài tiết trong nước tiểu, 20% bài thải theo phân.
Thuốc Omeprazole chỉ định: loét tá tràng tiến triển, loét dạ dày tiến triển,
viêm thực quản do hồi lưu dạ dày - thực quản, hội chứng Zollinger - Ellison [1,
12].
Liều tiêu chuẩn: 20mg/ ngày
Tác dụng phụ: thuốc dung nạp tốt. Các triệu chứng như buồn nôn, nhức
đầu, đầy hơi và táo bón rất hiếm. Thỉnh thoảng có ban da nhưng biểu hiện này
thường nhẹ và chóng hết.
1.2. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.1. Trên thế giới
Trên thế giới màng Cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng rất nhiều trong
các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình
xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm
chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y
học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình
điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm
mặt nạ dưỡng da cho con người.
1.2.2. Ở Việt Nam

8

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm
tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết
quả ứng dụng của màng CVK hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm.
Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A. xylinum BHN có khả
năng tạo màng CVK và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng CVK từ

chủng A. xylinum BHN có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để
tạo ra màng trị bỏng cho người [2, 3].
Mong muốn khắc phục được những tác dụng phụ của thuốc Omeprazole
trong chữa bệnh viêm loét dạ dày, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết
kiệm được chi phí. Màng CVK có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn
nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc
nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole.

9

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu
2.1.1 Chủng vi sinh
Vi khuẩn tạo Cellulose từ dịch trà xanh lên men [5, 9, 11] được nuôi cấy tại
Phòng sạch Vi sinh - Động vật, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường
ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1:
Bảng 2.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
STT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

1

Omeprazole

Mỹ

2

Nước dừa già

3

D- Glucose

Trung Quốc

4

Axit acetic

Việt nam

5

Amoni sulfat

Trung Quốc

6

Disodium phosphate

Trung Quốc

7

Axit citric

Trung Quốc

8

Peptone

European Union

9

Natri hidroxit

Việt Nam

10

Nước cất 2 lần

Viện NCKH và UD trường
Đại học Sư phạm HN 2

11

Ethanol

Nhà máy hóa chất Đức Giang

12

Kali dihidrophotphat

Trung Quốc

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu như bảng 2.2:

10

Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị

Nước sản xuất

Địa điểm nghiên cứu

Nồi hấp khử trùng HV- Nhật Bản

Viện NCKH&ƯD Trường

110/HIRAIAMA

ĐHSP Hà Nội 2

Máy đo quang phổ UV- Shimadru - Nhật Bản

Viện NCKH&ƯD Trường

Vis 2450

ĐHSP Hà Nội 2

Cân phân tích, cân kĩ Sartorius - Thụy Sỹ

Viện NCKH&ƯD Trường

thuật

ĐHSP Hà Nội 2

Buồng cấy vô trùng

Haraeus

Viện NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Tủ sấy, tủ ấm

Binder - Đức

Viện NCKH&ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2

Khuấy

từ

gia

nhiệt IKA - Đức

Viện NCKH&ƯD Trường

CC162

ĐHSP Hà Nội 2

Máy lắc tròn tốc độ chậm Orbital

Viện NCKH&ƯD Trường

Shakergallenkump

– ĐHSP Hà Nội 2

Anh
Tủ lạnh Daewoo, tủ

Viện

lạnh sâu

NCKH&ƯD

Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Bình tam giác có chia vạch, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh có chia vạch,
bình thủy tinh, lọ penicilin, đèn cồn, kẹp gỗ, thước, gạc vô trùng, giấy lọc, giấy
bạc và các dụng cụ hóa sinh thông dụng.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum.

11

- Xử lí màng CVK thô để thu được CVK tinh chế.
- Cho màng CVK nạp thuốc Omeprazole.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole từ hệ thống đã làm,
từ đó chọn ra hệ thống màng cho khả năng giải phóng thuốc chậm nhất.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men
Đun sôi 1000ml nước, bổ sung 20g trà xanh để trong thời gian 10 - 15
phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 100g đường khuấy
đều, để nguội. Sau 7 – 10 ngày ở nhiệt độ 30oC thu được dịch trà đường lên men
(chứa vi khuẩn Acetobacter: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum,... )
[5, 9, 11] và miếng thạch nổi lên trên bề mặt.
2.3.2. Phương pháp tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già
A. xylinum được nuôi cấy trong môi trường cải biến từ môi trường chuẩn
Hestrin - Schramm và được trình bày ở bảng 2.3 dưới đây:
Bảng 2.3: Thành phần môi trường tạo màng CVK
Glucose 20g

Nước dừa già 1000ml

KH2PO4 0,3g

Acid axetic 2%

(NH4)2SO4 0,5g

10% dịch giống A. xylinum

Pepton 10g
Hấp trong nồi khử trùng ở 113°C, 15 phút. Sau đó môi trường được khử
trùng bằng tia UV trong 30 phút để nguội môi trường rồi bổ sung thêm 10% dịch
giống và 2% acid acetic. Cuối cùng, ủ tĩnh trong khoảng 6 - 14 ngày ở 26°C 
thu màng.

12

2.3.3.Phương pháp xử lý màng CVK trước khi nạp Omeprazole
Sau khi ủ tĩnh trong 6 - 14 ngày ở 26°C, màng CVK được nhúng vào nước
cất, và sau đó các màng CVK được tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy
trình được thể hiện ở sơ đồ hình 2.1 dưới đây:

Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48h, rửa và ép
Hấp trong nồi hấp
113℃, 1 giờ
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
CVK tinh chế

Hình 2.1: Sơ đồ tinh chế màng CVK
-Tách CVK: trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
- Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong
NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi
khuẩn [4].
- Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước cất 2 lần
rồi ép màng, sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48h để trung hòa hết NaOH.

13

- Ngâm nước: Màng sau khi ngâm với HCl rửa sạch bằng nước cất 2
lần rồi ép màng. Ngâm nước cất 2 lần để trung hòa hết acid trong khoảng
48h ta thu được Cellulose vi khuẩn tinh chế [4].
2.3.4. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu CVK
Nhằm đảm bảo cho vật liệu CVK sau khi xử lý đã loại được các tạp chất
có thể gây độc hại. Sử dụng đường glucose và protein của vi khuẩn là chất
để khảo sát.
* Tìm sự hiện diện của glucose trong CVK tinh chế
Nguyên tắc: + Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện
diện của đường D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ [3].
Tiến hành:
+ Dịch thử của vật liệu CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
+ Mẫu đối chứng là nước cất và dung dịch D – glucose.
+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử
Fehling rồi ngâm trong cốc nước nóng.
+ Quan sát màu sắc kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
*Tìm sự hiện diện của protein trong vật liệu CVK tinh chế
Nguyên tắc: Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo kết tủa

của protein với acid triclor acetic.
Tiến hành: + CVK tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất, lắc kỹ
với máy rung siêu âm trong 10 phút.
+ Dùng dung dịch acid triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của
protein trong dịch chiết màng.
+ Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1%
(pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn).

14

+ Phản ứng dương tính khi cho kết tủa đục. So sánh với mẫu chứng âm
không chứa protein [3].
Vật liệu CVK tinh chế dùng để tạo màng nạp thuốc phải đạt được những
tính chất sau:
+ Cảm quan: mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính
che phủ tốt.
+ Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô.
2.3.5. Phương pháp dựng đường chuẩn
Nguyên lí: Sử dụng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 đo mật độ quang
phổ (OD) của Omeprazole ở các nồng độ khác nhau với bước sóng 275nm.
Máy quang phổ bao gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh
sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. Và có hai cuvet đo dùng cho dung dịch
thử và dung dịch đối chiếu được làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài
quang trình của cốc đo là ±0,005cm. Các cuvet đo được làm sạch và thao tác
thận trọng [1].
Thực hiện:
+ Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: NaOH 0,1N.
+ Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn chứa thuốc Omeprazole ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau: 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% mg/ml trong dung môi

NaOH 0,1N.
+ Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần
và đo quang phổ 3 lần, lấy giá trị trung bình để xây dựng đường chuẩn.
Phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng:
y = ax + b với R2 là hệ số tương quan
Trong đó:

y: độ hấp thu của dung dịch tại λmax

15

x: nồng độ của dung dịch
Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau.
Làm tương tự trên khảo sát phổ Omeprazole và xây dựng khoảng tuyến tính
định lượng (đường chuẩn) của Omeprazole trong môi trường pH = 2,0; 4,5 và
6,8.
2.3.6. Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK
Sử dụng màng CVK được tạo ra từ nước dừa già có kích thước 0,5cm
và độ dày 1cm, đem hấp thụ theo các thông số thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa.
Dùng máy đo quang phổ UV - 2450 xác định lượng Omeprazole trong
CVK đã nạp thuốc.
Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn ta được
nồng độ Omeprazole (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng
Omeprazole có trong dung dịch theo công thức số 1:
C% (w/v) = x 100% (1)
Trong đó: C% là nồng độ phần trăm khối lượng - thể tích chỉ số
mg chất tan có trong 100ml dung dịch.
mct: khối lượng chất tan (mg).
Vdd: thể tích của dung dịch (ml).

Sau khi tính được lượng thuốc Omeprazole có trong dung dịch ta tính
được khối lượng thuốc Omeprazole được hấp thụ vào màng CVK theo công thức
2:
mht = m1 - m2 (2)
Trong đó: mht là khối lượng thuốc Omeprazole được hấp thụ vào
màng CVK (mg).
m1 là khối lượng thuốc Omeprazole ban đầu (mg).

16

m2 là khối lượng thuốc Omeprazole trong dung dịch sau
khi hấp thụ (mg).
Hiệu suất nạp thuốc vào màng CVK được tính theo công thức 3:
EE (%) = mht/m1 x 100% (3)
Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào màng.
2.3.7. Chuẩn bị môi trường đệm
Pha 3 dung dịch đệm có pH là 2; 4,5; 6,8 theo cách pha chế một số dung
dịch chuẩn độ theo Dược điển Việt Nam [1].
+ Dung dịch đệm pH = 2,0: Hoà tan 6,57g kali clorid trong nước, thêm
119ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1000ml, đo pH và
hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng HCl hoặc NaOH).
+ Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong
1000ml nước, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH).
+ Dung dịch đệm pH = 6,8: Hoà tan 28,80g dinatri hydrophosphat và
11,45g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH
nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH).

17

Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc omeprazole của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về