TẬN DỤNG PHỤ PHẨM CÁ TRA BẰNG ENZYME PROTEASE TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA THỦY SẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẬN DỤNG PHỤ PHẨM CÁ TRA BẰNG ENZYME
PROTEASE TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis

Họ và tên sinh viên: TRẦN THỊ HỒNG NGHI
Ngành: CHẾ BIẾN THỦY SẢN
Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 09/2009


TẬN DỤNG PHỤ PHẨM CÁ TRA BẰNG ENZYME PROTEASE TỪ VI
KHUẨN Bacillus subtilis

Tác giả

TRẦN THỊ HỒNG NGHI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành
Chế Biến Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn:
PGS.TS LÊ THANH HÙNG
Th.S TRƯƠNG QUANG BÌNH

Tháng 09 năm 2009

i


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Các thầy cô trong khoa Thủy sản cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong
suốt bốn năm qua.
PGS.TS Lê Thanh Hùng và Th.S Trương Quang Bình đã tận tình hướng dẫn và
động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Th.S Trương Phước Thiên Hoàng và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc
Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Cùng tất cả các bạn đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm
đề tài.
Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Tận dụng phụ phẩm cá Tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn
Bacillus subtilis” được tiến hành trong thời gian từ 04/2009 đến 09/2009 với mục đích
khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân để tạo ra dịch đạm cao. Đồng
thời, khảo sát tỷ lệ mỡ thu được trong quá trình thủy phân. Sau đó, chúng tôi tiến hành
ủ dịch đạm này qua bã chượp cá cơm để gây hương nước mắm.
Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi kết luận như sau:
Quá trình thủy phân thích hợp ở tỷ lệ nước là 30%, nồng độ muối 2%, tỷ lệ

enzyme 4% và thời gian thủy phân 18 giờ sẽ cho hiệu suất thủy phân cao nhất là
81,75%, nitrogen formol 14,3 g/l, nitrogen tổng số 16,75 g/l và nitrogen NH3 1,22 g/l.
Dịch đạm thủy phân này phù hợp làm nước mắm.
Tỷ lệ nước và tỷ lệ enzyme không ảnh hưởng đến tỷ lệ thu hồi mỡ, thời gian thu
hồi mỡ là 20 giờ.
Mỡ thu được sau thủy phân có hàm lượng chất béo chiếm 95,8%, đạt chỉ số
acid 0,41 mg KOH/g, chỉ số Iod 29,24 g I2/100g và chỉ số peroxyt 0,47 ml Na2S2O3.
Khi tiến hành ủ dịch đạm thủy phân thu được qua bã chượp để gây hương nước
mắm thì thời gian ủ là 10 ngày với tỷ lệ bã chượp thích hợp 20%. Nước mắm đạt loại
khá với hàm lượng acid amin 13,01 g/l, nitrogen tổng số 16 g/l và nitrogen NH3 1,49
g/l và không có vi sinh vật gây hại.

iii


MỤC LỤC
Đề mục

Trang

Trang tựa.................................................................................................................... i
Lời cảm ơn................................................................................................................ii
Tóm tắt.....................................................................................................................iii
Mục lục .................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................vii
Danh sách các bảng ...............................................................................................viii
Danh sách biểu đồ và hình........................................................................................ x
Chương 1. GIỚI THIỆU ........................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2

1.3 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................... 3
2.1

Khái quát chung về enzyme ........................................................................... 3

2.1.1 Khái niệm về enzyme ..................................................................................... 3
2.1.2 Cấu tạo, tính chất và cơ chế tác dụng của enzyme......................................... 4
2.1.3 Ứng dụng của enzyme .................................................................................... 8
2.2

Tổng quan enzyme protease ........................................................................... 8

2.2.1 Khái quát chung về enzyme protease ............................................................ 8
2.1.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận protease ......................................................... 10
2.1.3 Ứng dụng của enzyme protease................................................................... 11
2.3

Tổng quan Bacillus subtilis ......................................................................... 13

2.4

Tổng quan về cá Tra .................................................................................... 15

2.4.1 Phân loại ..................................................................................................... 15
2.4.2 Đặc điểm sinh học ...................................................................................... 15
2.4.3 Sản lượng, giá trị kinh tế cá Tra .................................................................. 15
2.4.4 Một số nghiên cứu về thủy phân phụ phẩm cá trong và ngoài nước........... 17
2.4.5 Giới thiệu phụ phẩm cá Tra......................................................................... 18
2.4.6 Thành phần hóa học của cá Tra................................................................... 19

iv


2.4.7 Thành phần thể trọng của cá Tra ................................................................. 20
2.4.8 Muối............................................................................................................. 21
2.4.9 Quá trình amôn hóa protein......................................................................... 22
2.4.10 Quá trình thủy phân của protein cá.............................................................. 23
2.5

Giới thiệu về nước mắm .............................................................................. 27

Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 29
3.1

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................... 29

3.2

Vật liệu và dụng cụ...................................................................................... 29

3.2.1 Vật liệu ........................................................................................................ 29
3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất....................................................................... 29
3.3

Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 30

3.3.1 Phương pháp tinh sạch enzyme protease..................................................... 30
3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần của cơ chất dùng để thủy phân........... 30
3.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỷ lệ nước ảnh hưởng đến quá trình thủy phân .... 30
3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ muối ảnh hưởng đến quá trình thủy phân30

3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát tỷ lệ enzyme thủy phân......................................... 31
3.3.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát thời gian thủy phân ............................................... 31
3.3.7 Các chỉ tiêu khảo sát hiệu quả của quá trình thủy phân .............................. 31
3.3.8 Thí nghiệm 6: Ứng dụng thủy phân nguyên liệu với các điều kiện đã được
chọn ............................................................................................................. 32
3.3.9 Phương pháp đánh giá cảm quan................................................................. 32
3.3.10 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 32
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 33
4.1

Quy trình tinh sạch enzyme protease........................................................... 33

4.2

Kết quả khảo sát thành phần của cơ chất dùng để thủy phân...................... 34

4.3

Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân ................ 35

4.4

Kết quả khảo sát nồng độ muối bổ sung vào quá trình thủy phân .............. 36

4.5

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme bổ sung vào quá trình
thủy phân ..................................................................................................... 37

4.6

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân ........... 38

4.7

Ứng dụng chế phẩm protease trong thủy phân phụ phẩm cá với các điều
v


kiện tối ưu đã được chọn ............................................................................. 40
4.8

Kết quả đánh giá cảm quan của sản phẩm nước mắm sau ủ chượp ........... 42

4.9

Quy trình sản xuất thử nghiệm nước mắm ................................................. 45

4.10

Thời gian và chi phí sản xuất...................................................................... 49

4.10.1 Thời gian..................................................................................................... 49
4.10.2 Chi phí sản xuất .......................................................................................... 49
4.11

Thiết kế nhãn .............................................................................................. 50

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 51
5.1

Kết luận........................................................................................................ 51

5.2

Đề nghị ........................................................................................................ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASEAN

Association of South-East Asian Nations

CNSH

Công nghệ sinh học

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

EU

Eurorpean Union

HSHC

Hệ số hiệu chỉnh

HSTNdht

Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan

HSTP

Hiệu suất thủy phân

NL

Nguyên liệu

UI

International Unit

VASEP

Viet Nam Association of Seafood Exporters and Producers

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1 Một số nguồn protease động vật và thực vật ...........................................10
Bảng 2.2 Thị trường xuất khẩu cá Tra và Basa của Việt Nam năm 2007................17
Bảng 2.3 Thành phần thể trọng của cá Tra nuôi bè..................................................20
Bảng 2.4 Thành phần thể trọng của cá Tra nuôi ao..................................................20
Bảng 2.5 Thành phần hóa học trung bình của fillet cá Tra nuôi bè .........................20
Bảng 2.6 Thành phần hóa học trung bình của fillet cá Tra nuôi ao .........................21
Bảng 2.7 Nồng độ muối làm vi sinh vật ngừng phát triển .......................................24
Bảng 4.1 Thành phần khối lượng của phụ phẩm cá dùng để thủy phân ..................34
Bảng 4.2 Thành phần các loại đạm có trong phụ phẩm cá ......................................34
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra .....35
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến tỷ lệ thu hồi mỡ ...................................... 36
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra36
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến quá trình thủy phân phụ phẩm
cá Tra ........................................................................................................37
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến tỷ lệ thu hồi mỡ ..................................38
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra ......39
Bảng 4.9 Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ thu hồi mỡ ........................................40
Bảng 4.10 Thành phần dịch thủy phân......................................................................41
Bảng 4.11 Thành phần khối lượng sau khi thủy phân một kg phụ phẩm..................41
Bảng 4.12 Chỉ tiêu mỡ cá sau thủy phân...................................................................42
Bảng 4.13 Ảnh hưởng của phương pháp thu hồi mỡ đến chất lượng mỡ thô ...........42
Bảng 4.14 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của nước mắm có tỷ lệ bã chượp
10% ...........................................................................................................42
Bảng 4.15 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của nước mắm có tỷ lệ bã chượp
20% ...........................................................................................................43
Bảng 4.16 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của nước mắm có tỷ lệ bã chượp
30% ...........................................................................................................43
Bảng 4.17 Thành phần nước mắm sau khi ủ bã chượp cá.........................................48

viii


Bảng 4.18 Chi phí để thủy phân một kg phụ phẩm cá ..............................................49
Bảng 4.19 Giá bán của một số sản phẩm trên thị trường ..........................................50

ix


DANH SÁCH BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH
Biểu đồ
Biểu đồ 2.1 Sản lượng và giá trị xuất khẩu cá Tra và Basa 2003 – 2007 .................16
Hình
Hình 2.1 Cấu trúc enzyme ....................................................................................... 4
Hình 2.2 Bacillus subtilis ..........................................................................................13
Hình 2.3 Cá Tra .........................................................................................................15
Hình 4.1 Phụ phẩm cá Tra ........................................................................................48
Hình 4.2 Cá xay nhỏ .................................................................................................48
Hình 4.3 Trước thủy phân ........................................................................................49
Hình 4.4 Sau thủy phân .............................................................................................49
Hình 4.5 Ủ chượp cá..................................................................................................49
Hình 4.6 Xương cá Tra..............................................................................................50
Hình 4.7 Bã cá Tra.....................................................................................................50
Hình 4.8 Dịch sau thủy phân .....................................................................................50
Hình 4.9 Mỡ cá ..........................................................................................................50
Hình 4.10 Sản phẩm nước mắm ................................................................................51

x

Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Với điều kiện khí hậu thích hợp và tiềm năng to lớn về trữ lượng, thành phần
các nguồn tài nguyên sinh vật biển, việc khai thác nguồn lợi từ biển từ lâu đã trở thành
một trong những mục tiêu hàng đầu trong chiến lược phát triển kinh tế Việt Nam. Trị
giá thủy sản xuất khẩu tăng mạnh trong những năm gần đây đã làm cho thủy sản trở
thành một trong những ngành mũi nhọn để tăng kim ngạch xuất khẩu. Trong đó, nổi
bậc nhất là nghề nuôi trồng, khai thác và chế biến các loài cá da trơn ở các tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long. Khi sản lượng xuất khẩu ngày càng gia tăng, lượng cá tiêu thụ
ngày càng nhiều thì những phụ phẩm cá từ quá trình chế biến cũng tăng theo.
Theo hiệp hội thủy sản Việt Nam (VASEP) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long hiện
có trên 70 nhà máy chế biến mặt hàng fillet cá Tra trong năm 2006. Năm 2007, nếu
sản lượng cá nguyên liệu đạt 1 triệu tấn thì các nhà máy chế biến phải thải ra thị
trường hơn 600.000 tấn phụ phẩm cá Tra. Với nguồn phụ phẩm vô cùng lớn như vậy
nếu không có cách giải quyết thì lượng phụ phẩm này sẽ trở thành một gánh nặng cho
các doanh nghiệp, đặc biệt là trong việc bảo vệ môi trường. Thực tế khoảng 5 năm trở
lại đây, phụ phẩm cá Tra (đầu, xương sống, ruột, kỳ vi) được tận dụng tối đa chế biến
thành thức ăn công nghiệp phục vụ chăn nuôi sau khi đã nấu lấy mỡ. Bong bóng cá
bán cho những đại lý chuyên thu mua sấy khô cung cấp cho các nhà hàng nấu súp. Bao
tử cá làm sạch bán cho các quán ăn đặc sản. Da cá xuất khẩu sang Châu Âu phục vụ
công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm. Riêng mỡ cá chiếm từ 15 – 20% trọng lượng được
các cơ sở chế biến nấu thành mỡ nước cung ứng cho thị trường (Lê Hùng Anh, 2007).

1


Từ thực tế nguồn phụ phẩm cá Tra dồi dào có quanh năm việc xử lý phụ phẩm
cá Tra hiệu quả và thân thiện với môi trường càng trở nên cần thiết. Do đó, việc xử lý
nguồn phụ phẩm này bằng biện pháp sinh học là một lựa chọn hàng đầu. Trong đó,

enzyme thủy phân là một lựa chọn có thể để thu hồi protein và được nhận thấy sử dụng
rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm do tạo ra những sản phẩm có nhiều công dụng
và giá trị dinh dưỡng cao (Min-Tian Gao và ctv, 2005).
Từ thực tế trên để tận dụng và đa dạng hóa sản phẩm chế biến từ nguồn phụ
phẩm cá Tra của các nhà máy chế biến thủy sản, chúng tôi thực hiện đề tài “Tận dụng
phụ phẩm cá Tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis” nhằm làm
cho các nhà máy đông lạnh thủy sản chế biến phụ phẩm cá Tra khắc phục được những
trở ngại trong việc hạn chế sự tổn thất hàm lượng đạm thải ra ngoài gây ô nhiễm môi
trường, đồng thời giúp gia tăng hiệu quả kinh tế cho nhà máy.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Thủy phân protein cá trong điều kiện tốt nhất với sự tham gia của enzyme
protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis.
Thử nghiệm sản xuất nước mắm và thu hồi mỡ cá từ phụ phẩm cá Tra.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân của enzyme protease
như nồng độ muối, tỷ lệ nước, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân cần thiết cho
quá trình thủy phân. Đồng thời, khảo sát tỷ lệ mỡ thu được trong quá trình thủy phân.
Xây dựng qui trình thủy phân phụ phẩm cá Tra có thể áp dụng trong sản xuất
dịch đạm phục vụ cho sản xuất nước nắm.
Tìm tỷ lệ giữa chượp cá và dịch đạm thích hợp để sản xuất nước mắm.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát chung về enzyme
Hiện nay, ngành khoa học nghiên cứu về enzyme đã trở thành một ngành khoa
học mũi nhọn, phát triển rất nhanh trên thế giới, phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt
chẽ tới các ngành như hóa lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học. Hàng năm

trên thế giới xuất hiện hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của
enzyme, các phương pháp tách chiết và tinh chế enzyme, sự điều hòa rối loạn hoạt
động của cơ thể ở trạng thái sinh lý và bệnh lý của enzyme.
2.1.1 Khái niệm về enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, nó được cơ thể sinh vật
tổng hợp nên và tham gia xúc tác cho tất cả các phản ứng sinh hóa trong cơ thể
(Nguyễn Đức Lượng, 2001).
Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia phản ứng sinh hóa:
Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh
hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
Enzyme có thể tham gia các phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất
cao.
Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền, khi đó sản phẩm phản
ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.
Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng
enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy

3


ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi
enzyme.
Enzyme không bị mất đi trong phản ứng, do đó sau khi kết thúc một phản
ứng, các enzyme hoàn toàn được tự do và lại tham gia xúc tác phản ứng mới (trong
điều kiện không bị tác động bởi các yếu tố có hại đến cấu trúc của chúng như nhiệt độ,
pH).
Những ưu điểm cơ bản trên tạo cho enzyme đặc tính hoàn hảo khi tham gia các
phản ứng sinh hóa trong tế bào (Nguyễn Đức Lượng, 2001).
2.1.2 Cấu tạo, tính chất và cơ chế của enzyme

2.1.2.1 Cấu tạo
Bản chất hóa học của enzyme là protein, chúng có phân tử lượng từ 20.000 đến
100.000 dalton.
Enzyme được cấu tạo từ các L – α acid amin, các acid amin kết hợp với nhau
qua liên kết peptide. Dưới tác động của enzyme peptihydrolase, acid hoặc kiềm,
enzyme bị thủy phân hoàn toàn và kết quả là thu được các acid amin, trong một số
trường hợp ngoài acid amin còn thu được các chất khác. Nếu sau khi thủy phân sản
phẩm chỉ có acid amin thì enzyme đó thuộc loại enzyme đơn cấu tử, còn nếu sau khi
thủy phân ngoài acid amin còn có các thành phần khác thì enzyme này được gọi là
enzyme đa cấu tử.
Các enzyme trong tế bào thường là các protein có cấu trúc bậc bốn (hình 2.1).
Vì thế, nếu chúng bị tác động bởi một số yếu tố nhất định thì chúng sẽ phân ly để tạo
thành các phần dưới đơn vị (protome), lúc này hoạt tính của enzyme sẽ bị mất hoàn
toàn. Khi gặp điều kiện thuận lợi các protome này lại có khả năng kết hợp với nhau,
khi đó hoạt tính của enzyme lại được phục hồi.
Cấu trúc bậc 1

Cấu trúc bậc 2

Cấu trúc bậc 3

Hình 2.1: Cấu trúc của enzyme
4

Cấu trúc bậc 4


Trong quá trình xúc tác không phải toàn bộ tất cả các phần của enzyme tham
gia mà chỉ có một vùng giới hạn của phân tử enzyme tham gia phản ứng. Vùng giới
hạn tham gia phản ứng này được gọi là trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động của

enzyme do một số acid amin đảm trách, cụ thể:
Ở enzyme đơn cấu tử, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ hợp các
nhóm định chức của acid amin không tham gia vào trục chính của sợi polypeptide. Các
nhóm này có thể ở xa nhau trong mạch polypeptide nhưng chúng lại gần nhau trong
không gian, khoảng cách giữa chúng được xác định sao cho chúng có thể tương tác với
nhau trong quá trình xúc tác.
Ở enzyme đa cấu tử, trung tâm hoạt động của chúng là nhóm ngoại và nhóm
định chức của acid amin nằm ở apoenzyme.
Điểm đặc biệt của trung tâm hoạt động là chúng có cấu hình không gian rất
tương ứng với cấu trúc của cơ chất. Cấu hình không gian này của enzyme được hình
thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất. Khi enzyme tương tác với cơ chất,
các nhóm chức ở phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme sẽ thay đổi vị trí
không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể cơ chất.
Ở tế bào động vật tồn tại một loại enzyme không tham gia phản ứng ngay,
muốn có khả năng hoạt động chúng phải được hoạt hóa. Trung tâm hoạt động của loại
enzyme này tồn tại ở dạng chưa được hoạt hóa và được gọi là zymogen hay
proenzyme, ví dụ như enzyme pepxinogen, tripxinogen, kimotripxinogen hay
protrombin. Các enzyme này có thể tự hoạt hóa hoặc nhờ tác dụng của một enzyme
nào đó hoặc một yếu tố nào đó, khi đó một số liên kết peptide trong phân tử zymogen
bị mất, enzyme sẽ được hoạt hóa. Trong một số trường hợp khác có sự sắp xếp lại các
nhóm chức trong phân tử enzyme, khi đó sẽ hình thành trung tâm hoạt động của
enzyme ở trạng thái hoạt hóa.
Ở những enzyme dị lập thể (enzyme điều hòa) còn có trung tâm dị lập thể
(trung tâm điều hòa), các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất khác, các cơ
chất tương tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa. Khi trung tâm điều hòa tương
tác với chất điều hòa, chúng sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt
động, khi đó tốc độ phản ứng enzyme sẽ bị thay đổi. Nếu tốc độ phản ứng enzyme
được tăng lên khi chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất điều hòa này
5

được gọi là chất điều hòa dương, ngược lại nếu tốc độ phản ứng enzyme giảm xuống
thì chất điều hòa được gọi là chất điều hòa âm. Các chất điều hòa hoàn toàn không
biến đổi khi chúng tương tác với enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.1.2.2 Tính chất của enzyme
a. Cường lực xúc tác
Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó có đầy đủ các tính chất của một chất xúc
tác. Tuy nhiên so với chất xúc tác thường thì enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn
nhiều (Lê Ngọc Tú và ctv, 2005).
b. Tính đặc hiệu của enzyme
Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác cho sự chuyển
hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định, đây là tính chất
quan trọng nhất của enzyme.
Tính đặc hiệu của enzyme có liên quan đến cấu trúc không gian ba chiều của
enzyme. Vì enzyme là một protein có cấu trúc không gian ba chiều nên việc tương tác
giữa enzyme và cơ chất xảy ra chỉ khi enzyme và cơ chất tương ứng với nhau về cấu
trúc không gian (cụ thể là hình dạng và các nhóm tích điện) và cơ chất có khả năng lấp
đầy bề mặt của enzyme đó.
Tính đặc hiệu của enzyme được biểu hiện như sau:
™ Đặc hiệu phản ứng: tính đặc hiệu này thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ có thể
xúc tác cho một trong các kiểu phản ứng chuyển hóa một chất nhất định.
™ Đặc hiệu cơ chất: mỗi một cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng.
Các enzyme có thể phân biệt được những cơ chất mà nó sẽ tác dụng. Khả năng này
còn thấy rất rõ khi trong quá trình phản ứng tồn tại các dạng đồng phân. Tuy nhiên
mức độ đặc hiệu của các enzyme rất khác nhau và được phân biệt thành các mức sau:
Đặc hiệu tuyệt đối: khả năng tác động của enzyme lên một cơ chất nhất
định, ngoài cơ chất này ra enzyme hoàn toàn không có khả năng tác dụng lên một loại
cơ chất nào khác.
Đặc hiệu tương đối: khả năng của enzyme tác động lên một kiểu liên kết
hóa học nhất định của phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần

tham gia tạo thành các mối liên kết đó.

6


Đặc hiệu nhóm: khả năng của enzyme tác động lên một kiểu liên kết hóa
học với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác
định.
Đặc hiệu quang học: nếu có hai dạng đồng phân quang học thì enzyme chỉ
tác dụng lên một trong hai dạng đồng phân quang học đó (Lê Ngọc Tú và ctv, 2005).
2.1.2.3 Cơ chế tác dụng của enzyme
Bản chất của cơ chế tác dụng bởi enzyme trong các phản ứng hóa học là khả
năng hoạt hóa cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn.
Trong phản ứng có xúc tác enzyme nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian
enzyme – cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa, khi cơ chất kết hợp vào enzyme do kết
quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết
tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết
quả làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng.
Điểm đặc biệt là khi enzyme tham gia xúc tác thì năng lượng cần cho phản ứng
xảy ra không những nhỏ hơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác mà còn nhỏ
hơn so với trường hợp có chất xúc tác thông thường.
Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai đoạn:
E + S → ES → P + E
Trong đó:
E: enzyme
S: cơ chất
P: sản phẩm
Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành
phức ES không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa
thấp.

Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ
các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
Giai đoạn thứ ba: sản phẩm được tạo thành, enzyme được giải phóng và trở
lại trạng thái tự do.
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức ES: liên kết
hydro, tương tác tĩnh điện, tương tác Vanderwaals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những
7


điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước (Nguyễn Phước Nhuận
và ctv, 2003).
2.1.3 Ứng dụng của enzyme
Trong khoảng hai mươi năm trở lại đây, enzyme được ứng dụng rất rộng rãi
trong nhiều ngành khác nhau của nền kinh tế quốc dân: trong hóa học, trong y học,
trong công nghiệp nhẹ và đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm. Do đó ở nhiều
nước trên thế giới, việc sản xuất các chế phẩm enzyme đã trở thành một ngành công
nghiệp lớn.
Hiện nay có hai hướng ứng dụng enzyme:
Hướng thứ nhất: sử dụng có định hướng các enzyme có trong tế bào sống của
vi sinh vật. Theo hướng này việc sử dụng enzyme đồng nghĩa với việc sử dụng tế bào
vi sinh vật trong quá trình sản xuất. Ứng dụng này chỉ có ý nghĩa khi sản phẩm của sự
tham gia phản ứng là sản phẩm không tinh khiết. Đây là hỗn hợp các sản phẩm được
tạo thành trên cơ sở có sự tham gia của hàng loạt enzyme vì trong tế bào vi sinh vật
sống tồn tại hàng loạt các enzyme tham gia những phản ứng sinh hóa khác nhau, sản
phẩm của phản ứng này là nguyên liệu hay cơ chất cho phản ứng kế tiếp.
Hướng thứ hai: sử dụng enzyme này hoàn toàn không liên quan gì đến tế bào
sống của vi sinh vật. Ở đây, các loại enzyme được tách ra khỏi tế bào và được tinh chế
hoặc không tinh chế. Sử dụng enzyme theo hướng này người ta không quan tâm đến tế
bào vi sinh vật đó sống hay chết mà quan tâm đến khối lượng sinh khối vi sinh vật
chứa nhiều enzyme và có hoạt tính cao. Công việc ứng dụng chỉ bao gồm việc tạo điều

kiện thuận lợi cho enzyme hoạt động chứ không phải tạo điều kiện cho vi sinh vật phát
triển. Theo hướng này sản phẩm của sự tham gia phản ứng hầu như là sản phẩm tinh
khiết (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.2 Tổng quan enzyme protease
2.2.1 Khái quát chung về enzyme protease
Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptide
ngắn và cuối cùng là tạo thành các acid amin và NH3.
Enzyme protease được các nhà khoa học nghiên cứu đầu tiên không phải là các
protease của vi sinh vật mà là các protease của động vật, chủ yếu là protease trong hệ
tiêu hóa của động vật. Năm 1936, Schwann đã quan sát khả năng phân giải của
8


protease của dịch vị, sau 30 năm (1857) Corvisart mới tách được enzyme này. Đây
được coi như protease ở dạng chế phẩm đầu tiên trên thế giới về enzyme protease. Các
loại protease của thực vật được nghiên cứu chậm hơn các nghiên cứu protease động
vật, mãi đến năm 1874 Besaner mới công bố kết quả nghiên cứu protease từ đậu. Năm
1879 Wurtz nghiên cứu nhựa quả đu đủ cho thấy chúng có khả năng thủy phân protein,
sau đó là hàng loạt nghiên cứu của Wilstaller, Gnassmam, Ambnos về bromelin,
protease ở mô động vật.
Từ những năm 1950, sau khi hoàn thiện phương pháp tinh sạch protease người
ta đã thu nhận được những chế phẩm protease tinh khiết hơn và cũng từ đây các nhà
khoa học bắt đầu những nghiên cứu protease của vi sinh vật. Khác với protease của
thực vật (ficin, papain, bromelin) và động vật (trypsine, pepsine, rennet), protease của
vi sinh vật là những enzyme ngoại bào và có tính đặc hiệu rộng rãi. Dựa vào đặc trưng
của trung tâm hoạt động, người ta cũng có thể phân protease của vi sinh vật thành
protease serin, protease thiol, protease kim loại và protease acid; nếu dựa vào pH tác
dụng tối ưu thì người ta chia protease của vi sinh vật thành protease acid, protease
trung tính, protease kiềm.
Ngày nay, các loại enzyme protease từ vi sinh vật được sản xuất rất nhiều và

được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp vì chúng có ưu điểm lớn là rất
phong phú về chủng loại. Các chế phẩm protease ứng dụng trong công nghiệp đều thu
được từ canh trường nấm mốc (Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus
sojae, Aspergilus fumigatus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus,
Bacillus circulans, Bacillus thermophilus) và xạ khuẩn (Actinomyces fradiae,
Actinomyces rimosus, Actinomyces griseus).
Chế phẩm protease tinh khiết từ vi khuẩn Bacillus có thể thủy phân hoàn toàn
protein, chế phẩm này có tên gọi subtilisine. Khi tác dụng trên casein thì hoạt độ sẽ
cực đại khi pH trung hòa. Chế phẩm protease từ Bacillus mesentericus cũng thủy phân
được các protein của động vật và thực vật đến acid amin và peptide. Điều đáng lưu ý
là các chế phẩm protease từ những vi khuẩn này còn có khả năng làm đông sữa. Do đó
trong sản xuất fromage người ta thay thế một phần rennin động vật bằng chế phẩm từ
Bacillus mesentericus này.

9


Ngoài ra một số chế phẩm protease của vi khuẩn còn có hoạt độ elastase,
nghĩa là chỉ có thể thủy phân các liên kết peptide kề liền bên gốc acid amin trung tính,
đây cũng là điểm khác với protease của nấm mốc (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.2.2 Nguồn nguyên liệu thu nhận protease
Protease có ở tất cả động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, sự phân bố của
chúng không đồng đều ở các loài, các mô và các cơ quan. Một số loài, cơ quan và mô
của động thực vật có chứa một hoặc một số protease nhất định có thể dùng làm nguyên
liệu để tách các enzyme tương ứng.
Sau khi được tổng hợp, protease có thể được tiết ra ngoài tế bào gọi là enzyme
ngoại bào hoặc tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường gọi là enzyme nội
bào và chỉ có thể nhận được các enzyme này sau khi đã phá vỡ tế bào.
Một số protease ngoại bào đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong nông nghiệp và y học. Một số vi

khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc có thể được dùng để sản xuất protease.
Bảng 2.1: Một số nguồn protease động vật và thực vật
Nguyên liệu
- Tụy tạng
- Màng nhày dạ dày
- Dạ dày động vật có sừng,
còn non
- Gan, lá lách, thận, phổi,
cơ lá lách, tim, cơ thận, dạ
non (mô cơ)
- Huyết tương (máu)
- Mủ cây đu đủ
-Các cây Ficus, sung si,
vải, dứa

Enzyme
- Trypsin
- Chymotrypsin
- Carboxypeptidase Avà B
- Pepsin A, B, C và D
- Gastricin
- Renin

Đặc điểm
- Các enzyme này được
tiết ra ngoài cùng với
dịch tụy.
- Các enzyme được tiết
ra ngoài cùng với dịch
vị.

- Cathepsin A, B, C và D
- Leucinaminopeptidase

- Enzyme nội bào

- Trompin
- Plazmin
- Papain
- Fixin Bromelin

- Gồm nhiều enzyme
protease bromelin của
thân và quả không giống
nhau.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

10


2.2.3 Ứng dụng của enzyme protease
Các chế phẩm protease được ứng dụng rộng rãi trong trong các lĩnh vực: công
nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì
và bánh kẹo.
Trong công nghiệp thịt:
Trong công nghiệp thịt protease được sử dụng để làm mềm thịt. Ngoài papain
có thể dùng chế phẩm protease của vi sinh vật để thủy phân một phần nào đó các
protein tham gia trong thành phần của thịt. Kết quả là chất lượng của các loại thịt được
tăng cao, có thể chuyển thịt loại thấp thành phần thành thịt có phẩm chất cao. Không
những thế, thời gian chín của thịt sẽ rút xuống nhiều lần (nếu để thịt nhiệt độ 0 – 2oC

để cho tự các enzyme trong thịt thủy phân thì phải mất 10 – 14 ngày).
Trong công nghiệp sữa:
Protease không những có khả năng phân ly protein mà còn có khả năng làm
đông tụ sữa. Protease của nấm mốc và vi khuẩn cũng thể hiện khả năng đó. Tuy nhiên,
tất cả protease của vi sinh vật đều khác với rennet của động vật ở chỗ chúng không
những làm đông tụ được sữa mà còn có thể thủy phân sâu casein, do đó có ảnh hưởng
xấu đến chất lượng của fromage. Bởi vậy trong quá trình làm fromage, rennet vẫn
chiếm một vị trí đặc biệt so với các protease khác.
Trong sản xuất fromage, người ta cố gắng tìm những chủng vi sinh vật tạo ra
được enzyme có tính chất tương tự rennin hoặc thay thế một phần rennet (25 – 50%)
bằng protease của vi sinh vật.
Trong công nghiệp da:
Trong công nghiệp da, protease của vi sinh vật cũng có tầm quan trọng trên hai
quá trình: làm mềm và tách lông. Về mặt này, chế phẩm protease như là một phương
tiện có hiệu quả để hoàn thiện kỹ thuật chế biến da.
Trong da có thành phần quan trọng nhất là collagen. Phân tử của nó gồm những
acid amin kết lại với nhau thành mạch dài. Dưới tác dụng của protease, các chất nhờn
bị tách ra và một số liên kết trong sợi collagen bị phá hủy. Kết quả là da thu được có
độ mềm nhất định và trong quá trình thuộc da, tính chất này lại được củng cố thêm.
Điểm thuận lợi là các chế phẩm protease dùng cho công nghiệp da chỉ cần hòa
tan tốt, không chứa các hợp chất không tan và không đòi hỏi phải tinh chế cẩn thận.
11


Chế phẩm enzyme có thể dưới dạng nước chiết từ canh trường bề mặt của nấm mốc,
thường phải cô đặc lại đến trên 50% chất khô. Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus,
Aspergillus parasitucus, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Actinomyces fradiae,
Streptomyces rimosus là những nguồn để thu chế phẩm protease.
Trong sản xuất tơ tằm:
Quá trình làm sạch các sợi tơ tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn. Sợi tơ

gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng xerixin. Sau khi tách hết
xerixin thì sẽ được sợi fibroin rất tinh khiết.
Sợi thu được khi kéo ở kén ra thường có chứa 30% xerixin. Muốn tách xerixin
thì phải nấu tơ trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1,5 – 2 giờ. Chỉ sau khi có
sự gia công này, tơ mới bắt đầu kéo chỉ. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa sẽ
làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều và khó trang trí trên
lụa. Để tách lượng xerixin còn lại đó người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm
mốc và đặc biệt là từ vi khuẩn.
Trong mỹ phẩm:
Các mỹ phẩm thường có tác dụng hồi phục các da già và trong một chừng mực
nhất định cũng có tác dụng sát trùng. Còn các enzyme kiểu keratinase thì lại có tác
dụng làm mềm lông, tóc vì phân ly được keratin. Vì vậy, hiện nay ở một số nước
người ta đã sản xuất những loại kem có chứa enzym dùng để xoa mặt, xoa tay và cạo
râu. Dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu bì của da đã chết sẽ được tách ra,
da non và mới sẽ xuất hiện trên bề mặt, đồng thời sự phát triển của lông, tóc cũng bị
chậm lại.
Trong công nghiệp y học:
Trong công nghiệp y học, các chế phẩm protease cũng được sử dụng để sản
xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và
các vi sinh vật khác. Chẳng hạn môi trường dinh dưỡng để nuôi các vi sinh vật sản
xuất ra các kháng sinh, chất kháng độc. Dĩ nhiên, các protein có trong môi trường phải
ở dạng dễ đồng hóa đối với vi sinh vật. Do đó phải thủy phân sơ bộ các protein bằng
protease của động vật hoặc của vi sinh vật.
Ngoài ra người ta còn dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các
huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch) (Lê Ngọc Tú và ctv,
2005).
12


2. 3 Tổng quan Bacillus subtilis

™ Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus

Hình 2.2: Bacillus subtilis

Loài: Bacillus subtilis
™ Đặc điểm của loài Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí
hay kị khí tùy ý, thường được tìm thấy trong đất.
Có khả năng di động, sinh nội bào tử. Tế bào sinh dưỡng có dạng hình que, kích
thước chiều rộng từ 0,7 đến 0,8 µm, chiều dài từ 2,0 đến 3,0 µm. Không kết thành
chuỗi, bắt phẩm nhuộm đều, không tạo bao nang (Lương Đức Phẩm, 2001).
Khi nhuộm sơ, thấy được nguyên sinh chất của những tế bào non. Bacillus
subtilis không có không bào khi phát triển trên môi trường thạch chứa glucose cũng tốt
như trên môi trường thạch không có chứa glucose và phát triển tốt nhất trên môi
trường chứa bột đậu nành (Tiêu Thị Ngọc Thảo, 2008).
Nang bào tử hẹp, trụ tròn, nằm trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào. Bào
tử rộng 0,6 – 0,9 µm, dài 1,0 – 1,5 µm, có dạng hình elip hay hình cầu, vách bào tử
mỏng, phần nhiều được tạo thành trong vòng 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo được một bào
tử, bào tử này có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm.
Những đặc điểm của loài trực khuẩn này cho phép chúng sống được trong nhiều
sinh cảnh, bao gồm nhiều kiểu giới hạn như cát, sa mạc, những con suối có nhiệt độ
cao, môi trường đất ở Bắc Cực. Ngoài ra, trong nhóm này có thể có loài ưa nóng, ưa
lạnh, ưa kiềm, ưa acid, ưa muối hay có thể phát triển ở những môi trường có pH, nhiệt
độ và nồng độ muối mà ít sinh vật nào có thể chịu được (Lương Đức Phẩm, 2001).

Đặc điểm biến dị: sự tạo thành bào tử tốt hơn nếu trên môi trường thạch thô hay
thạch tinh bột có bổ sung chất chiết từ đất.

13


Khi cấy sâu dưới mặt gelatin, thường hóa lỏng gelatin thành dạng chén hay
phân tầng.
Khi cấy ria trên mặt thạch đĩa, thường tạo thành vùng thủy phân rộng. Khuẩn
lạc trên mặt thạch có dạng gồ ghề, sần sùi, đục, trải rộng. Các đặc điểm biến dị: trơn
nhẵn, có chất nhầy mỏng, trong, mờ, màu vàng hay cam (vài giống có màu xanh lục
đến vàng), sắc tố bị khuyếch tán khi ủ ở 45oC.
Khi cấy trên mặt thạch nghiêng có glucose, khuẩn lạc mịn, phát triển đều hơn ở
môi trường thạch không có glucose, đôi khi có màu hồng nhạt hay nâu.
Trong môi trường thạch nghiêng có bột đậu nành, khuẩn lạc mọc tốt, đều, mịn và mật
độ nhiều hơn trong môi trường không có bột đậu nành.
Khi nuôi Bacillus subtilis trong môi trường có sữa, xảy ra hiện tượng peptone
hóa một cách chậm chạp và làm pH môi trường chuyển sang kiềm. Khi cấy ria trên
mặt thạch sữa sẽ tạo vùng thủy phân casein rộng.
Trong môi trường lỏng có NaCl, Bacillus subtilis phát triển tốt ở nồng độ NaCl
7%, một vài trường hợp phát triển tốt ở môi trường có 10 – 12% NaCl.
Trong môi trường có khoai tây, khuẩn lạc mọc khá phong phú, uốn nếp hay gấp
thô, trải rộng, màu vàng hoặc hồng nâu. Đặc điểm biến dị: mỏng, mềm, mịn, có vài nốt
sần.
Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và manitol nhưng không tạo khí
(sử dụng nguồn nitrogen là muối ammonium). Thường không sinh acid từ lactose.
Thủy phân tinh bột tạo acetylmethyl carbinol. Khi ủ ở 37oC cho kết quả tốt hơn khi ủ ở
32oC. Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrite từ nitrate. Trong điều kiện kị khí,
không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate.
Các yếu tố về nhiệt độ: nhiệt độ tối thích vào khoảng 28 – 40oC. Nhiệt độ cao

nhất mà Bacillus subtilis có thể tồn tài là 50oC. Tuy nhiên nhiều giống chỉ chịu được
nhiệt độ 40oC. Không cần bổ sung các yếu tố phụ khác trong quá trình tăng trưởng.
Bacillus subtilis có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết cho quá
trình sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường như: amylase,
hemicellulase, glucanase, xylanase, protease…(Tiêu Thị Ngọc Thảo, 2008).

14