ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CẢM NHIỄM Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis sp.) NUÔI CHUNG VỚI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BỊ BỆNH GAN THẬN MỦ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CẢM NHIỄM Edwardsiella ictaluri
TRÊN CÁ RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis sp.) NUÔI
CHUNG VỚI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
BỊ BỆNH GAN THẬN MỦ

Sinh viên thực hiện:

ĐINH THỊ THANH TÂM

Ngành:

NGƯ Y

Niên khoá:

2005 – 2009

Thành phố Hồ Chí Minh 8/2009


ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CẢM NHIỄM Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ
RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis sp.) NUÔI CHUNG VỚI CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) BỊ BỆNH GAN THẬN MỦ

Tác giả

ĐINH THỊ THANH TÂM

Khóa luận được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Nuôi Trồng Thủy Sản,
chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn
T.S NGUYỄN HỮU THỊNH

Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2009
i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên và hỗ trợ về mặt vật chất và tinh thần cho
con trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Quý thầy cô Bộ môn Bệnh học thủy sản cùng toàn thể quý thầy cô khoa Thủy sản
đã tận tình giảng dạy, cung cấp và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong
suốt quá trình học tập.
Tôi kính lời cảm ơn thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn
này với tất cả tinh thần, trách nhiệm và lòng nhiệt thành.
Đồng gửi lời cảm ơn đến các anh chị quản lý phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài; xin gửi lời cảm ơn
đến tất cả bạn bè và tập thể lớp Ngư Y 31 đã giúp đỡ, chia sẻ và động viên chúng tôi
trong suốt thời gian qua.
Với thời gian hạn hẹp và kiến thức còn hạn chế, chắc chắn Khóa Luận Tốt Nghiệp
này sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự thông cảm và
nhiệt tình đóng góp của quý thầy cô và các bạn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.

0

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu: “ Đánh giá khả năng cảm nhiễm Edwadsiella ictaluri trên cá
rô phi đỏ (Oreochromis sp.) nuôi chung với cá tra (Pangasianodon ypophthalmus)
bị bệnh gan, thận, mủ”.
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm bệnh học – khoa Thủy sản, trường
Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 7/2009 đến ngày 6/08/2009.
Cá tra được gây nhiễm bằng phương pháp tiêm với E. ictaluri. Sau đó nuôi chung
cá tra được gây nhiễm với cá tra và cá rô phi đỏ khỏe mạnh nhằm tìm hiểu khả năng
lây nhiễm E. ictaluri trên các loài cá này.
Từ ngày 1 đến ngày thứ 8, hầu hết cá tra được gây nhiễm đều bị bệnh và chết với
bệnh tích điển hình, tỷ lệ chết 100% sau 8 ngày gây bệnh.
Đối với số cá tra khỏe nuôi chung với cá tra gây nhiễm ở nghiệm thức I, từ ngày
thứ 7 trở đi cá cũng đã bị bệnh và chết với với các triệu chứng điển hình như cá tra
được cảm nhiễm. Tỷ lệ chết trung bình là 76,67%.
Riêng cá rô phi đỏ ở nghiệm thức II, cá cũng chết rải rác từ ngày thứ 8 đến ngày
13, triệu chứng không rõ rệt như cá tra. Tỷ lệ chết trung bình là 36,67%.
Kết quả phân lập và định danh cho thấy mầm bệnh hiện diện trong mẫu gan, thận,
lách của cá tra và cá rô phi đỏ bệnh là vi khuẩn E. ictaluri.
Kết quả quan sát mô bệnh học trên các mẫu gan, thận, lách của cá tra và cá rô phi
đỏ bị lây nhiễm E. ictaluri từ cá tra bệnh: có sự biến đổi cấu trúc, xuất huyết và hoại tử
trên các mô.
Từ những kết quả đạt được chúng tôi nhận thấy rằng so với cá tra, trong cùng 1
điều kiện thí ngiệm, khả năng cảm nhiễm E. ictalluri của cá rô phi đỏ thấp hơn với
những biểu hiện bệnh tích ở mức độ nhẹ hơn.

iii


MỤC LỤC
Đề mục

trang

Trang tựa ................................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................ii
TÓM TẮT................................................................................................................iii
MỤC LỤC .............................................................................................................. iv
DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ......................................................vii
CHƯƠNG 1.MỞ ĐẦU............................................................................................. 1
1.1.Đặt vấn đề........................................................................................................... 1
1.2.Mục tiêu đề tài .................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
2.1.Bệnh gan thận mủ trên cá tra ............................................................................. 3
2.1.1.Lịch sử bệnh ................................................................................................... 3
2.1.2.Tác nhân gây bệnh .......................................................................................... 3
2.1.2.1.Phân loại ...................................................................................................... 4
2.1.2.2.Đặc điểm sinh lý và sinh hóa ....................................................................... 4
2.1.2.3.Đặc điểm gây bệnh ...................................................................................... 4
2.1.3.Đường lây truyền............................................................................................ 5
2.1.4.Dấu hiệu bệnh lý ............................................................................................. 6
2.1.5.Chẩn đoán ....................................................................................................... 8
2.1.6.Phòng bệnh ..................................................................................................... 8
2.1.7.Một số nghiên cứu về bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra ............................ 9
CHƯƠNG 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 11

3.1.Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm..................................................... 11
3.1.1.Thời gian ....................................................................................................... 11
3.1.2.Địa điểm ....................................................................................................... 11
3.2.Vật liệu .......................................................................................................... 11
3.2.1.Dụng cụ.......................................................................................................... 11
3.2.2.Hóa chất và môi trường ................................................................................. 11
3.2.3.Đối tượng thí nghiệm..................................................................................... 11
iv


3.2.3.1.Cá thí nghiệm.............................................................................................. 11
3.2.3.2.Vi khuẩn gây bệnh...................................................................................... 11
3.3.Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 12
3.3.1.Bố trí thí nghiệm............................................................................................ 12
3.3.2.Phương pháp gây bệnh .................................................................................. 13
3.3.3.Quản lý thí nghiệm ........................................................................................ 13
3.3.4.Phương pháp tính mật độ, phân lập, làm thuần, định danh vi khuẩn ............ 14
3.3.4.1.Phương pháp tính mật độ vi khuẩn............................................................. 14
3.3.4.2.Phương pháp phân lập ................................................................................ 15
3.3.4.3.Cấy thuần.................................................................................................... 16
3.3.4.4.Định danh vi khuẩn .................................................................................... 16
3.3.5.Nghiên cứu mô bệnh học............................................................................... 21
CHƯƠNG 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 22
4.1.Các chỉ tiêu môi trường .................................................................................... 22
4.1.1.Nhiệt độ ......................................................................................................... 22
4.1.2.DO ................................................................................................................. 22
4.1.3.pH .................................................................................................................. 22
4.1.4.NH3 ................................................................................................................ 23
4.2.Tính mật độ khuẩn lạc ...................................................................................... 23
4.3.Triệu chứng và bệnh tích đại thể ...................................................................... 23

4.3.1.Cá tra gây nhiễm............................................................................................ 23
4.3.2.Cá tra lây nhiễm............................................................................................. 24
4.3.3. Cá rô phi đỏ lây nhiễm ................................................................................. 25
4.4.Tỷ lệ cá chết...................................................................................................... 26
4.4.1.Cá tra gây nhiễm............................................................................................ 26
4.4.2.Cá tra lây nhiễm............................................................................................. 27
4.4.3.Cá rô phi đỏ lây nhiễm .................................................................................. 28
4.5. Đánh giá khả năng cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra và cá rô
phi đỏ lây nhiễm so với cá tra lây nhiễm......................................................... 28
4.5.1.Cá tra gây nhiễm và cá tra lây nhiễm ............................................................ 29
4.5.2.Cá tra gây nhiễm và cá rô phi đỏ lây nhiễm .................................................. 29
v


4.6.Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn .......................................................... 31
4.6.1.Đặc điểm khuẩn lạc E. ictaluri ...................................................................... 31
4.6.2.Kết quả định danh sơ bộ ................................................................................ 31
4.6.3.Kết quả định danh bằng Test kit IDS 14GNR của công ty Nam Khoa......... 32
4.7.Bệnh tích vi thể................................................................................................. 32
4.8.Kết quả kiểm tra cá còn sống sót sau 14 ngày thí nghiệm ............................... 35
CHƯƠNG 5.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................... 37
5.1.Kết luận............................................................................................................. 37
5.2.Đề nghị ............................................................................................................. 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ

BẢNG

NỘI DUNG

TRANG

3.1

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

13

3.2

Thuốc thử và kết quả phản ứng sinh hóa trong các giếng

19

3.3

Kết quả LDC và di động

20

4.1

Bảng tỷ lệ cá chết tích lũy của cá tra gây nhiễm

27

4.2

Bảng tỷ lệ cá chết tích lũy của cá tra lây nhiễm

27

4.3

Bảng tỷ lệ cá chết tích lũy của cá rô phi đỏ lây nhiễm

28

4.4

Tỷ lệ chết tích lũy của cá tra gây nhiễm và cá tra lây nhiễm

sau 14 ngày gây bệnh
4.5

29

Tỷ lệ chết tích lũy của cá tra gây nhiễm và cá rô phi đỏ lây

nhiễm sau 14 ngày gây bệnh
4.6

30

Tỷ lệ nhiễm E. ictaluri trên cơ thể cá tra và cá rô phi đỏ còn

sống sót sau 14 ngày thí nghiệm

36

HÌNH

NỘI DUNG

TRANG

4.1

Xuất huyết quanh miệng và các gốc vây

25

4.2

Bệnh tích đại thể cá tra

25

4.3

Triệu chứng và bệnh tích đại thể cá rô phi đỏ

26

4.4

Hình dạng khuẩn lạc E. ictaluri

31

4.5

Định danh sơ bộ

31

4.6

Định danh bằng test 14 IDS GRN của công ty Nam Khoa

32

4.7

Cấu trúc mô thận cá bệnh

33

4.8

Cấu trúc mô gan cá bệnh

34

4.9

Cấu trúc mô lách cá bệnh

35

vii


ĐỒ THỊ

NỘI DUNG

TRANG

Đồ thị 1 Cá tra gây nhiễm và cá tra lây nhiễm chết tích lũy sau 14
ngày gây bệnh ở các nghiệm thức

29

Đồ thị 2 Cá tra gây nhiễm và cá rô phi đỏ lây nhiễm chết tích lũy
sau 14 ngày gây bệnh tại các nghiệm thức

viii

30


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề:
Hiện nay, ngành nuôi trồng thủy sản đang trên đà phát triển và đóng vai trò quan

trọng trong nền kinh tế quốc dân. Để đáp ứng nhu cầu về sản lượng và chất lượng sản
phẩm thủy sản, người nuôi đã từng bước chuyển đổi hình thức nuôi quảng canh sang
nuôi thâm canh để nâng cao năng suất. Mặc dù ngành nuôi trồng thủy sản đã mang lại
nhiều thành công đáng kể như sản lượng và chất lượng đã nâng lên rõ rệt, đem lại lợi
nhuận cho người nông dân nhưng do nhịp độ phát triển quá nhanh, người nuôi không
tuân thủ các biện pháp khoa học kĩ thuật, thả nuôi với mật độ dày, không kiểm soát
được lượng thức ăn thừa, khâu quản lý chất lượng nước chưa hiệu nên dịch bệnh xảy
ra ngày càng nhiều.
Bệnh dịch gây chết cá hàng loạt đang là mối lo ngại cho người nuôi nói riêng và
cho tương lai của ngành thủy sản nói chung.
Bệnh gan thận mủ trên cá tra do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây thiệt hại lớn
cho nghề nuôi cá nước ngọt đồng bằng sông Cửu Long. Vi khuẩn gây bệnh có độc lực
và khả năng lây lan cao. Đối với nghề nuôi cá tra hiện nay, việc xử lý nước cấp vào ao
và đặc biệt là nước thải từ ao ra môi trường bên ngoài chưa được chú trọng. Vì vậy,
khi ao cá tra bị bệnh gan thận mủ, vi khuẩn trong nước thải từ ao cá có thể được xem
là mối nguy đáng kể cho cá tra nuôi ở các ao khác cũng như các đối tượng cá nước
ngọt nuôi bè khác.
Ở đồng bằng sông Cửu Long, nghề nuôi cá rô phi đỏ nuôi bè dọc theo sông Tiền và
sông Hậu đang phát triển khá mạnh. Vì vậy, nếu khâu quản lý chất lượng nước không
hiệu quả cá rô phi đỏ nuôi bè có thể nhiễm E. ictaluri từ cá tra bệnh gan thận mủ thông
qua môi trường nước thải từ ao nuôi.

1


Được sự phân công của khoa Thủy sản, trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM,
chúng tôi tiến hành đề tài: “ Đánh giá khả năng cảm nhiễm Edwardsiella ictaluri
trên cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) nuôi chung với cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) bị bệnh gan, thận, mủ”
1.2 Mục đích đề tài:

- Đánh giá khả năng cảm nhiễm E. ictaluri trên cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) và cá
tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi chung với cá tra bị bệnh gan, thận, mủ.
- Khảo sát sự biến đổi cấu trúc mô bệnh của cá tra và rô phi đỏ khi bị bệnh do E.
ictaluri.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1. Bệnh gan thận mủ trên cá tra
2.1.1. Lịch sử bệnh
Năm 1976, bệnh đã được ghi nhận lần đầu tiên trên cá da trơn nuôi trong ao tại Mỹ.
Mẫu cá bệnh được lấy từ Alabama và Georgia để kiểm tra bởi tổ chức SECFDL
(Southeastern Cooperative Fish Disease Laboratory), trường Đại học Auburn. Bệnh
này tương tự như một bệnh khác trên cá da trơn do một loài vi khuẩn Gram âm là
Edwardsiella tarda nhưng đặc điểm lại khác nhau. Năm 1979, các nhà khoa học đã mô
tả bệnh với các dấu hiệu đặc trưng, tuy nhiên vẫn chưa biết được nguyên nhân gây
bệnh (Hawke, 1979). Cho đến năm 1981, lần đầu tiên bệnh được xác định nguyên
nhân là do vi khuẩn gây nên, và đặt tên mầm bệnh này là Edwardsiella ictaluri. Và lúc
này, bệnh được gọi tên là bệnh nhiễm trùng huyết và viêm ruột, được viết tắt là ESC
(Enteric Septicemia of Catfish) hay còn có tên gọi khác là “Hole in the head disease”
(bệnh lỗ đầu) do cá bệnh hay có vết thương trên đầu (Shotts và Blazer, 1986; Johnson,
1989).
Năm 1987, ở Thái Lan đã xảy ra dịch bệnh do Edwardsiella ictaluri trên cá trê
(Clarias bactrachus). Cho đến năm 1992, bệnh được phát hiện trên cá tra, cá basa nuôi
ao, bè ở Việt Nam. Vào cuối năm 1998, bệnh xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long (Ferguson và cộng sự, 2001). Và đến năm 2001, bệnh
được gọi là bệnh mủ gan hay bệnh gan thận mủ, bệnh thường gây thiệt hại đối với cá
tra cỡ từ 4 – 6 cm đến khi cá được 5 – 6 tháng tuổi. Tỷ lệ tử vong của cá khi mắc bệnh

trong giai đoạn này rất cao, từ 60 – 70 %, có trường hợp lên đến 100 % (Nguyễn Hữu
Thịnh, 2008).
2.1.2. Tác nhân gây bệnh
Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ trên cá tra xảy ra là do vi khuẩn E. ictaluri
(Crumlish và ctv, 2002).

3


2.1.2.1. Phân loại
Edwardsiella thuộc
Ngành: Proteobacter
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Edwardsiella
Loài: Edwardsiella ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006).
2.1.2.2. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
E. ictaluri là vi khuẩn yếm khí tùy nghi, gây bệnh bắt buộc. Nó có khả năng gây
bệnh cho cá khoẻ, đây là vi khuẩn kén vật chủ. Đây là trực khuẩn gram âm, kích thước
0,75 x 1,25 µm, di động yếu, hình que mảnh, không sinh bào tử, chuyển động nhờ
vành tiêm mao. E. ictaluri cho phản ứng catalase dương tính, oxidase âm và lên men
trong môi trường O/F glucose, H2S (-), Indol (-). Có từ 1 – 3 plasmid liên kết với E.
ictaluri, những plasmid có thể đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng với kháng
sinh (Speyerer và Boyle, 1987; Newton và ctv, 1988). Thành phần Guanin và Cytozin
trong AND là 55 – 59 % (Bùi Quang Tề, 2006).
E. ictaluri là một trong những loài khó phát triển của giống Edwardsiella. Vi khuẩn
phát triển chậm trong môi trường nuôi cấy, cần từ 36 – 48 giờ mới phát triển thành
những khuẩn lạc nhỏ trong môi trường thạch BHIA (Brain Heart Infusion Agar) ở 28 –
30 oC và tăng trưởng chậm hoặc không tăng trưởng ở nhiệt độ 37 oC (Valerie và ctv,

1994).
Vi khuẩn có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, lách) trên môi trường BHIA,
NA hay TSA + 5 % máu. Tuy nhiên, môi trường BHIA giúp vi khuẩn phát triển tốt
hơn. Khuẩn lạc của E. ictaluri có hình tròn nhỏ, màu trắng đục, ở tâm khuẩn lạc có
màu hơi vàng, rìa có răng cưa (Bùi Quang Tề, 2006).
2.1.2.3. Đặc điểm gây bệnh
E. ictaluri thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc, có thể gây bệnh ngay cả trên cá
khỏe mạnh. Vi khuẩn tồn tại trong gan, thận, não cá sau khi khỏi bệnh được vài tháng
(trên 200 ngày). Chính vì vậy mà có sự kích thích tạo thành đáp ứng miễn dịch có thể
giúp cá vượt qua được các sự nhiễm trùng và các dịch bệnh xảy ra sau này. Khả năng
4


tồn tại của E. ictaluri trong môi trường nước không cao, khoảng 8 ngày (Hawke,
1979). Tuy nhiên, nó có thể tồn tại trong bùn đến 95 ngày ở 18oC và 25oC (Plumb và
Quinlan, 1986). Bị giết chết bởi ethanol hoặc isopropanol 70 %, ammonia bậc 4,
aldehyde, acid mạnh và bazơ, thuốc tẩy rửa (Chlorine 540 mg/l và các hợp chất của
Iod 250 ppm) trong 30 phút (Speyerer và Boyle, 1987; Newton và ctv, 1988).
Vi khuẩn ký sinh tùy nghi trong tế bào của cá, có khả năng xâm nhập trực tiếp vào
cơ thể cá qua ruột, mũi, mang. Nó được bài thải ra môi trường nước từ phân và xác cá
chết. Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô. Thời điểm phát
triển bệnh và mức độ thiệt hại khác nhau theo từng năm. Ở nhiệt độ 20 – 28 oC, bệnh
bộc phát mạnh, nhưng khi nhiệt độ lên tới 30 0C, ta thấy tỷ lệ chết giảm dần (Nguyễn
Hữu Thịnh, 2008).
Những nghiên cứu bệnh học cho thấy vi khuẩn E. ictaluri xâm nhập trực tiếp vào
cơ thể cá qua ruột, mũi và có thể là qua mang. Vi khuẩn trong nước có thể qua đường
mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu
giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shotts và ctv, 1986). Bệnh lan rộng từ
màng não đến sọ và da. E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá và niêm
mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shotts và ctv, 1986). Bằng đường này thì vi

khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da. Cá da trơn còn
nhiễm E. ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột. Bệnh tiến triển gây viêm
ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm bệnh.
Tóm lại, vi khuẩn E. ictaluri có thể xâm nhập vào cơ thể cá từ môi trường nước
qua da, qua mang cá và qua miệng bằng đường thức ăn gây bệnh cho cá (Shotts và ctv,
1986).
Mùa vụ xuất hiện bệnh tháng 7 – 12, đặc biệt sau khi kết thúc mùa lũ. Cao điểm
xuất hiện bệnh thường xảy ra từ tháng 9 – 12 hàng năm (Nguyễn Hữu Thịnh và
Trương Thanh Loan, 2007).
2.1.3. Đường lây truyền
Bệnh do E. ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỷ lệ chết cao. Bệnh có thể lây
trực tiếp từ cá sang cá trong môi trường nước qua chất thải như phân cá bệnh hoặc do
cá khỏe ăn cá bệnh, cá chết.

5


Nếu ta sử dụng chung các dụng cụ như lưới, vợt giữa các ao thì sẽ là một trong
những nguyên nhân dẫn đến lay lan mầm bệnh từ ao này sang ao khác. Tuy nhiên, nếu
các dụng cụ này được phơi nắng trực tiếp thì có khả năng giết chết vi khuẩn. Ngoài ra,
chim, cò, vật nuôi (chó, mèo…) và người tham quan cũng góp phần làm lây lan mầm
bệnh.
2.1.4. Dấu hiệu bệnh lý
Cỡ cá mắc bệnh thường từ 0,2 g đến 300 g (cá giống và cá thịt). Đối với cá giống,
tỷ lệ chết cao có thể lên đến 100 % sau 5 ngày phát hiện bệnh. Cá lớn có tỷ lệ chết thấp
hơn so với cá giống (50 – 60 %). Đối với cá nuôi thương phẩm có thể chết đến 30 – 50
% trong một đợi dịch bệnh. Khi đã nhiễm bệnh cá có biểu hiện bơi xoay vòng, treo lơ
lững cơ thể ở trên mặt nước, bỏ ăn ngay sau khi bị nhiễm khuẩn.
Triệu chứng bên ngoài: cá bệnh thường thấy xuất huyết quanh hậu môn, miệng,
bụng, vây và gốc vây. Cá có thể xuất huyết điểm trên thân hoặc xuất huyết trên toàn

thân. Cá bị nhiễm E. ictaluri hay bị phù đầu do tích dịch ở dưới da vùng sọ. Khi dịch
quá nhiều sẽ chảy xuống hốc mắt và gây lồi mắt. Quan sát mang cá thấy màu sắc nhợt
nhạt do vi khuẩn có khả năng gây dung huyết làm mất máu.
Bệnh tích bên trong
¾ Bệnh tích đại thể
Gan, thận cá bệnh sưng rất to, thận có hiện tượng nhũn, lách sưng ít hơn. Trên gan,
thận, lách xuất hiện mảng trắng hoại tử. Khi bệnh nặng, chúng phát triển thành đốm
trắng tròn có chứa dịch hơi đặc (mủ), đường kính khoảng 1 – 3 mm khắp bề mặt và cả
bên trong gan, thận, lách.
Cá bị bệnh thường tích dịch viêm ở xoang bụng có màu hơi vàng và có thể lẫn
máu. Cá nhiễm E. ictaluri thường bỏ ăn do đó ruột trống không chứa thức ăn, lòng
ruột có chứa dịch lẫn máu. Đồng thời còn thấy cá bị xuất huyết điểm trên ruột, cơ và
mô mỡ (Nguyễn Hữu Thịnh, 2008).
¾Bệnh tích vi thể
Gan: quan sát tiêu bản ở gan có đốm trắng dưới kính hiển vi cho thấy đây là vùng
hoại tử. Các tế bào gan không còn sát nhau như ở mô thường mà tách rời ra từng tế
bào hoặc thoái hóa thành một vùng không còn nhận ra được cấu trúc với nhiều mức
độ. Giai đoạn đầu có hiện tượng sung huyết động mạch và tĩnh mạch gan, đặc biệt là
6


hệ thống xoang mao mạch giữa các dãy tế bào gan làm cho toàn bộ tổ chức gan bị
sưng to. Sau đó, do quá trình sung huyết kéo dài dẫn đến vỡ mạch máu và giải thoát
nhiều enzyme (protease, lipase,…) làm các tế bào ở vùng viêm bị hoại tử dẫn đến hoại
tử. Lúc này quan sát thấy những tế bào đã tách rời nhau, nhân tế bào co lại và vỡ vụn,
cuối cùng những tế bào này bị tiêu hủy. Khi cá bệnh nặng, những tổn thương lan rộng
làm gan không còn chức năng khử độc và lọc máu, làm chất độc tích tụ trong cơ thể
kết hợp với những yếu tố khác làm cá chết. Ngoài ra, do tổ chức gan bị hư hại làm mất
khả năng tiết mật của gan. Một số cá mới chết khi mổ ra thấy túi mật bị vỡ, dịch mật
lan tràn khắp nội quan. Điều này có thể do khi gan bị hoại tử đồng thời cũng hoại tử

ống dẫn mật và túi mật làm túi mật vỡ, dịch mật thoát ra ngoài.
Thận: cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, các phản ứng sưng viêm xảy
ra ở toàn bộ tổ chức. Thận sưng to đồng thời bị nhũn do sung huyết, một phần có thể
do tích tụ nước trong thận mà không đào thải được do hệ thống tiểu cần thận và ống
thận bị hư hại. Phản ứng viêm kéo dài gây hoại tử và làm mất chức năng các đơn vị
cấu tạo nên thận. Mô tạo máu nằm xen kẻ với các tế bào nội tiết của thận cũng bị hoại
tử làm cho máu trong cơ thể bị giảm sút. Khi thận bị hoại tử, chức năng bài tiết chất
thải trong quá trình trao đổi chất bị ngưng trệ. Trong khi đó quá trình trao đổi chất lại
đặc biệt tăng mạnh do cơ thể cá huy động các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân gây
bệnh. Ngoài ra, hai loại hormone tuyến thượng thận là adrenalin và noradrenalin
không được sản xuất khi thận bị hoại tử cũng góp phần làm rối loạn chức năng sinh lý
của cá.
Lách: cùng với gan và thận, lách cũng là cơ quan bị hủy hoại nặng khi cá bị bệnh
mủ gan. Những đốm trắng trên lách là những vùng mô hoại tử với nhiều mức độ khác
nhau. Đối với cá bệnh nặng, nhiều vùng hoại tử dạng hạt lan rộng, phá hủy các tiểu thể
hình elip là vùng chức năng của lách, nơi tiêu hủy các vật lạ và vi khuẩn xâm nhập vào
cơ thể. Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập quá nhiều sẽ gây ra tình trạng quá tải đến một
lúc nào đó tế bào sẽ mất chức năng và thoái hóa. Quá trình hoại tử ở lách bắt đầu từ
quá trình thoái hóa và hoại tử các tiểu thể lách làm mất chức năng tạo hồng cầu mới và
phá hủy hồng cầu già cũng như không thể sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu bảo
vệ cơ thể chống các tác nhân gây bệnh. Cũng như thận, mô tạo máu bị phá hủy nên
lách mất chức năng cung cấp máu cho cơ thể.
7


2.1.5. Chẩn đoán
Việc điều trị chỉ có hiệu quả khi phát hiện bệnh sớm. Do đó, trong quá trình nuôi
cần thường xuyên quan sát những biểu hiện của cá để phát hiện bệnh và xử lý kịp thời.
Giai đoạn đầu vài con tách đàn bơi lờ đờ ở đầu bè hoặc dạt về gốc bè, dọc bờ ao đôi
lúc cá giảm ăn. Bắt khoảng 5 – 10 con kiểm tra các đốm trắng ở gan, thận, và tỳ tạng

(Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, lách. Nuôi cấy trên môi trường BHIA, đem ủ ở
nhiệt độ 28 – 30 0C trong vòng 48 giờ. Sau 48 giờ sẽ thấy các khuẩn lạc trắng nhỏ mọc
lên, ta cấy thuần lại từ những khuẩn lạc này.
Chúng ta có thể sử dụng các phương pháp chẩn đoán như: dùng bộ test kit API
20E, hay test IDS 14 GNR để định danh. Dùng phương pháp miễn dịch như phản ứng
ngưng kết trên phiến kính, phản ứng ELISA, và phương pháp PCR (Nguyễn Hữu
Thịnh, 2007).
2.1.6. Phòng bệnh
Chúng ta nên chọn con giống khoẻ mạnh, không nhiễm bệnh, thường xuyên chú ý
đến vấn đề chăm sóc sức khoẻ cá để giảm bệnh, giảm tình trạng stress, phải quản lý
môi trường nước tốt, tránh làm cá sây sát. Vào mùa dịch bệnh, nhất là về mùa lũ
không nên cho cá tra ăn cá tạp tươi sống. Thức ăn cần được nấu chín, tốt nhất nên sử
dụng thức ăn viên.
Không sử dụng hoá chất để diệt ký sinh trùng như CuSO4 trong thời gian có nhiệt
độ nước thích hợp cho vi khuẩn phát triển do hoá chất sẽ làm cá stress, dẫn tới cá bị
yếu lúc này vi khuẩn sẽ xâm nhập gây bệnh.
Phải sát trùng ao nuôi, cải tạo ao nuôi đúng quy trình. Sau mỗi vụ nuôi hút bùn đáy
ao, để lại khoảng 10 cm để loại mầm bệnh. Khi thấy ao bắt đầu có bệnh thì ngưng cho
ăn hoàn toàn. Tránh dùng chung dụng cụ, sau khi sử dụng xong đem đi phơi nắng để
cho khô ráo và tiêu diệt mầm bệnh. Tiệt trùng các dụng cụ như lưới, vợt, ống, sọt dây
bằng Chlorine 10 – 15 g/m3 trong 30 phút, rửa nước sạch và phơi khô. Cá chết nên vớt
ra khỏi ao, bè càng sớm càng tốt. Không vứt cá chết bừa bải ra sông, rạch, trên mặt
đất, cần được chôn vào các hố cách ly có rải vôi sống (CaO) để tiệt trùng (Bùi Quang
Tề, 2004).

8


2.1.7. Một số nghiên cứu bệnh do E. ictaluri gây ra

Năm 1983, Areechon và Plumb đã chứng minh được hầu hết các tổn thương lớn do
E. ictaluri là ở gan, thận và lách cá.
Jarboe et al (1984); Miyazaki et al (1985) và Shotts et al (1986) đã có những
nghiên cứu về mô học bệnh tích. Năm 1986, Waltman đã mô tả đặc điểm sinh lý, sinh
hóa của vi khuẩn E. ictaluri.
Plumb và Vinitnantharat (1989) đã tìm thấy một vài đặc điểm hóa sinh học và tính
đa dạng về huyết thanh giữa các loài.
Ainsworth et al (1986) định danh E. ictaluri thông qua những đặc điểm sinh hóa và
huyết thanh của chúng bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh chuyên biệt, hoặc dùng
kháng thể phát huỳnh quang (fluoresent antibody – FA).
Shotts và Waltman (1990) đã nghiên cứu ra một môi trường có tính chọn lọc cho E.
ictaluri, Edwardsiella ictaluri agar (EIA) giúp tăng tính chính xác khi phán đoán sự có
mặt của E. ictaluri trong lần phân lập vi khuẩn đầu tiên.
Theo Wolter và Johnson (1994) khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm trên cá
nheo Mỹ (từ 15 – 20 cm) với mật độ vi khuẩn E. ictaluri là 1,2x106 cfu/ 0,1 ml ở 25
o

C, tốc độ nước chảy 1 lít/phút, cho ăn 3 % trọng lượng thân/ngày. Tỷ lệ chết dao động

từ 38 – 95,3 % trong thời gian thí nghiệm là 7 ngày (trích dẫn từ Phan Thị Mỹ Hạnh,
2004).
Theo Ferguson và ctv (2001) thì sau khi phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh
đốm trắng ở nội tạng cá tra rồi tiến hành gây cảm nhiễm. Kết quả vi khuẩn có khả
năng tạo hoại tử trong 7 ngày (trích dẫn từ Lê Thị Bé, 2002).
Theo Panigoro và ctv (2005) khi tiến hành gây cảm nhiễm nhân tạo trên cá tra
(Pangasionodon hypophthalamus) với chiều dài trung bình khoảng 10 cm bằng 2
phương pháp tiêm và ngâm vi khuẩn E. ictaluri, kết quả cho thấy:
- Cá chết, bệnh là do vi khuẩn E. ictaluri với những dấu hiệu đặc trưng: xuất huyết
quanh miệng, hậu môn, bụng và các vây. Xuất hiện những đốm trắng trên gan, thận,
lách. Mang bị nhợt nhạt do mất máu.

- Khi tiêm vi khuẩn vào xoang bụng cá với mật độ vi khuẩn 2,2x106 cfu/ mL và
2,2x108 cfu/mL, tỷ lệ cá chết là 100% sau 3 ngày gây bệnh.

9


- Đối với phương pháp ngâm vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/mL và 108 cfu/mL trong vòng
10 ngày ở nhiệt độ thí nghiệm 25 – 270C, tỷ lệ cá chết tích lũy là 100% sau 4 ngày gây
bệnh.
Panigoro và ctv (2005) cũng đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm do E. ictaluri để
tìm hiểu khả năng nhiễm bệnh trên 7 loài cá nuôi ở Indonesia : cá tra (Pangasionodon
hypophthalamus), cá trê ( Clarias batrachus), cá Patin jambal (cá hú), cá lăng (Mystus
nemurus), cá chép (Cyprinus carpio L), cá rô phi (Oreochromis sp.), cá mùi
(Helostoma temmickii) với trọng lượng trung bình tương ứng là : 7,8g; 4,2g; 6,5g;
4,7g; 37g; 5,4g; 6,5g. Mật độ vi khuẩn để gây cảm nhiễm nhân tạo lần lượt là 2,6 x 105
cfu/mL và 2,6 x 107 cfu/mL với 2 phương pháp gây bệnh là tiêm vào xoang bụng với
liều 0,1mL/ cá và phương pháp ngâm vi khuẩn. Kết quả thu được sau 10 ngày theo dõi
thí nghiệm:
- Cá tra nhiễm bệnh chết 100% sau 4 gây bệnh với các triệu chứng điển hình: có mủ
trên gan, thận, lách.
- Cá Patin (cá hú) và cá trê có tỷ lệ chết 90 – 100% sau 5 ngày gây bệnh, vi khuẩn
phân lập từ mẫu cá bệnh là E. ictaluri nhưng không có triệu chứng rõ nét như đối với
cá tra thí nghiệm. Cá nhiễm bệnh chỉ thấy hiện tượng xuất huyết và nhiễm trùng máu.
- Cá lăng và cá rô phi có tỷ lệ chết thay đổi từ 20 – 70% với bệnh tích tương tự như cá
hú và cá trê.
- Cá chép ở nghiệm thức 2,6 x 107 cfu/mL có tỷ lệ chết là 40% nhưng không phải chết
do nguyên nhân E. ictaluri gây ra mà do nguyên nhân khác. Ở nghiệm thức 2,6 x 105
cfu/mL không có cá chết.
- Cá mùi hoàn toàn không chết.
Như vậy, độc lực của vi khuẩn E. ictaluri ảnh hưởng đến các loài cá từ cao đến

thấp lần lượt là: cá tra, cá hú, cá trê, cá lăng, cá rô phi. E. ictaluri hoàn toàn không có
khả năng gây bệnh đối với cá chép và cá mùi. Tuy nhiên trong tự nhiên chỉ thấy dịch
bệnh xảy ra trên cá tra.

10


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
3.1.1.Thời gian
Đề tài được tiến hành từ tháng 7/2009 đến ngày 6/8/2009.
3.1.2.Địa điểm
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản – khoa Thủy sản,
trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2.Vật liệu
3.2.1.Dụng cụ
Bể kính, xô nhựa, kim tiêm, máy sục khí, đĩa Petri, que cấy (vòng, trang), đèn cồn,
bộ tiểu phẩu, pipet (0,1ml, 1ml, 5ml), bộ test định danh IDS 14GNR của công ty Nam
Khoa, vợt lưới nhỏ, và 1 số dụng cụ phòng thí nghiệm cần thiết khác.
Tủ cấy, máy hấp Autoclave, tủ ủ, máy lắc Votex, cân điện tử.
3.2.2.Hoá chất và môi trường
Cồn 90o, 70o, bộ thuốc nhuộm Gram, nước muối sinh lí, nước cất, .
Môi trường: BHIA ( Brain Heart Infusion Agar): dùng để phân lập vi khuẩn từ mẫu
gan, thận, lách của cá bệnh, cấy thuần để định danh và trang vi khuẩn để tính mật độ.
3.2.3.Đối tượng thí nghiệm
3.2.3.1.Cá thí nghệm
Cá tra giống: khỏe, không sây sát, cá có trọng lượng từ 10 – 15 g/con và có kích
thước từ 10 – 12 cm.
Cá rô phi đỏ giống: khỏe, không sây sát, cá có trọng lượng từ 7 – 8 g/con và kích

thước từ 7 – 9 cm.
Cá tra giống và cá rô phi đỏ giống được mua ở trại cá Bàu Cá, tỉnh Đồng Nai.
3.2.3.2.Vi khuẩn gây bệnh
Chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh, làm thuần và được bảo quản
trong môi trường NB (Nutrient Broth) có bổ sung 5% glycerol lưu giữ ở - 200C của
11


phòng thí nghiệm Bệnh học thủy sản, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh.
3.3.Phương pháp nghiên cứu
Vi khuẩn
Cấy trên BHIA( ủ 300C, 48h)
Gây bệnh thực nghiệm
Ghi nhận tỷ lệ chết
Mổ khám
Ghi nhận bệnh tích
Phân lập vi khuẩn

Lấy mẫu mô

(gan, thận, lách)

(gan, thận, lách)

Cấy thuần vi khuẩn
Nhuộm Gram

Cắt mẫu mô

Định danh

Quan sát bệnh tích vi thể

3.3.1.Bố trí thí nghiệm
Cá thí nghiệm được bố trí trong bể kính có thể tích 30 x 30 x 40 cm.
Trước khi tiến hành thí nghiệm, cá được trữ trong bể kính từ 3 – 5 ngày cho quen với
điều kiện môi trường ( phòng lạnh nhiệt độ 280C).
Bố trí 12 bể, chia làm 4 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần), gồm 2 nghiệm
thức đối chứng và 2 nghiệm thức gây bệnh.
-

Nghiệm thức ĐC I: cá tra đối chứng, mật độ 20 cá tra/ bể.
12


-

Nghiệm thức ĐC II: cá rô phi đỏ đối chứng, mật độ 20 cá /bể.

-

Nghiệm thức gây bệnh I: cá tra gây nhiễm bằng vi khuẩn E. ictaluri và cá tra khỏe,
mật độ 10 cá tra được gây nhiễm và 10 cá tra khỏe.

-

Nghiệm thức gây bệnh II: cá tra gây nhiễm bằng vi khuẩn E. ictaluri và cá rô phi
đỏ khỏe, mật độ 10 cá tra được gây nhiễm và 10 cá rô phi đỏ khỏe mạnh.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nước trong bể được sục khí nhẹ.
Thời gian thí nghiệm là 14 ngày.
Bảng 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm
I. 1

ĐC II.1

II. 1

II. 2

I. 3

ĐC II. 2

ĐC I.2

II. 3

I. 2

ĐC I.3

ĐC II.3

ĐC I.1

3.3.2.Phương pháp gây bệnh
- Chuẩn bị vi khuẩn gây bệnh: Dùng que cấy vòng trích lấy vi khuẩn trong ống giống
và cấy ria trên đĩa petri đã đổ sẵn môi trường BHIA, đem ủ ở 300C, 48h. Sau 48h chọn

những khuẩn lạc rời tiếp tục cấy thuần trên môi trường BHIA.
- Gây bệnh bằng phương pháp tiêm vào cơ lưng của cá tra với liều 0,1 ml huyền phù vi

khuẩn/ 10g cá. Gây mê cá trước khi tiêm bằng thuốc mê MS222 nhằm hạn chế tối đa
cá bị sốc. Sau khi gây mê cho ngay cá vào xô nhựa chứa nước có sục khí để cá mau
hồi phục. Riêng nghiệm thức ĐC I, gây sốc cho cá tra trong bể bằng cách tiêm 0,1 ml
nước muối sinh lý /10g cá vào cơ lưng.
3.3.3 Quản lý thí nghiệm
Siphon đáy hằng ngày, thay nước khoảng 1/3 bể, nước được sử dụng là nước máy
được trử qua đêm để bay hết chlorine.
Cho cá rô phi đỏ ăn 1 lượng bằng 1% trọng lượng thân.
Quan sát biểu hiện bất thường của cá ở các bể nghiệm thức so với các bể đối chứng,
ghi nhận.
Theo dõi, giải phẫu cá bệnh mới chết hoặc hấp hối ở cả cá tra và cá rô phi đỏ, ghi
nhận các dấu hiệu bên ngoài và bên trong, đặc biệt các dấu hiệu ở gan, thận, lách.

13


3.3.4.Phương pháp tính mật độ , phân lập, làm thuần, định danh vi khuẩn
3.3.4.1.Phương pháp tính mật độ vi khuẩn
-

Nguyên tắc

Cấy 1 thể tích xác định huyền phù vi khuẩn cần nghiên cứu lên môi trường thạch,
sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên sau khi ủ, khi đó, ta coi 1 khuẩn lạc là sự phát triển
từ 1 tế bào.
-

Tiến hành

0,5ml

0,5ml

Huyền phù vi khuẩn

100

4,5ml NaCl

10-1

0,5ml

4,5ml NaCl

……….

10-2

4,5ml NaCl

10-6

0,5ml

4,5ml NaCl

10-7

4,5ml NaCl

10-8

..........

Sơ đồ pha loãng mẫu
¾

Cân khoảng 10 mg khuẩn lạc (đã được ủ ở 300C, 48h) trong ống nghiệm vô

trùng, sau đó cho vào ống nghiệm nước muối sinh lý sao cho đạt được tỷ lệ 10 mg/
1mL. Sau đó, đặt ống chứa khuẩn lạc lên máy Votex để khuẩn lạc phân tán đều trong
nước muối sinh lý, ta được mẫu huyền phù vi khuẩn.
¾

Chuẩn bị 8 ống pha loãng đã tiệt trùng, cho vào mỗi ống 4,5ml NaCl 0,9%,

dùng pipet lấy 0,5ml mẫu vào ống thứ 1 (theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu + 9 thể tích nước
muối sinh lý), lắc đều mẫu nước ta được hệ số pha loãng 10-1
¾

Dùng pipet trộn đều, chuyển 0,5ml mẫu từ ống 1 vào ống thứ 2, dùng máy lắc

trộn đều ta được hệ số pha loãng 10-2
14

¾

Tiếp tục chuyển 0,5ml mẫu từ ống có hệ số pha loãng 10-2, dùng máy lắc trộn

đều ta được hệ số pha loãng 10-3…. tiếp tục thao tác trên cho đến hệ số pha loãng 10-8.
¾

Chuyển 0,1ml mẫu vào đĩa petri có chứa môi trường BHIA, ở mỗi nồng độ pha

loãng lấy 2 đĩa.
¾

Dùng que trang bằng thủy tinh trang đều mẫu trên mặt thạch cho đến khi mặt

thạch khô, lật ngược đĩa lại và đem ủ 24h ở 300C.
-

Tính mật độ vi khuẩn trong bình gốc
N (cfu /mL) = M / (V * fi )
Trong đó:

Cfu ( Colony forming unit ): đơn vị khuẩn lạc
N (cfu /mL ): mật độ vi khuẩn trong bình gốc
M: số khuẩn lạc trung bình đếm được ở độ pha loãng thứ i ( i =[ 1,8 ] )
V (mL): thể tích mẫu cấy vào đĩa petri
fi : hệ số pha loãng
-

Kết quả

Chỉ lấy kết quả ở những đĩa trang có mật độ vi khuẩn nằm trong khoảng 25 – 250
cfu.
3.3.4.2.Phương pháp phân lập
-

Mục đích

Cá sau khi cảm nhiễm, tiến hành phân lập vi khuẩn trên gan, thận, lách để kiểm tra
xem có phải cá chết là do E. ictaluri gây ra hay không, từ đó có thể xác định đúng
nguyên nhân gây bệnh. Đồng thời, chúng tôi cũng tiến hành phân lập vi khuẩn trên cá
còn sống sót sau 14 ngày gây bệnh để kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn trong cơ thể
cá.
-

Thao tác thực hiện

Cá hấp hối hoặc mới chết, vớt ra, quan sát các dấu hiệu bên ngoài, sau đó tiến hành
giải phẩu, lấy các mẫu ở gan, thận, lách để phân lập.
Tất cả các dụng cụ giải phẩu đều được khử trùng bằng cồn 900 hoặc đốt nóng trên
ngọn lửa đèn cồn.
Khử trùng bề mặt cá bằng cồn 700 tại vị trí cần giải phẩu.
15


Tiến hành giải phẩu, ghi nhận các dấu hiệu bất thường trên gan, thận, lách. Cần sát
trùng bề mặt gan, thận, lách bằng cồn 70o, sau đó cắt 1 mẫu nhỏ, dùng kẹp phết nhẹ
lên đĩa thạch chứa môi trường BHIA, dùng que cấy vòng cấy ria mẫu phết trên đĩa, tùy
vào cách chia đĩa thạch mà chúng ta có thể ria 1, 2 hay 3 đường, chú ý ghi chú tên mẫu
(gan, thận, lách), nghiệm thức có cá bệnh, ngày phân lập mẫu để tránh nhầm lẫn mẫu
cá của nghiệm thức này với nghiệm thức khác. Sau khi ghi chú xong, đặt đĩa thạch vào

tủ ủ, ủ các đĩa môi trường trong vòng 48h ở 300C. Quan sát, ghi nhận hình dạng, màu
sắc của khuẩn lạc.
3.3.4.3.Làm thuần
-

Mục đích

Để nghiên cứu về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn, ta phải sử
dụng giống vi khuẩn ở dạng thuần (là giống vi khuẩn được sinh ra từ 1 tế bào ban
đầu).
-

Thao tác thực hiện

Đốt nóng que cấy vòng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội.
Dùng que cấy vòng vô trùng lấy khuẩn lạc đặc trưng, riêng lẻ ở đĩa petri phân lập ở
trên và cấy chuyền sang đĩa petri mới (môi trường tương tự môi trường dùng để phân
lập) bằng phương pháp cấy ria.
Sau đó đem ủ ở 300C trong vòng 36 – 48h.
Phương pháp làm thuần vi khuẩn được tiến hành tiếp tục cho đến khi quan sát trên
mặt thạch chỉ còn duy nhất 1 loại khuẩn lạc đồng dạng về hình thái, kích thước và màu
sắc.
3.3.4.4.Định danh vi khuẩn:
* Nhuộm Gram:
-

Nguyên tắc: Đây là phương pháp quan trọng để phân loại vi khuẩn, nó cho phép

ta phân biệt 2 loại vi khuẩn Gr- và Gr+ dựa theo phản ứng với thuốc nhuộm do sự khác
biệt về cấu trúc vách tế bào:

¾ Nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thì đó là vi khuẩn G+
¾ Nếu vi khuẩn bị mất màu sau khi tẩy, khi nhuộm với dung dịch Safranin vi
khuẩn sẽ có màu hồng, đó là vi khuẩn G-.
-

Cách tiến hành
16