Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

LÊ THỊ TÌNH

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MỘT SỐ MÔI TRƢỜNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI, 2018


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

LÊ THỊ TÌNH

NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG
HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MỘT SỐ MÔI TRƢỜNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

Th.S. PHẠM THỊ KIM DUNG

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khoá luận, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn và
giúp đỡ tận tình từ các thầy cô, bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Thị Kim Dung.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các thầy cô trong khoa
Sinh - KTNN cùng các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng
trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thụận lợi giúp đỡ tôi
hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới những ngƣời thân, bạn bè đã luôn ở
bên động viên, giúp đỡ và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực
hiện khóa luận.
Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2018
Sinh viên

Lê Thị Tình


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Tất
cả những số liệu đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê,
hoàn toàn không có số liệu sao chép và không trùng với bất cứ tài liệu nào.

Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2018
Sinh viên

Lê Thị Tình


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 3
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu................................................................. 3
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn (CVK) ......................................................... 5
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK ...................................................................... 5
1.1.2. Vi khuẩn A. xylinum ................................................................................ 5
1.1.2.1. Phân loại ............................................................................................... 5
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái A. xylinum ............................................................. 6
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum .......................................... 6
1.1.3. Đặc điểm của CVK ................................................................................. 8
1.1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của CVK ................................................................ 8
1.1.3.2. Tính chất độc đáo của CVK ................................................................. 8
1.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum nhằm tạo ra màng CVK ...................... 9
1.1.5. Ứng dụng của màng CVK ....................................................................... 9
1.1.6. Tình hình nghiên cứu về màng CVK ở Việt Nam và trên thế giới ....... 12
1.1.6.1. Trên thế giới ....................................................................................... 12
1.1.6.2. Ở Việt Nam ........................................................................................ 12
1.2. Giới thiệu về thuốc diclofenac ................................................................. 13
1.2.1. Công thức hóa học và tên gọi................................................................ 13
1.2.2. Tính chất................................................................................................ 14
1.2.3. Công dụng và cơ chế tác động của diclofenac ...................................... 14
1.2.4. Dƣợc động học của thuốc...................................................................... 14

1.2.5. Dƣợc lực học của thuốc ........................................................................ 16
1.2.6. Tác dụng không mong muốn của thuốc (ADR) .................................... 17
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 19
2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 19
2.1.1. Chủng vi sinh ........................................................................................ 19
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 19
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 21
2.2.1. Cách bố trí thí nghiệm ........................................................................... 21
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 21
2.2.2.1. Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men và chế tạo
hệ mạng lƣới CVK .......................................................................................... 21
2.2.2.1.1. Tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men ............ 21
2.2.2.1.2. Chế tạo hệ mạng lƣới CVK ............................................................. 21
2.2.2.2. Xử lý màng CVK trƣớc khi hấp thụ thuốc, đánh giá độ tinh khiết của
màng CVK....................................................................................................... 23
2.2.2.2.1. Xử lý màng CVK trƣớc khi hấp thụ thuốc...................................... 23
2.2.2.2.2. Đánh giá độ tinh khiết của màng CVK ........................................... 23
2.2.2.3. Tìm phổ hấp thụ của thuốc diclofenac ............................................... 24
2.2.2.4. Xây dựng đƣờng chuẩn diclofenac. ................................................... 24
2.2.2.5. Xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng CVK. Tính hiệu suất 24
2.2.2.6. Xử lý thống kê .................................................................................... 26
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 27
3.1. Kết quả tạo màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum trong ba môi trƣờng ..... 27
3.1.1. Kết quả tạo chủng vi khuẩn Acetobacter từ dịch trà xanh lên men ...... 27
3.1.2. Kết quả tạo màng CVK từ 3 môi trƣờng............................................... 27
3.2. Kết quả thu màng CVK thô từ 3 môi trƣờng ........................................... 28

3.4. Kết quả quét phổ hấp thụ của thuốc diclofenac ....................................... 29
3.5. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn diclofenac.............................................. 30
3.6. Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK ...................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 40
I. KẾT LUẬN .................................................................................................. 40
II. KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 41


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn ........................................... 8
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của diclofenac ................................................... 13
Hình 3.1. Dịch trà đƣờng lên men sau 7-10 ngày ........................................... 27
Hình 3.2. Màng CVK đƣợc nuôi trong môi trƣờng chuẩn.............................. 28
Hình 3.3. Màng CVK đƣợc nuôi trong môi trƣờng nƣớc dừa già .................. 28
Hình 3.4. Màng CVK đƣợc nuôi trong môi trƣờng nƣớc vo gạo ................... 28
Hình 3.5. Màng CVK có độ dày 0,5cm .......................................................... 28
Hình 3.6. Màng CVK có độ dày 1cm ............................................................. 28
Hình 3.7. Vớt màng và đặt dƣới vòi nƣớc chảy sau khi ngâm NaOH ............ 29
Hình 3.8. Màng CVK tinh khiết ...................................................................... 29
Hình 3.9. Phổ hấp thụ của diclofenac ............................................................. 30
Hình 3.10. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của diclofenac ................................... 31
Hình 3.11. Chuẩn bị hấp thụ thuốc ................................................................. 32
Hình 3.12. Đƣa màng CVK vào hấp thụ ......................................................... 32
Hình 3.13. Mẫu lấy ra đo OD sau thời gian hấp thụ ....................................... 32
Hình 3.14. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng CVK lên men từ 3
môi trƣờng với thao tác không ép loại nƣớc ................................................... 37
Hình 3.15. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng CVK lên men từ 3
môi trƣờng với thao tác ép loại nƣớc 50% ...................................................... 38

Hình 3.16. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng CVK lên men từ 3
môi trƣờng với độ dày 0,5cm .......................................................................... 38
Hình 3.17. Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ của màng CVK lên men từ 3
môi trƣờng với độ dày 1cm ............................................................................. 39


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.2. Các ứng dụng của CVK .................................................................. 11
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 20
Bảng 2.3. Thành phần của các môi trƣờng lên men thu màng CVK. ............. 22
Bảng 3.1. Nồng độ diclofenac và giá trị OD tƣơng ứng (n =3) ...................... 30
Bảng 3.2. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng CVK ...................................... 33
Bảng 3.3. Lƣợng thuốc hấp thụ vào các màng CVK trong 2 giờ ................... 35
Bảng 3.4. Hiệu suất thuốc hấp thụ vào các loại màng CVK trong 2 giờ ........ 37


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ở những ngƣời tuổi cao, các cơn đau do bị phong tê thấp hay thoái hóa
khớp không còn quá xa lạ. Và những năm gần đây, một trong các căn bệnh
gây đau đớn về xƣơng khớp cho ngƣời bệnh đó chính là bệnh Gout, đây là
một loại viêm khớp, thƣờng gặp ở nam giới. Diclofenac - một dẫn xuất của
acid phenylacetic là thuốc chống viêm không steroid [2]. Thuốc có tác dụng
chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh, ví dụ nhƣ khi bị phong thấp, bị thâm
tím, căng bắp thịt, đau thắt lƣng cấp (lumbago) và thoái hoá khớp. Nó còn
đƣợc dùng để điều trị đau bụng kinh. Diclofenac là một chất ức chế mạnh
hoạt tính của cyclooxygenase, do vậy làm giảm đáng kể sự tạo thành
prostaglandin, prostacyclin và thromboxan là những chất trung gian của quá
trình viêm. Diclofenac cũng có vai trò điều hòa con đƣờng lipoxygenase và sự
kết tụ tiểu cầu.

Giống nhƣ các thuốc chống viêm không steroid khác, diclofenac gây hại
cho đƣờng tiêu hóa do giảm tổng hợp prostaglandin dẫn đến ức chế tạo mucin
(chất có tác dụng bảo vệ đƣờng tiêu hóa) [2]. Prostaglandin có vai trò duy trì
tƣới máu thận. Các thuốc chống viêm không steroid ức chế tổng hợp
prostaglandin nên có thể gây viêm thận kẽ, viêm cầu thận, hoại tử nhú và hội
chứng thận hƣ đặc biệt ở những ngƣời bị bệnh thận hoặc suy tim mãn tính.
Với những ngƣời bệnh này, các thuốc chống viêm không steroid có thể làm
tăng suy thận cấp và suy tim cấp.
Những năm gần đây, đã có nhiều phát hiện mới về việc sử dụng các vật
liệu sinh học. Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra đƣợc trong tự nhiên có một số loài
vi khuẩn có khả năng tạo ra màng cellulose. Khi nuôi cấy những vi khuẩn này
trong môi trƣờng thích hợp, chúng có khả năng hình thành trên bề mặt một

1


lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và đƣợc gọi là màng cellulose vi
khuẩn (CVK).
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của
thực vật (PC) [7]. Chúng bao gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng
liên kết β-1,4-glucozit. Nhƣng cellulose vi khuẩn khác hẳn với cellulose thực
vật là không có sự kết hợp của các hợp chất cao phân tử nhƣ ligin,
hemicellulose, peptin và sáp nến,…mà đƣợc cấu tạo từ những sợi microfibril
tạo nên các bó sợi song song cấu thành mạng lƣới cellulose với những đặc
tính vƣợt trội so với cellulose của thực vật. Ngoài ra, màng CVK còn chứa
nhiều dƣỡng chất, axit hữu cơ,…đồng thời là một hàng rào ngăn cản oxi và
các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn
cản tác động của UV,…
Nhờ những đặc tính ƣu việt trên mà màng CVK đƣợc coi là một nguồn
nguyên liệu mới cần đƣợc khai thác và tìm hiểu hiện nay. Nó đã và đang thu

hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỉ XIX và hiện đƣợc
ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ: dùng làm màng phân tách
trong quá trình xử lí nƣớc, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho
tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang,
thực phẩm. Hiện nay, trong lĩnh vực y học và dƣợc phẩm, màng CVK đã
đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét
da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da,
vận chuyển thuốc,…[12,21].
Ở nƣớc ta, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK vào đời sống và sản
xuất còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở bƣớc đầu mà
nhu cầu về các loại màng để điều trị bỏng, đắp lên các vết thƣơng hở, làm mặt
nạ dƣỡng da, làm vật liệu dẫn truyền thuốc còn khan hiếm và đều phải nhập
khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành rất cao. Trong khi đó, màng CVK hoàn toàn

2


có thể sản xuất trong nƣớc theo quy mô công nghiệp bằng phƣơng pháp lên
men tĩnh vi khuẩn Acetobacter xylium trong môi trƣờng thích hợp từ các
nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm. Màng CVK đã đƣợc nghiên cứu, ứng dụng để
thiết kế hệ thống hấp thụ và giải phóng thuốc trên màng.
Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng
Acetobacter xylium, từ đó so sánh khả năng hấp thụ của thuốc diclofenac ở
một số môi trƣờng khác nhau, chúng tôi đã chọn đề tài: Nghiên cứu so sánh
khả năng hấp thụ thuốc Diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men
từ một số môi trường.
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu chế tạo ra màng cellulose vi khuẩn từ 3 môi trƣờng: môi
trƣờng chuẩn, môi trƣờng nƣớc dừa già, môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc diclofenac từ 3 môi trƣờng

trên nhằm tìm ra môi trƣờng hấp thụ đƣợc nhiều thuốc nhất.
3. Nội dung nghiên cứu
- Chế tạo màng CVK từ 3 môi trƣờng: môi trƣờng chuẩn, môi trƣờng
nƣớc dừa già, môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Tiến hành hấp thụ thuốc diclofenac qua màng CVK trong một khoảng
thời gian nhất định, xác định lƣợng thuốc và hiệu suất hấp thụ ở các môi
trƣờng đó.
- So sánh lƣợng thuốc, hiệu suất hấp thụ qua màng đƣợc tạo ra từ 3 môi
trƣờng trên.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: So sánh khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của
màng cellulose vi khuẩn (CVK) lên men từ 3 môi trƣờng: Môi trƣờng chuẩn,
môi trƣờng nƣớc dừa già và môi trƣờng nƣớc vo gạo.

3


- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu đƣợc thực hiện trên quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trƣờng
ĐHSP Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học:
+ Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.
+ Bổ sung thêm các kiến thức về vi khuẩn A. xylinum nhằm ứng dụng
tạo ra màng CVK đƣợc tốt nhất, từ đó phục vụ cho việc tìm ra môi trƣờng có
khả năng hấp thụ thuốc diclofenac tốt nhất.
- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
+ Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter
xylinum.

+ Tăng sinh khả dụng của thuốc diclofenac.

4


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn (CVK)
Cellulose là hợp chất cao phân tử đƣợc cấu tạo từ các liên kết các mắt
xích β-D-Glucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n, là
thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật. Trong gỗ lá kim,
cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích.
Cellulose vi khuẩn (CVK) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo
màng bảo vệ [7].
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK
CVK đƣợc tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn. Trong đó, Acetobacter
xylinum (A. xylinum) đƣợc đánh giá là loài vi khuẩn có khả năng sinh màng
CVK hiệu quả nhất trong tự nhiên. A. xylinum là loài vi khuẩn gram âm sống
hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến hóa nhất
của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi tế bào Acetobacter xylium có thể chuyển hóa tới
108 phân tử glucose và phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp
cellulose là rất lớn.
1.1.2. Vi khuẩn A. xylinum
1.1.2.1. Phân loại
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter. Là nhóm vi
khuẩn gram âm, sống hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose
ngoại bào [7].
Theo khóa phân loại Bergey, A. xylinum thuộc:
- Lớp: Schizomycetes
- Bộ: Pseudomonadales
- Bộ phụ: Pseudomonadieae

- Họ: Pseudomonadaceae
- Giống: Acetobacter

5


- Loài: Acetobacter xylinum
Gần đây, A. xylinum đã đƣợc xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao
gồm các loài là G. xylinus, G. hansenii, G. europaeus, G. oboediens và G.
intermedius.
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái A. xylinum
- A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc
đứng yên và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm. Chúng có thể
đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt
buộc vì thế chúng tăng trƣởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trƣờng lỏng và môi
trƣờng khí và có khả năng tạo màng cellulose trên môi trƣờng nuôi cấy [11].
- Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thƣớc (đƣờng kính khuẩn lạc đạt 12mm) tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và
sẫm hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.
- Trên môi trƣờng rắn, sau khoảng 3-7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A.
xylinum có kích thƣớc nhỏ, bề mặt nhày, có màu kem, hơi trong. Sau 1 tuần
thì khuẩn lạc có kích thƣớc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần.
- Trên môi trƣờng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng
đục dày. Sau 36-48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày.
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của A. xylinum
- Vi khuẩn A. xylinum phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 25-35oC, pH = 4-6.
Nhiệt độ và pH tối ƣu tùy thuộc vào giống nhƣng bình thƣờng nhiệt độ và pH
tối ƣu để A. xylinum phát triển là từ 25-30oC và pH từ 5,4-6,3. A. xylinum có
thể phát triển trong phạm vi pH từ 3-8, nhiệt độ từ 12-35oC và nồng độ
ethanol có thể tới 10%. Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong
môi trƣờng tối ƣu.

6


- A. xylinum có khả năng chịu đƣợc pH thấp, vì vậy cần bổ sung thƣờng
xuyên acid acetic vào môi trƣờng nuôi cấy để hạn chế sự xâm nhiễm của
khuẩn lạ [9].
- Năm 1950, Franteur đã chính thức đƣa ra một khóa phân loại mới căn
cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt
tính catalase; khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer,…[9]. Theo quan
điểm này A. xylinum là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae,
bộ Pseudomonadaless, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng
khác trong cùng một chi đƣợc trình bày ở bảng dƣới đây:
Bảng 1.1. Đặc điểm phân biệt chủng A. xylinum với các chủng khác
Đặc điểm

Hiện tƣợng

Kết quả

Oxy hóa ethanol thành acid Chuyển hóa môi trƣờng chứa +
acetic

Bromphenol Blue 0,04% từ
màu xanh sang màu vàng

Hoạt tính catalase

Hiện tƣợng sủi bọt khí

Sinh trƣởng trên môi trƣờng Sinh khối không phát triển

+
_

Hoyer
Chuyển hóa glycerol thành Tạo kết tủa đỏ gạch trong +
dihydroxyaceton

dịch sau lên men

Chuyển hóa glucose thành Vòng sáng xuất hiện xung +
acid

quanh khuẩn lạc trên môi
trƣờng chứa CaCO3

Kiểm tra khả năng sinh sắc Không hình thành sắc tố nâu

_

tố nâu
Kiểm tra khả năng tổng hợp Váng vi khuẩn xuất hiện màu +
cellulose

lam

7

- A. xylinum sử dụng nhiều nguồn đƣờng khác nhau và tùy thuộc vào
chúng mà nguồn đƣờng nào đƣợc sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển hóa
glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trƣờng giảm từ 1-2
đơn vị.
1.1.3. Đặc điểm của CVK
1.1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của CVK
Màng cellulose vi khuẩn (CVK) đƣợc cấu tạo bởi những chuỗi polymer
β-1,4-glucopyranose mạch thẳng không phân nhánh. CVK đƣợc tổng hợp từ
một số loài vi khuẩn, chủ yếu là Acetobacter xylinum (A. xylinum). Các
nghiên cứu cho thấy màng CVK do vi khuẩn A. xylinum tạo ra có cấu trúc hóa
học đồng nhất với cellulose thực vật nhƣng lại có một số tính chất lý hóa nổi
trội. Điển hình nhƣ: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nƣớc cao, đƣờng kính
sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn,...[17].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của cellulose vi khuẩn [3]
1.1.3.2. Tính chất độc đáo của CVK
-

Độ tinh khiết cao: CVK là màng cellulose sinh học duy nhất đƣợc tổng
hợp không có chứa lignin hay hemicellulose. Vì vậy CVK có thể bị phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh, an toàn cho môi trƣờng.

-

Độ bền dai cơ học lớn:Cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng
lƣợng nhẹ,…

-

Khả năng hút nƣớc cực cao ở trạng thái ẩm: Màng CVK có khả năng giữ

nƣớc cao, có thể hút 60-700 lần trọng nƣớc của nó [17].

8


-

Màng CVK đƣợc tạo ra trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp vì vậy việc
sản xuất giấy, tơ sợi không cần qua các bƣớc trung gian, từ đó tiết kiệm
thời gian sản xuất.

-

Màng cellulose đƣợc định hƣớng trong quá trình tổng hợp: Có khả năng
hình thành các sợi biến động, tạo các sợi bền theo một trục.

-

Màng cellulose đƣợc biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: khi thêm
chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp CVK thì
có thể làm thay đổi những thuộc tính của CVK.

-

Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động gen
liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng
cellulose, kiểm soát trọng lƣợng phân tử cellulose.

1.1.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum nhằm tạo ra màng CVK
Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum là môi trƣờng nuôi cấy tổng hợp từ các

nguồn dinh dƣỡng cần thiết và quan trọng nhƣ: Nguồn cacbon, nitơ, sulfur,
phospho,…Nhu cầu sử dụng đƣờng ở A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò nhất
định trong quá trình sinh tổng hợp CVK. Nhiều nghiên cứu đề nghị sử dụng
các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác nhƣ: Chất thải trong
công nghệ sản xuất phomat, chất thải của nhà máy sản xuất bột ngọt, nƣớc
dừa già, nƣớc vo gạo,…để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A. xylinum.
1.1.5. Ứng dụng của màng CVK
Trên thế giới màng CVK đƣợc sử dụng phổ biến trong nhiều ngành khác
nhau. Trong đó, dƣợc phẩm và mỹ phẩm đƣợc sử dụng nhiều hơn cả. Các tác
giả: Hamlyn và cs, Cienchanska, Legeza và cs, Wan và Million, Czaja và cs,
sử dụng màng CVK để điều trị bỏng, đắp lên các vết thƣơng hở và đã thu
đƣợc kết quả tƣơng đối tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã đƣợc đăng kí
bản quyền về làm màng CVK từ A. xylinum dùng để điều trị bỏng. Các tác giả

9


Jonas và Farad, Czaja và cs đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ
dƣỡng da.
Ngoài ra, CVK còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhƣ:
Trong công nghiệp giấy màu, CVK đƣợc dùng để sản xuất giấy điện tử chất
lƣợng cao; trong công nghiệp môi trƣờng, màng CVK đƣợc sử dụng làm
màng phân tách để xử lý nƣớc và biến đổi độ nhớt của nƣớc [17], dùng CVK
làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lƣợng (Brown, 1989),
làm các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, sử dụng để
cố định protein.
Với những ƣu điểm nổi trội hơn hẳn so với các màng cellulose thực vật,
CVK ngày càng đƣợc nghiên cứu rộng rãi và có nhiều ứng dụng trong đời
sống [1],[7],[11],[12],[13],[15],[16],[17],[21],[22],[25].

10


Bảng 1.2. Các ứng dụng của CVK
Lĩnh vực

Sản phẩm ứng dụng

Thực phẩm

Tráng miệng (thạch dừa)
Thực phẩm dành cho ngƣời ăn kiêng (kem, salad)
Thịt nhân tạo, vỏ bao xúc xích
Nƣớc uống siro không có cholesterol
Trà Kobucha hay manchurian

Y dƣợc

Lớp màng trị bỏng
Tác nhân, hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc
Da nhân tạo
Chất làm co mạch

Mỹ phẩm

Móng nhân tạo

Môi trƣờng

Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn

Hấp thu chất độc
Quần áo, giày dép tự phân hủy

Dầu mỏ

Thu hồi dầu

Trang phục

Sản xuất sợi nhân tạo
Y phục quân đội

Thể thao

Lều lắp ráp

Sản phẩm rừng

Gỗ nhân tạo
Giấy, giấy đặc biệt để lƣu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

11


1.1.6. Tình hình nghiên cứu về màng CVK ở Việt Nam và trên thế giới

1.1.6.1. Trên thế giới
Tính đến cuối năm 2014, trên thế giới mới đã có 18 nghiên cứu ứng
dụng về CVK trong hệ thống vận tải và phân phối thuốc đã đƣợc báo cáo
[16]. Trong đó có 9 nghiên cứu về màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu về thể
chất biến đổi màng CVK và 7 nghiên cứu về các vật liệu nano composite.
Nghiên cứu của Wei B. và cs (2011) [26] cho thấy màng CVK khô thu
đƣợc sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn;
Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị
diện tích bề mặt là 0,116kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ
chống lại hoạt động của S. Aureus và B. Subtilis [26]. Tiềm năng vận tải và
phân phối thuốc của màng CVK qua da đã đƣợc nghiên cứu bằng cách tải
tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và không đƣợc chiếu xạ. CVK
không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn so với ảnh hƣởng của
CVK chiếu xạ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng CVK không chỉ có khả
năng vận tải mà còn đề xuất một mô hình cho giải phóng thuốc qua màng
[16].
1.1.6.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK vào đời sống sản
xuất còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại bƣớc đầu
nghiên cứu, các kết quả ứng dụng hầu nhƣ mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí
nghiệm. Mới đây nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung [11]
cũng đang bƣớc đầu ứng dụng màng CVK trong điều trị bỏng trên thỏ. Công
tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng trị
bỏng nhƣ màng ối, trung bì da lớn, da ếch, màng chitosan, sử dụng các chất
có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng,…Từ năm 2000 nhóm
nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự [7] đã có một số công

12

trình nghiên cứu về màng CVK từ A. xylinum và bƣớc đầu nghiên cứu về các
đặc tính của màng CVK thu đƣợc là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng
trong trị bỏng ở Việt Nam.
Điều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã đƣợc áp dụng
từ rất lâu và phổ biến ở tất cả các nƣớc. Các thuốc này có sẵn trong thiên
nhiên và có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng nhƣ chữa các vết
thƣơng, vết loét…
Màng CVK có nhiều ƣu điểm để trở thành chất mang các hợp chất có
nguồn gốc từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng.
1.2. Giới thiệu về thuốc diclofenac
1.2.1. Công thức hóa học và tên gọi
Diclofenac là một thuốc chống viêm không steroid [2].
+ Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2
+ Phân tử gam: 296,148g/mol
+ Tên chung quốc tế: Diclofenac
+ Tên IUPAC: 2-(2-(2,6-dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid
+ Công thức cấu tạo:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của diclofenac

13


1.2.2. Tính chất
- Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm nhẹ. Dễ tan trong methanol,
tan trong ethanol 96%, hơi tan trong nƣớc, khó tan trong aceton [4].
- Chảy ở khoảng 280°C kèm theo phân hủy [4].
1.2.3. Công dụng và cơ chế tác động của Diclofenac
Diclofenac - dẫn chất của acid phenylacetic. Diclofenac là thuốc chống
viêm không steroid [2]. Thuốc có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt

mạnh. Diclofenac cũng có thể đƣợc sử dụng để điều trị các cơn đau khác
(chẳng hạn nhƣ đau răng, đau nhức cơ bắp, đau sau phẫu thuật hoặc sau
khi sinh). Tuy nhiên, nếu bị các cơn đau nghiêm trọng bất ngờ nên sử dụng
các thuốc giảm đau có tác dụng nhanh hơn diclofenac.
Diclofenac đƣợc hấp thu dễ dàng qua đƣờng tiêu hóa sau khi uống.
Thuốc đƣợc hấp thu nhanh hơn nếu uống lúc đói. Diclofenac gắn rất nhiều với
protein huyết tƣơng, chủ yếu với albumin (99%) [2]. Khoảng 50% liều uống
đƣợc chuyển hóa qua gan lần đầu và sinh khả dụng trong máu tuần hoàn xấp
xỉ 50% sinh khả dụng của liều tiêm tĩnh mạch.
1.2.4. Dược động học của thuốc
Hấp thu:
Viên 50mg: Hấp thu hoàn toàn nhƣng lúc bắt đầu bị trì hoãn cho đến
đoạn qua dạ dày, có thể bị ảnh hƣởng bởi thức ăn mà trì hoãn làm rỗng dạ
dày. Nồng độ đỉnh trung bình trong huyết tƣơng của diclofenac 1,48 ±
0,65μg/ml đạt đƣợc khoảng 2 giờ sau khi uống một liều 50mg (1,5μg/ml =
5μmol/l).
Viên 100mg: Lƣợng hoạt chất đƣợc phóng thích và hấp thu từ viên
phóng thích chậm tƣơng tự nhƣ viên bao tan trong ruột. Nồng độ đỉnh trung
bình trong huyết tƣơng của diclofenac là 0,508 ± 0,185μg/ml (0,5μg/ml =
1,6μmol/l) đạt đƣợc sau 4 giờ dùng viên phóng thích chậm 100mg. Viên

14


phóng thích chậm 100mg là dạng bào chế phóng thích có kiểm soát và nồng
độ trong huyết tƣơng của diclofenac đƣợc ghi nhận sau 24 giờ dùng thuốc là
13ng/ml (40μmol/l). Sự hấp thu của thuốc không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn.
Sinh khả dụng
Sinh khả dụng toàn thân của diclofenac từ dạng bào chế phóng thích
chậm đạt đƣợc trung bình khoảng 82% so với viên bao tan trong ruột ở cùng

liều lƣợng (có thể tùy thuộc vào tỷ lệ phóng thích do chuyển hóa lần đầu). Do
kết quả của sự phóng thích hoạt chất chậm hơn nên nồng độ đỉnh trong huyết
tƣơng thấp hơn so với dạng viên bao tan trong ruột tƣơng ứng.
Tính chất dƣợc động học không thay đổi khi dùng liều lặp lại. Thuốc
không bị tích lũy nếu đƣợc dùng đúng khoảng cách liều đƣợc khuyến cáo.
Nồng độ lõm của diclofenac trong huyết tƣơng sau khi dùng viên phóng thích
chậm 100mg/ngày khoảng 22ng/ml (70nmol/l).
Phân bố
99,7% thuốc gắn kết với protein, chủ yếu với albumin (99,4%).
Diclofenac đi vào hoạt dịch, nơi có nồng độ tối đa đo đƣợc sau 2-4 giờ
đạt đƣợc nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng. Thời gian bán thải biểu kiến từ hoạt
dịch là 3-6 giờ. 2 giờ sau khi đạt tới nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng, nồng độ
hoạt chất trong hoạt dịch đã cao hơn so với trong huyết tƣơng và duy trì cao
hơn cho đến 12 giờ.
Chuyển hóa
Sinh chuyển hóa của diclofenac xảy ra một phần do sự glucuronid hóa
của phân tử diclofenac nguyên vẹn nhƣng chủ yếu do sự hydroxyl hóa và
methoxyl hóa một lần và nhiều lần tạo ra một vài chất chuyển hóa phenolic,
phần lớn những chất chuyển hóa này đƣợc chuyển thành dạng liên hợp
glucuronid. Hai trong số các chất chuyển hóa phenolic có hoạt tính sinh học
nhƣng với mức độ yếu hơn nhiều so với diclofenac.

15


Thải trừ
Độ thanh thải toàn phần của diclofenac trong huyết tƣơng là 263 ±
56ml/phút (giá trị trung bình ± SD). Thời gian bán thải cuối cùng trong huyết
tƣơng là 1-2 giờ. 4 trong số các chất chuyển hóa trong đó gồm hai chất có
hoạt tính có thời gian bán thải ngắn trong huyết tƣơng từ 1-3 giờ.

Khoảng 60% liều dùng đƣợc thải trừ qua nƣớc tiểu ở dạng liên hợp
glucuronid của nguyên tử diclofenac nguyên vẹn và chất chuyển hóa, phần
lớn những chất này cũng đƣợc chuyển thành dạng liên hợp glucuronid. Dƣới
1% đƣợc thải trừ dƣới dạng không đổi. Phần còn lại đƣợc thải trừ dƣới dạng
chất chuyển hóa theo mật qua phân.
1.2.5. Dược lực học của thuốc
Diclofenac, dẫn xuất của acid phenylacetic, là một thuốc kháng viêm
không steroid (NSAID) nguyên thủy. Diclofenac có cấu trúc liên quan với
meclofenamat natri và acid meclofenamic và có tác động dƣợc lý tƣơng tự
nhƣ các NSAID nguyên thủy khác. Thuốc ức chế sự hình thành mạch máu và
làm thoái hóa mạch máu mới sinh trong mô viêm của thú vật. Các NSAID,
bao gồm cả diclofenac, đƣợc dự đoán là ức chế sự hình thành mạch máu
thông qua ức chế cơ chất P hoặc ức chế tác động tạo mạch của prostaglandin
E (PEG). Thuốc có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ sốt. Cơ chế chính
xác chƣa đƣợc thiết lập rõ ràng, nhƣng nhiều tác dụng liên quan chủ yếu với
sự ức chế tổng hợp prostaglandin. Diclofenac ức chế sự tổng hợp
prostaglandin trong mô cơ thể bằng cách ức chế cyclooxygenase; tối thiểu 2
isoenzym, cyclooxygenase-1 (COX-1) và cyclooxygenase -2 (COX-2) (tƣơng
ứng prostaglandin G/H synthase-1 [PGHS-1] và prostaglandin G/H synthase 2 [PGHS-2]), xúc tác cho sự hình thành prostaglandin trong con đƣờng acid
arachidonic. Diclofenac, giống nhƣ những NSAID nguyên thủy khác, ức chế
cả COX-1 và COX-2. Mặc dù cơ chế chính xác chƣa đƣợc thiết lập rõ ràng,

16