Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======
NGUYỄN THỊ DINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
HẤP THỤ THUỐC CAPTOPRIL
CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học

ThS. HÀ THỊ MINH TÂM

HÀ NỘI, 2018


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Hà Thị Minh Tâm đã hướng
dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành
tốt khoá luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2,
khoa Sinh- KTNN, Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2, cùng các thầy
cô trong tổ bộ môn Động vật, ban bảo vệ đã tạo điều kiện giúp đỡ em.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, quan tâm động viên của bạn bè,
gia đình trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018
SINH VIÊN

Nguyễn Thị Dinh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi, các số
liệu, kết quả trong khoá luận là trung thực, không trùng lặp với bất kì công
trình công trình nghiên cứu nào khác.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018
SINH VIÊN

Nguyễn Thị Dinh


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
A. xylinum
CAP

Tên đầy đủ
Acetobacter xylinum
Captopril

CVK

Cellulose vi khuẩn

C

Nồng độ

E. coli

Escherichia coli

h

Giờ

OD

Optical Density

HS

Môi trường chuẩn Hestrin –
Schramm

g

Gam


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ...................................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................................. 3

5. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 3
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn .................................................................... 3
NỘI DUNG ................................................................................................................. 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4
1.1. Giới thiệu về VCK ............................................................................................... 4
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra VCK ................................................................................ 4
1.1.2. Cấu trúc và đặc điểm của màng CVK ............................................................... 4
1.2. Captopril ............................................................................................................... 5
1.2.1. Một số tính chất lí hoá ....................................................................................... 5
1.2.2. Dược tính ........................................................................................................... 5
1.2.3. Tác dụng không mong muốn ............................................................................ 6
1.3. Môi trường chuẩn Hestrin – Schramm (HS) ........................................................ 6
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................................... 6
1.4.1. Cellulose vi khuẩn (CVK) ................................................................................. 6
1.4.2. Captopril ............................................................................................................ 7
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 9
2.1. Vật liệu nghiên cứu và trang thiết bị .................................................................... 9
2.1.1. Giống vi khuẩn .................................................................................................. 9
2.1.2. Nguyên liệu và hoá chất .................................................................................... 9


2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................ 9
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 9
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 10
2.3.1. Phương pháp tạo màng và xử lí màng CVK trước khi hấp thụ thuốc Captopril10
2.3.2. Thử độ sạch của màng..................................................................................... 10
2.3.3. Phương pháp chế tạo màng CVK nạp thuốc CAP .......................................... 11
2.3.3. Phương pháp tạo màng CVK nạp thuốc CAP ................................................. 12
2.3.4. Phương pháp xác định lượng CAP nạp vào màng CVK................................. 12
2.3.5. Phương pháp thống kê và xử lí kết quả ........................................................... 13

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 14
3.1. Phổ hấp thụ và đường chuẩn của thuốc CAP ..................................................... 14
3.2. Tạo màng CVK của A. xylinum trong môi trường chuẩn .................................. 16
3.3. Thu màng VCK thô từ môi trường chuẩn .......................................................... 18
3.4. Tinh chế màng CVK .......................................................................................... 19
3.5. Màng CVK hấp thụ thuốc CAP ......................................................................... 21
3.6. Lượng thuốc CAP hấp thụ vào màng CVK ....................................................... 21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 25
1. Kết luận ................................................................................................................. 25
2. Kiến nghị ............................................................................................................... 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 26
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần của môi trường chuẩn ............................................................. 6
Bảng 2.1. Các trường hợp thí nghiệm ....................................................................... 12
Bảng 3.1. Bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc CAP .............................................. 14
Bảng 3.2. Mật độ quang của dung dịch CAP ở các nồng độ khác nhau (n=3). ........ 15
Bảng 3.3. Giá trị OD trung bình của dung dịch CAP sau khi ngâm màng CVK 120
phút (n=3) .................................................................................................................. 22
Bảng 3.4. Lượng thuốc CAP hấp thụ vào màng CVK (n=3) .................................... 22


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Phổ hấp thụ cực đại của CAP với dung môi là nước cất .......................... 14
Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn CAP OD200nm với dung môi là nước cất ................... 15
Hình 3.3. Màng CVK sau 5 ngày nuôi cấy tĩnh trong môi trường chuẩn ................. 16
Hình 3.4. Màng CVK có độ dày 0,5cm sau 7 ngày nuôi cấy.................................... 17
Hình 3.5. Màng CVK có độ dày 1cm sau 14 ngày nuôi cấy..................................... 17

Hình 3.6. Màng CVK thô thu được từ môi trường chuẩn ......................................... 18
Hình 3.7. Màng CVK thô thu được từ môi trường chuẩn có kích thước d1,5cm .... 19
Hình 3.8. Màng CVK tinh khiết sau xử lý bởi NaOH .............................................. 20
Hình 3.9. Màng CVK tinh khiết ở độ dày 0,5cm ...................................................... 20
Hình 3.10. Màng CVK tinh thiết ở độ dày 1cm ........................................................ 21
Hình 3.11. Hiệu suất hấp thụ CAP của 2 độ dày màng của trường hợp 1 ................ 23
Hình 3.12. Hiệu suất hấp thụ CAP của 2 độ dày màng của trường hợp 2 ................ 23


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Captopril (CAP) là một chất ức chế men chuyển angiotensin hoạt tính
đường uống. Captopril được dùng để điều trị tăng huyết áp, giúp ngăn ngừa
đột quỵ, đau tim và các vấn đề về thận. Captopril không gây độc đối với các
tế bào bình thường. Ngoài ra, captopril không gây trầm cảm trên thần kinh
trung ương và không gây rối loạn giấc ngủ. Captopril còn cho thấy hoạt tính
chống trầm cảm. Captopril cũng đã được điều tra để sử dụng trong điều trị
ung thư phổi. Các đồng phân lập thể captopril được báo cáo là có khả năng là
ức chế một số metallo-β-lactamase [12,14].
Mặc dù captopril đã cho thấy khả năng chống lại một số bệnh nhưng
hiệu quả điều trị của nó vẫn có một số hạn chế. Captopril có thời gian bán thải
ngắn (1-3h), rất dễ bị oxy hoá làm giảm tác dụng của thuốc [9]. Vì vậy gây
ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả điều trị lâm sàng và đặc tính an toàn của
captopril đối với bệnh nhân. Trong quá trình điều trị bằng thuốc CAP, bệnh
nhân có thể gặp một số tác dụng phụ không mong muốn như: Hạ huyết áp
(Thường gặp ở liều đầu tiên), ho, suy thận cấp, dị ứng, phù mạch thần kinh do
thoát nước ra ngoài mao mạch, thay đổi vị giác, viêm tuỵ, viêm lưỡi, thiếu
máu, bệnh vàng da,... Vì vậy, đã có nhiều nỗ lực đã được thực hiện để cải
thiện những hạn chế của captopril bằng cách thay đổi các tính năng này.
Việc sử dụng vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe

trong những năm gần đây đã có sự chú ý đặc biệt như: Khả năng tái tạo,
tương thích sinh học và phân hủy sinh học. Trong đó đáng chú ý là cellulose,
đây là vật liệu vượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [16].
Cellulose vi khuẩn (Viết tắt là CVK) là sản phẩm của một loài vi
khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Màng CVK có cấu trúc và đặc
tính rất giống với cellulose của thực vật. Màng CVK có nhiều đặc tính vật lí,
1


hoá học ưu việt hơn so với cellulose thực vật như: độ bền cơ học cao, khả
năng thấm hút nước cao, cấu trúc từ những sợi nhỏ rất tinh vi, có độ tinh khiết
cao và khả năng polymer hoá lớn,… [7]. Vì vậy, màng CVK được ứng dụng
khá nhiều trong thực tiễn ở các lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, y học, mỹ
phẩm,... đặc biệt trong lĩnh vực y tế nhờ khả năng kháng khuẩn cao [5]. Ngoài
ra, màng CVK cho thấy khả năng ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển
thuốc, được dùng qua đường uống, thẩm thấu qua da, và một số ứng dụng y
sinh học khác [6,8], đáng chú ý nhất là trong sự kiểm soát các hệ thống vận
chuyển thuốc.
Vì vậy, dựa trên khả năng ứng dụng của màng CVK trong tương lai có
thể tạo ra hệ thống tăng cường khả năng hấp thụ thuốc captopril, từ đó có thể
cải thiện một số hạn chế của thuốc trong quá trình sử dụng, giúp tăng hiệu quả
chữa trị. Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ
thuốc captopril của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường
chuẩn”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Tìm hiểu khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng CVK lên men từ
môi trường chuẩn HS.
- Nghiên cứu hệ thống CVK được hấp thụ thuốc captopril ở độ dày
màng khác nhau từ đó nhằm tìm ra trường hợp khả năng hấp thụ thuốc
captopril tối đa vào màng CVK.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng
Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: Viện NCKH&ƯD, Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2


4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng và tinh chế màng CVK.
- Thiết kế hệ thống các thí nghiệm hấp thụ thuốc CAP vào vật liệu
CVK.
- Khảo sát, đánh giá khả năng hấp thụ thuốc thông qua thí nghiệm đã
thiết kế.
5. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A. xylinum tạo màng CVK từ nguyên
liệu có sẵn.
- Thu vật liệu CVK từ dịch nuôi cấy và tinh chế.
- Chế tạo vật liệu CVK hấp thụ thuốc CAP.
- Thử nghiệm tác dụng hấp thụ thuốc CAP của vật liệu CVK.
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học
+ Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của màng CVK trong việc hấp thụ
thuốc tại chỗ.
+ Đánh giá những tiềm năng của màng CVK hấp thụ captopril để từ đó
có thể đề xuất hướng nghiên cứu trên các loại thuốc khác.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Sử dụng màng CVK làm hệ thống hấp thụ thuốc captopril định
hướng tạo ra hệ thống giúp khắc phục những hạn chế trong việc điều trị của

captopril .
+ Từ hệ thống màng CVK đã hấp thụ thuốc tìm ra màng hấp thụ thuốc
tốt nhất.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về CVK
Cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là đại diện cho
các polymer ngoại bào của vi sinh vật. CVK là sản phẩm của một số loài vi
khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum (AJ Brown, 1986). Điều kiện
nuôi cấy có khả năng quyết định cấu trúc của màng CVK [15].
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK
Màng CVK được tổng hợp từ một số chi vi khuẩn phổ biến như
Achromobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Alcaliganes, Azotobacter,
Escherichia, Gluconacetobacter, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina và
Zoogloae, đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum [2]. Đây cũng là loài vi
khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất. A. xylinum cũng là chủng vi
khuẩn được tập trung nghiên cứu nhiều nhất trong tổng hợp màng CVK.
Chúng có dạng hình que, thẳng hay hơi cong. Vi khuẩn A. xylinum là vi
khuẩn không sinh bào tử, thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, không di động, sắp
xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi. Chúng là một trong những loài tiến hóa
nhất của nhóm vi khuẩn tía [18]. Mỗi tế bào A. xylinum có thể tổng hợp được
lượng cellulose là rất lớn nhờ khả năng chuyển hóa đến 108 phân tử glucose
và cellulose trong 1 giờ. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc.
Chúng phát triển ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí
nên có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [6].
1.1.2. Cấu trúc và đặc điểm của màng CVK

CVK được cấu tạo bởi những chuỗi β-1,4-glucopyranose không phân
nhánh. Cấu trúc hoá học cơ bản của CVK khá giống với cellulose thực vật,
nhưng theo các nghiên cứu cho thấy chúng có sự khác nhau về cấu trúc đại
thể [18].
4


Trong nuôi cấy tĩnh, CVK đã cho thấy những tính chất rất đặc biệt như:
độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao.
Ngoài ra, CVK còn có khả năng thấm hút, có thể bị phân hủy sinh học, không
độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản
khuẩn. Với các tính chất này, CVK được ứng dụng khá nhiều trong các ngành
công nghiệp khác nhau trong đó có y học. CVK là một polymer sinh học có
nhiều tính năng vượt trội. CVK cũng là tác nhân tăng cường và là vật liệu bọc
ngoài cho các ứng dụng giải phóng một số loại thuốc đã được nghiên cứu
[17].
1.2. Captopril
- Tên quốc tế: Captopril.
- CTHH: C9H15NO3S.
- Tên IUPAC: Acid (2S)-1-[92S)-2-methyl-3-sulphanyl-propanoyl]
pyrolidin-2-carboxylic.
- Phân tử khối: 217,29 g / mol.
- Hàm lượng thường dùng: 12,5 mg; 25mg.
1.2.1. Một số tính chất lí hoá
Captopril

là

acid

(2S)-1-[92S)-2-methyl-3-sulphanyl-propanoyl]

pyrolidin-2-carboxylic; phải chứa từ 98,0% đến 101,5% C9H15NO3S; tính
theo chế phẩm đã làm khô. Thuốc ở dạng kết tinh trắng hoặc gần như trắng,
dễ tan trong nước, trong dicloromethan và methanol, tan trong các dung dịch
loãng của hydroxid kim loại kiềm. Về định tính thì phổ hấp thụ hồng ngoại
chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của captopril chuẩn.
1.2.2. Dược tính
Captopril là chất ức chế men chuyển angiotensin thông qua ức chế hệ
renin - angiotensin - aldosteron. Captopril được hấp thu tốt qua đường uống,
đạt sinh khả dụng khoảng 65%, nồng độ đỉnh trong máu của thuốc đạt được
5


sau khi uống thuốc 1h, duy trì tác dụng 6-8h. Thức ăn làm giảm hấp thu
thuốc. Thuốc có các tác dụng dược lý như: Chống tăng huyết áp, điều trị suy
tim, và sau nhồi máu cơ tim [10,14].
1.2.3. Tác dụng không mong muốn
Trong quá trình dùng thuốc thường gặp một số tác dụng phụ như: Hạ
huyết áp, ho, suy thận cấp, dị ứng, phù mạch thần kinh do thoát nước ra ngoài
mao mạch, thay đổi vị giác, viêm tuỵ, viêm lưỡi, thiếu máu, bệnh vàng da,…
1.3. Môi trường chuẩn Hestrin – Schramm (HS)
Các thí nghiệm đều sử dụng môi trường chuẩn là môi trường Hestrin –
Schramm (HS) bao gồm thành phần được thể hiện trong bảng 1.1 (Schramm
et al, 1954) [15]:
Bảng 1.1. Thành phần của môi trường chuẩn
D– glucose

20g

Peptone

5g

Cao nấm men

5g

Axit citric

1,15g

Dinatri phosphat (khan) (Na2HPO4)

2,7g

Nước cất hai lần

1000ml

- Thêm dịch giống vào từng môi trường với lượng như nhau và tối thiểu
bằng 10% thể tích môi trường.
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.4.1. Cellulose vi khuẩn (CVK)
CVK đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực hiện nay và rất có tiềm
năng trong tương lai. Với kết cấu linh hoạt, CVK cho phép định hình theo
nhiều cách khác nhau nhằm phù hợp với các mục đích sử dụng khác nhau.
- Trên thế giới: Tính đến cuối năm 2014, trên thế giới chỉ có 18 nghiên
cứu ứng dụng CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [9],
6

trong đó có 9 nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, hai nghiên cứu với thể
chất biến đổi màng CVK và 7 nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite.
Trên thế giới, CVK đã được xem là nguồn nguyên liệu mới có khả năng
có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong thực tế như: Công
nhiệp thực phẩm, sử dụng để phân tách cho quá trình xử lí nước, được dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào [3,13]. Trong
lĩnh vực y học, màng CVK đã được nghiên cứu và ứng dụng làm màng điều
trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, mặt nạ dưỡng da,... Đặc biệt CVK
còn được sử dụng để làm vật liệu vận tải và chất bọc ngoài thuốc được sử
dụng ngoài da như caffeine, diclofenac,... Màng CVK đã cho thấy những hiệu
quả rõ rệt, khắc phục được một số hạn chế của thuốc ở dạng thông thường.
- Tại Việt Nam: CVK cũng đã được nghiên cứu tạo màng trị bỏng
[3,18], cố định bạc nano làm màng lọc nước uống nhiễm khuẩn [11].
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter
xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, và kết
quả cho thấy triển vọng của màng CVK trong ứng dụng làm màng trị bỏng
[3].
1.4.2. Captopril
- Trên thế giới: Cho đến nay tuy có sự xuất hiện của nhiều thuốc cùng
nhóm nhưng thuốc captopril vẫn luôn được lựa chọn trong lâm sàng. Theo
bản báo cáo thứ 5 của Uỷ ban liên kết quốc gia (Joint National Committee)
của Mỹ, khuyên nên sử dụng Captopril, Nifedipine, Clonidine và Labetalol
trong điều trị cấp cứu cho bệnh nhân cao huyết áp. Tới nay, trên thế giới đã có
nhiều công trình nghiên cứu về thuốc captopril. Trong đó, phải kể đến công
trình nghiên cứu của tiến sĩ Samir Attoub, Khoa Dược, Khoa Y học và Sức
khoẻ, Đại học UAE với công trình “Captopril như một chất ức chế tiềm năng
7

của sự phát triển khối u và khối u phổi” được xuất bản lần đầu tiên vào
29/9/2008 trên tạp trí “Annals of the new York academy of sciences”. Nghiên
cứu cho thấy Captopril ức chế tế bào LNM35 bằng cách gây ra apoptosis,
cung cấp thêm thông tin về các cơ chế hoạt động chống lại vi khuẩn. Từ đó có
thể kết luận rằng captopril có thể là một lựa chọn đầy tiềm năng trong điều trị
ung thư phổi [12].
- Tại Việt Nam: Đã có những công trình nghiên cứu captopril như:
Nghiên cứu bào chế viên nén captopril rã nhanh đặt dưới lưỡi, nghiên cứu bào
chế viên nén captopril giải phóng kéo dài, bước đầu nghiên cứu tổng hợp và
thiết lập tạp chuẩn captopril disulfide [4], nghiên cứu bào chế viên
nén captopril giải phóng theo nhịp [9],…

8


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu và trang thiết bị
2.1.1. Giống vi khuẩn
Chủng vi sinh: Vi khuẩn tạo cellulose được nuôi cấy tại Phòng sạch Vi
sinh – Động vật, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà
Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu và hoá chất
- Hoá chất: Captopril; Pepton (Europeon Union); Cao nấm men (Mỹ);
các hoá chất sử dụng khác đảm bảo tiêu chuẩn phân tích.
- Nguyên liệu: Chè xanh, nước cất 2 lần, gạc vô trùng.
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường chuẩn HS (Glucose: 20g; Dinatri
phosphat: 2,7g; Pepton: 5g; Cao nấm men: 5g; Acid citric: 1,15g; Nước cất 2
lần: 1000ml)

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Trang thiết bị: Máy đo quang phổ UV- Vis 2450 (Shimadru - Nhật
Bản); Nồi hấp khử trùng (HV-110/HIRAIAMA – Nhật Bản); Cân phân tích
(Sartorius - Thuỵ Sỹ); Bể rửa siêu âm (Thuỵ Sỹ); Buồng cấy vô trùng
(Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Brinder - Đức); Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA Đức); Máy nước cất hai lần (Anh); Tủ lạnh bảo quản mẫu (Ý).
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A. xylinum trong môi trường chuẩn.
- Thu sản phẩm là màng CVK từ môi trường nuôi cấy và quá trình xử
lý.
- Chế tạo màng CVK nạp thuốc CAP.
- Khảo sát khả năng hấp thụ của thuốc CAP vào màng CVK.

9


2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng và xử lí màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Captopril
- A. xylinum được nuôi cấy để tạo màng CVK trong môi trường chuẩn
HS
Nguyên liệu cao nấm men thêm các chất dinh dưỡng cần thiết để tạo
màng. Sau đó hấp tiệt trùng ở 1130C trong 15 phút. Khử trùng bằng tia cực
tím trong 15 phút. Sau đó để nguội rồi bổ sung dịch giống và acid acetic theo
tỷ lệ.
- Sau khi nuôi cấy tĩnh trong 6 – 14 ngày ở 26℃, ta thu được màng
CVK thô. Màng CVK sau đó được tinh chế bằng cách: Cho màng CVK thô
vào dung dịch NaOH 3M, đem đi hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút. Sau đó
mang xả nước đến khi pH trung tính.
2.3.2. Thử độ sạch của màng
2.3.2.1. Kiểm tra glucose

- Mục đích: Để kiểm tra xem trong màng CVK có còn glucose hay
không.
- Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling để phát hiện xem trong màng
CVK có chứa glucose hay không, nếu trong màng CVK có glucose thì sẽ có
kết tủa màu nâu đỏ.
- Cách tiến hành:
+ Màng CVK tinh chế được nuôi cấy từ môi trường chuẩn.
+ Mẫu đối chứng: Là nước cất và dung dịch glucose.
+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling.
+ Đun sôi ống nghiệm chứa mẫu thử trên ngọn lửa đèn cồn từ 10 – 15
phút.
10


+ Quan sát, so sánh mẫu thử và dung dịch đối chứng.
2.3.2.2. Kiểm tra protein
- Mục đích: Kiểm tra xem trong màng CVK có còn chứa protein hay
không.
- Nguyên tắc: Kiểm tra sự có mặt của protein còn lại trong màng bằng
phản ứng tạo kết tủa của protein với acid triclor acetic 1%.
- Cách tiến hành:
+ Màng CVK cho vào 25ml nước cất đựng trong cốc thuỷ tinh.
+ Mẫu đối chứng dương là dung dịch pepton 1%, mẫu đối chứng âm là
nước cất và màng CVK thô.
+ Tiến hành nhỏ vài giọt acid triclor acetic 1% vào mẫu.
+ Quan sát hiện tượng, so sánh mẫu thử và mẫu đối chứng.
2.3.3. Phương pháp chế tạo màng CVK nạp thuốc CAP
2.3.3.1. Quét phổ và xây dựng dường chuẩn của thuốc CAP
- Quét phổ: Tiến hành quét phổ của CAP trong khoảng bước sóng từ

190nm đến 250nm bằng cách sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 ta
thu được phổ hấp thụ cực đại của thuốc CAP.
- Nguyên tắc xây dựng đường chuẩn CAP:
Sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 để xác định lượng CAP. Đo
các mẫu dung dịch chuẩn (6 mẫu) ở bước sóng 200nm.
+ Pha thuốc CAP với dung môi là nước cất ở các nồng độ là: 10%,
20%, 40%, 60%, 80%, 100%.
+ Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – Vis 2450 để đo mật độ quang
của các dung dịch đã pha ở bước sóng 200nm trong các dung dịch mẫu chuẩn.
+ Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn bằng phần mềm
Excel 2010.

11


+ Để kết quả đo có độ chính xác cao ta tiền hành đo dung dịch chuẩn ba
lần và đo quang phổ ba lần, lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn.
2.3.3. Phương pháp tạo màng CVK nạp thuốc CAP
Captopril được nạp vào vật liệu CVK theo phương pháp hấp thụ: Vật
liệu CVK (Kích thước d1,5cm) sau khi được sản xuất và làm sạch được ngâm
trong 25ml dung dịch CAP bão hoà (75mg/ml), dung môi là nước, đặt ở điều
kiện tĩnh ở 2 trường hợp như bảng 2.3.
Bảng 2.1. Các trường hợp thí nghiệm
Trường hợp

Độ dày màng (cm)

Điều kiện load thuốc vào màng

1

0,5

Nhiệt độ phòng

1
2

Nhiệt độ 80oC

0,5
1

2.3.4. Phương pháp xác định lượng CAP nạp vào màng CVK
- Xác định lượng thuốc hấp thu vào vật liệu CVK: Sau khoảng thời
gian xác định tiến hành rút mẫu ra từ dung dịch Captopril chứa vật liệu CVK
nêu trên. Sau đó đo quang phổ bằng máy UV – Vis 2450 để xác định lượng
thuốc còn lại trong dung dịch tại thời điểm rút mẫu. Từ đó xác định được
lượng thuốc hấp thu vào màng CVK theo công thức:
mht (mg) = m1 - m2
Trong đó: mht: Khối lượng thuốc CAP đã hấp thu vào vật liệu.
m1: Khối lượng CAP ban đầu trong dung dịch.
m2: Khối lượng CAP còn lại trong dung dịch sau thời gian
vật liệu CVK hấp thu thuốc CAP.
- Hiệu suất nạp CAP vào vật liệu CVK được tính theo công thức:
EE (%) = mht/m1×100%
12


2.3.5. Phương pháp thống kê và xử lí kết quả

Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần để lấy giá trị trung bình. Số liệu thí
nghiệm thu được khi xác định hiệu suất nạp thuốc được phân tích trên phần
mềm Microsofl Excel, các số liệu nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng số
trung bình ± độ lệch chuẩn. Số trung bình cộng được dùng để tính giá trị trung
bình của các lần lặp lại thí nghiệm. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa
thống kê khi giá trị p < 0,05.

13


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phổ hấp thụ và đường chuẩn của thuốc CAP
- Sử dụng máy đo quang phổ UV – Vis 2450 ta thu được phổ hấp thụ
cực đại của thuốc CAP được thể hiện như bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc CAP
Nồng độ

Bước sóng (nm)

OD

25mg/900ml

200

1,081

Abs.

Mật độ quang (OD)

1.102
1.000

0.500

0.000
-0.103
190.00

200.00

220.00
nm.

240.00

Bước sóng (nm)
Hình 3.1. Phổ hấp thụ cực đại của CAP với dung môi là nước cất

14

250.00


- Kết quả trung bình quang phổ của CAP ở bước sóng 200nm được
trình bày như trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Mật độ quang của dung dịch CAP ở các nồng độ khác nhau
(n=3).
Nồng 0,1

0,2

0,4

0,6

0,8

1

độ
(mg/
ml)
0,113

OD

0,226

± 0,0013 ± 0,0015

0,458

0,665

± 0.0019 ± 0,0021

0,889

1,081

± 0,0012

± 0,0017

- Đồ thị đường chuẩn CAP OD200nm với dung môi là nước cất được thể
hiện như trong hình 3.2.

OD200

1.2

y = 1,0804x + 0,0136
R² = 0,9992

Mật độ quang (OD)

1

0.8

0.6

OD200
Linear (OD200)

0.4

0.2

0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Nồng độ CAP (mg/ml)
Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn CAP OD200nm với dung môi là nước cất

15


- Phương trình đường chuẩn:
y = 1,0804x + 0,0136 (R² = 0,9992)
Trong đó: x - Nồng độ CAP (µg/ml).
y - Giá trị OD tương ứng.
R2 là hệ số tương quan.
3.2. Tạo màng CVK của A. xylinum trong môi trường chuẩn
Nuôi cấy tĩnh vi khuẩn A. xylinum, lúc này môi trường có đầy đủ chất
dinh dưỡng nên tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. Ngày

đầu tiên, vi khuẩn bắt đầu tiếp xúc với môi trường làm cho pH môi trường
giảm nhẹ. Đến ngày thứ hai, trên bề mặt dung dịch trong bình nuôi cấy bắt
đầu xuất hiện một lớp màng có màu trắng đục. Lớp màng này dày dần lên đến
khi môi trường hết chất dinh dưỡng và vi khuẩn ngừng sinh trưởng thì dừng
lại. Sau 7 – 14 ngày nuôi cấy tĩnh thì màng có độ dày khoảng 0,5 – 1cm. Thời
gian nuôi cấy quyết định độ dày của màng.
Màng CVK khi nuôi cấy tĩnh trong môi trường chuẩn đến ngày thứ 5
được thể hiện như trong hình 3.3.

Hình 3.3. Màng CVK sau 5 ngày nuôi cấy tĩnh trong môi trường chuẩn

16


- Theo dõi sự tạo thành màng CVK sau các khoảng thời gian thu được
màng CVK ở các độ dày như sau:
+ Nuôi cấy trong thời gian 7 ngày ta thu được màng CVK có độ dày
0,5cm được thể hiện như hình 3.4.

Hình 3.4. Màng CVK có độ dày 0,5cm sau 7 ngày nuôi cấy
+ Nuôi cấy trong thời gian 14 ngày ta thu được màng CVK có độ dày
1cm được thể hiện như hình 3.5.

Hình 3.5. Màng CVK có độ dày 1cm sau 14 ngày nuôi cấy
17