Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men sản xuất thực phẩm chức năng nattokinase tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------***------------

Hoàng Thị Bích Vân

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------***------------

Hoàng Thị Bích Vân

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành:

Khoa học Môi trường

Mã số:

60440301

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. NGÔ THỊ TƯỜNG CHÂU
2. TS. HỒ TUYÊN

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn, em đã luôn
nhận được sự dạy dỗ, chỉ bảo tận tình của các Thầy, Cô giáo cũng như sự quan tâm
chăm sóc từ gia đình và bạn bè.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Ngô Thị Tường
Châu và TS. Hồ Tuyên. Thầy Côđã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho em kiến thức
và kinh nghiệm quý báu. Luôn nhắc nhở, bảo ban và động viên em suốt thời gian tiến
hành đề tài cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, học viên và sinh viên
thuộc phòng thí nghiệm phân tích - Khoa Môi trường và Bộ môn Sinh thái Môi
trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn chỉ
bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và đóng góp ý kiến quý báu để em hoàn thành
luận văn một cách tốt nhất.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn
bè đã luôn bên cạnh động viên, chia sẻ và giúp đỡ em về mọi mặt trong suốt thời gian
qua.
Hà Nội, năm 2017
Học viên

Hoàng Thị Bích Vân


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN ........................................................................................... 3
1.1.

Khái niệm về huyết khối .................................................................................... 3

1.2.

Đại cương về nattokinase ................................................................................... 3

1.2.1.

Lịch sử phát hiện nattokinase ..................................................................... 3

1.2.2.

Hoạt tính của nattokinase ............................................................................ 4

1.2.3.

Cơ chế phân hủy fibrin của nattokinase ...................................................... 5

1.2.4.

Sinh tổng hợp và sản xuất nattokinase ........................................................ 5

1.2.5.

Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase................................................. 7

1.3.

Đại cương về Bacillus subtilis ......................................................................... 10

1.3.1. Đặc điểm tế bào.......................................................................................... 10
1.3.2.
1.4.

Chất cảm ứng IPTG ................................................................................... 12

Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học khi lên men sản xuất NK ....... 12

1.4.1.

Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý ............................................................ 12

1.4.2.

Ảnh hưởng của các tác nhân hóa học......................................................... 15

1.4.3. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học đến sản
xuất NK ................................................................................................................... 18
1.5.

Các phương thức lên men sản xuất NK ........................................................... 20

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 23
2.1.

Vật liệu ............................................................................................................. 23

2.1.1.

Chủng giống .............................................................................................. 23

2.1.2.

Môi trường ................................................................................................ 23

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 24

2.2.1.

Chuẩn bị giống vi khuẩn B. subtilis tái tổ hợp .......................................... 25

2.2.2.

Phương pháp lên men ............................................................................... 25

2.2.3.

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme .................................................. 25

2.2.4.

NK

Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường và điều kiện lên men cho sinh tổng hợp
................................................................................................................... 28

2.2.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học khi lên
men nhằm nâng cao hoạt tính NK ........................................................................... 32
2.2.6.

Phương pháp xác định ảnh hưởng của các chế độ lên men ...................... 32

2.2.7.

Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 33


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 34
3.1.

Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men..................................................... 34

3.1.1.

Lựa chọn môi trường lên men cơ sở ......................................................... 34

3.1.2.

Lựa chọn nguồn C ..................................................................................... 35

3.1.3.

Hàm lượng Maltose thích hợp cho sinh tổng hợp NK .............................. 36

3.1.4.

Lựa chọn nguồn N .................................................................................... 36

3.1.5.

Hàm lượng đậu nành thích hợp cho sinh tổng hợp NK đến hoạt tính NK 38

3.1.6.

Ảnh hưởng của muối khoáng đến sinh tổng hợp NK ............................... 38

3.1.7.

Ảnh hưởng của chất cảm ứng (tiền chất) đến sinh tổng hợp NK ............. 40

3.1.8. Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men theo phương pháp bề mặt đáp
ứng (Design Expert Version 7.1) .............................................................................. 41
3.2.

Tối ưu hóa điều kiện môi trường lên men ....................................................... 52

3.2.1.

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ................................................................. 52

3.2.2.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................... 52

3.2.3.

Nhu cầu oxy của chủng tái tổ hợp trong quá trình lên men. ..................... 53

3.2.4.

Ảnh hưởng của tuổi giống và lượng giống tới sinh tổng hợp NK ............ 54

3.3. So sánh khả năng sinh tổng hợp NK của chủng tái tổ hợp và chủng tự nhiên
(chủng gốc mang gen mã hóa NK) ............................................................................. 56
3.4.

Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý tới sinh tổng hợp NK ............................... 57

3.4.1.

Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới sinh tổng hợp NK ................................. 58

3.4.2.

Ảnh hưởng của nhiệt độ cuối lên men tới sinh tổng hợp NK ................... 59

3.5.

Ảnh hưởng của một số tác nhân hóa học tới sinh tổng hợp NK ...................... 59

3.5.1.

Ảnh hưởng của hàm lượng IPTG và Lactose đến sinh tổng hợp NK ....... 60

3.5.2.

Xác định thời điểm bổ sung chất cảm ứng IPTG ...................................... 61

3.6. Hoạt tính NK của dịch lên men chủng B. subtilis BD170 tái tổ hợp trong điều
kiện tối ưu hóa ảnh hưởng của các nhân tố vật lý và hóa học .................................... 61
3.7.

Ảnh hưởng chế độ lên men tới sinh tổng hợp NK ........................................... 62

3.7.1.

Nghiên cứu chế độ lên men theo mẻ ......................................................... 62

3.7.2.

Nghiên cứu chế độ lên men bán liên tục ................................................... 63

3.7.3.

So sánh hiệu quả sinh tổng hợp NK của 2 chế độ lên men....................... 65

3.7.4.

Hoạt tính NK của dịch lên men trong chế độ lên men .............................. 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 69


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế phân giải fibrin invivo bởi nattokinase [29]……………………..5
Hình 1.2. Các sản phẩm nattokinase………………………………………………..6
Hình 1.3. Hình dạng bào tử B. subtilis dưới kính hiển vi ……..…………………..10
Hình 2.1. Nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp…………...23
Hình 2.2. Môi trường lên men……………………………………………………..24
Hình 2.3. Lên men N trên thiết bị Bioflo 110 có dung tích 5 lít (3L môi trường)…32
Hình 3.1. Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hưởng………………………...47


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Hoạt tính protease và NK của dịch lên men chủng B. subtilis BD170 tái
tổ hợp trong một số môi trường cơ sở .................................................................. 34
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nguồn C đến sinh tổng hợp NK ................................. 35
Bảng 3.3. Hàm lượng Maltose thích hợp cho sinh tổng hợp NK ........................ 36
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn N đến sinh tổng hợp NK ........................... 37
Bảng 3.5. Lượng đậu nành thích hợp cho sinh tổng hợp NK .............................. 38
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các muối khoáng đến sinh tổng hợp NK .................... 39
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chất cảm ứng đến sinh tổng hợp NK ......................... 40
Bảng 3.8. Giá trị mã hóa các yếu tố thực nghiệm trong mô hình tố i ưu môi trường
lên men chủng B. subtillis BD170 tái tổ hợp sinh NK......................................... 42
Bảng 3.9. Bảng quy hoạch thực nghiệm .............................................................. 43
Bảng 3.10. Kết quả phân tích hồi quy của mô hình ............................................. 45
Bảng 3.11. 47 phương án trong vùng tối ưu các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp
NK của chủng B. subtillis BD170 tái tổ hợp ....................................................... 48
Bảng 3.12. Kiểm chứng sự tương thích của mô hình với kết quả thực nghiệm .. 51
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh tổng hợp NK........................... 52

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp NK .................. 53
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của độ thông khí lên men đến sinh tổng hợp NK ........... 54
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của tuổi giống đến khả năng sinh NK ............................ 55
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của lượng giống đến khả năng sinh NK ......................... 55
Bảng 3.18. So sánh khả năng sinh tổng hợp NK của chủng tái tổ hợp và chủng tự
nhiên (chủng gốc) trong quá trình lên men trong bình tam giác. ......................... 56
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới sinh tổng hợp NK .......................... 58
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ cuối lên men tới sinh tổng hợp NK ............ 59
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của hàm lượng IPTG tới sinh tổng hợp NK ................... 60
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung IPTG tới sinh tổng hợp NK........ 61
No table of figures entries found.BẢNG KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Viết đầy đủ


NK

Nattokinase

B. subtilis

Bacillus subtilis

C

Carbon

N

Nitơ

ACE

Angiotensin Converting Enzyme

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

DNA

Axit deoxyribonucleic


MỞ ĐẦU
Hiện nay, tỷ lệ bệnh nghẽn mạch (chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não)
đang gia tăng ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt
Nam... Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 17 triệu người
chết vì bệnh tim mạch và dự báo rằng các bệnh do nghẽn mạch sẽ là nguyên nhân
gây tử vong hàng đầu vào các năm tới.
Theo ước tính thị trường toàn cầu về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14
tỷ USD. Các loại thuốc làm tan huyết khối như Alteplase (t-PA), Streptokinase,
Urokinase (UK), Tenecteplase… có hiệu lực tức thì sau khi tiêm tĩnh mạch. Tuy
nhiên hiệu lực hoạt động sinh học của các loại thuốc này tồn tại không lâu sau khi
tiêm, giá thành đắt, đồng thời cũng có nguy cơ biến chứng gây xuất huyết.
Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto đã rất phổ biến và thu
hút nhiều sự chú ý. Nó được xem là một loại thức ăn giúp giảm thiểu sự nghẽn
mạch máu vì có chứa enzyme phân hủy huyết khối “nattokinase” do GS. Sumi
Hiroyuki phát hiện năm 1980. Nattokinase (còn gọi là subtilisin natto) là một serine

protease được chiết tách từ sản phẩm lên men đậu nành với vi khuẩn Bacillus
subtilis natto. Nó không chỉ làm giảm fibrin trực tiếp, mà còn thúc đẩy các tế bào để
phát triển mô plasminogen activator để phân huỷ fibrin.
Nattokinase (NK), đại diện tiêu biểu của chất có hoạt tính làm tiêu sợi huyết,
là một đối tượng được nghiên cứu sâu rộng từ lâu nhờ những ưu điểm nổi bật hơn
các enzyme phân giải cục máu đông khác về hiệu quả phân giải, độ an toàn cao và
dễ sử dụng. Trong y học, NK được ứng dụng để sản xuất các dược phẩm, thực phẩm
phòng ngừa và điều trị các bệnh do tắc nghẽn mạch máu gây ra bởi cục máu động

1


như tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim, co thắt động mạch vành. Vì vậy, phát
triển các sản phẩm nattokinase liên quan đã thu hút quan tâm đặc biệt trên toàn thế
giới.
Theo thống kê, nhu cầu sản phẩm NK ngày càng tăng cao ở thị trường Nhật
Bản và Đài Loan. Trong nước, các công ty dược phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản
phẩm từ NK với nguyên liệu nhập ngoại chủ yếu từ Nhật Bản như Nattospes (300
FU/g), Japato (600 FU/g), NK plusTM (3.000 FU/g), Dosaka (300 FU/g)... với đơn
giá rất cao (trên 10 triệu đồng/kg). Vì vậy, nghiên cứu sản xuất NK với hoạt lực cao,
thân thiện môi trường và giá cả phù hợp là một vấn đề cấp thiết và là định hướng
quan trọng cho ngành công nghiệp thực phẩm chức năng của nước ta. Đồng thời
việc sử dụng nguyên liệu đầu vào là đậu nành sẽ góp phần giúp cải thiện chất lượng
cuộc sống cho người nông dân tại các vùng nông thôn Việt Nam. Chính vì lí do đó,
chúng tôi đã tiến hành xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố thành phần, điều kiện
môi trường, tác nhân vật lý, hóa học tới quá trình lên men để thu nhận được hoạt
tính NK cao nhất với đề tài “Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men sản xuất
thực phẩm chức năng Nattokinase tái tổ hợp”

2

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1.

Khái niệm về huyết khối
Huyết khối (cục máu đông) là kết quả của một loạt các hiện tượng xảy ra

trong quá trình cầm máu mà có tác dụng ngăn cản chảy máu vết thương, hàn gắn vết
thương để giúp bảo vệ mạch máu. Tuy nhiên, huyết khối còn được hình thành trong
cơ thể do sự phát sinh và lan rộng bất hợp lý của phản ứng đông máu của cơ thể dẫn
đến hình thành nút huyết khối trong lòng mạch máu. Huyết khối ở não sẽ làm cản
trở việc cung cấp oxy cho các mô não, gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến
mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ… Huyết khối ở tim gây ra các bệnh
lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim… Bệnh nghẽn mạch là một bệnh
lý nguy hiểm do quá trình sinh bệnh diễn ra chậm và chỉ phát hiện khi phát bệnh vì
không hề có triệu chứng hay cảnh báo trước. Bệnh khởi phát rất nhanh, rất đột ngột
và gây ra những biến chứng gây tử vong cao [1,10].
1.2.

Đại cương về nattokinase

1.2.1. Lịch sử phát hiện nattokinase
Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến sĩ K. Yabe,
một chuyên gia về vi sinh học. Ông công bố những kết quả tìm tòi về quá trình lên
men của natto vào năm 1894. Ông cho rằng “Natto là một loại pho-mai thực vật”.
Vào năm 1905, TS. Shin Sawamura đã thành công trong việc phân lập các vi khuẩn
lên men từ đậu nành nấu chín. Trong số các vi khuẩn này vi khuẩn Baccillus natto
đem lại mùi hương đặc biệt làm đậu lên men [10]. Đến năm 1980, GS. Sumi
Hiroyuki phát hiện NK là chất sản sinh trong quá trình lên men tự nhiên của đậu

nành nhờ vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Năm 1986, ông công bố toàn bộ kết quả
3


nghiên cứu về tác dụng của NK sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác
nhau và ông thấy rằng NK là một loại enzyme có khả năng phân hủy huyết khối
một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme (mạnh gấp 4 lần plasmin enzyme nội sinh làm tan máu đông và tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua
đường ăn uống) [20].
1.2.2. Hoạt tính của nattokinase
NK là một enzyme ngoại bào, thuộc họ serine protease kiềm, có pI 8,7 và có
nhiệt độ tối ưu là 40oC. Theo những nghiên cứu của Yibing Feng và ctv. (2009),
80% hoạt tính của nó tồn tại ở 50oC sau 1 giờ, 70% ở 60oC sau 40 phút và mất hoạt
tính hoàn toàn ở nhiệt độ trên 60oC [39,55].
NK làm tan cục máu đông bằng cách làm tan sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu
cầu vón kết lại với nhau hình thành cục máu đông). NK hoạt động mạnh gấp 4 lần
plasmin nội sinh (loại enzyme duy nhất trong cơ thể làm nhiệm vụ phân hủy sợi
fibrin) với cơ chế tương tự như plasmin này. Sức khỏe, tuổi tác và sự suy giảm sản
sinh plasmin trong cơ thể càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông. NK cũng
giúp tăng cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như
urokinase [25].
NK có tác dụng làm giảm huyết áp. Các nghiên cứu chỉ ra rằng NK làm giảm
huyết áp bằng cách ức chế Angiotensin Converting Enzyme (ACE). ACE khiến mạch
máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao. NK có khả năng ức chế ACE và ngăn cản dầy nội
mạc mạch, trợ giúp máu lưu thông bằng cách hỗ trợ hệ tuần hoàn và được chứng minh
là có tác dụng ngăn chặn xơ vữa mạch. NK còn làm chắc xương, trợ giúp đau khớp,
giảm nhức đầu, kháng khuẩn, ngừa bệnh tả, thương hàn và bệnh lỵ [26,30,57].

4

Cục máu đông làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí nhớ,
xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và trĩ. Lợi ích tuyệt vời từ NKhứa hẹn
mang lại nhiều lợi ích cho những người mắc bệnh này.
1.2.3. Cơ chế phân hủy fibrin của nattokinase
NK phân hủy fibrin theo ba cơ chế chính như sau: A) tham gia phân hủy trực
tiếp fibrin – một protein dạng sợi tạo mạng lưới gây đông tụ máu, B) đẩy mạnh hoạt
động của urokinase (nhân tố làm tăng cường sự chuyển hóa plasminogen thành
plasmin) và C) tăng cường chất hoạt hóa plasminogen mô (t-PA) sản sinh plasmin
[29].

Hình 1.1. Cơ chế phân giải fibrin invivo bởi nattokinase [29]
1.2.4. Sinh tổng hợp và sản xuất nattokinase
NK được mã hóa bởi gen apr. Gen này chủ yếu được biểu hiện ở pha cân
bằng trong quá trình sinh trưởng của Bacillus subtilis dưới sự kiểm soát của
promoter có liên quan đến sự tạo bào tử (Ps, s-sporulation). Ps chỉ hoạt động khi có
5


sự gắn kết với Spo0A, một protein liên kết DNA giữ vai trò điều hòa chủ đạo
(master regulator) và điều hòa trực tiếp hoặc gián tiếp khoảng 500 gen liên quan
chặt chẽ đến quá trình tạo bào tử cũng như hiện tượng biến nạp ở B. subtilis. Do có
vai trò điều hòa quan trọng, lượng Spo0A ở dạng hoạt hóa (dạng phosphoryl hóa)
được kiểm soát khá nghiêm ngặt bởi phức hệ protein phosphorelay (chuỗi các
protein chuyển nhóm phosphoryl) và vòng tự điều hòa (autoregulatory loop). Vì vậy,
thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp NK (subtilisin) trong tự nhiên ở B.
subtilis khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn [8,14,18].
Từ trước đến nay NK được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán
rắn của chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men
dịch thể. Thực tế, NK được phân tách từ cơ chất hay môi trường lỏng và nó có hàm
lượng không cao cũng như hoạt tính ít ổn định. Hay nói cách khác, cách tiếp cận

trên thường chỉ có hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông
số đã được nghiên cứu tối ưu hóa [15,58].
Các sản phẩm nattokinase trên thị trường hiện nay:

Hình 1.2. Các sản phẩm nattokinase

6


1.2.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase
Mùi nhẹ và kết cấu dạng sợi của natto là một trở ngại lớn cho việc sử dụng
natto như một thực phẩm thông thường, vì vậy NK tinh khiết đã được nghiên cứu
sản xuất. B. subtilis (natto) là giống khởi động được sử dụng để làm natto, thương
mại hóa hay quy mô hộ gia đình. B. subtilis (natto) có thể duy trì hoạt động ở pH
6-12 và kháng lại nhiệt độ cao lên đến 60°C [18]. Các chủng B. subtilis có trong các
sản phẩm NK thương mại hiện nay có thể duy trì tính khả thi và hoạt động trao đổi
chất ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 6 tháng.
So với quá trình lên men đơn giản, việc chiết xuất và tinh chế NK từ dịch lên
men natto là rất khó khăn và không hiệu quả. Một số biện pháp cho mục đích này
đã được áp dụng như chiết rút bằng dung môi hữu cơ, kết tủa bằng muối, sắc ký trao
đổi ion protein và thẩm tích, nhưng hoạt tính NK thu được từ các biện pháp này vẫn
thấp [18]. Mặt khác, bên ngoài Nhật Bản, NK ở dạng viên nang thường được uống
qua đường miệng, sự có mặt của các tạp chất trong các sản phẩm NK là một trở
ngại khi sử dụng nó làm thuốc chữa bệnh huyết khối đối với người ăn chay. Hơn thế
nữa, các sản phẩm NK hiện nay được quan tâm nhiều hơn bởi Cục Quản lý Dược
Liên bang (FDA) do yêu cầu về mức độ tinh khiết cao. Vì vậy, công nghệ tái tổ hợp
đã được áp dụng để đáp ứng các yêu cầu nâng cao sản lượng và đơn giản hóa quá
trình tinh sạch NK.
Các gen NK đã được nhân dòng và biểu hiện ở các hệ thống vật chủ vi sinh
vật khác nhau, bao gồm Escherichia coli[32] và B. subtilis. Trong đó, B. subtilis đã

được công nhận là một vật chủ tốt cho sự biểu hiện của các protein ngoại lai với các
hoạt động dược lý bởi không có tính độc [56]. Nhiều nỗ lực đã được đầu tư để tăng

7


cường sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách loại bỏ các yếu tố hạn chế[14], sử dụng
các vector biểu hiện với sự ổn định cấu trúc cao, tối ưu hóa môi trường sử dụng
phương pháp bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa promoter [57]. Hiệu quả hơn, chủng B.
subtilis đã được thiết kế cho sản xuất thừa các protein như enzyme tiêu sợi huyết
/NK/subtilisin trong B. subtilis WB600 [57].
Việc sản xuất NK thương mại đòi hỏi tối ưu hóa các điều kiện lên men để tối
đa hóa sản lượng NK được tạo ra bởi B. subtilis (natto), bao gồm nhiệt độ, pH, và
thời gian lên men tối ưu [3,5] và đặc biệt là môi trường lên men. Một loạt các chất
dinh dưỡng, như là glycerol, cao nấm men, peptone đậu nành, hoặc bột vỏ tôm đã
được đánh giá cho khả năng nâng cao sản lượng NK [24,53]. Chiến lược bổ sung cơ
chất thích hợp được sử dụng trong các phương pháp lên men mẻ có bổ sung cơ chất
(fed-batch fermentation) đã nâng cao đáng kể việc sản xuất NK, liên quan đến sản
lượng đạt được bởi lên men mẻ[10]. Việc tăng sản lượng của NK đã được báo cáo
bởi một số tác giả khi sử dụng nguồn carbon (C) là các loại đường khác nhau như
maltose [6], mannitol [16], glucose [46] và fructose [50]. Tương tự, muối
ammonium sulphate và sodium nitrate cũng đã được xem là nguồn nitơ (N) kích
thích sản xuất NK ở vi sinh vật [6]. Ngoài ra, peptone (1%) và cao nấm men (1-2%)
cũng là các nguồn N tuyệt vời [16,50]. Việc bổ sung các hợp chất amino nhất định
nào đó đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong sản xuất NK ngoại bào bởi
chủng Bacillus lichniformis B4 phân lập tại địa phương [16]. Tuy nhiên, aspartate
dường như có tác dụng ức chế đến sự sản xuất của cả protease và protease tiêu sợi
huyết [50]. Việc sản xuất NK ở các mức thấp cũng đã được báo cáo với việc sử
dụng các nguồn N vô cơ trong môi trường lên men [6]. Các ion kim loại hóa trị II
như Ca, Co, Cu, B, Fe, Mg, Mn và Mo được đòi hỏi trong môi trường lên men để

8


sản xuất tối ưu NK. Tuy nhiên, nhu cầu các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn
enzyme. Việc sử dụng MgSO4, AgNO3, CaCl2, MnCl2 ở nồng độ 0,1-0,5 mM hoặc
NaN3 ở nồng độ 0,1-0,5 mM đã dẫn đến sự gia tăng trong hoạt động NK của
Bacillus subtilis[22]. Khoảng pH 5-8 và nhiệt độ 30-40°C đã được báo cáo là tối ưu
cho việc sản xuất NK bởi Bacillus subtilis[51]. Đồng thời, Bacillus subtilis A26 cho
sản lượng enzyme tối đa tại tốc độ khuấy trộn là 200 vòng/phút.
Mặc dù phương pháp tối ưu hóa một lúc một biến (a variable-at-a time
method) truyền thống là đơn giản và dễ dàng thực hiện, tuy nhiên phương pháp này
thường không xác định được vùng đáp ứng tối ưu bởi hiệu ứng toàn diện của các
biến không được xem xét [26], vì vậy cần sử dụng phương pháp thống kê mô hình
kiểu tâm phức (CCD) để tối ưu hóa môi trường lên men sản xuất NK và cuối cùng
đã làm tăng hoạt lực của NK lên đến 1.300 ± 60 FU/ml, cao hơn so với hoạt lực ban
đầu khoảng 6,5 lần [18]. Các nguồn N và C thích hợp được chọn lọc làm cơ sở cho
việc sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính NK bằng thiết kế thí nghiệm
Plackett-Burman. Trong các yếu tố khảo sát, pepton đậu nành, MgSO4 và NaCl là
ba yếu tố tác động nhiều nhất (p<0,05). Kết quả nhận được môi trường thích hợp
cho quá trình sinh tổng hợp NK gồm: 10 g/l pepton đậu nành, 0,88 g/l MgSO4, 5 g/l
NaCl. Thời gian lên men sau 16 giờ cho hoạt tính NK cao nhất 152 FU/ml cao hơn
trước khi tối ưu 1,8 lần (83 FU/ml) chiếm 45%.
Tuy vậy, không có một môi trường và điều kiện lên men nhất định nào là tối
ưu cho quá trình sinh tổng hợp NK của tất cả các chủng vi sinh vật bởi mỗi chủng vi
sinh vật có các điều kiện đặc trưng cho sản xuất tối đa enzyme.

9


1.3.

Đại cương về Bacillus subtilis

1.3.1. Đặc điểm tế bào
B. subtilis có hình que, một dạng tiêu biểu của nhóm vi khuẩn Gram dương [59].
Đó là mô ̣t trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 0,5-0,8 µm x 1,5-3 µm, đứng đơn
lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn.
B. subtilislà một vi sinh vậtmô hình đểnghiên cứu sựhìnhthành nội bào tử
(endospore) trong vi khuẩn.Các điều kiện không thuận lợi như sự suy giảm nguồn
carbon,nitơ, … chính là nguyên nhân dẫn tới quá trình hình thành bào tử [61].

Hình 1.3.Hình dạng bào tử B. subtilis dưới kính hiển vi
Cấu trúc đặc biệt của nội bào tử quyết định phần lớn tới khả năng tồn tại của nó
trước điều kiện môi trường bất lợi. Đó là c ấu trúc lõi chứa DNA nhiễm sắc thể
được bọc trong chất nhiễm sắc ở trạng thái bị nén chặt và bất hoạt, bảo vệ bào tử
khỏi tia UV và ảnh hưởng từ nhiệt. Các lớp vỏ xung quanh lõi tính từ trong ra
10


ngoài cùng bao gồm lớp vỏ lõi bao quanh phần lõi hoặc lớp nguyên sinh chất, lớp
cortex chứa peptidoglycan, tiếp đến là các lớp áo bào tử chứa các loại protein khác
nhau. Cấu trúc lõi bào tử cũng chứa các thành phần thông thường như ribosome và
nhiều loại enzyme khác nhau nhưng không hoạt động trao đổi chất [61].
Trình tự bộ gen của vi khuẩn B. subtilis đã được giải mã thành công và được
công bố vào tháng 11 năm 1997 [60]. Tế bào vi khuẩn B. subtilis chỉ có một phân
tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể dạng tròn.Kích thước DNA tổng thể của vi
khuẩn này là4.214.814 bp (TIGRCMR). Phần lớn bộ gen B. subtilis liên quan đến
các quá trình tổng hợp nguồn carbon [34]. Khoảng 87% bộ gen (bao gồm 4.100
gen) mã hóa cho protein. 192 gen trong số này được coi là không thể thiếu và 79
gen được coi là cần thiết cho các quá trình sống của B. subtilis. Hơn 74% khung

đọc mở và 94% gen ribosome được phiên mã cùng hướng và được sao chép. Chỉ có
53% số gen là gen đơn bản, trong khi 25% thuộc họ đa gen có 2-77 bản sao của gen
trong tế bào [34]. Khoảng 220 yếu tố điều hòa phiên mã đã được xác định trong hệ
gen. Cho đến nay, chỉ khoảng 58% số gen đã được biết chức năng, 42% số gen còn
lại vẫn chưa biết rõ được chức năng và đang được nghiên cứu [60].
Vi khuẩnB. subtiliscókhảnăngtiết một lượng lớn các loại enzyme ngoại bào do
tế bào của chúng chứa những tín hiệu mã hóa cho các peptidase điều khiển chức
năng tiết này.Nhiều gen trong tế bàovi khuẩn B.subtilis chịu trách nhiệmtổng
hợpkhángsinh [60].
B. subtilis tái tổ hợp chủng vi khuẩn đã được chuyển vector mang gen biểu hiện
cho một loại protein nhất định bằng phương pháp tái tổ hợp. B. subtilis BD170 đã
được chuyển gen mã hóa cho enzyme nattokinase bằng phương pháp di truyền tái

11


tổ hợp donhóm nghiên cứu phối hợp thực hiện đề tài (GS. Nguyễn Hoàng Lộc và
cs.) tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Sự biểu hiện của enzyme NK được
kiểm soát bới cơ chế kích hoạt phiên mã tại Operon lac.
1.3.2. Chất cảm ứng IPTG
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) là một chất cảm ứng sinh
học phân tử được sử dụng thường xuyên trong lĩnh vực biểu hiện protein. IPTG có
chức năng kích hoạt phiên mã tại opera lac khi gen bị kiểm soát bới operator. Khi
chấ t IPTG c ảm ứng promoter lac của operon lac, IPTG sẽ liên kết với các chất ức
chế quá trình phiên mã tại operator khiến chúng không còn khả năng ức chế phiên
mã như ban đầu, dẫn đến quá trình phiên mã sẽ diễn ra bình thường và sản sinh ra
NK. Ở nồng độ cao, IPTG có thể thâm nhập trực tiếp vào tế vào dưới sự liên kết
với lactose và ngay lập tức kích thích sự biểu hiện của protein NK nên IPTG là chất
cảm ứng được sử dụng rộng rãi trong việc biểu hiện protein bao gồm cả
Nattokinase [57].

1.4.

Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý và hóa học khi lên men sản xuất NK

1.4.1. Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý
1.4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH
Nhiệt độ phản ứng và pH của môi trường là các thông số quan trọng của
quá trình sinh học mà thường được mong muốn giữ cả hai biến này ổn định và ở các
giá trị tối ưu của chúng trong suốt quá trình lên men. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ
pH đến một quá trình sinh học có thể rất khác nhau, và bởi vì quá trình sinh trưởng
và phát triển là kết quả của nhiều quá trình enzyme, ảnh hưởng của cả hai thông số
nuôi cấy đến toàn bộ phản ứng sinh học là khá phức tạp [11].
12


Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tốc độ sinh trưởng tối đa của một vi sinh vật là
tương tự với những gì quan sát được ở hoạt tính của một enzyme. Tốc độ sinh
trưởng tăng dần tăng đến nhiệt độ tối ưu nhưng nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì tốc độ
tăng trưởng giảm nhanh chóng [32]. Cơ chế kiểm soát nhiệt độ trong sản xuất
enzyme không được hiểu rõ [13], tuy nhiên các nghiên cứu của Frankena et al.
(1986) cho thấy có một mối liên kết được tồn tại giữa sinh tổng hợp enzyme và
chuyển hóa năng lượng của vi khuẩn thuộc chi Bacillus mà được kiểm soát bởi
nhiệt độ và sự hấp thụ oxy.
pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng mạnh đến nhiều quá trình enzyme
và sự vận chuyển một số chất qua màng tế bào. Sự thay đổi độ pH làm thay đổi cân
bằng acid-base và các dòng của các chất dinh dưỡng khác nhau, chất gây cảm ứng
và các yếu tố tăng trưởng giữa pha vô sinh và hữu sinh [28]. Ảnh hưởng của pH đến
hoạt động của tế bào được xác định bởi mức độ nhạy cảm của các enzyme riêng lẻ
đối với sự thay đổi pH. Enzyme thường hoạt động chỉ trong một khoảng pH nhất
định và vì thế hoạt động enzyme tổng số của tế bào chịu ảnh hưởng lớn bởi pH môi

trường. Các tế bào vi sinh có khả năng đáng kể trong duy trì độ pH nội bào ở mức
không đổi ngay cả với sự biến đổi lớn về pH của môi trường ngoại bào[32]. Độ pH
trong tế bào chất của các loài thuộc chi Bacillus ưa kiềm (ví dụ: B.firmus) là 8,2-8,5,
trong khi đối với các loài thuộc chi Bacillus ưa trung tính (ví dụ: B.subtilis,
B.licheniformis), giá trị này là 7,5 [11].
1.4.1.2. Sục khí và khuấy trộn
Trong quá trình lên men, tốc độ sục khí gián tiếp cho biết mức oxy hoà tan
trong dịch lên men. Nồng độ oxy hoà tan khác nhau có thể đạt được bằng cách: (i)

13


thay đổi về tốc độ sục khí; (ii) các thay đổi về tốc độ khuấy của hệ lên men; hoặc
(iii) sử dụng pha khí giàu hoặc thiếu oxy (các hỗn hợp không khí-oxy hoặc không
khí-nitơ thích hợp) làm nguồn oxy [28].
Sự thay đổi tốc độ khuấy ảnh hưởng đến mức độ pha trộn trong các bình
tam giác được lắc hoặc hệ lên men và cũng sẽ ảnh hưởng đến sự sẵn có của chất
dinh dưỡng. Sản lượng tối ưu của protease kiềm được tạo ra ở tốc độ khuấy 200
vòng/phút cho B. subtilis ATCC 14416 và B. Licheniformis [38]. Tuy nhiên, hạ thấp
tốc độ sục khí đã làm giảm đáng kể sản lượng protease [28]. Điều này cho thấy việc
giảm cung cấp oxy là một yếu tố giới hạn quan trọng cho sự sinh trưởng và phát
triển cũng như sự tổng hợp protease.
Sự truyền oxy cho thấy những ảnh hưởng khác nhau đối với sự hình thành
sản phẩm trong quá trình lên men hiếu khí thông qua việc ảnh hưởng đến các con
đường trao đổi chất và việc thay đổi các dòng trao đổi chất. Theo điều kiện tăng
trưởng tế bào và phân tích con đường trao đổi chất, một số quá trình sinh học đòi
hỏi tốc độ truyền oxy cao, trong khi các quá trình khác đòi hỏi điều kiện mà tốc độ
truyền oxy được kiểm soát [12].
1.4.1.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống và thời gian nuôi cấy
Sản xuất enzyme cũng chịu ảnh hưởng bởi mật độ giống ban đầu được cấy

vào. Tỉ lệ tiếp giống cần tối ưu để sản xuất protease. Sự tăng sản xuất protease bằng
cách sử dụng các tỉ lệ tiếp giống nhỏ đã được khuyến khích do tỷ lệ diện tích bề mặt
và thể tích cao hơn dẫn đến tăng sinh tổng hợp protease. Nếu tỉ lệ tiếp giống quá
nhỏ, số lượng vi khuẩn không đủ sẽ dẫn đến giảm lượng protease được tiết ra. Điều
này có thể được giải thích vì hạn chế trong các thành phần khác của môi trường lên

14


men và hàm lượng oxy hòa tan bị giảm [36].
Thời gian lên men cũng ảnh hưởng đến việc sản xuất protease. Thông
thường protease có thể tự phân hủy trong tự nhiên. Vì vậy, năng suất protease có thể
tăng lên theo thời gian ủ thích hợp. Điều này cũng có thể được giải thích vì hạn chế
trong các thành phần khác của môi trường.
1.4.2. Ảnh hưởng của các tác nhân hóa học
Nồng độ của các thành phần môi trường thực sự quan trọng vì chúng là các
công cụ để thiết kế môi trường lên men [11]. Môi trường nuôi cấy cung cấp cho vi
sinh vật tất cả các yếu tố cần thiết cho sự phát triển của chúng. Một số vi sinh vật có
khả năng tổng hợp tất cả các thành phần tế bào của chúng từ các nguồn C và N. Tuy
nhiên, hầu hết các vi sinh vật đều cần một số nguồn dinh dưỡng vi lượng (như axit
amin, các nguyên tố vi lượng, vitamin...). Các điều kiện nuôi cấy thúc đẩy sản xuất
các enzyme như proteases có sự khác biệt đáng kể so với điều kiện nuôi cấy tăng
sinh tế bào [28]. Hầu hết các enzyme vi sinh vật được sản xuất là kết quả của sự đáp
ứng của với các thành phần môi trường, như các chất dinh dưỡng, hormone sinh
trưởng và ion. Protein kiềm bao gồm 53,8% C và 15,6% N. Sản xuất protease phụ
thuộc rất nhiều vào sự sẵn có của cả nguồn C và N trong môi trường. Việc dư thừa
hoặc thiếu hụt C và N có thể kìm hãm sự tổng hợp protease của vi khuẩn [28].
Đối với thực tiễn sản xuất thương mại, việc tối ưu hóa thành phần môi
trường được thực hiện để duy trì sự cân bằng giữa các thành phần khác nhau trong
môi trường lên men. Các nỗ lực nghiên cứu chủ yếu trung vào:

- Đánh giá hiệu quả của nguồn dinh dưỡng C và N khác nhau như là các cơ
chất hiệu quả về kinh tế đến sản lượng enzyme;
15


- Nhu cầu của các ion kim loại hóa trị hai trong môi trường lên men;
- Tối ưu hóa các thông số về môi trường và lên men như độ pH, nhiệt độ, sự
sục khí và sự khuấy.
Ngoài ra, không có một môi trường nào được xem là tốt nhất cho sản xuất
các serine protease từ các chủng vi khuẩn khác nhau. Mỗi chủng có nhu cầu dinh
dưỡng riêng cho sự tổng hợp enzyme tối đa.
1.4.2.1. Ảnh hưởng của nguồn C
Glucose thường được sử dụng trong lên men sản xuất protease. Một số
nghiên cứu cho thấy sản xuất protease giảm do giảm dị hóa bởi glucose (Kole et al.,
1988). Sản lượng protease kiềm tăng cũng được báo cáo bởi một số nghiên cứu khi
có mặt của các loại đường khác nhau như lactose [27], maltose [47], sucrose [34] và
fructose [38]. Tuy nhiên, một sự kìm hãm tổng hợp protease đã được quan sát thấy
khi các thành phần này ở nồng độ cao. Trong thực tiễn sản xuất thương mại, nồng
độ carbohydrate cao đã làm giảm hoạt động sản xuất enzyme [7].
1.4.2.2. Ảnh hưởng của nguồn N
Các nguồn N phức tạp thường được sử dụng để sản xuất protease kiềm.
Nhu cầu bổ sung N là khác nhau giữa các chủng vi sinh vật. Mức độ thấp của sản
xuất protease kiềm đã được báo cáo khi sử dụng các nguồn N vô cơ trong môi
trường sản xuất [38]. Sự tổng hợp enzyme được phát hiện là bị kìm hãm bởi các
nguồn N có thể được đồng hóa nhanh chóng như axit amin hoặc NH4+ trong môi
trường [19]. Tuy nhiên, không có kìm hãm hoạt tính protease khi có mặt muối
ammonium [31]. Sự tăng sản xuất protease cũng được quan sát thấy khi có mặt
(NH4)2SO4 và KNO3 trong môi trường lên men [40]. Tương tự, NaNO3 (0,25%)
16

được cho là kích thích sản xuất protease kiềm [9]. Sự thay thế NaNO3 trong môi
trường cơ sở bằng NH4NO3 làm tăng sản xuất enzyme [34].
Ngược lại, một số báo cáo đã chứng minh việc sử dụng các nguồn N hữu cơ
dẫn đến sản xuất enzyme cao hơn các nguồn N vô cơ. Bã đậu nành cũng được báo
cáo là nguồn N thích hợp để sản xuất protease. Thêm vào đó, bằng cách sử dụng sản
phẩm thủy phân bằng acid của đậu nành thay cho sữa đậu nành thông thường đã
làm tăng 3 lần hoạt tính enzyme tổng số [45].
Ngoài ra, nước chiết ngô cũng được nhận thấy là một nguồn N rẻ và phù
hợp [38]. Ngoài việc cung cấp nguồn N, nước chiết ngô còn cung cấp một số vi chất
dinh dưỡng, vitamin và các yếu tố kích thích sinh trưởng. Tryptone và casein cũng
là nguồn cung cấp N tuyệt vời [34] để sản xuất protease. Một số hợp chất amin đã
được chứng minh có hiệu quả trong sản xuất các enzyme ngoại bào bởi Bacillus sp.
[21]. Tuy nhiên, glycine dường như có tác động ức chế trên sự sản xuất protease.
Casamino acid cũng được nhận thấy là ức chế sản xuất protease [33].
1.4.2.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và muối
Các ion kim loại hóa trị 2 như Ca, Co, Cu, Bo, Fe, Mg, Mn và Mo được đòi
hỏi trong môi trường lên men để sản xuất tối ưu các protease kiềm. Tuy nhiên, yêu
cầu đối với các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn enzyme. Kali phosphate đã
được sử dụng làm nguồn phosphate trong hầu hết các nghiên cứu [20] và chịu trách
nhiệm đệm môi trường. Phosphate ở nồng độ 2 g/L được nhận thấy là tối ưu cho
việc sản xuất protease. Tuy nhiên, khi vượt quá nồng độ này, sự sinh trưởng, phát
triển của tế bào bị ức chế và sự sản xuất protease bị kìm hãm [28].

17